Afwijkingen in niet-coderende regulatorische regio`s van het MEF2C

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Centrum voor Medische Genetica, Gent
Afwijkingen in niet-coderende regulatorische regio’s
van het MEF2C -gen als een nieuw ziekte-mechanisme
bij patiënten met een Rett-like fenotype
Céline Helsmoortel
Tutor
Ir. Sarah Vergult
Promotoren
Prof. dr. Godelieve Gheysen
Prof. dr. ir. Björn Menten
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van
Master in de bio-ingenieurswetenschappen: cel- en genbiotechnologie
Academiejaar 2010-2011
Auteursrecht
“De auteur en de promotoren geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te
stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de
beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron
te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.”
“The author and the promoters authorize consultation and partial reproduction of this thesis for
personal use. Any other reproduction or use is subject to copyright protection, more specifically
the source must be extensively specified when using results from this thesis.”
Gent, juni 2011
De promotor,
De co-promotor,
De auteur,
Prof. dr. G. Gheysen
Prof. dr. ir. B. Menten
C. Helsmoortel
Dankwoord
Het is vandaag 1 juni, een zonnige namiddag, en het ideale moment om aan mijn dankwoord
te beginnen schrijven! Dat ik dit gedeelte kan aanvatten, betekent dat de rest van mijn thesis
stilaan definitief vorm begint te krijgen. Dit werk kon enkel tot stand komen dankzij de aanwezigheid en hulp van heel wat mensen, die ik dan ook zeker wil bedanken!
Allereerst zou ik graag mijn beide promotoren bedanken om mijn thesis op het CMGG mogelijk
te maken. Björn, bedankt voor de interessante inzichten die je met mij deelde en de tijd die
je ondanks je drukke agenda voor me hebt vrijgemaakt. En prof. Gheysen, bedankt voor het
snelle nalezen van deze tekst, in de periode dat u met de hele aardappelpolemiek ongetwijfeld
heel wat anders aan uw hoofd had.
Sarah, of mijn labomama zoals ik je samen met men labozusje Elke noemde, je was fantastisch!
Het anders verwoorden zou enkel afbreuk doen aan al wat je voor mij gedaan hebt. Op eender
welk moment dat ik je bureau binnenkwam met vragen, je mailtjes stuurde, je belde toen je
niet in het labo zelf aanwezig was, ... steeds legde je datgene waar je mee bezig was even weg
en hielp je me meteen verder. Steeds bekommerd of ik wel genoeg informatie had om verder
te kunnen, zorgde je er altijd voor dat ik in optimale omstandigheden aan mijn thesis kon
werken. De eerste dag dat ik op het CMGG aankwam had je alles minutieus voorbereid, mijn
laboboek, papieren voor de badge en een planning om me in te wijden in alle technieken van
de wondere wereld van de medisch genetische biotechnologie. Dit MEF2C-verhaal hebben we
samen beleefd, in de enthousiaste en teleurgestellende dagen. Je hebt mijn nieuwsgierigheid
en passie voor onderzoek enkel maar versterkt. En ja, zelfs een skype-gesprek voeren om mijn
presentatie te oefenen, ik kan me geen betere begeleidster voorstellen!
Ook een welgemeende dank u aan alle andere medewerkers van MRB2, ik mocht jullie steeds
lastigvallen met mijn talloze vragen en komen kijken wanneer jullie experimenten uitvoerden,
kortom, jullie hebben me veel bijgeleerd! En samen met mijn mede-studenten van de archiefkast hebben jullie ervoor gezorgd dat het aangenaam werken was op het labo.
Natuurlijk had ik ook af en toe nood aan ontspanning, en daarvoor kon ik altijd rekenen op mijn
demetris-vriendjen voor goeie feestjes, gmailchats, zotte weekends en leuke vakanties! Ook de
cel- & genactiviteiten met ons klasje, de boerekotactiviteiten, het organiseren van bloedserieus
met een geweldig team, samen kook-, sport-, babbel- of plezier-avondjes met de kotgenoten,
geroddel tussen de redders op het werk,... hebben ervoor gezorgd dat ik deze thesis overleefd
heb :).
Tot slot mag mijn familie hier zeker niet ontbreken. Merci mama en papa om me de kans te
geven om 5 jaar te studeren om te worden wat ik graag wilde: bio-ingenieur! Bedankt voor
het vertrouwen dat ik ondanks mijn overvolle agenda alles tot een goed einde zou brengen. En
zusjes en broertje, de (examen)pret samen en het feit dat jullie naar mij bleven luisteren als
ik met mijn enthousiaste (en voor jullie redelijk onbegrijpelijke) verhalen kwam opzetten zijn
maar enkele voorbeelden van dingen die ik enorm geapprecieerd heb, thanks!
Céline
1 juni 2011
Inhoudsopgave
Lijst van afkortingen
i
Lijst van figuren
iii
Lijst van tabellen
v
Samenvatting
vi
Abstract
vii
Résumé
viii
Inleiding en doelstelling
ix
1
1
1
2
2
3
5
6
6
7
8
8
8
9
9
10
10
11
11
12
12
Literatuurstudie
1
Genomische afwijkingen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1
Chromosomale afwijkingen . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.1
Numerieke afwijkingen . . . . . . . . . . . .
1.1.2
Structurele afwijkingen . . . . . . . . . . . .
1.2
Microdeletie- en microduplicatiesyndromen . . . . . .
1.3
Genafwijkingen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3.1
Basepaarsubstituties . . . . . . . . . . . . . .
1.3.2
Deleties en inserties (InDels) . . . . . . . . .
1.3.3
Repeat expansies . . . . . . . . . . . . . . . .
1.4
Functionele effecten van genomische afwijkingen . . .
1.4.1
Verlies van functie . . . . . . . . . . . . . . .
1.4.2
Winst aan functie . . . . . . . . . . . . . . .
2
Long-range controle van genexpressie . . . . . . . . . . . . . .
2.1
Belang van long-range controle van genexpressie . . .
2.2
Regulatorische elementen . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2.1
Enhancers en repressors . . . . . . . . . . .
2.2.2
Insulators . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2.3
Locus Control Regions . . . . . . . . . . . . .
2.3
Mechanismen van long-range controle van genexpressie
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
3
2
2.4
Verstoring van long-range controle van
2.5
Onderzoeksstrategieën . . . . . . . . .
Het MEF2C -gen . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1
Reeds beschreven afwijkingen . . . . .
3.1.1
Afwijkingen . . . . . . . . . .
3.1.2
Fenotypes . . . . . . . . . . .
3.2
Functie . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3
Gerelateerde ziektes . . . . . . . . . .
genexpressie
. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
Materiaal en Methoden
1
Technieken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1
Mate Pair Sequencing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2
Concentratiebepaling van DNA . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2.1
Benodigdheden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2.2
Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3
Amplificatie van DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3.1
Benodigdheden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3.2
Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.4
Visualisatie van DNA-fragmenten . . . . . . . . . . . . . . . .
1.4.1
Visualisatie met behulp van agarosegelelektroforese
1.4.2
Visualisatie met behulp van de LabChip® GX . . .
1.5
High Resolution Melting mutatie-analyse van DNA . . . . . .
1.5.1
Benodigdheden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.5.2
Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.6
Sequentieanalyse van DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.6.1
Benodigdheden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.6.2
Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.7
Kwantitatieve PCR (qPCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.7.1
Benodigdheden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.7.2
Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.8
Amplificatie van volledige genomen . . . . . . . . . . . . . . .
1.8.1
Benodigdheden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.8.2
Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.9
Opzuivering van DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.9.1
Benodigdheden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.9.2
Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.10 In silico analyses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.10.1
Selectie van kandidaat-regulatorische regio’s . . . .
1.10.2
Ontwerpen van primers . . . . . . . . . . . . . . . .
1.10.3
Mutatie-analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
Werkwijze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
13
14
15
17
17
18
19
21
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
23
23
23
24
24
25
25
26
27
27
27
30
31
32
33
33
34
35
36
38
38
39
40
40
41
41
41
42
42
43
43
45
2.1
2.2
2.3
3
4
5
Fijnmappen van de translocatie in de proband . . . . . . . . . . . . . .
Mutatie-analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Onderzoek naar regulatorische regio’s . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Resultaten
1
Fijnmappen van de translocatie in de proband . . .
1.1
Karyotypering . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2
FISH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3
Mate Pair Sequencing . . . . . . . . . . . . .
1.4
Exacte lokalisatie breukpunten . . . . . . . .
2
Mutatie-analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.1
Mutaties in de 5’UTR . . . . . . . . . . . . .
2.2
Mutaties in de coderende regio . . . . . . . .
2.3
Mutaties in intronen . . . . . . . . . . . . . .
3
Onderzoek naar regulatorische regio’s . . . . . . . .
3.1
Selectie van kandidaat-regulatorische regio’s .
3.2
Element 789 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3
Analyse van veertien kandidaat-regulatorische
45
46
46
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
47
47
47
47
48
49
49
49
50
50
51
51
51
52
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
53
53
54
56
57
58
58
59
60
61
61
61
62
Conclusie
1
Besluit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
Toekomstperspectieven . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
63
63
64
Discussie
1
Fijnmappen van de translocatie in de proband . . .
1.1
Mate Pair Sequencing . . . . . . . . . . . . .
1.2
Exacte lokalisatie breukpunten . . . . . . . .
1.3
Vergelijking van de verschillende methoden .
2
Mutatie-analyse van MEF2C . . . . . . . . . . . . .
2.1
Optimalisatie van High Resolution Melting .
2.2
Missense mutatie . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3
Synonieme mutatie . . . . . . . . . . . . . . .
2.4
SNPs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
Onderzoek naar regulatorische regio’s . . . . . . . .
3.1
Element 789 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2
Analyse van veertien kandidaat-regulatorische
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
regio’s
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
regio’s
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
Bibliografie
65
A Bijlage
1
Fijnmappen van de translocatie in de proband . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1
Sequenties van de primers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
73
73
73
2
3
1.2
Samenstelling van de PCR-reactiemengsels . . . . . .
1.3
Temperatuursprotocol KAPA58 . . . . . . . . . . . . .
Mutatie-analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.1
Sequenties van de primers . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2
Samenstelling van de PCR-reactiemengsels . . . . . .
2.2.1
Standaard PCR . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2.2
PCR voor HRM zonder DMSO . . . . . . . .
2.2.3
PCR voor HRM met 5% DMSO . . . . . . .
2.3
Temperatuursprotocols . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.1
Gradiënt KAPA55-70 . . . . . . . . . . . . .
2.3.2
TD64-52HRM . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.3
STS58(52)HRM . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.4
KAPA56 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4
Mastermixsamenstellingen en temperatuursprotocollen
2.5
Normalisatietemperaturen . . . . . . . . . . . . . . . .
Onderzoek naar regulatorische regio’s . . . . . . . . . . . . .
3.1
Sequenties van de primers . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2
Temperatuursprotocol Roche 5xMM . . . . . . . . . .
B CD-ROM
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
73
73
74
74
75
75
75
75
76
76
76
76
77
77
78
79
79
79
80
Lijst van afkortingen
3C
Chromosome Conformation Capture
ANCORA
Altlas of Non-Coding Conserved Regions in Animals
array-CGH
Array Comparative Genomic Hybridization
ASS
Autisme spectrum stoornis
AZ
Aminozuur
CAT
Chloramfenicolacetyltransferase
ChIP
Chromatine immunoprecipitatie
chr
Chromosoom
CMGG
Centrum voor Medische Genetica van het UZ Gent
CNC
Conserved Non-Coding Sequence
CNE
Copy Number Evaluation
CQ
Quantitation Cycle
CT
Treshold Cycle
CZS
Centraal zenuwstelsel
DNA
Desoxyribonucleic Acid
ddNTP
Dideoxyribonucleotidetrifosfaat
dNTP
Deoxyribonucleotidetrifosfaat
DMSO
Dimethylsulfoxide
dsDNA
Double-stranded DNA
EB
Enhancer Blocking
ECR
Evolutionary Conserved Regions
i
EDTA
Ethyleendiaminetetraäzijnzuur
ESE
Exonic Splicing Enhancer
FAIRE
Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements
FISH
Fluorescente in-situ hybridisatie
HRM
High Resolution Melting
gDNA
Genomisch DNA
LCR
Locus Control Region
MADS
MCM1 Agamous Deficiens Serum response factor
MEF2
Myocyte Enhancer Factor 2
MRI
Magnetic Resonance Imaging
mRNA
Messenger RNA
NaAc
Natriumacetaat
NGS
Next Generation Sequencing
ORF
Open Reading Frame
PCR
Polymerase Chain Reaction
PolyPhen-2
Polymorphism Phenotyping v2
qPCR
Quantitative Polymerase Chain Reaction
RNA
Ribonucleic Acid
RNA-TRAP
RNA Tagging and Recovery of Associated Protein
rRNA
Ribosomaal RNA
SIFT
Sorting Intolerant From Tolerant
SNP
Single Nucleotide Polymorphism
ssDNA
Single-stranded DNA
Tm
Melt Temperature
tRNA
Transfer RNA
UTR
Untranslated Region
WGA
Whole Genome Amplification
ii
Lijst van figuren
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
Enkele veel voorkomende stabiele structurele chromosomale afwijkingen . . . .
Verschillende klassen van gekende regulatorische elementen. . . . . . . . . . . .
Verschillende modellen die enhancer -activiteit over lange afstand verklaren. . .
Verschillende mechanismen van verstoring van long-range controle van genexpresie.
Functionele analyses van de transcriptionele activiteit van regulatorische elementen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Schematische weergave van de alternatieve splice-varianten van MEF2C. . . . .
Reeds beschreven deleties en translocaties in de buurt van MEF2C. . . . . . . .
Reeds beschreven afwijkingen in de coderende sequentie van MEF2C. . . . . . .
15
16
17
17
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
Mate Pair Sequencing. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Meting met de NanoDrop® ND-1000. . . . . . . . . . . . .
Vergelijking tussen niet-verzadigende en verzadigende dyes.
HRM-smeltprofiel. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Normalisatie en grouping-analyse van HRM-smeltprofielen.
Voorbeeld van een elektroferogram. . . . . . . . . . . . . . .
DNA-amplificatiecurve van een qPCR-reactie. . . . . . . . .
Het amplificatieproces met GenomiPhi. . . . . . . . . . . .
.
.
.
.
.
.
.
.
23
24
31
31
32
34
37
39
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
47
48
48
49
49
3.9
Karyogram van de proband met translocatie tussen 3p en 5q. . . . . . . . . . .
Microscopische beelden van de FISH-analyse. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Circosplot van de proband van chromosoom 3 en 5. . . . . . . . . . . . . . . . .
Visualisatie van de Mate Pair Sequencing data in arrayCGHbase. . . . . . . . .
Exacte locaties (hg19) van de breukpunten van de translocatie in de proband. .
Elektroferogrammen van mutaties en bijhorende referentiesequenties in de coderende regio van MEF2C. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Locatie van de 14 geselecteerde kandidaat-regulatorische regio’s. . . . . . . . .
Elektroferogrammen van mutaties en bijhorende referentiesequenties in het element 789. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Resultaten van de copy number analyse met behulp van qbaseP LU S . . . . . . .
4.1
4.2
Clusters van mate pairs gelegen rond de breukpunten in arrayCGHbase. . . . .
Naar buiten en naar binnen gerichte reads. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
53
54
3.7
3.8
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
4
11
12
13
50
51
51
52
iii
4.3
Histogram van de oriëntatie van de reads van de Mate Pair Sequencing van
proband. (CMGG, 2011) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4 Interpretatie van Paired-end Mapping (PEM) data. . . . . . . . . . . . . . .
4.5 Fragmenten die de breukpunten in de proband overspannen. . . . . . . . . .
4.6 Visualisatie in arrayCGHbase van afwijkingen in de proband. . . . . . . . .
4.7 Samenvatting fijnmapping chromosoom 3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.8 Samenvatting fijnmapping chromosoom 5. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.9 Chemische structuren van asparaginezuur en asparagine. . . . . . . . . . . .
4.10 qPCR-expressie-analyse van de twee verschillende isovormen van MEF2C
verschillende humane weefsels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
de
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
in
. .
54
55
55
56
57
57
59
60
iv
Lijst van tabellen
1.1
Structurele afwijkingen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
FISH-probes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Baseposities van de clusters die gedeeltelijk op chromosoom 3 en 5 mappen.
Gevonden mutaties in de 5’UTR. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Gevonden heterozygote SNPs in intronen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Gevonden heterozygote SNPs in het element 789. . . . . . . . . . . . . . . .
4.1
Allelfrequenties van SNP rs3729703 (c.589+57A>C) in de cohorte patiënten en
de HapMap-CEU populatie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Allelfrequenties van SNP rs10514303 (c.590-95C>A) in de cohorte patiënten en
de HapMap-CEU populatie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Allelfrequenties van SNP rs6876988 (g.88673722G>T) in de cohorte patiënten
en de HapMap-CEU populatie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2
4.3
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
A.1 Sequenties van de primers gebruikt voor het fijnmappen van de translocatie in
de proband. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A.2 Sequenties en ampliconlengten van de primers gebruikt voor de HRM-analyse. .
A.3 Temperatuursprotocols en samenstelling van de reactiemengsels van de amplicons van de HRM-analyse en van het element 789. . . . . . . . . . . . . . . . .
A.4 Normalisatietemperaturen van de amplicons van de HRM-analyse. . . . . . . .
A.5 Sequenties van de CNCs en de referentiegenen voor de qPCR-analyse en van het
element 789. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
47
48
50
50
52
61
61
62
73
74
77
78
79
v
Samenvatting
Niet-coderende regio’s zijn sequenties die niet coderen voor eiwitten. Na het verschijnen van
de complete nucleotide-sequentie van het humane genoom in 2001 werd aanvankelijk gedacht
dat deze sequenties niet van belang waren, ze werden beschouwd als “junk DNA”. Naarmate
meer genetisch onderzoek verricht werd, zag men in dat deze regio’s wel degelijk belangrijke
functies vervullen. Een interessante aanwijzing hiertoe is dat bepaalde gebieden binnen deze
niet-coderende regio’s sterk geconserveerd blijken te zijn. Genetische afwijkingen in dergelijke
geconserveerde niet-coderende regio’s kunnen leiden tot een ziektebeeld, bijvoorbeeld als gevolg
van een verstoorde genexpressie.
Recent werd aangetoond dat haploı̈nsufficiëntie van MEF2C een Rett-like fenotype veroorzaakt. Bij een patiënt met dit fenotype werd in het Centrum voor Medische Genetica van
het UZ Gent een de novo translocatie gevonden, waarbij geen genen onderbroken zijn, maar
waarbij één van beide breukpunten stroomopwaarts van het MEF2C -gen gelegen is. Dit doet
vermoeden dat de expressie van MEF2C in deze proband verstoord wordt door de verplaatsing
van een of meerdere belangrijke regulatorische gebieden. Het doel van deze thesis bestond erin
om dergelijke regulatorische regio’s voor het MEF2C -gen te identificeren. Afwijkingen in deze
regio’s kunnen mogelijks leiden tot verstoorde MEF2C -transcriptie en het bijhorende Rett-like
fenotype.
Met behulp van Mate Pair Sequencing en daaropvolgende Sanger sequenering werden de breukpunten van de translocatie in de proband precies gelokaliseerd. Om regulatorische gebieden
stroomopwaarts van MEF2C te identificeren werd een copy number analyse van kandidaatregulatorische regio’s uitgevoerd bij een cohorte patiënten met Rett-like fenotypes. Geen van
de geselecteerde regio’s bleken bij de patiënten pathogene deleties of duplicaties te bevatten.
Tevens werd het Vista Enhancer element 789, een gevalideerd potentieel regulatorisch element,
voor alle patiënten gesequeneerd. In dit element werden twee mutaties gedetecteerd waarvan
de functionele effecten later onderzocht zullen worden. Om mutaties in het MEF2C -gen uit
te sluiten, werd er eveneens een mutatie-analyse uitgevoerd op deze cohorte. Hiermee werden
geen pathogene mutaties binnen de coderende sequentie van MEF2C gevonden.
qPCR bleek een goede techniek voor de analyse van copy numbers en de voordelen van het
gebruik van de HRM-technologie als pre-screenmethode voor mutatie-analyse werden bevestigd.
Bovendien werd Mate Pair Sequencing als techniek voor de detectie van genetische afwijkingen
gevalideerd.
vi
Abstract
Non-coding regions are sequences that do not encode proteins. After the publication of the
complete nucleotide-sequence of the human genome in 2001, these sequences were initially
thought to be of minor importance and were considered as “junk DNA”. As more genetic
research was conducted, one realised that those sequences do fulfill important functions. A
strong indication to this is the fact that some areas located within these non-coding regions
are strongly conserved. Genetic aberrations in these conserved non-coding regions may lead to
disease, for example as a result of a disrupted gene expression.
Recently it was shown that haploinsufficiency of MEF2C is the cause of a Rett-like phenotype.
In the Centre of Medical Genetics of the Universitary Hospital of Ghent a de novo translocation was found in a patient with this phenotype. This translocation does not interrupt any
gene, but one of both breakpoints is located upstream of the MEF2C gene. This leads one
to suspect that the expression of MEF2C is affected due to the displacement of one or more
regulatory regions. The purpose of this thesis was to identify such regulatory regions for the
MEF2C gene. Aberrations within these regions may cause MEF2C haploinsufficiency and the
accompanying Rett-like phenotype.
By means of Mate Pair Sequencing and subsequent Sanger sequencing the breakpoints of the
translocation in the proband were localised precisely. To identify regulatory regions, a copy
number analysis of candidate regions was performed on a cohort of patients with Rett-like phenotypes. None of the selected regions seemed to contain pathogenic deletions or duplications
in the patients. Besides that, the Vista Enhancer element 789, a validated potential regulatory
element, was sequenced for all patients. Within this element two mutations were detected from
which the functional effects will be investigated later on. A mutation analysis was conducted
on the cohort to exclude mutations in the MEF2C gene and revealed no pathogenic mutations
within the coding region.
qPCR turned out to be a good technique to analyse copy numbers, and the advantages of
the use of the HRM technology as a pre-screenmethod for mutation analysis were confirmed.
Furthermore, Mate Pair Sequencing was validated as a technique for the detection of genetic
aberrations.
vii
Résumé
Les régions non codantes sont les séquences du génome qui ne sont pas traduites en protéines.
Après la publication de la séquence nucléotidique complète du génome humain en 2001, ces
séquences n’étaient pas considérées comme étant importantes et elles étaient appelées improprement ADN poubelle (“junk DNA”). Au fur et à mesure que plus de recherches génétiques
se sont effectuées, on a compris que ces régions remplissent des fonctions importantes. Une
indication intéressante à ce sujet est le fait que certains domaines situés dans ces régions non
codantes soient fortement conservés. Des malformations génétiques dans ces régions conservées
non codantes peuvent causer une maladie, par exemple à cause de la dérégulation de l’expression
génétique.
Récemment on a démontré que l’haplo-insuffisance de MEF2C cause un phénotype ressemblant
à celui du syndrome de Rett. Au Centre de Génétique Médicale de l’hôpital universitaire de
Gand on a trouvé une translocation chez un patient avec ce phénotype. Cette translocation
n’interrompt pas de gènes, mais un point de cassure est localisé en amont du gène MEF2C.
Ceci laisse présager que l’expression de MEF2C est perturbée à cause du déplacement d’une ou
plusieurs régions régulatrices. Le but de cette thèse consistait à identifier ce genre de régions
régulatrices. Des malformations dans ces régions peuvent causer l’haplo-insuffisance de MEF2C
et le phénotype correspondant qui ressemble à celui du syndrome de Rett.
A l’aide du Mate Pair Sequencing et du séquençage Sanger consécutif, les points de cassures
de la translocation dans le proband ont été localisés précisément. Afin d’identifier des régions
régulatrices, une analyse de copy numbers de régions candidates a été effectuée pour une cohorte de patients avec des phénotypes ressemblant à celui du syndrome de Rett. Aucune des
régions selectionées contient des délétions ou des duplications pathogènes chez les patients. Le
séquençage de l’élément 789 du Vista Enhancer Browser, un élément validé potentiel regulateur, a également été accompli pour tous les patients. Dans cet élément deux mutations ont
été trouvées, dont les effets fonctionnels seront examinés plus tard. Pour exclure des mutations
dans le gène MEF2C, une analyse de mutations a été accomplie pour la cohorte. Les résultats
de cette analyse ne révèlent aucune mutation pathogène dans la séquence codante de MEF2C.
qPCR est ressorti comme bonne technique quant à l’analyse de copy numbers et les avantages
de l’usage de la technologie HRM comme methode pre-screen à l’analyse de mutations ont été
confirmés. En outre Mate Pair Sequencing a été validé comme technique pour la détection de
malformations génétiques.
viii
Inleiding en doelstelling
Dit project werd opgestart na de bevinding van een interessante de novo translocatie tussen
chromosoom (chr) 3 en 5 in een patiënt met een fenotype gelijkend aan datgene van het Rettsyndroom. Naar deze patiënt zal later verwezen worden als de proband. De translocatie werd
ontdekt met karyotypering en verder fijngemapt met behulp van fluorescente in-situ hybridisatie (FISH). Op chromosoom 3 ligt het breukpunt van deze translocatie 5’ van het RBMS3 gen,
een ribonucleı̈nezuur (RNA) bindend eiwit. Op chromosoom 5 ligt het breukpunt tussen de
genen MEF2C en CETN3. De proband vertoont met andere woorden een afwijkend fenotype
zonder dat coderende regio’s van genen bij de translocatie betrokken zijn.
Recent werd aangetoond dat deleties en mutaties van het MEF2C -gen geassocieerd zijn met
een verstandelijke beperking, stereotype bewegingen, epilepsie en/of cerebrale misvormingen
(OMIM #613443). Dit fenotyope is sterk gelijkend aan datgene van het Rett-syndroom en
wordt om die reden aangeduid als een Rett-like fenotype. Aangezien de proband een gelijkaardig fenotype heeft maar het MEF2C -gen intact is, wordt vermoed dat de verplaatsing van één
of meerdere regulatorische elementen in de regio stroomopwaarts van dit gen de oorzaak is van
de waargenomen symptomen. Dergelijke elementen zijn vaak geconserveerde niet-coderende
sequenties en kunnen de expressie van MEF2C beı̈nvloeden, wat kan resulteren in eenzelfde
fenotype dan dat van een gemuteerd gen.
Een cohorte van 330 patiënten met Rett-like fenotypes werd geselecteerd uit een pool van beschikbare DNA-stalen van het Centrum voor Medische Genetica van het UZ Gent (CMGG).
Dit zijn allemaal patiënten waarvan de oorzaak van hun fenotype onbekend is.
Het MEF2C -gen werd in deze cohorte onderzocht door allereerst een mutatie-analyse uit te
voeren aan de hand van de High Resolution Melting (HRM) technologie, gevolgd door sequenering, om mutaties in de coderende sequentie van het gen op te sporen. Het element 789 van de
Vista Enhancer Browser werd voor alle patiënten gesequeneerd en onderzocht op de aanwezigheid van mutaties en indels. Verder werd een analyse gemaakt aan de hand van kwantitatieve
PCR (qPCR) van mogelijke deleties en duplicaties in veertien kandidaat-regulatorische regio’s
die geselecteerd werden op basis van conservatie tussen verscheidene species. Tevens werd er
een Mate Pair Library van de proband gemaakt en vervolgens met behulp van Next Generation
Sequencing (NGS) gesequeneerd om de breukpunten van de translocatie preciezer te lokaliseren.
ix
1
Literatuurstudie
1
Genomische afwijkingen
Het humane genoom is een dynamisch gegeven dat onderhevig is aan tal van genetische modificaties (Strachan and Read, 2004). Dergelijke afwijkingen kunnen erg schadelijk zijn voor een
organisme of cel. Zo kan een verandering in een gen tot gevolg hebben dat alle kopiëen van
gecodeerde proteı̈nen aangetast zijn. Hierdoor kan de structuur van genproducten wijzigen of
de eiwitexpressie verlaagd of zelfs stopgezet worden. (Lodish et al., 2000) Rechtstreeks kan
dit leiden tot ziekte, en onrechtstreeks kan de vatbaarheid voor een bepaalde ziekte hierdoor
verhogen. Genomische herschikkingen zijn daarnaast ook de oorzaak van genetische diversiteit
en evolutie. (Strachan and Read, 2004)
De oorsprong van genomische afwijkingen is tweeërlei. In bepaalde gevallen worden ze overgeërfd
van een van beide ouders en in andere gevallen ontstaan ze in het individu zelf en komen ze
niet bij de ouders voor (de novo afwijkingen).
Constitutionele afwijkingen zijn aanwezig in elke cel, wat erop wijst dat de modificatie zeer
vroeg in de embryonale ontwikkeling heeft plaatsgevonden of werd overgeërfd. Ze worden
meestal veroorzaakt door abnormale ei- of zaadcellen en in mindere mate door problemen tijdens de bevruchting of fouten tijdens de eerste ontwikkelingsfasen van het embryo. Somatische
mutaties komen slechts voor in enkele cellen of weefsels en ontstaan later in de ontwikkeling.
(Strachan and Read, 2004)
In volgende onderdelen worden chromosomale afwijkingen en genafwijkingen meer in detail
behandeld. Ook wordt er dieper ingegaan op de verschillende functionele effecten die met
genomische afwijkingen gepaard gaan.
1
Literatuurstudie
1.1
1. Genomische afwijkingen
Chromosomale afwijkingen
Chromosomale afwijkingen zijn veranderingen in het decarboxyribonucleı̈nezuur (DNA) die veroorzaakt worden door specifieke chromosomale mechanismen. Met standaard cytogenetische
methoden kunnen inserties en deleties met een resolutie van 5 à 10Mb gedetecteerd worden.
Met FISH kan men specifieke loci bestuderen en met de komst van array Comparative Genomic
Hybridization (arrayCGH) kunnen genoomwijd ongebalanceerde afwijkingen met een hele hoge
resolutie gedetecteerd worden. Deze nieuwe technieken hebben de detectielimiet dus drastisch
verkleind, waardoor het onderscheid tussen de chromosomale afwijkingen en de genafwijkingen (die niet zichtbaar zijn met standaard cytogenetische methoden) vervaagt. (Strachan and
Read, 2004)
De frequentie van voorkomen van chromosomale afwijkingen bedraagt ongeveer 1% voor zaadcellen en 5% voor eicellen. 10 tot 20% van de bevruchtingen bevatten dergelijke afwijkingen.
Vele ervan zijn echter niet leefbaar, waardoor minstens 95% van deze bevruchtingen aanleiding
geven tot spontane miskramen. Chromosomale afwijkingen zijn verantwoordelijk voor de helft
van dit type miskramen. Van de zwangerschappen die wel uitgedragen worden, vertoont zo’n
1 op 150 individuen een cytogenetische afwijking. Vaak resulteert dit in een mentale en/of
fysieke handicap. (Jorde et al., 2010)
Chromosomale afwijkingen kunnen voornamelijk onderverdeeld worden in numerieke en structurele afwijkingen.
1.1.1 Numerieke afwijkingen
Numerieke afwijkingen zijn deze waarbij het aantal chromosomen verschilt van de normale
situatie. Het zijn dus afwijkingen die te maken hebben met het verlies of de winst van volledige
chromosomen. (Strachan and Read, 2004)
Aneuploı̈die is het tegenovergestelde van euploı̈die, wat de situatie omschrijft waarbij het aantal chromosomen gelijk is aan een veelvoud van het haploı̈d chromosomenaantal (n). Bij
de mens bevat een volledige chromosoomset 23 chromosomen, waarvan 21 autosomale en
2 geslachtschromosomen.
In geval van aneuploı̈die ontbreken er één of meer chromosomen of zijn er extra kopieën
aanwezig. Hierbij is het aantal chromosomen dus niet gelijk aan een exact veelvoud van
n. Trisomie betekent dat er drie kopieën zijn van een bepaald chromosoom en is meestal
niet levensvatbaar. Monosomie staat voor de aanwezigheid van slechts één kopie van een
bepaald chromosoom en is steeds letaal, behalve in geval van monosomie X. (Strachan
and Read, 2004)
2
Literatuurstudie
1. Genomische afwijkingen
Polyploı̈die (>2n) wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van meer dan twee volledige chromosomensets. In de normale situatie zijn er twee volledige sets aanwezig en zijn de cellen
diploı̈d. Constitutieve polyploı̈die is zeldzaam en letaal, al hebben de meeste mensen
enkele polyploı̈de cellen.
Triploı̈die (3n) komt voor bij 1 tot 3% van de zwangerschappen. In de meeste gevallen
wordt dit veroorzaakt door dispermie, bevruchting van één eicel met twee zaadcellen,
en soms gebeurt dit door bevruchting van een diploı̈de eicel met een normale zaadcel.
Aangezien triploı̈die niet leefbaar is, sterven de meeste foetussen voor het einde van de
zwangerschap. Tetraploı̈die (4n) is nog zeldzamer en eveneens letaal. Dergelijke cellen
ontstaan hierbij waarschijnlijk door de mislukking van de eerste zygotische deling. (Strachan and Read, 2004)
Mixoploı̈die betekent dat twee of meer verschillende cellijnen binnen hetzelfde individu voorkomen. Wanneer genetisch verschillende celpopulaties van eenzelfde zygote afkomstig
zijn, spreekt men van mozaı̈cisme. In het zeldzamere geval dat ze van verschillende zygoten afkomstig zijn, gaat het over chimeren. Bepaalde constitutief letale afwijkingen
(aneuploı̈die en polyploı̈die) kunnen leefbaar zijn in mozaı̈sche individuen. (Strachan and
Read, 2004)
1.1.2 Structurele afwijkingen
Structurele afwijkingen zijn afwijkingen in de structuur van chromosomen. Ze worden veroorzaakt door breuken in het DNA die ontstaan tengevolge van bijvoorbeeld straling of chemische
stoffen, of als onderdeel van het recombinatieproces (Strachan and Read, 2004). Dit type afwijkingen komt minder vaak voor dan numerieke afwijkingen, ongeveer bij 1 op 135 baby’s.
(Nussbaum et al., 2007)
Chromatidebreuken zijn breuken die zich tijdens de G2-fase van de celcyclus voordoen en die
maar één van beide zusterchromatiden aantasten. Chromosoombreuken daarentegen zijn breuken die zich in de G1-fase voordoen en die beide chromatiden aantasten. Cellen kunnen de
breuken herstellen door de twee uiteinden te verbinden of door een telomeer aan een uiteinde
toe te voegen. Controlemechanismen van de celcyclus verhinderen cellen die gebroken chromosomen bevatten waarbij geen herstel uitgevoerd is om in mitose gaan. Als de schade werkelijk
onherstelbaar is, zal de cel apoptose ondergaan. (Strachan and Read, 2004)
Structurele afwijkingen ontstaan wanneer breuken foutief hersteld worden. Indien er geen
gebroken vrije uiteinden meer aanwezig zijn in cellen, raken deze wel voorbij de controlemechanismen van de celcyclus. Indien door het herstel acentrische (zonder centromeer) of dicentrische
(twee centromeren) chromosomen ontstaan, zullen deze verloren gaan aangezien ze niet stabiel
kunnen segregeren. Robertsoniaanse translocaties (zie verder) zijn een uitzondering hierop
aangezien ze in se dicentrisch zijn, maar wel stabiel segregeren. (Strachan and Read, 2004)
3
1. Genomische afwijkingen
Literatuurstudie
Figuur 1.1 illustreert de belangrijkste stabiele structurele afwijkingen.
Figuur 1.1: Enkele veel voorkomende stabiele structurele chromosomale afwijkingen.
(Buysse, 2009)
Onderstaande tabel vat de belangrijkste stabiele structurele afwijkingen samen.
Tabel 1.1: Structurele afwijkingen veroorzaakt door foutief herstel van chromosoombreuken of recombinatie tussen homologe chromosomen. (Strachan and
Read, 2004)
Eén chromosoom
Twee chromosomen
Eén breuk
Terminale deletie
Twee breuken
Interstitiële deletie
Ringchromosoom
Duplicatie door ongelijke
zusterchromatide overkruising
Deletie door ongelijke
zusterchromatide overkruising
Isochromosoom
Paracentrische inversie
Pericentrische inversie
Reciproke translocatie
Robertsoniaanse translocatie
Duplicatie door ongelijke
recombinatie
Deletie door ongelijke
recombinatie
Drie breuken
Verschillende herschikkingen
bv.: inversie met deletie,
intrachromosomale insertie
Interchromosomale insertie
(direct of indirect)
4
Literatuurstudie
1. Genomische afwijkingen
Structurele chromosomale afwijkingen kunnen gebalanceerd of ongebalanceerd zijn. Men spreekt
van een gebalanceerde afwijking wanneer er geen netto winst of verlies van chromosomaal materiaal is. Indien dit wel het geval is, heeft men te maken met een ongebalanceerde afwijking.
Gebalanceerde afwijkingen zoals inversies of gebalanceerde translocaties resulteren meestal niet
in afwijkende fenotypes aangezien al het chromosomaal materiaal behouden blijft. Wanneer
een breukpunt een gen onderbreekt of de expressie ervan verstoort, kan het fenotype echter
wel afwijken. Zo kan de genexpressie verstoord worden wanneer het gen in heterochromatine
terechtkomt of fysisch van zijn regulatorische regio(’s) afgescheiden wordt. Verder zorgen gebalanceerde translocaties in het X-chromosoom ook voor problemen in verband met X-inactivatie.
(Strachan and Read, 2004)
Situering thesis
De proband heeft een translocatie met breukpunt in de regio stroomopwaarts van het
MEF2C -gen en vertoont een fenotype gelijkaardig aan datgene van patiënten waarbij
MEF2C zelf gedeleteerd of gemuteerd is (5q14.3 microdeletiesyndroom) (Cardoso et al.,
2009; Engels et al., 2009; Le Meur et al., 2010; Novara et al., 2010; Nowakowska et al.,
2010; Zweier et al., 2010). Dit doet vermoeden dat er een positie-effect is op MEF2C
waarbij door de translocatie een belangrijke regulatorische regio van het gen verwijderd
wordt, waardoor de expressie van MEF2C verstoord wordt.
Robertsoniaanse translocaties worden als genetisch gebalanceerd beschouwd omdat het enige
chromosomale materiaal dat verdwijnt, repetitieve ribosomale RNA (rRNA) genen zijn. De
distale fragmenten van de p-armen van acrocentrische chromosomen die bij deze translocaties
betrokken zijn, bevatten namelijk enkel dergelijke sequenties. (Strachan and Read, 2004)
Ongebalanceerde structurele afwijkingen kunnen van directe of indirecte aard zijn. Directe
afwijkingen worden meestal door deleties veroorzaakt. Wanneer chromosomen foutief segregeren in dragers van gebalanceerde afwijkingen, worden ongebalanceerde afwijkingen op een
indirecte manier gevormd. Afhankelijk van het type afwijking ligt het risico op dit laatste
fenomeen tussen 1 en 20%. (Strachan and Read, 2004; Nussbaum et al., 2007)
1.2
Microdeletie- en microduplicatiesyndromen
Microdeletie- en microduplicatiesyndromen vullen de ruimte op tussen de chromosomale afwijkingen en de genafwijkingen. Als in het humane genoom van 3000Mb ongeveer 1Mb gedeleteerd
wordt, wat microscopisch niet detecteerbaar is, kunnen hierbij nog steeds een tiental genen betrokken zijn. Hierbij zullen enkel die genen die onderhevig zijn aan een dosage-effect bijdragen
aan het fenotype. Verder geldt dat hoe meer dosage-gevoelige genen betrokken zijn, hoe meer
symptomen met het syndroom gepaard gaan. De identificatie van welke genen juist verantwoordelijk zijn voor welke aspecten van het fenotype is bij deze syndromen vaak een grote uitdaging.
Met behulp van arrayCGH worden tegenwoordig meer en meer dergelijke submicroscopische
afwijkingen gedetecteerd. (Strachan and Read, 2004)
5
Literatuurstudie
1. Genomische afwijkingen
Situering thesis
Het 5q14.3 microdeletiesyndroom is sinds juni 2010 gerapporteerd in de OMIM-database
(OMIM #613443) en gaat gepaard met een verstandelijke beperking, stereotype bewegingen, epilepsie en/of cerebrale afwijkingen. Dit syndroom wordt veroorzaakt door heterozygote mutaties in het MEF2C -gen of door deleties in de 5q14.3 regio. Dergelijk fenotype
komt waarschijnlijk tot stand door haploı̈nsufficiëntie van het MEF2C -gen, wat inhoudt
dat één juiste kopie van het gen niet volstaat om normaal te functioneren. Tot nu toe werden er twintig patiënten gerapporteerd met een dergelijke genetische afwijking (Cardoso
et al., 2009; Engels et al., 2009; Le Meur et al., 2010; Novara et al., 2010; Nowakowska et al.,
2010; Zweier et al., 2010). De kleinst geobserveerde deletie bevat enkel het MEF2C -gen.
1.3
Genafwijkingen
1.3.1 Basepaarsubstituties
Basepaarsubstituties worden gedefiniëerd als de vervanging van een nucleotide door een ander
nucleotide. Wanneer het type nucleotide (purine of pyrimidine) behouden blijft, spreekt men
van transities en wanneer het wijzigt gaat het om transversies. Basepaarsubstituties worden in
verschillende groepen ingedeeld naargelang hun effect op eiwit-niveau. (Nussbaum et al., 2007)
Synonieme (stille) mutaties zijn mutaties die resulteren in een nieuw codon dat codeert voor
hetzelfde aminozuur (AZ). Dankzij de specifieke opbouw van de genetische code treedt
er dus geen aminozuurverandering op. Deze mutaties komen het meest frequent voor op
de derde codonpositie, de Wobble-base, aangezien antidocodons van dezelfde aminozuren
vaak enkel op deze positie verschillen. (Strachan and Read, 2004; Nussbaum et al., 2007)
Missense mutaties zijn mutaties waarbij één aminozuur verandert, het zijn met andere woorden aminozuursubstituties. Conservatieve mutaties zijn deze waarbij de chemische eigenschappen van het originele en het mutante aminozuur sterk gelijkend zijn. Bij nietconservatieve mutaties verschillen deze eigenschappen wel sterk en is het effect van de
mutatie ingrijpender. (Strachan and Read, 2004; Nussbaum et al., 2007)
Situering thesis
Zweier et al. (2010) rapporteerde twee patiënten met missense mutaties in MEF2C.
Bij één patiënt was op positie 27 alanine aanwezig in plaats van glycine door een
mutatie van G naar C op de middelste positie van het codon. Bij een tweede patiënt
werd op positie 38 glycine geobserveerd in plaats van leucine door een mutatie van T
naar A eveneens op de middelste positie van het codon. (zie paragraaf 3.1 p.17)
6
Literatuurstudie
1. Genomische afwijkingen
Nonsense mutaties zijn mutaties waarbij een coderend codon wordt vervangen door een stopcodon. Dergelijke mutaties zijn zeer zeldzaam omdat ze gepaard gaan met een drastisch
verlies aan genfunctie. (Strachan and Read, 2004; Nussbaum et al., 2007)
Situering thesis
Le Meur et al. (2010) rapporteerde één patiënt waarbij serine op positie 228 van
MEF2C vervangen werd door een stopcodon door een mutatie van C naar G op de
middelste positie van het codon. (zie paragraaf 3.1 p.17)
Splice site mutaties zijn mutaties die een afwijkende vorm van RNA-splicing veroorzaken die
pathogeen is. Dergelijke mutaties kunnen leiden tot intronretentie wanneer het splicingmechanisme volledig defect is. Dit komt voor als het intron klein is en als de naburige
sequenties geen alternatieve splice sites bevatten. Exon skipping komt voor wanneer
het splicing-mechanisme splice sites van niet-aangrenzende exonen gebruikt. Ten slotte
komen er ook mutaties voor die cryptische splice sites activeren door de sequentie zo te
wijzigen dat die lijkt op de consensus splicedonor- of spliceacceptorsequentie. (Strachan
and Read, 2004; Nussbaum et al., 2007)
1.3.2 Deleties en inserties (InDels)
Deleties en inserties zijn respectievelijk het verlies en de aanwinst van nucleotiden. Een duplicatie is een insertie waarbij een stuk DNA verdubbeld wordt. (Nussbaum et al., 2007)
Wanneer een veelvoud van drie nucleotiden ingebouwd wordt of verloren gaat, is de mutatie
in frame. Dit betekent dat er geen verschuiving van het leesraam (open reading frame (ORF))
optreedt. In frame inserties zijn meestal niet pathogeen, tenzij ze resulteren in een vernietiging
van de structuur of functie van het genproduct. In frame deleties daarentegen zijn meestal wel
pathogeen. (Strachan and Read, 2004)
Frameshift mutaties zijn mutaties waarbij het aantal betrokken nucleotiden geen veelvoud is
van drie, wat wel een verschuiving van het ORF veroorzaakt. Bijgevolg worden volledig andere
aminozuren in het proteı̈ne ingebouwd vooraleer er een (vaak vroegtijdig) stopcodon aangetroffen wordt. (Lodish et al., 2000)
Situering thesis
Le Meur et al. (2010) rapporteerde twee patiënten met frame shift mutaties. In de eerste
werd een T op positie 99 gedupliceerd, wat aanleiding gaf tot een stopcodon. In de tweede
patiënt werd een deletie van 11 nucleotiden geobserveerd, van positie 226 tot en met 236.
Op positie 76 in het genproduct is histidine vervangen door aspartaat en ontstaat er 15
codons verder een stopcodon. (zie paragraaf 3.1 p.17)
7
Literatuurstudie
1. Genomische afwijkingen
1.3.3 Repeat expansies
Op vele plaatsen in het menselijke genoom komen tandem repeats voor, dit zijn reeksen van
dezelfde nucleotiden die naast elkaar gelegen zijn. De lengte van deze repeats kan sterk variëren.
Repeat sequenties die voorkomen in niet-coderende regio’s zoals de promotor, niet-vertaalde regio’s (untranslated regions (UTR)) en intronen kunnen grote expansies ondergaan. Dergelijke
expansies kunnen de expressie van nabijgelegen genen verhinderen, waardoor de functies van
de genproducten verloren kunnen gaan. (Strachan and Read, 2004)
Stabiele niet-pathogene repeats bevatten meestal vijf tot vijftig eenheden. Wanneer dit aantal
verhoogt tot honderden of soms zelfs duizenden worden ze onstabiel en pathogeen. In bepaalde
gevallen zijn zeer grote repeats toch niet pathogeen, maar beı̈nvloeden ze de chromosoomstructuur met de vorming van fragiele plaatsen als gevolg. Onstabiele repeats zijn ook onstabiel in
mitose en meiose, wat betekent dat ouder en kind steeds een verschillend aantal eenheden in
de repeat zal hebben. Hoogstwaarschijnlijk wordt het expansiemechanisme veroorzaakt door
slipped strand mispairing. (Strachan and Read, 2004)
1.4
Functionele effecten van genomische afwijkingen
Het effect van genomische afwijkingen hangt sterk af van de plaats waar ze voorkomen. Zo
kunnen afwijkingen in promotorregio’s leiden tot problemen bij de transcriptie, afwijkingen in
exonen tot problemen bij de translatie en afwijkingen in intronen tot problemen bij de splicing.
De functionele effecten van genomische afwijkingen kunnen in twee grote groepen onderverdeeld
worden. Wanneer het pathologische effect gelijkenissen vertoont met wat geobserveerd wordt
bij deleties kan men ervan uitgaan dat het gaat om een verlies van functie. Wanneer echter
enkel heel specifieke afwijkingen tot een bepaald ziektebeeld leiden, zal het meestal gaan om
een winst aan functie. (Strachan and Read, 2004)
1.4.1 Verlies van functie
Afwijkingen die gepaard gaan met het verlies van een bepaalde functie worden vaak opgemerkt
bij recessieve ziektes. Heterozygote afwijkingen resulteren in deze gevallen namelijk in het
verlies van 50% van het genproduct, waarbij de overblijvende 50% meestal voldoende is om de
normale functie uit te voeren. Met andere woorden zullen enkel homozygoten aangetast zijn
omdat in deze gevallen geen normale functie meer uitgevoerd kan worden. (Jorde et al., 2010)
Bij haploı̈nsufficiëntie zal 50% verlies van functie wel resulteren in abnormale fenotypes omdat
de helft aan genproduct niet volstaat om de functie uit te voeren. Hierbij zal de afwijking
dominant overgeërfd worden. (Strachan and Read, 2004)
8
Literatuurstudie
2. Long-range controle van genexpressie
Situering thesis
Le Meur et al. (2010) concludeerde dat haploı̈nsufficiëntie van het MEF2C -gen aan de
oorzaak ligt van ernstige verstandelijke beperkingen met stereotype bewegingen, epilepsie
en/of cerebrale misvormingen.
Bij heterozygoten leiden dominant negatieve afwijkingen tot niet-functionele genproducten die
de functie van de genproducten van het onaangetaste allel zullen inhiberen. Hierbij zal de
functie van het gen dus volledig uitgeschakeld worden. (Strachan and Read, 2004)
1.4.2 Winst aan functie
Afwijkingen die gepaard gaan met de winst van een bepaalde functie resulteren af en toe
in de vorming van een compleet nieuw genproduct. In de meeste gevallen zullen ze echter
leiden tot overexpressie of expressie in het foutieve weefsel of ontwikkelingsstadium. Dergelijke
afwijkingen zijn geassocieerd met dominante ziektebeelden aangezien de aanwezigheid van een
normaal allel het effect van het mutante allel niet teniet kan doen. (Strachan and Read, 2004;
Jorde et al., 2010)
2
Long-range controle van genexpressie
Correcte kwantitatieve genexpressie tijdens het juiste ontwikkelingsstadium en in het juiste
weefsel vereist de aanwezigheid van een intacte coderende sequentie en van een goed functionerende regulatorische controle. Wanneer één of meerdere van deze voorwaarden niet vervuld
zijn, kan een genetische ziekte optreden. (Kleinjan and Coutinho, 2009)
Mutaties in exonen, intronen en/of de promotorregio van een ziektegen kunnen leiden tot een
genetische ziekte. Afwijkingen in regio’s binnen een afstand van meer dan 1Mb (Benko et al.,
2009) van het ziektegen kunnen eveneens bijdragen tot een ziektebeeld aangezien ze de longrange controle van genexpressie kunnen verstoren. Dit kan optreden wanneer cis-regulatorische
elementen door de afwijking te ver van het ziektegen terechtkomen of wanneer de chromatinestructuur wijzigt. (Kleinjan and Coutinho, 2009)
Regulatorische afwijkingen zijn hoogstwaarschijnlijk betrokken bij ziekte indien één of meerdere van volgende voorwaarden vervuld zijn: (1) er is genetisch bewijs dat een fenotype linkt
aan een gekende ziektelocus, (2) een identificeerbare genomische afwijking flankeert een gekend
ziektegen, (3) het resulterende fenotype lijkt sterk op datgene van mutaties binnen het ziektegen zelf en (4) de afwijking is verantwoordelijk voor het volledige of een significant aandeel
van het ziekterisico. (Noonan and McCallion, 2011)
9
Literatuurstudie
2. Long-range controle van genexpressie
Situering thesis
In de proband werden geen mutaties in het vermoedelijke ziektegen, MEF2C, gevonden.
Door de translocatie met breukpunt op een afstand van minder dan 0,5Mb zou er echter
wel een verstoring kunnen zijn van de long-range controle van de genexpressie van MEF2C,
wat op zijn beurt de oorzaak zou kunnen zijn van het geobserveerde fenotype. De kans
hiervoor is reëel aangezien aan meerdere van voorgaande voorwaarden voldaan is.
In volgende paragrafen zal dieper ingegaan worden op de long-range controle van genexpressie. Zo zullen de verschillende types regulatorische elementen besproken worden, alsook de
mechanismen waarmee genexpressie op lange afstand gecontroleerd wordt. Verder zullen de
verschillende processen overlopen worden waardoor deze controle verstoord kan worden. Om
af te sluiten worden een enkele onderzoeksstrategiën aangehaald om regulatorische elementen
op te sporen en de functie ervan te achterhalen.
2.1
Belang van long-range controle van genexpressie
Het belang van long-range controle van genexpressie hangt samen met de nood aan exacte
regulatie van een bepaald gen. Huishoudgenen komen bijvoorbeeld tot expressie in alle cellen
en staan daarvoor enkel onder controle van de proximale promotor. Weefselspecifieke genen
worden bijkomstig gereguleerd door één of meer enhancers, specifiek voor de bepaalde weefsels
waarin ze tot expressie komen. Ze kunnen eveneens rechtstreeks onder controle staan van een
weefselspecifieke promotor. Ten slotte is de controle van de genexpressie van ontwikkelingsregulerende genen de meest strenge. Meerdere enhancers zorgen er in deze gevallen voor dat de
correcte hoeveelheid genproduct in de juiste weefsels tijdens welbepaalde ontwikkelingsstadia
aanwezig is. (Kleinjan and van Heyningen, 2005)
2.2
Regulatorische elementen
Figuur 1.2 geeft een overzicht weer van de gekende regulatorische elementen die een rol spelen
in de controle van genexpressie. De proximale promotor (zie figuur 1.2a) is een verzamelpunt
voor het basale transcriptie-apparaat en bepaalt de richting en oorsprong van de transcriptie.
De promotor wordt beı̈nvloed door de verschillende long-range regulatorische elementen, maar
oefent er zelf geen actieve rol op uit. (Maston et al., 2006)
10
Literatuurstudie
2. Long-range controle van genexpressie
Figuur 1.2: Verschillende klassen van gekende regulatorische elementen. (Noonan
and McCallion, 2011)
2.2.1 Enhancers en repressors
Enhancers (zie figuur 1.2b) zijn elementen die een positief effect hebben op de transcriptie
door interactie met de promotor. Evenzo zijn repressors (zie figuur 1.2c) elementen die de
transcriptie negatief beı̈nvloeden. Het effect van deze elementen is onafhankelijk van hun
positie en richting, en kunnen dichtbij of veraf van de promotor gelegen zijn. (Noonan and
McCallion, 2011)
2.2.2 Insulators
Insulators zorgen ervoor dat de transcriptionele integriteit van aangrenzende genen behouden
blijft door discrete regulatorische domeinen af te bakenen. Dit effect is in tegenstelling tot
datgene van de enhancers en repressors wel positie-afhankelijk. De functie van insulators is
tweeërlei. Zo kunnen ze enhancers blokkeren (Enhancer Blocking (EB)) (zie figuur 1.2d) en/of
als barriëre fungeren (zie figuur 1.2e). Het blokkeren van enhancers gebeurt door het activerende effect van de enhancer te inhiberen. In het geval dat de insulator fungeert als barriëre
zal het de uitbreiding van chromatinecondensatie voorkomen opdat andere regulatorische elementen onaangetast blijven. (Noonan and McCallion, 2011)
11
Literatuurstudie
2. Long-range controle van genexpressie
2.2.3 Locus Control Regions
Regulatorische sequenties kunnen individueel of geclusterd in een functionele regio voorkomen,
de locus control region (LCR). Een LCR is een actieve regio die hoge genexpressie mogelijk
maakt door (1) het openen van chromatinedomeinen, (2) het beschermen tegen de negatieve effecten van omliggend negatief of positief chromatine, (3) het uitoefenen van een cellijnspecifieke
enhancer -activiteit en (4) het beı̈nvloeden van de timing en de oorsprong van DNA-replicatie.
(Li et al., 1999, 2002)
2.3
Mechanismen van long-range controle van genexpressie
Figuur 1.3 stelt vier verschillende hypotheses voor met betrekking tot de wijze waarop regulatorische elementen op lange afstand een effect kunnen uitoefenen op de promotor van een gen
(zwarte rechthoek).
Figuur 1.3: Verschillende modellen die enhancer-activiteit over lange afstand verklaren. (Li et al., 2006)
In het looping model wordt verondersteld dat de enhancer op korte afstand van de promotor terecht komt door directe interactie tussen enhancer -gebonden eiwitten (rode cirkels) en
promotor-gebonden eiwitten (blauwe cirkels). Hierbij zal het tussenliggende DNA een lus vormen en niet in het activatieproces betrokken zijn.
In het tracking en het linking model wordt verondersteld dat de enhancer fungeert als een regio
waarop eiwitten kunnen binden. In het tracking model zullen deze eiwitten op zoek gaan naar
de promotor, waarbij ze de enhancer achterlaten. In het linking model zullen deze eiwitten de
polymerisatie van verbindingseiwitten (groene cirkels) naar de promotor toe vergemakkelijken,
waardoor promotor en enhancer verbonden worden via een eiwitketen.
In het facilitated tracking model zal een complex bestaande uit de enhancer en RNA-polymerase II
het tussenliggende DNA aftasten en kleine polygeadenyleerde intergenische RNA-moleculen
produceren om uiteindelijk met de promotor te binden. (D’haene, 2009)
12
Literatuurstudie
2.4
2. Long-range controle van genexpressie
Verstoring van long-range controle van genexpressie
Transcriptie is een erg complex proces dat door verschillende mechanismen verstoord kan worden. Elk van deze mechanismen kan aanleiding geven tot verschillende fenotypes. In figuur
1.4 worden de verschillende mechanismen weergegeven die tot nu toe bij genetische ziektes
geobserveerd zijn. (Kleinjan and Coutinho, 2009)
Figuur 1.4: Schematische voorstelling van de verschillende mechanismen van verstoring van long-range controle van genexpresie, die kunnen leiden tot
een genetische ziekte.(Kleinjan and Coutinho, 2009)
Verstoring van de long-range controle van genexpressie kan gebeuren door (1) de deletie van
een long-range cis-element, (2) de afscheiding van cis-regulatorische elementen van de promotor door translocaties of inversies, (3) schadelijke mutaties in cis-elementen, (4) de verstoring
van de normale interactie tussen de promotor en cis-werkende enhancers door de opkomst van
een nieuwe promotor, (5) de wijziging van de lokale chromatinestructuur door interferentie
met afwijkende read-through transcripten, (6) de verstoring van de regionale chromatinestructuur, (7) de duplicatie van een cis-regulatorische regio en (8) de verwerving van ongepaste
weefselspecifieke stroomopwaartse promotors of enhancers. (Kleinjan and Coutinho, 2009)
13
Literatuurstudie
2.5
2. Long-range controle van genexpressie
Onderzoeksstrategieën
Regulatorische elementen kunnen via in-silico analyses geı̈dentificeerd worden. Deze methoden
zijn gebaseerd op het feit dat de sequenties van dergelijke elementen vaak een hoge conservatie
binnen verschillende soorten vertonen. Conserved Non-Coding Sequences (CNCs) kunnen een
structurele rol spelen, alternatieve splicing reguleren, niet-coderend RNA produceren, betrokken zijn bij de pakking van chromatine, fungeren als cis- of trans-regulatorische elementen
enzovoort. (Dermitzakis et al., 2005)
Om uit deze CNCs cis-regulatorische elementen te onderscheiden, kan men gebruik maken van
bio-informatica filters of van experimentele analyses. DNase I hypersensitiviteitsmapping is
een vaak gebruikte techniek die regio’s identificeert met een hoge gevoeligheid voor enzymatische digestie door DNase I. Cis-regulatorische elementen vertonen een dergelijke hoge gevoeligheid aangezien ze gelegen zijn in euchromatine regio’s die toegankelijk zijn voor DNase I.
(Follows et al., 2006) Alternatieve methoden zijn chromatine immunoprecipitatie (ChIP) en
Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements (FAIRE). (D’haene, 2009)
Nadat mogelijke cis-regulatorische elementen geı̈dentificeerd zijn, kan het regulatorisch potentieel ervan experimenteel nagegaan worden. Reportergenanalyses worden hiervoor vaak gebruikt.
Figuur 1.5 geeft een overzicht weer van de verschillende mogelijkheden bij dit type testen. Als
reportergen worden meestal chloramfenicolacetyltransferase (CAT), green fluorescent protein
(GFP), luciferase (luc) of β-galactosidase (lacZ ) gebruikt. Dit type analyses kan in vitro in
celculturen of in vivo in bijvoorbeeld zebravis- of muisembryo’s uitgevoerd worden.
RNA Tagging and Recovery of Associated Protein (RNA-TRAP) en methoden gebaseerd op
Chromosome Conformation Capture (3C) zijn relatief nieuwe technieken die de interactie tussen veraf gelegen sequenties kunnen detecteren. (D’haene, 2009)
Situering thesis
Voor het onderzoek naar regulatorische regio’s werd in deze thesis gebruik gemaakt van
verschillende in-silico analysemethoden om CNCs te identificeren. De activiteit van de
geselecteerde CNCs zal in een later stadium nagegaan worden aan de hand van luciferaseexperimenten.
14
Literatuurstudie
3. Het MEF2C-gen
Figuur 1.5: Functionele analyses om de transcriptionele activiteit van regulatorische
elementen na te gaan. Het te testen genomische segment is telkens
aangegeven in het lichtblauw, de minimale protomor in het donkerblauw,
de transcriptie-startplaats in het grijs en het reportergen in het zwart.
(Maston et al., 2006)
3
Het MEF2C-gen
MEF2C behoort tot de Myocyte Enhancer Factor 2 (MEF2) subfamilie van de MCM1 Agamous Deficiens Serum response factor (MADS) genfamilie (Leifer et al., 1993; Martin et al.,
1993). MEF2-factoren activeren de expressie van spierspecifieke genen door als homo- of heterodimeer aan AT-rijke controlesequenties van deze genen te binden (Molkentin et al., 1996).
MEF2C heeft verschillende splice-varianten en het voornaamste transcript bestaat uit elf exonen, waarvan enkel de laatste tien coderend zijn. In figuur 1.6 wordt isovorm 1 van 473AZ met
de coderende exonen en domeinen voorgesteld. Deze isovorm bevat exon 4α1. Isovorm 2 bevat
exon 4α2, mist het β-domein dat gecodeerd wordt door exon 8 en is 463AZ lang. (Ensembl,
2011; UniProtKB/Swiss-Prot, 2011)
15
Literatuurstudie
3. Het MEF2C-gen
Figuur 1.6: Schematische weergave van de alternatieve splice-varianten van
MEF2C. De verschillende isovormen worden benoemd naargelang welke
domeinen aanwezig zijn, bv α2.β.γ. (aangepast van Zhu et al. (2005)
De MADS-box is een minimaal DNA-bindend domein van 57AZ gelegen aan het extreme
N-uiteinde van MEF2C. Het MEF2-domein ligt net achter de MADS-box en bestaat uit 29AZ.
Het is enkel in samenwerking met het MEF2-domein dat de MADS-box kan instaan voor DNAbinding met een hoge affiniteit en dimerisatie. (Molkentin et al., 1996)
De MADS-box bindt doorgaans AT-rijke gebieden en het MEF2-domein bindt aan de consensussequentie YTA(A/T)4 TAR (Black and Olson, 1998).
Het variabele C-terminale einde van MEF2C mediëert de activatie van de genexpressie van
spierspecifieke genen volgend op de DNA-binding (Black and Olson, 1998). Dit gebeurt door
het rekruteren van en het samenwerken met meerdere andere transcriptiefactoren, en door
translationele en posttranslationele modificaties (Potthoff and Olson, 2007).
Splicing waardoor het ene of het andere alternatieve exon 4 ingevoegd wordt is weefselafhankelijk, maar de functie ervan is nog niet bekend. Isovorm 1 dat exon 4α1 bevat komt voornamelijk
in de hersenen tot expressie. Isovorm 2 dat exon 4α2 bevat komt wijdverspreid voor, maar
wordt overheersend in skeletspieren geëxpresseerd. (Zweier et al., 2010)
Het β-domein is vereist voor de versterking van de transcriptie en functioneert onafhankelijk
van de positie. Tijdens een laat stadium van de spierceldifferentiatie wordt de splicing van genproducten die dit domein bevatten bevorderd, wat doet vermoeden dat het specifieke subsets
van spierspecifieke genen reguleert. (Martin et al., 1993; Zhu et al., 2005)
Het γ-domein codeert voor een transcriptie-repressor. Dit domein kan uitgesloten worden wanneer een cryptische splice-acceptorsite in exon 11 gebruikt wordt. Isovormen die dit domein
niet bevatten zijn transcriptioneel activer en komen enkel in de hersenen voor. Het expressieniveau ervan daalt naarmate de postnatale ontwikkeling vordert. Dit zou kunnen betekenen
dat MEF2C een rol speelt in de ontwikkeling van de corticale architectuur. (Leifer et al., 1993;
Zhu et al., 2005)
16
Literatuurstudie
3.1
3. Het MEF2C-gen
Reeds beschreven afwijkingen
3.1.1 Afwijkingen
Figuur 1.7 geeft een overzicht weer van de twintig reeds beschreven deleties en translocaties in
de buurt van het MEF2C -gen. Enkel patiënt 2 van Cardoso et al. (2009), patiënt 3 van Engels
et al. (2009) en patiënt 2 van Floris et al. (2008) vertonen net zoals de proband een afwijking
tussen het MEF2C - en het CETN3 -gen, zonder dat MEF2C zelf betrokken is.
Figuur 1.7: Overzicht van de reeds beschreven deleties en translocaties in de
buurt van MEF2C. (UCSC Genome Browser, Human Feb. 2009
(GRCh37/hg19) assembly) (Cardoso et al., 2009; Floris et al., 2008;
Engels et al., 2009; Le Meur et al., 2010; Novara et al., 2010; Nowakowska et al., 2010; Zweier et al., 2010)
Figuur 1.8 geeft een overzicht weer van de vijf reeds beschreven mutaties in het MEF2C -gen.
Figuur 1.8: Overzicht van de reeds beschreven mutaties in de coderende sequentie
van MEF2C. De nummering van de nucleotiden verwijst naar cDNA
van de referentiesequentie van GenBank, NM 002397.4. (aangepast van
Le Meur et al. (2010)) (Le Meur et al., 2010; Zweier et al., 2010)
17
Literatuurstudie
3. Het MEF2C-gen
3.1.2 Fenotypes
Floris et al. (2008) rapporteerden een patiënt met een gebalanceerde translocatie tussen de
chromosoombanden 8q23 en 5q14.3. Op geen van beide chromosomen gaat de translocatie
door een gen. Op chromosoom 5 ligt het breukpunt tussen het MEF2C -gen en het CETN3 gen. Deze patiënt vertoont onder andere autistisch gedrag, psychomotore achterstand, ernstige
spraakachterstand, epilepsie, korte concentratietijd, stereotype handbewegingen en heeft geen
sociale interesse.
Cardoso et al. (2009) rapporteerden twee ongerelateerde patiënten met deleties in de 5q14.3-15
regio met epilepsie, verstandelijke beperking, spierhypotonie (verlaagde skeletspierspanning),
mineure gezichtsafwijkingen en bilaterale periventriculaire heterotopie (hersencellen migreren
niet na de geboorte, maar blijven diep in de hersenen naast de ventrikels zitten). In de drie
patiënten is de regio tussen het MEF2C -gen en het CETN3 -gen geheel of gedeeltelijk gedeleteerd. In patiënt 2 is het MEF2C -gen zelf intact.
Engels et al. (2009) rapporteerden drie ongerelateerde patiënten met microdeleties in de 5q14.315 regio. In patiënt 1 en 2 is MEF2C gedeleteerd en in patiënt 3 is MEF2C onaangetast. Deze
patiënten vertonen allemaal ernstige psychomotore achterstand, epilepsie of koortsaanvallen,
spierhypotonie, verschillende hartafwijkingen en een aantal mineure afwijkingen.
Le Meur et al. (2010) rapporteerden vijf ongerelateerde patiënten met 5q14.3 microdeleties
waarvan de kleinste gemeenschappelijke gedeleteerde regio enkel het MEF2C -gen bevat, en
één patiënt met een nonsense mutatie in het MEF2C -gen zelf. Alle patiënten vertonen een
aantal gelijke fenotypische eigenschappen: ernstige verstandelijke beperkingen met afwezige
spraak, ontwikkelingsachterstand, spierhypotonie, zwak oogcontact en stereotype handbewegingen. Gezichtsafwijkingen, epilepsie en/of hersenafwijkingen zijn ook in de meeste patiënten
aanwezig.
Nowakowska et al. (2010) rapporteerden vier patiënten met overlappende deleties in de 5q14.3
regio, inclusief het MEF2C -gen zelf. Deze patiënten vertonen allen verstandelijke beperkingen,
aanvallen en spierhypotonie. Verdere klinische variabiliteit kan geheel of gedeeltelijk verklaard
worden door de verschillen in deletiegrootte en -locatie. Ze stellen dat de periventriculaire
heterotopie waarschijnlijk veroorzaakt wordt door deleties van één of meerdere naburige genen
van MEF2C. Sommige patiënten vertonen dit namelijk wel en anderen helemaal niet.
Novara et al. (2010) rapporteerden twee patiënten met ernstige verstandelijke beperkingen, autisme spectrum stoornissen (ASS) en epilepsie. Beide patiënten hebben een zeer kleine deletie
die het MEF2C -gen bevat.
18
Literatuurstudie
3. Het MEF2C-gen
Zweier et al. (2010) rapporteerden twee patiënten met microdeleties die het MEF2C -gen bevatten, één patiënt met een duplicatie in de coderende regio, één patiënt met een nonsense mutatie
en twee patënten met missense mutaties. De patiënten vertonen steeds een normale hoofdomtrek, ernstige verstandelijke beperkingen met de afwezigheid van spraak en gelimiteerde
mogelijkheid tot stappen, aandoeningen met aanvallen vanaf de kleutertijd en een gemeenschappelijk maar moeilijk te onderscheiden gezichtsafwijking met een breed, hoog voorhoofd,
relatief grote naar achter gedraaide oren met opvallende oorlellen, milde schuin-opwaartse kloven in de oogleden en fraai gewelfde of tentvormige bovenlip. De meeste patiënten vertonen
ernstige spierhypotonie en variable subtiele hersenafwijkingen in Magnetic Resonance Imaging
(MRI) scans, maar de periventriculaire heterotopie werd niet aangetroffen.
Situering thesis
De proband vertoont ontwikkelingsachterstand, epilepsie, een ernstige verstandelijke beperking, milde atrofie (verschrompeling) van de hersenen, zwak oogcontact, sterk vertraagde taalontwikkeling, bruxisme (tandenknarsen) en endorotatie (het naar binnen
draaien) van de voeten.
Samengevat hebben de meeste patiënten een ernstige verstandelijke beperking, lijden ze aan
ernstige primaire ontwikkelingsachterstand (spierhypotonie, motorische achterstand en afwezigheid van spraak), herkent men symptomen van ASS (stereotype handbewegingen en zwak
oogcontact), hebben ze epilepsie-aanvallen en vertonen de hersenen mineure afwijkingen. Dit
fenotype is erg gelijkend aan datgene van het Rett-syndroom (zie paragraaf 3.3 p.21) en wordt
om deze reden een Rett-like fenotyope genoemd.
3.2
Functie
MEF2C speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling en het onderhoud van meerdere orgaansystemen in de mens (Janson et al., 2001). De voornaamste functies met betrekking tot de
fenotypes geobserveerd in de patiënten met microdeleties of mutaties in het MEF2C -gen zullen
besproken worden.
MEF2C reguleert de ontwikkeling van spierweefsel door spierspecifieke genen te activeren na
binding aan de specifieke MEF2-elementen in de regulatorische gebieden van deze genen (Martin
et al., 1993). Dit zou de ernstige spierhypotonie gezien in patiënten met MEF2C -mutaties of
-deleties kunnen verklaren.
Knock-out muismodellen hebben aangetoond dat MEF2C eveneens een essentiële regulator is
van de ontwikkeling van de hartspier en het rechterventrikel (Lin et al., 1997). Overexpressie
van MEF2C in hartspiercellen van muizen veroorzaakt hartafwijkingen (Xu et al., 2006). In de
tot nu toe gerapporteerde patiënten werden echter geen structurele hartafwijkingen ontdekt.
Enkel patiënt 1 van Engels et al. (2009) vertoont een abnormale concentrische toename in
omvang en gewicht van het hartspierweefsel zonder celvermeerdering (myocardiale hypertrofie)
die te wijten zou kunnen zijn aan haploı̈nsufficiëntie van MEF2C.
19
Literatuurstudie
3. Het MEF2C-gen
De expressiepatronen van de vier MEF2 -genen zijn goed gedefiniëerd in tijd en ruimte tijdens de embryonale ontwikkeling en in adulte weefsels, en overlappen gedeeltelijk. De hoogste
expressieniveau’s werden gemeten in dwarsgestreept spierweefsel en de hersenen (Edmondson
et al., 1994). MEF2C vertoont een hoge expressie in de embryonale cerebrale cortex, de hippocampus, de amygdalae, de middenhersenen, de bulbus olfactorius en de kleine hersenen,
alsook in de adulte frontale cortex, de gyrus dentatus, de hippocampus, de thalamus en de
kleine hersenen (Lyons et al., 1995). De expressie van MEF2C daalt naargelang de postnatale
ontwikkeling vordert (Leifer et al., 1993).
Muizen waarbij de functie van Mef2c in de migrerende cellen van de neurale lijst ontbreekt,
vertonen allen gelijkaardige afwijkingen in de mondholte zoals een kleinere onderkaak, een
gespleten gehemelte en een verplaatsing van de tong. Dit doet vermoeden dat de ontwikkelingsprocessen gereguleerd door Mef2c kunnen bijdragen tot de vergelijkbare afwijkingen van
hoofd en aangezicht gezien bij de patiënten. (Verzi et al., 2007)
Klassieke homozygote knock-out van Mef2c in muizen leidt tot embryonale sterfte door harten vaatafwijkingen. Om deze reden werden voor verdere studies conditionele knock-out muizen
gebruikt. In muizen waarbij Mef2c tijdens de late embryogenese uitgeschakeld werd, werd aangetoond dat de deletie van Mef2c in het centrale zenuwstelsel (CZS) resulteert in een drastische
stijging van het aantal excitatorische synapsen. Dit resulteert op zijn beurt in een verslechterd
hippocampaal leren en geheugen (Flavell et al., 2006; Barbosa et al., 2008). De rol van Mef2c
in deze regulatie komt overeen met de mogelijke betrokkenheid bij aanvallen geobserveerd in
sommige patiënten.
Verder werd in muizen waarbij de knock-out negen dagen na fertilisatie plaatsvond, geobserveerd dat de ontwikkeling, verdeling en elektrofysiologische eigenschappen van neuronen in de
neocortex verstoord waren (Li et al., 2008). Dit zou aan de basis kunnen liggen van de verstandelijke beperkingen en de epilepsie geobserveerd in verschillende patiënten.
Ten slotte kon men uit deze studies een overeenkomst afleiden tussen het gedrag van Mef2c
knock-out muizen en Mecp2 knock-out muizen (Rett-syndroom). De Mef2c knock-out muizen
vertonen namelijk abnormale angsten, slechtere cognitieve functies en stereotype handbewegingen, wat een autisme spectrum stoornis (ASS) of een Rett-like fenotype (zie paragraaf 3.3
p.21) doet vermoeden. (Stearns et al., 2007; Li et al., 2008; Lipton et al., 2009)
Bijkomend bewijs hiervoor werd onder andere geleverd door Morrow et al. (2008) die meerdere
autismegenen identificeerde die MEF2-bindingsplaatsen bevatten. Ook Zweier et al. (2010)
hebben hiertoe bijgedragen door met transcriptionele analyses aan te tonen dat mutaties in
MEF2C de synergische transactivatie van E-box promotors zoals deze van MECP2 en CDKL5
verminderen. In patiënten met MEF2C -mutaties werden in vitro eveneens lagere expressiewaarden gemeten van MECP2 en CDKL5. Hieruit werd door hen besloten dat de fenotypische
overlap tussen patiënten met MEF2C mutaties en Rett(-like) fenotypes te wijten zijn aan het
feit dat deze genen in een gemeenschappelijke pathway betrokken zijn.
20
Literatuurstudie
3.3
3. Het MEF2C-gen
Gerelateerde ziektes
Het Rett-syndroom (OMIM #312750) werd voor het eerst beschreven in 1966 (Rett, 1966) en
is een progressieve ziekte die de neurologische ontwikkeling verstoort. Het is één van de belangrijkste oorzaken van verstandelijke beperkingen bij meisjes, met een prevalentie die variëert
voor de verschillende werelddelen van 1 in 10 000 tot 1 in 22 800 geboortes (Hagberg, 1985a,b;
Kerr and Stephenson, 1985; Burd et al., 1991; Kozinetz et al., 1993).
Patiënten met een klassieke vorm van het Rett-syndroom ontwikkelen normaal tijdens de eerste
zes tot achttien levensmaanden. Daarna gaan het spraakvermogen en de intellectuele capaciteiten snel achteruit en wordt het functionele handgebruik vervangen door stereotype handbewegingen. Na deze periode van snelle achteruitgang stabiliseert de patiënt en bereikt meestal
een volwassen leeftijd (45 jaar). Verdere symptomen zijn autistische kenmerken, roepbuien,
ontroostbaar wenen, apnoe en/of hyperventilatie, ataxie (dronkemansgang), apraxie (het onvermogen om complexe handelingen uit te voeren), tremor (beving), bruxisme, aanvallen en
verworven microcefalie (kleine hoofdomtrek). (Hagberg et al., 1983)
Patiënten met een atypische vorm van het Rett-syndroom vertonen bijvoorbeeld verstandelijke
beperkingen met spasticiteit, aangeboren spierhypotonie met infantiele spasmen of ernstige
encephalopathie (degeneratie van het hersenweefsel) bij pasgeboren jongens (OMIM #312750,
#300672, #613454).
Bij ongeveer 90% van de patiënten met het standaard Rett-syndroom worden mutaties of deleties in het MECP2 -gen op het X-chromosoom gedetecteerd (Amir et al., 1999). Vooral meisjes
worden door deze ziekte aangetast aangezien het ontbreken van een functionele kopij letaal is.
Bij patiënten die lijden aan atypische vormen van het Rett-syndroom bedraagt het aantal mutaties in het MECP2 -gen minder dan 50% (Fukuda et al., 2005; Kammoun et al., 2004; Li
et al., 2007; Zahorakova et al., 2007). Een klein aantal van de MECP2 -negatieve patiënten
vertonen mutaties in CDKL5, eveneens gelokaliseerd op chromosoom X, (Archer et al., 2006;
Weaving et al., 2004) of FOXG1, gelegen op chromosoom 14 (Ariani et al., 2008; Mencarelli
et al., 2010; Philippe et al., 2010).
Het overlappende fenotype van patiënten met mutaties in MECP2 en CDKL5 werd moleculair
bevestigd door de ontdekking van een gemeenschappelijke pathway (Mari et al., 2005). Ook
MEF2C is moleculair in verband gebracht met MECP2. In de muis werd namelijk aangetoond
dat Mecp2 als repressor aan de promotor van Mef2c bindt (Chahrour et al., 2008).
21
Literatuurstudie
3. Het MEF2C-gen
Zeer treffende fenotypische gelijkenissen maken het onderscheid tussen het Rett- en het Angelmansyndroom moeilijk. Dit laatste wordt veroorzaakt door afwijkingen in het UBE3A gen op chromosoom 15 die gepaard gaan met maternale imprinting. De fenotypische verschillen beginnen
pas zichtbaar te worden op latere leeftijd en dankzij genetische testen kan de diagnose tegenwoordig correct gesteld worden. (Scheffer et al., 1990; Philippart, 2001).
Ook moleculair zijn beide ziektebeelden verwant, aangezien in muizen aangetoond werd dat
Mecp2 deficiëntie gepaard gaat met epigenetische afwijkingen op de 15q11.2-q13 regio, waarbij
de methylatie-status van belang is voor het Angelmann-syndroom en waarin het UBE3A gen
gelegen is. (Makedonski et al., 2005)
Situering thesis
Voor deze thesis werd een cohorte samengesteld van patiënten waarvoor testen aangevraagd werden voor MECP2, CDKL5 en/of methylatie van 15q11.2-q13, die negatieve
resultaten opleverden. Patiënten met spraak- en taalproblemen werden eveneens opgenomen, net als patiënten met verstandelijke beperkingen waarvoor micro-arrays uitgevoerd
werden en waarbij geen noemenswaardige afwijkingen ontdekt werden.
22
2
Materiaal en Methoden
1
1.1
Technieken
Mate Pair Sequencing
Figuur 2.1 illustreert het opstellen en sequeneren van een
Mate Pair Library. In eerste instantie wordt het genomische DNA van de patiënt opgezuiverd en in fragmenten
van ongeveer 3kb verdeeld met behulp van de CovarisTM
DNA miniTUBE - Blue. Vervolgens worden de uiteinden van deze fragmenten hersteld en gemerkt met biotine. De fragmenten worden dan met agarosegelelektroforese van elkaar gescheiden, en de fragmenten van
3kb worden uitgesneden. Daarna worden de fragmenten
gecirculariseerd en opnieuw gefragmenteerd met behulp
van de CovarisTM DNA microTubes naar een lengte van
ongeveer 450bp. De gebiotinyleerde fragmenten worden
opgezuiverd met streptavidinebeads en de niet gemerkte
fragmenten worden weggewassen. De uiteinden van de
gebiotinyleerde fragmenten worden vervolgens hersteld,
er wordt een A-overhang aan geplaatst alsook illumina
adapters. Er wordt dan een Polymerase Chain Reaction
(PCR) reactie uitgevoerd om deze fragmenten te amplificeren en het mengsel hieraan te verrijken. Opnieuw
wordt een agarosegelelektroforese uitgevoerd en worden
fragmenten van 350 tot 650bp uitgesneden. Dit is de
uiteindelijke Mate Pair Library, die door de illuminasequencer verwerkt zal worden. Dit toestel genereert clusters van dezelfde fragmenten met behulp van brugamplificatie. Uiteindelijk worden telkens 36bp aan de uiteinden van de fragmenten gesequeneerd en gemapt aan
Figuur 2.1: Mate Pair Sequencing. (il- een referentiegenoom. (illumina, 2011)
lumina, 2011)
23
Materiaal en Methoden
1.2
1. Technieken
Concentratiebepaling van DNA
Met behulp van de NanoDrop® ND-1000 spectrofotometer kan men op een snelle manier de
concentratie van DNA-stalen meten in een volume van slechts 1µL (in de praktijk wordt 1,5µL
gebruikt voor de zekerheid). Het is een full-spectrum (220nm-750nm) UV/Vis spectrofotometer
die stalen analyseert zonder gebruik te maken van cuvetten of capillairen. Het geladen staal
wordt enkel op zijn plaats gehouden door oppervlaktespanning (sample retention technology).
Een bijkomend voordeel van deze technologie is dat het toestel snel proper gemaakt kan worden
voor de meting van een volgend staal. Hiervoor hoeft men namelijk enkel de optische vezels
te reinigen met een stofvrij doekje. Een laatste voordeel van de NanoDrop® ND-1000 bestaat
erin dat stalen met een concentratie van 2 tot 3700ng/µL zonder voorafgaande aanrijking of
verdunning acurraat gemeten kunnen worden.
Figuur 2.2 toont hoe de meting met de NanoDrop® ND-1000 in zijn werk gaat. Nadat het
staal op de onderste optische vezel gepipetteerd wordt (A) en de arm van het toestel gesloten
wordt, zal een vloeistofkolom gevormd worden. Vervolgens zal bij een weglengte van 1,0mm
(B) en 0,2mm (C) het absorptiespectrum van 220 tot 350nm gemeten worden.
Figuur 2.2: Meting met de NanoDrop® ND-1000. (Thermo Scientific, 2011)
De software geeft vervolgens het volledige absorptiespectrum, de concentratie gebaseerd op de
absorptie van UV-licht bij 260nm (1 OD260 ≈ 50µg/mL) en de zuiverheid gebaseerd op de ratio
van de absorpties bij 260 en 280nm (1,8 is zuiver DNA) weer.
(Thermo Scientific, 2011)
1.2.1 Benodigdheden
• NanoDrop® ND-1000 spectrofotometer (Thermo Scientific)
• 100% ethanol (VWR, 1115)
• Nuclease-vrij water (Sigma, W4502)
• Stofvrije doekjes (Kimtech, Kimberley-Clark)
24
Materiaal en Methoden
1. Technieken
1.2.2 Protocol
1. Start de NanoDrop® ND-1000 software.
2. Klik op “Nucleic Acid Measurement”.
3. Reinig de optische vezels van het toestel met een stofvrij doekje en achtereenvolgens met
100% ethanol en nuclease-vrij water.
4. Pipetteer 1,5µL water op de onderste optische vezel, breng de arm naar beneden en klik
op “Initialise”.
5. Open de NanoDrop® en reinig beide vezels opnieuw met een stofvrij doekje.
6. Pipetteer 1,5µL van het solvent of de buffer waarin het te meten DNA opgelost is op de
onderste optische vezel, breng de arm naar beneden en klik op “Blank ”.
7. Open de NanoDrop® en reinig beide vezels opnieuw met een stofvrij doekje.
8. Pipetteer nogmaals 1,5µL van het solvent of de buffer op de onderste optische vezel, breng
de arm naar beneden en klik op “Measure”. Het resulterend spectrum mag niet meer dan
0,05 absorptie-eenheden (A) afwijken van de basislijn (absorptie = 0) en de concentratie
moet gelegen zijn tussen -0,5 en 0,5 ng/µL.
9. Indien niet aan deze voorwaarden voldaan is, herhaal stap 5 tot en met 8.
10. Vul de naam van het staal in onder “Sample ID”.
11. Open de NanoDrop® en reinig beide vezels opnieuw met een stofvrij doekje.
12. Pipetteer 1,5µL staal op de onderste optische vezel, breng de arm naar beneden en klik
op “Measure”.
13. Open de NanoDrop® en reinig beide vezels opnieuw met een stofvrij doekje.
14. Herhaal stap 10 tot en met 13 voor alle stalen en herhaal de “Blank ”-procedure als het
toestel erom vraagt.
15. Sluit de software af.
16. Reinig beide vezels met een stofvrij doekje en 100% ethanol.
17. Sluit de NanoDrop® .
1.3
Amplificatie van DNA
PCR is een techniek die gebruikt wordt om een specifieke DNA-sequentie te amplificeren. Men
beschikt hiervoor over een DNA-staal en twee oligonucleotide primers die complementair zijn
aan de uiteinden van de te amplificeren sequentie. Verder worden deoxyribonucleotidetrifosfaten (dNTPs) gebruikt als bouwstenen voor de amplificatie. (Mullis et al., 1986) Tot slot zal het
hittebestendige Taq DNA-polymerase zorgen voor de synthese van de PCR-producten (Saiki
et al., 1988).
25
Materiaal en Methoden
1. Technieken
Een PCR-reactie is een opeenvolging van een aantal identieke cycli met in elke cyclus drie verschillende temperatuursstadia. In het eerste stadium wordt het DNA volledig gedenatureerd
bij een temperatuur tussen de 92 en 96◦ C. In de annealing fase wordt de temperatuur verlaagd
tot 45 à 72◦ C waardoor de aanwezige primers hybridiseren met het complementaire gebied van
de te amplificeren sequentie. In een laatste fase wordt door incorporatie van dNTPs aan het
3’-eind van de primers, het eigenlijke PCR-product gesynthetiseerd bij een temperatuur van
72◦ C. In de praktijk worden meestal 20 à 35 van deze cycli na elkaar herhaald. Met elke cyclus
verhoogt de hoeveelheid DNA exponentieel. (Saiki et al., 1988)
Analyse van de resultaten kan met behulp van elektroforese en/of sequenering.
Heel wat factoren dragen bij tot de kwaliteit van een PCR-reactie: het gekozen temperatuursprotocol, het aantal cycli, het soort DNA-polymerase, de concentraties aan dNTPs, de aard
en concentratie van de primers enzovoort. Optimalisatie van een PCR-reactie kan dus bereikt
worden door een of meerdere van deze factoren aan te passen.
1.3.1 Benodigdheden
• PCR-Thermocycler (Bio-Rad)
• Vortexer
• Microcentrifuge
• Centrifuge
• KAPATaqTM HotStart PCR-kit (KapaBiosystems, KK1510)
• Nuclease-vrij water (Sigma, W4502)
• dNTP-set 100mM (Invitrogen, 10297-018), verdund tot 1mM met nuclease-vrij water
• Dimethylsulfoxide (DMSO) (VWR, 1953.1000)
• Werkoplossing van zelfontworpen primers, 5µM (IDT)
• Humaan genomisch DNA (Roche, 11 691 112 001)
• DNA-staal, 25ng/µL
• 0,2mL Thermo-Strip (ThermoScientific, AB-0266) of Thermo-Fast® 96, Non-Skirted
(ThermoScientific, AB-0600)
• 0,5mL SafeSeal Microcentrifuge Tubes (Sorenson® BioScience Inc., 11080)
• Safe-Lock Eppendorf Tubes 1,5mL (Eppendorf, 4843140)
• Adhesive PCR Film (ThermoScientific, AB-0558)
26
Materiaal en Methoden
1. Technieken
Bijkomende benodigdheden indien men na de PCR-amplificatie een HRM-analyse (zie paragraaf 1.5 p.31) uitvoerd:
• LCGreen® Plus+ Melting Dye (Idaho Technology Inc., BCHM-ASY- 0005)
• Minerale olie (Sigma-Aldrich, M3516-1L)
• 96-well-HRM-plaat (4titude, 4ti-0961)
1.3.2 Protocol
1. Ontdooi, vortex en centrifugeer de benodigde producten, behalve het Taq-polymerase.
2. Pipetteer alle elementen van de mastermix in een epje van geschikt volume. De producten
waarvan het grootste volume nodig is worden eerst toegevoegd en het Taq-polymerase
laatst, na enkel centrifugeren. In geval van HRM-analyse met gebruik van LCGreen®
Plus+ dient men in het donker te werken aangezien dit product lichtgevoelig is.
3. Voeg de mastermix toe aan elk van de welletjes van de 96-well-plaat of strips.
4. Voeg de stalen, het standaard humaan genomisch DNA (gDNA) en het H2 O toe aan de
daartoe bestemde welletjes.
5. Indien HRM-analyse volgt, voeg 25µL minerale olie aan elk welletje toe.
6. Sluit goed af met de caps of met een PCR Thermoseal kleefstrip.
7. Centrifugeer gedurende 1 minuut aan 1500rpm.
8. Start de PCR-reactie in de thermocycler.
1.4
Visualisatie van DNA-fragmenten
1.4.1 Visualisatie met behulp van agarosegelelektroforese
Gelelektroforese is een analytische en preparatieve scheidingstechniek die gebaseerd is op de
beweging van geladen moleculen in een elektrisch veld. Met agarosegelelektroforese kunnen nucleı̈nezuren met een lengte tot 20kb op basis van massa en lading van elkaar gescheiden worden.
De nucleı̈nezuren bewegen hierbij door een agarose gel, een complex netwerk van polymeren
met een poriëngrootte die varieert naargelang de gebruikte buffer en het type en concentratie
aan agar. De negatief geladen nucleı̈nezuren migreren onder invloed van het aangelegde elektrische veld naar de positieve pool. Hoe groter de fragmenten, hoe trager ze doorheen de gel
bewegen. (Primrose and Twyman, 2006)
Standaard wordt een gel van 2% agarose gebruikt en een spanning van 140V. Hiermee zullen
fragmenten van 100bp tot 3kb van elkaar gescheiden worden. Voor het scheiden van grotere
fragmenten gebruikt men een gel met een lagere agaroseconcentratie en voor het scheiden van
kleinere fragmenten een hogere agaroseconcentratie.
27
Materiaal en Methoden
1. Technieken
Aan de stalen wordt een ladingsbuffer met kleurmerker toegevoegd (in dit geval Orange G)
wat het mogelijk maakt om het verloop van de moleculen over de gel tijdens de elektroforese
te volgen. Om de fragmenten na afloop te visualiseren wordt bij het aanmaken van de gel
ethidiumbromide toegevoegd. Deze stof zal intercaleren met het DNA en in gebonden toestand
oplichten wanneer het beschenen wordt met UV-licht.
A. Benodigdheden
• Elektroforese toestel (Bio-Rad, Sub-Cell Model 192)
• Weegschaal
• Microgolfoven
• UV-lichtbak
• Nuclease-vrij water (Sigma, W4502)
• UltraPureTM Agarose (Invotrogen, 15510-027)
• Ethidiumbromide (Transgenomic, 553401)
• 100bp DNA-ladder (Invitrogen, 15628-019)
• Orange G
• 1x TBE-buffer
• Nitrile handschoenen
• Maatcilinder
• Erlenmeyer
• Gelhouder en kammen
B. Bereiding van reagentia
1x TBE-buffer
Verdun 200mL UltraPureTM 10x TBE-buffer (Invitrogen, 15581-036) in 1800mL nucleasevrij water en bewaar bij kamertemperatuur.
Orange G
Los 5g Ficoll 400 (Sigma, 2637-25), 5mL 0,5M EDTA pH 8 (Invitrogen, 15575-038) en
25mg Orange G (0,1%)(Sigma, O1625) op in 25mL nuclease-vrij water, verdeel in epjes
van 2mL en bewaar bij -20◦ C.
28
Materiaal en Methoden
1. Technieken
C. Staalvoorbereiding
Samenstelling van de laadoplossing van de PCR-producten
5µL PCR-product
3µL Orange G
5µL H2 O
Samenstelling van de laadoplossing van de ladder
0,8µL 100bp DNA-ladder
3µL Orange G
10µL H2 O
D. Protocol
1. Los 5g agarose op in 250mL 1x TBE-buffer in een erlenmeyer.
2. Warm 2 maal 1 minuut op in de microgolfoven tot de agarose volledig opgelost is en de
oplossing helder is.
3. Laat het mengsel afkoelen tot er geen dampen meer vrijkomen door de erlenmeyer onder
koud water te houden.
4. Voeg 5 druppels ethidiumbromide toe en meng voorzichtig.
5. Giet de oplossing uit in de daartoe bestemde reservoirs, verwijder de luchtbellen zo goed
mogelijk met een pipettip en plaats de kammetjes.
6. Laat ongeveer 30 minuten afkoelen en stollen.
7. Verwijder de kammetjes nadat de gel gestold is.
8. Plaats de gel in de elektroforesebak.
9. Vul de elektroforesebak met 1x TBE buffer tot de gel net ondergedompeld is.
10. Laad de volledige oplossing van de ladder en de stalen in de slotjes.
11. Stel het elektroforesetoestel in op 140V en zet het programma stop wanneer de kleuring
van de stalen de onderkant van de gel bereikt heeft (meestal na 45 minuten à 1 uur).
12. Leg de gel op het UV-toestel, klap de beschermplaat neer, schakel de UV-lamp aan en
bekijk de gel.
13. Indien gewenst kan een foto van de gel genomen worden met het bijhorende fototoestel
en de software.
29
Materiaal en Methoden
1. Technieken
1.4.2 Visualisatie met behulp van de LabChip® GX
Elektroforese met behulp van de LabChip® GX kent een aantal interessante voordelen ten
opzichte van de standaard agarosegelelektroforese. Analyse van RNA, DNA en eiwitten met
dit toestel is sneller, minder arbeidsintensief, levert resultaten op die beter reproduceerbaar
en van hogere kwaliteit zijn, vereist slechts minimale staalvoorbereiding en genereert meteen
digitale data. Deze technologie kan echter niet toegepast worden wanneer men fragmenten van
een bepaalde lengte wenst te isoleren, hiervoor dient men de standaard agarosegelelektroforese
techniek te gebruiken.
De LabChip® GX elektroforese wordt uitgevoerd op een kleine chip waarvan de welletjes op
voorhand met reagentia gevuld worden. Deze welletjes zijn verbonden met kleine kwartsplaten
die van microkanalen voorzien zijn. Wanneer de chip in het toestel wordt geladen zullen de
welletjes verbonden worden aan platinumelektrodes die zorgen voor voltage en controle van de
elektrische stroom. Vervolgens zal de interne robot de 384-well-plaat net onder de capillair van
de chip brengen, waarna ongeveer 150nL in de chip opgezogen wordt. De individuele stalen
worden dan elektroforetisch gescheiden en de banden worden met behulp van laser geı̈nduceerde
fluorescentie gedetecteerd. De grootte en concentratie van de banden worden toegekend na vergelijking met de ladder en interne merkers. Na elk staal wordt de capillair gespoeld, wat het
risico op contaminatie minimaliseert.
Analyse van de elektroforese-data gebeurt aan de hand van de bijgeleverde software.
(Calliper LifeSciences, 2009)
A. Benodigdheden
• LabChip® GX (Caliper LifeSciences)
• Centrifuge
• Nuclease-vrij water (Sigma, W4502)
• 384-well-plaat (4titude, 4ti-0384)
B. Protocol
1. Voeg 3µL PCR-product en 17µL H2 O samen.
2. Centrifugeer gedurende 1 minuut aan 1500rpm.
3. Laad 20µL per staal in de gereserveerde welletjes van de LabChip-384-well-plaat.
4. De LabChip® GX wordt door laboranten opgestart.
5. De analyse van de data gebeurt aan de hand van de LabChip® GX software.
30
1. Technieken
Materiaal en Methoden
1.5
High Resolution Melting mutatie-analyse van DNA
HRM is een methode die gebruikt wordt in de genoomdiagnostiek voor snelle genotypering en
high-throughput mutatie-analyse van ziektegenen. HRM is een eenvoudige methode waarbij
men eerst een PCR-amplificatie uitvoert, gevolgd door een smeltstap en de daaropvolgende
analyse. (Vossen et al., 2009)
Tijdens de PCR-amplificatie wordt LCGreen® Plus+ tussen de dubbelstrengige DNA-moleculen
ingebouwd. Dit is een verzadigende dye die noodzakelijk is voor de detectie van heteroduplexen.
Het verzadigende karakter wordt geı̈llustreerd in figuur 2.3. Deze dye is bovendien zeer stabiel,
inhibeert de PCR-reactie niet en kan tijdens de smeltanalyse verschillende amplicons in een
mengsel van elkaar onderscheiden. (Wittwer et al., 2003)
(a) heteroduplexen worden enkel door verzadigende dyes zoals LCGreen® Plus+ gedetecteerd
(b) dit komt omdat niet-verzadigende dyes
verspringen bij denaturatie en geen verschil in fluorescentie opleveren
Figuur 2.3: Vergelijking tussen niet-verzadigende (SYBR® Green) en verzadigende
(LCGreen® Plus+) dyes. (Bioké, 2011)
Bij graduele opwarming van DNA-stalen zal LCGreen® Plus+ vrijkomen en de fluorescentie
uitdoven. Op deze manier worden smeltprofielen verkregen waarbij de fluorescentie daalt naarmate de temperatuur, en dus ook de graad van denaturatie, stijgt (zie figuur 2.4). (Wittwer
et al., 2003) De vorm van de smeltprofielen hangt af van het GC-gehalte, de lengte, de sequentie
en de heterozygositeit van het PCR-product. Mutaties in de sequentie zullen aanleiding geven
tot heteroduplexen die de vorm van de smeltprofielen veranderen ten opzichte van het wildtype smeltprofiel. Door de profielen met elkaar te vergelijken kunnen mutaties in DNA-stalen
ontdekt worden. (Vossen et al., 2009)
Figuur 2.4: HRM-smeltprofiel: het gedrag van LCGreen® Plus+ naarmate de temperatuur stijgt. (The Wittwer Lab for DNA Analysis, 2011)
31
Materiaal en Methoden
1. Technieken
Enkel amplicons die afwijkende profielen vertonen zullen gesequeneerd worden, waardoor de
kost van de mutatie-analyse drastisch daalt. Een bijkomend voordeel van deze technologie is
dat het scannen niet destructief is, waardoor de stalen herbruikt kunnen worden voor bijvoorbeeld sequenering en gelelektroforese. (Vossen et al., 2009)
Analyse van de smeltprofielen gebeurt aan de hand van de LightScanner® software (Idaho
Technology Inc.). Hiermee worden de verschillende profielen genormaliseerd. Deze normalisatie houdt in dat er grenzen met een interval van 1◦ C gekozen worden voor en na de werkelijke
smeltovergang rond de smelttemperatuur Tm . Deze grenzen moeten liggen in het gebied waar
de profielen allemaal evenwijdig lopen en dit zo dicht mogelijk bij de smeltovergang. Ten slotte
wordt een grouping-analyse uitgevoerd op een hoge resolutie. Stalen die afwijkende profielen
vertonen worden dan gegroepeerd en aangekleurd. Figuur 2.5 illustreert deze analyse. (Idaho
Technology Inc., 2011b)
Figuur 2.5: Normalisatie en grouping-analyse van HRM-smeltprofielen.
Technology Inc., 2011a)
(Idaho
1.5.1 Benodigdheden
• LightScanner® (Idaho Technology Inc., LSCN-ASY-0011)
• Centrifuge
• Alle benodigheden om een PCR-amplificatiereactie uit te voeren (zie paragraaf 1.3 p.25)
32
Materiaal en Methoden
1. Technieken
1.5.2 Protocol
Zie kwaliteitshandboek van het CMGG, document H7.1-TP1258.
1. Voer een PCR-amplificatiereactie uit zoals beschreven in paragraaf 1.3.
2. Centrifugeer de 96-well-HRM-plaat gedurende 10 minuten aan 3000rpm.
3. Zet de LightScanner® aan.
4. Start de LightScanner® software.
5. Stel de begintemperatuur in op 70◦ C en de eindtemperatuur op 98◦ C.
6. Klik op “Got to Hold Temp”.
7. Wanneer de hold temperature bereikt is, verwijder de Thermoseal en voer de HRM-96well-plaat in het toestel in met de afgeknotte hoek naar linksboven gericht.
8. Klik op “Start run” en geef een naam in waarmee het experiment opgeslagen zal worden.
9. Nadat de run beëindigd is, zal de plaat automatisch uitgeworpen worden en koelt het
toestel terug af naar de hold temperature.
10. Sluit de software af.
11. Zet de LightScanner® uit.
12. De analyse van de data gebeurt aan de hand van de LightScanner® software.
1.6
Sequentieanalyse van DNA
Met behulp van Sanger sequenering wordt de volgorde van de baseparen in DNA-stalen bepaald.
Voorafgaand aan de eigenlijke sequenering worden de te sequeneren DNA-stalen geamplificeerd met genspecifieke primers waaraan universele primer-tags gehangen werden. In de eerste
stap van het sequeneren zelf worden universele primers aan de PCR-producten toegevoegd.
Vervolgens worden hierbij dNTPs en fluorescerent gemerkte dideoxyribonucleotidetrifosfaten
(ddNTPs) in een ratio van 100:1 toegevoegd zodat de ddNTPs random worden ingebouwd.
ddNTPs zijn nucleotiden die een OH-groep missen op het 3’-einde, waardoor de synthese van
de keten wordt stopgezet wanneer ze worden ingebouwd. Ten slotte wordt het polymerase
toegevoegd en worden de polynucleotideketens gesynthetiseerd. (Primrose and Twyman, 2006)
Wanneer een ddNTP ingebouwd wordt, stopt de ketenverlenging met als gevolg dat men een
mix van polynucleotideketens van verschillende lengte krijgt. Deze worden vervolgens naar
grootte van elkaar gescheiden door capillaire elektroforese en met behulp van laserdetectoren
wordt de volgorde van de verschillende fragmenten geregistreerd. Tot slot zetten computerprogramma’s de lasersignalen om in een lineaire sequentie. (Primrose and Twyman, 2006)
33
...........................A..........................................
AAAGAAAACAAAGGCTGTGAAAGCCCCAATCCCGACTCCTCTTATGCACTCACCCCACGCACTGAAGAAA
Materiaal en Methoden
1. Technieken
Figuur 2.6 geeft een voorbeeld weer van het resultaat van een sequentieanalyse met behulp
---------------------------------------------------------------------van een automatische sequencer. Dergelijke chromatogrammen kunnen met het programma
......................................................................
SeqScape® v2.5 (Applied Biosystems) geanalyseerd worden.
AAAGAAAACAAAGGCTGTGAAAGCCCCGATCCCGACTCCTCTTATGCACTCACCCCACGCACTGAAGAAA
------
-
-
------
122'+,-.,$/0
-
-
------
-
-
------
-
-
------
-
--------------------------------------------------- - - - -2.6:
- - -Voorbeeld
- - - - - van
- - -een
- - electroferogram,
- - - - - - - - - het
- - resultaat
------ -sequentieanalyse
-------------Figuur
van
- - - - - - - -met
- - behulp
- - - -van
- - een
- - automatische
- - - - - - - -sequencer.
- - - - - -(CMGG)
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Onderstaand protocol wordt gebruikt wanneer men de sequeneringsreactie manueel uitvoert en
daarna de stalen zuivert van alle reagentia, zodat ze enkel over de capillaire sequencer gelopen
moeten worden.
1.6.1 Benodigdheden
• PCR-Thermocycler (Bio-Rad)
• Microcentrifuge
• 100% ethanol (VWR, 1115)
• Nuclease-vrij water (Sigma, W4502)
• Exo: Exonuclease I (New England Biolabs, M0293S)
• AP: Antarctic phosphatase (New England Biolabs, M0289S)
• RR: Ready Reaction mix from BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (ABI,
4337457)
• Sequencing buffer: 5x buffer from BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit or
custom made
• Custom primer 1µM (IDT)
• CleanSeq magnetische beads (Agencourt, GC Biotech AG000136)
• Betaine (Sigma-Aldrich, B2629)
• Dimethylsulfoxide (DMSO) (VWR, 1953.1000)
• Ijs
• 0,2mL Thermo-Strip (ThermoScientific, AB-0266) of Thermo-Fast® 96, Non-Skirted
(ThermoScientific, AB-0600)
• 0,5mL SafeSeal Microcentrifuge Tubes (Sorenson® BioScience Inc., 11080)
• Magnetische houder (Agencourt BioScience Inc. (987), 867-2600)
• Stofvrije doekjes (Kimtech, Kimberley-Clark)
34
Materiaal en Methoden
1. Technieken
1.6.2 Protocol
Zie protocols op de website van het CMGG, document “Cycle sequencing”.
1. Zet een bakje ijs klaar.
2. Bereid een verse Exo-AP-mix en voorzie één eenheid per PCR-reactie + 10%. Werk op
ijs en centrifugeer de producten kort voor gebruik.
• 0,05µL Exo
• 0,20µL AP
• 0,75µL H2 O
3. Bereid de PCR clean up mix voor elke reactie. Werk op ijs en centrifugeer de producten
kort voor gebruik. Indien het PCR-product een hoge concentratie heeft, verdun dan
3,5µL PCR-product met 1,5µL H2 O.
• 5µL PCR-product
• 1µL Exo-AP mix
4. Voer de clean up reactie uit in de PCR-Thermocycler volgens onderstaand temperatuursprotocol.
• 15 minuten bij 37◦ C
• 20 minuten bij 80◦ C
• 1 minuut bij 4◦ C
5. Indien gewenst, bewaar de stalen bij 4◦ C.
6. Voeg 20µL H2 O toe aan elk Exo-AP product.
7. Bereid de sequenerings-reactiemix voor elke gewenste sequenering (dus indien forward
en reverse vereist is, maak 1 mix per sequeneringsrichting aan) + 5%. Werk op ijs en
centrifugeer de producten kort voor gebruik. Pipetteer na het toevoegen van RR enkele
malen op en neer.
• 2,0µL custom sequencing buffer 5x
• 2,0µL 1µM primer (M13 F B of M13 R A)
• 1,0µL gezuiverd PCR-product uit stap 6
• 0,5µL RR
• optioneel: 0,5µL DMSO of betaine
• H2 O tot een totaalvolume van 10µL (4,5µL voor standaard reacties en 4µL bij het
gebruik van DMSO of betaine)
35
Materiaal en Methoden
1. Technieken
8. Voer de sequeneringsreactie uit in de PCR-Thermocylcer volgens onderstaand temperatuursprotocol.


• 15 minuten bij 37◦ C 


◦
25 cycli
• 20 minuten bij 80 C



◦

• 1 minuut bij 4 C
9. Indien gewenst, bewaar de stalen bij -20◦ C.
10. Maak een 85% ethanoloplossing aan voor 150µL per sequeneringsproduct.
11. Resuspendeer de magnetische beads.
12. Voeg 10µL beads toe aan elk sequeneringsproduct.
13. Voeg 45µL 85% ethanol toe en pipetteer 7 maal op en neer.
14. Plaats de plaat/strips op de magnetische houder voor 3 minuten.
15. Verwijder het supernatans.
16. Voeg 100µL 85% ethanol toe en plaats de plaat/strips 30 seconden op de magnetische
houder.
17. Verwijder het supernatans.
18. Laat 10 minuten aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.
19. Voeg 40µL H2 O toe, meng door te pipetteren en wacht 3 minuten (niet op de magnetische
houder). Let er op dat er geen luchtbellen gevormd worden.
20. Plaats de plaat/strips op de magnetische houder en wacht minstens 30 seconden.
21. Transfereer 30µL sequeneringsproduct (zonder beads) naar een lege plaat/strips. Indien
beads aan de tips hangen, dep deze af met een stofvrij doekje.
22. Geef de stalen in bij de sequeneringsfaciliteit voor “just run”, de stalen moeten namelijk
enkel nog maar over de capillaire sequencer gelopen worden.
23. De analyse van de data gebeurt aan de hand van de software SeqScape v2.5 (Applied
Biosystems).
1.7
Kwantitatieve PCR (qPCR)
Bij vele PCR-toepassingen kan het nuttig zijn om de starthoeveelheid aan genetisch materiaal te kennen. Bij gewone PCR is in theorie de hoeveelheid startmateriaal verbonden met de
hoeveelheid PCR-product na een gegeven aantal cycli. In praktijk echter worden vaak verschillende hoeveelheden PCR-product verkregen, waardoor kwantificering onbetrouwbaar is. Met
de komst van qPCR is het nu wel mogelijk om de initiële hoeveelheid genetisch materiaal in
een staal bepalen. (Primrose and Twyman, 2006)
36
Materiaal en Methoden
1. Technieken
In de mastermix van een qPCR-reactie wordt een fluorescerende dye toegevoegd, die enkel
zal fluoresceren wanneer ze ingebouwd zit in dubbelstrengig DNA (dsDNA). De hoeveelheid
fluorescentie zal met andere woorden stijgen met de hoeveelheid dsDNA, en dus met het aantal
cycli. Door deze stijging grafisch uit te zetten ten opzichte van het aantal cycli kan men de
kinetiek van de reactie in real-time volgen.
Voor de analyse van de data wordt de CQ -waarde (Quantification Cycle) gebruikt. Deze waarde
is gedefiniëerd als de cyclus waarbij de fluorescentie het sterkst stijgt, en wordt bepaald door
het eerste maximum van de tweede afgeleide van de amplificatiecurve. Deze CQ -waarde hangt
af van de hoeveelheid startmateriaal aangezien hoe lager de initiële concentratie, hoe meer cycli
nodig zullen zijn vooraleer de tweede afgeleide zijn maximum bereikt. Zoals eerder vermeld is
de eindconcentratie, en dus de eindfluorescentie, meestal niet reproduceerbaar, in tegenstelling
tot de CQ -waarde. Het voordeel van deze methode om CQ te bepalen is dat ze onafhankelijk
is van de onderzoeker (cfr. vroeger wanneer de onderzoeker zelf een threshold -waarde moest
instellen en waarbij de CT -waarde (Threshold Cycle) de cyclus aangaf waarbij deze threshold
overschreden wordt). (zie figuur 2.7) (Wittwer et al., 2001; Roche Applied Science, 2005;
Biogazelle, 2011b)
De verworven data van qPCR-experimenten wordt geanalyseerd met behulp van de qbaseP LU S
software (Biogazelle).
Figuur 2.7: DNA amplificatie curve van een qPCR-reactie. De rode curve is de
eerste afgeleide en de rode de tweede. Aangepast van (Biogazelle, 2011b)
qPCR kan ook gebruikt worden voor de analyse van deleties en duplicaties in en rond genen
(Copy Number Evaluation (CNE)). De experimentele opzet hiervan en daaropvolgende dataanalyse verloopt conform het artikel van D’haene et al. (2010) en met behulp de copy number
analysis module van de qbaseP LU S v2.0 software (Biogazelle, 2011a).
In dergelijke analyses worden telkens minstens twee referentiegenen (in dit geval ZNF80 en
GPR15) mee geëvalueerd. Zoals voor alle PCR-gebaseerde methoden wordt een negatieve
controle geı̈ncludeerd die geen genetisch materiaal bevat. Verder worden een of meerdere
positieve controles met een gekend kopij-aantal geı̈ncludeerd.
Door de CQ -waarden van de stalen te vergelijken met deze van de positieve controles kunnen
conclusies getrokken worden in verband met de aanwezigheid van deleties en/of duplicaties.
(D’haene et al., 2010)
37
Materiaal en Methoden
1. Technieken
1.7.1 Benodigdheden
• LightCycler® 480 (Roche)
• Vortexer
• Microcentrifuge
• Centrifuge
• Nuclease-vrij water (Sigma, W4502)
• RealTime Ready DNA Probes Master (Roche, 05 502 381 001)
• LightCycler® 480 ResoLight Dye (Roche, 04 909 640 001)
• Werkoplossing van zelfontworpen primers, 5µM (IDT)
• Humaan genomisch DNA (Roche, 11 691 112 001)
• DNA-staal, 5ng/µL
• 384-well-qPCR-plaat (Roche, 138820)
• 0,5mL SafeSeal Microcentrifuge Tubes (Sorenson® BioScience Inc., 11080)
• LightCycler® 480 Sealing Foil (Roche, 04 729 757 001)
1.7.2 Protocol
1. Werk in het donker aangezien het lichtgevoelige ResoLight gebruikt wordt.
2. Stel per primerpaar een reactiemengsel samen in een epje van geschikt volume.
• 1,25µL Master mix (5x)
• 0,25µL ResoLight
• 0,25µL forward primer (5µM)
• 0,25µL reverse primer (5µM)
• 1,00µL H2 O
3. Voeg het reactiemengsel toe aan de welletjes van de 384-well-qPCR-plaat.
4. Voeg 2µL DNA-staal, gDNA of H2 O toe aan de daartoe bestemde welletjes. Werk in
duplo.
5. Sluit de plaat goed af met een LightCycler® 480 sealing foil.
6. Centrifugeer de plaat gedurende 1 minuut aan 1500rpm.
7. Voer de plaat in de schuif van de LightCycler® 480 in.
8. Open de LightCycler® software en klik op “New experiment”.
38
1. Technieken
Materiaal en Methoden
9. Klik op “Apply templates” en kies “Templates > Run templates > Roche 5xMM ”. Dit
qPCR-temperatuursprogramma ziet er als volgt uit:
• 1 minuut bij 95◦ C
• 3 seconden bij 95◦ C


• 30 seconden bij 60◦ C 
• 5 seconden bij 65◦ C
45 cycli
• temperatuursstijging van 65◦ C tot 95◦ C
10. Klik op “Start run”.
11. Sla het experiment op in de gewenste map.
12. De analyse van de data gebeurt aan de hand van de software qbaseP LU S (Biogazelle).
1.8
Amplificatie van volledige genomen
Wanneer onvoldoende DNA van een bepaalde patiënt aanwezig is, kan men het volledige genoom amplificeren met behulp van Whole Genome Amplification (WGA). In het CMGG wordt
hiervoor standaard gebruik gemaakt van de GenomiPhi methode van GE HealthCare. Figuur
2.8 illustreert deze methode.
Figuur 2.8: Schematische voorstelling van het amplificatieproces met GenomiPhi.
(GE Healthcare, 2010)
In een eerste stap zullen random hexameer primers op meerdere plaatsen met het te amplificeren, gedenatureerde DNA hybridiseren. Vervolgens zal het Phi29 DNA-polymerase de replicatie
aan deze plaatsen initiëren. Wanneer het polymerase nieuw gesynthetiseerd dsDNA tegenkomt,
treedt er strand displacement op waarbij de oude streng vervangen wordt door de nieuw gegenereerde streng. Op deze manier komt er telkens enkelstrengig DNA (ssDNA) vrij, waarop
opnieuw primers zullen binden. Opnieuw zal er strand displacement optreden, wat resulteert
in de vorming van dubbelstrengig DNA. (GE Healthcare, 2010)
Na deze amplificatie zullen de stalen met behulp van ethanolprecipitatie opgezuiverd en geanalyseerd worden (zie paragraaf 1.9).
39
Materiaal en Methoden
1. Technieken
1.8.1 Benodigdheden
• PCR-Thermocycler (Bio-Rad)
• Microcentrifuge
• Gekoelde blok voor epjes
• Gekoelde blok voor PCR-platen
• illustra GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit (GE Healthcare, 25-6600-32)
• DNA-staal (10ng/µL, verdund in TE of water)
• 0,2mL Thermo-Strip (ThermoScientific, AB-0266) of Thermo-Fast® 96, Non-Skirted
(ThermoScientific, AB-0600)
• Adhesive PCR Film (ThermoScientific, AB-0558)
1.8.2 Protocol
Zie protocols op de website van het CMGG, document “Genomiphi whole genome amplification”.
1. Behoud de reagentia steeds in de gekoelde blok.
2. Voer het protocol 3 maal uit per DNA-staal.
3. Ontdooi, vortex en centrifugeer de sample buffer en de reaction buffer.
4. Pipetteer 9µL sample buffer in elk welletje.
5. Voeg 1µL DNA-staal aan elke well toe.
6. Denatureer de DNA-stalen door ze 3 minuten te verwarmen op 95◦ C en ze vervolgens af
te koelen tot 4◦ C. Plaats de stalen hierna meteen in de gekoelde blok.
7. Centrifugeer de enzyme mix.
8. Bereid een mastermix voor elk staal + 10%.
• 9µL reaction buffer
• 1µL enzyme mix
9. Transfereer 10µL mastermix naar de gekoelde, gedenatureerde DNA-stalen.
10. Sluit de plaat/strips af met stripdeksels/Thermoseal.
11. Voer de amplificatiereactie uit volgens onderstaand temperatuursprotocol.
• 1,5 uur bij 30◦ C
• 10 minuten bij 65◦ C
• 10 minuten bij 4◦ C
12. Bewaar het geamplificeerde DNA bij -20◦ C.
40
Materiaal en Methoden
1.9
1. Technieken
Opzuivering van DNA
Na WGA met de GenomiPhi procedure wordt door de firma aangeraden om het verkregen
dubbelstrengige DNA op te zuiveren met behulp van ethanolprecipitatie. In een eerste stadium
wordt natriumacetaat (NaAc), een zout, aan het opgeloste DNA toegevoegd. Opgelost in
water zal dit zout opsplitsen in Na+ en [CH3 COO]− . Het positief geladen natriumion zal dan
de negatieve ladingen van het DNA neutraliseren, waardoor het slechter oplosbaar wordt in
water. Dit proces is veel efficiënter in ethanol dan in H2 0, waardoor ethanol aan het mengsel
toegevoegd wordt. Na centrifugatie worden de verkregen pellets vervolgens met 70% ethanol
gewassen om eventuele zoutresten te verwijderen. (Sambrook and Russell, 2001)
Om te bepalen hoeveel DNA de WGA opgebracht heeft, zal men de gezuiverde stalen met
behulp van de NanoDrop® analyseren.
1.9.1 Benodigdheden
• Microcentrifuge
• Vacuum-centrifuge
• NanoDrop® ND-1000 spectrofotometer (Thermo Scientific)
• 100% ethanol (VWR, 1115)
• Nuclease-vrij water (Sigma, W4502)
• NaAc 3M pH 5,6 oplossing gemaakt uit stock (Vel, 1698)
• Ethyleendiaminetetraäzijnzuur (EDTA) 0,5M pH 8(Invitrogen, 15575-038)
• TE buffer (Invitrogen, 12090-015)
• Geamplificeerd DNA
• Safe-Lock Eppendorf Tubes 1,5mL (Eppendorf, 4843140)
1.9.2 Protocol
Zie protocols op de website van het CMGG, document “Ethanol Precipitation Recommended
by Genomiphi ”.
1. Breng de inhoud van de drie epjes geamplifeerd DNA die afkomstig zijn van hetzelfde
staal samen in een 1,5mL epje (totaalvolume 60µL).
2. Maak een 1,5M NaAc/0,25M EDTA mengsel aan per geamplificeerd staal.
• 7,5µL 3M NaAc
• 7,5µL 0,5M EDTA
41
Materiaal en Methoden
1. Technieken
3. Maak een 70% ethanol oplossing aan per geamplificeerd staal.
• 700µL 100% ethanol
• 300µL H2 0
4. Voeg 60µL H2 0 toe aan de geamplificeerde stalen.
5. Voeg 12µL van het NaAc/EDTA mengsel toe en meng goed.
6. Voeg 308µL 100% ethanol toe en meng goed.
7. Centrifugeer de epjes bij kamertemperatuur (!) voor 15 minuten aan 12 000 rpm.
8. Verwijder zoveel mogelijk supernatans.
9. Was de pellets met 1mL 70% ethanol. Centrifugeer voor 1 minuut aan 12 000 rpm.
10. Verwijder het supernatans.
11. Laat de pellets aan de lucht drogen of damp ze droog in een vacuüm-centrifuge. Let er
wel op om de pellets niet te droog te maken, want dan zullen ze moeilijk te resuspenderen
zijn.
12. Resuspendeer de pellets in 50µL TE buffer.
13. Meet de concentratie van de gezuiverde, geamplificeerde stalen met de NanoDrop® ND1000 spectrofotometer, zoals beschreven in paragraaf 1.2.
1.10
In silico analyses
1.10.1 Selectie van kandidaat-regulatorische regio’s
Voor de selectie van kandidaat-regulatorische regio’s kan men enerzijds nakijken of er al dergelijke elementen in de literatuur beschreven werden en in de Vista Enhancer databank opgenomen zijn. Anderzijds kan de conservatie binnen verschillende soorten nagegaan worden met
behulp van diverse webtools.
• Vista Enhancer browser
http://enhancer.lbl.gov/
• ECR browser (Evolutionary Conserved Regions)
http://ecrbrowser.dcode.org
• Ancora (Atlas of Non-Coding Conserved Regions in Animals)
http://ancora.genereg.net
42
Materiaal en Methoden
1. Technieken
1.10.2 Ontwerpen van primers
1. Zoek het gen/de regio van interesse op in Ensembl, selecteer een transcript en kies in het
menu rechts om de exonen weer te geven.
http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index
Kies bij “Configure this page” volgende instellingen:
• “Flanking sequence at either end of transcript:” 50bp
• “Intron base pairs to show at splice sites:” 200bp
2. Kopieer de sequentie in een Word-bestand.
3. Kopieer de te amplificeren sequentie met ongeveer 50bp extra, zowel links als rechts, in
de Primer3 webtool. http://frodo.wi.mit.edu/primer3/
Stel volgende waarden in:
• “Product Size Ranges:” kijk na of de lengte van het amplicon erbij staat
• “Primer size:” Min:18 - Opt:20 - Max:22
Zet vierkante haken rond de exacte te amplificeren sequentie en klik op “Pick Primers”
4. Kijk na of de gevonden primers geschikt zijn via onderstaande webtools:
• Er mogen geen Single nucleotide Polymorphisms (SNPs) in de primers voorkomen
en de primers moeten een uniek stuk DNA amplificeren: geef hiertoe de primers in
in de In-Silico PCR-tool van UCSC.
http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=start
• Er mogen geen secundaire structuren gevormd worden in de primers: geef hiertoe
de sequentie van de In-Silico PCR in in m-fold webtool.
http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form, met condities:
– “Folding temperature:” 60◦ C
– “Ionic conditions:” [Na+ ] 50 mM [Mg++ ] 3mM
• Het GC-gehalte van het amplicon moet rond de 50% liggen: geef hiertoe de sequentie van de In-Silico PCR in in de GC-content webtool.
http://www.sciencebuddies.org/science-fair-projects/project$_$ideas/Genom$_
$GC$_$Calculator.shtml
1.10.3 Mutatie-analyse
Nadat met de SeqScape® v2.5 software (Applied Biosystems) mutaties gevonden zijn, kan met
de Alamut® software (Interactive Biosoftware) het mogelijks effect ervan nagegaan worden.
De aanpak verschilt naargelang de positie waarin de mutatie gevonden werd. In ieder geval
kan de conservatie van de gemuteerde regio in het genoom onderzocht worden met behulp
van de conservatie-track van de UCSC Genome Browser http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/
hgGateway.
43
Materiaal en Methoden
1. Technieken
A. In geval van een mutatie gevonden in de 5’UTR, 3’UTR en in intronisch gebied
In dergelijke gebieden kan een mutatie zo goed als enkel een effect hebben op het genproduct wanneer het een splice site modificeert. Er zijn twee belangrijke webtools waarmee dit
gecontroleerd kan worden.
• Splice Site Prediction van de Berkeley Drosophila Genome Project
http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html
• Human Splicing Finder
http://www.umd.be/HSF/
Alamut® beschikt verder ook over een ingebouwde analyse die gebaseerd is op
• Splice-signaal detectie:
– SpliceSiteFinder-like
– MaxEntScan
– GeneSplicer
– Gekende constitutieve signalen
• ESE (Exonic Splicing Enhancer ) bindingsplaats detectie:
– ESEFinder
– RESCUE-ESE
(Interactive Biosystems, 2011)
Indien de mutatie zich in een laag-geconserveerde regio ver van de coderende regio bevindt en
er zich geen splice site modificatie lijkt voor te doen, zal de mutatie vermoedelijk geen effect
uitoefenen en wordt deze dan ook buiten beschouwing gelaten.
B. In geval van een mutatie gevonden in coderend gebied
Mutaties in het coderende gebied van een gen hebben veel meer kans om een effect uit te oefenen
op het gevormde proteı̈ne. Zo kunnen ze eveneens een splice site modificatie veroorzaken (tools
zie vorige paragraaf). Verder kunnen ze er ook voor zorgen dat een foutief aminozuur ingebouwd
wordt of dat het eiwit maar deels of zelfs helemaal niet overgeschreven wordt. De graad van
pathogeniciteit van dergelijke mutaties kan met onderstaande tools onderzocht worden, waarvan
deze eerste drie eveneens in Alamut® ingebouwd zijn.
44
Materiaal en Methoden
2. Werkwijze
• SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant)
http://sift.jcvi.org/www/SIFT_seq_submit2.html
De webtool SIFT maakt voorspellingen over het effect van mutaties op de eiwitfunctie
door informatie te verzamelen uit aligneringen. Deze tool is gebaseerd op het idee dat
de evolutie van eiwitten gecorreleerd is aan hun functie. Posities die belangrijk zijn
voor de eiwitfunctie zouden namelijk geconserveerd moeten zijn in een alignering van de
eiwitfamilie en onbelangrijke posities zouden verschillen moeten vertonen. (SIFT, 2011)
• PolyPhen-2 (Polymorphism Phenotyping v2 )
http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/
De webtool PolyPhen-2 maakt eveneens voorspellingen over de impact van aminozuursubstituties op de eiwitstructuur en -functie. Het maakt hiervoor gebruik van informatie
omtrent de sequentie, de fylogenie en de structuur van de omgeving van de substitutie.
Eigenschappen van wild-type allelen en hun overeenkomstige mutanten worden vergeleken en een aantal homologe sequenties worden gealigneerd. Vervolgens wordt nagekeken
(1) hoe groot de kans is, gegeven de alignering, dat beide allelen de bepaalde positie
innemen, (2) hoe groot de evolutionaire afstand is tussen het eerste mutante eiwit en het
wild-type eiwit en (3) of het mutante allel in een mutatiehotspot gelegen is. (Adzhubei
et al., 2010)
• Grantham scorematrix (Grantham, 1974)
Deze scorematrix geeft een maat aan voor de fysicochemische afstand tussen twee aminozuren (Grantham, 1974).
2
Werkwijze
Het onderzoek naar het MEF2C -gen verliep in drie verschillende luiken. In eerste instantie
werd de translocatie in de proband fijngemapt. Daarna werd de coderende regio onderzocht op
de aanwezigheid van mutaties. Het derde luik bestond er ten slotte in om met behulp van qPCR
de gene desert stroomopwaarts van het gen te analyseren op de aanwezigheid van deleties en
duplicaties in geconserveerde regio’s.
In onderstaande paragrafen zal de werkwijze van deze drie luiken uitgewerkt worden.
2.1
Fijnmappen van de translocatie in de proband
Met behulp van karyotypering en FISH-analyses werd de translocatie in de proband gevonden
en fijngemapt. Verder werd een Mate Pair Library van de proband opgesteld en geanalyseerd
met behulp van in-huis bio-informaticamethoden (Menten et al., 2005). Nadat de resultaten
hiervan bekend waren werden de breukpunten exact gelokaliseerd met behulp van PCR en daaropvolgende Sanger sequenering. Hiervoor werden voor beide derivatieven primers ontworpen
(zie bijlage 1.1 p.73) in de regio’s van de clusters waarvan beide fragmenten van de Mate Pairs
op verschillende chromosomen mappen (zie discussie).
45
Materiaal en Methoden
2.2
2. Werkwijze
Mutatie-analyse
De mutatie-analyse werd uitgevoerd met behulp van de HRM-technologie (samenstelling reactiemengsels, zie bijlage 2.2 en temperatuurprotocols, zie bijlage 2.3). Hiertoe werden primers voor de verschillende exonen ontworpen (zie bijlage tabel A.2). Vervolgens werden de
patiëntenstalen verdund naar een concentratie van 25ng/µL. Stalen waarvan onvoldoende DNA
beschikbaar was, werden geamplificeerd met behulp van de WGA-methode en vervolgens opgezuiverd door middel van ethanolprecipitatie.
Analyse van de smeltprofielen liet toe stalen te selecteren die afwijkende profielen vertoonden
(normalisatietemperaturen, zie bijlage tabel A.4). Deze afwijkende stalen werden vervolgens
gesequeneerd en indien meerdere stalen eenzelfde afwijkende profiel vertoonden, werd hieruit
slechts één staal gesequeneerd. Indien de mutaties relevant bleken te zijn, werden de smeltprofielen van deze stalen opnieuw bekeken en werd hetzelfde staal ter validatie opnieuw gesequeneerd, evenals stalen die eenzelfde smeltprofiel vertoonden. Enkel de gevalideerde relevante
mutaties werden in de resultaten opgenomen.
2.3
Onderzoek naar regulatorische regio’s
Veertien kandidaat-regulatorische gebieden werden geselecteerd op basis van de literatuur en
webtools die conservatie binnen verschillende soorten weergeven (zie paragraaf 1.10.1 p.42).
Het onderzoek naar deze kandidaat-regulatorische regio’s werd uitgevoerd met behulp van
qPCR. Er werden primers voor deze veertien regio’s ontworpen (zie bijlage tabel A.5) en de
patiëntenstalen werden verdund naar een concentratie van 5ng/µL.
Eén van de kandidaat-regulatorische regio’s, element 789 (Vista Enhancer databank), werd
eveneens voor alle patiënten gesequeneerd (primers en PCR-condities, zie bijlage tabel A.3,
paragraaf 2.3 en tabel A.5).
46
3
Resultaten
1
Fijnmappen van de translocatie in de proband
1.1
Karyotypering
Figuur 3.1 geeft het karyogram van de proband weer. Hierop is duidelijk te zien dat er een
translocatie aanwezig is tussen chromosoomarmen 3p en 5q. Het karyotype van de proband
kan geschreven worden als 46,XX,t(3;5)(p24.1;q14.3)dn.
Figuur 3.1: Karyogram van de proband met translocatie tussen 3p en 5q. De rode
pijlen stellen de breukpunten voor. (CMGG, 2010)
1.2
FISH
Tabel 3.1 bevat de gegevens van de FISH-probes in de directe omgeving van de breukpunten.
Tabel 3.1: FISH-probes in de directe omgeving van de breukpunten, de vetgedrukte
probes overspannen de breukpunten.
Naam
RP11-11L6
RP11-66O9
RP11-775F14
RP11-293L18
RP11-153K07
RP11-276J11
Kleur
Begin (hg19)
Einde (hg19)
Band
groen
rood
28749004
29184895
29302813
28849354
29364595
29456057
3p24.1
3p24.1
3p24.1
chr3 en der5
chr3, der3 en der5
chr3 en der3
88436932
88548862
88606604
88585438
88681442
88774389
5q14.3
5q14.3
5q14.3
chr5 en der5
chr5, der5 en der3
chr5 en der3
groen
rood
Signaal
47
1. Fijnmappen van de translocatie in de proband
Resultaten
In figuur 3.2 worden de microscopische beelden van de FISH-analyse weergegeven.
(a) hybridisatie op chromosoom 3
(b) hybridisatie op chromosoom 5
Figuur 3.2: Microscopische beelden van de FISH-analyse. (CMGG, 2010)
1.3
Mate Pair Sequencing
Figuren 3.3 en 3.4 visualiseren de data van de Mate Pair Sequencing respectievelijk als een
circosplot en met de in-huis ontwikkelde arrayCGHbase software (Menten et al., 2005). Twee
clusters van mates mappen gedeeltelijk op chromosoom 3 en 5. Onderstaande tabel geeft de
baseposities van deze clusters weer.
Tabel 3.2: Baseposities van de clusters die gedeeltelijk op chromosoom 3 en 5
mappen (HH = Head-to-Head oriëntatie, tt = Tail-to-Tail oriëntatie, zie
paragraaf 1 p.53).
Derivatief 3 (HH)
Derivatief 5 (tt)
Posities op chr3
Posities op chr5
Aantal mates
29300609 - 29301935
29297853 - 29299463
88598398 - 88599966
88595584 - 88597509
6
5
Figuur 3.3: Circosplot van de proband van chromosoom 3 en 5. (CMGG, 2011)
48
Resultaten
(a) breukpunt op chromosoom 3
2. Mutatie-analyse
(b) breukpunt op chromosoom 5
Figuur 3.4: Visualisatie van de Mate Pair Sequencing data in arrayCGHbase. De
groene lijnen stellen de posities van de breukpunten voor, de blauwe
lijnen onder de ingezoomde chromosomen de posities van de genen en
de zwarte rechthoekjes de coverage. (CMGG, 2011)
1.4
Exacte lokalisatie breukpunten
Op derivatief 3 werd het breukpunt van chromosoom 3 gelokaliseerd op base 29299919(hg19)
en het breukpunt van chromosoom 5 op base 88597864(hg19). Tussen de delen van beide
chromosomen is een insertie van 13bp aanwezig. Op derivatief 5 werd het breukpunt van
chromosoom 3 gelokaliseerd op base 29299928(hg19) en het breukpunt van chromosoom 5
op base 88597847(hg19). Tussen de delen van beide chromosomen is een insertie van 12bp
aanwezig. Figuur 3.5 visualiseert deze resultaten.
Figuur 3.5: Exacte locaties (hg19) van de breukpunten van de translocatie in de
proband. (Hiller et al., 2004)
2
2.1
Mutatie-analyse
Mutaties in de 5’UTR
Mutaties in dit gebied werden voorlopig niet verder geanalyseerd aangezien ze zeer moeilijk te
koppelen zijn aan een functioneel effect in de betreffende patiënt. Wel werd er nagekeken of ze
zich bevinden in een regio met hoge of lage conservatie en of ze splice site varianten kunnen
veroorzaken. In alle gevallen was de mutatie gelegen in een gebied met lage conservatie en
werden er geen mogelijke splice site modificaties gevonden. Tabel 3.3 geeft een overzicht van
deze mutaties weer.
49
2. Mutatie-analyse
Resultaten
Tabel 3.3: Gevonden mutaties in de 5’UTR. De nummering van de nucleotiden is
gebaseerd op hg19.
2.2
Afwijking
Positie
Aantal patiënten
g.88183437 88183438insA
g.88179153T>C
g.88179156C>T
g.88119722A>G
g.88119744A>G
g.88119745G>A
intron 1 transcript 2
exon 1
exon 1
exon 2
exon 2
exon 2
2
1
1
2
5
3
Mutaties in de coderende regio
In patiënt A6H1 werd in exon 4α2 een heterozygote mutatie van A naar G ontdekt op positie
88056902(hg19). In patiënt G5H3 werd in exon 5 een heterozygote synonieme mutatie van C
naar T ontdekt op positie 88047823(hg19). Figuur 3.6 toont de elektroferogrammen van deze
mutaties en hun respectievelijke referentiesequenties.
(a) patiënt A6H1
c.298G>A, p.D100N (gebaseerd op NM 001131005.2)
(b) patiënt G5H3
c.446C>T, p.I149I (gebaseerd op NM 002397.4)
Figuur 3.6: Elektroferogrammen van mutaties en bijhorende referentiesequenties in
de coderende regio van MEF2C.
2.3
Mutaties in intronen
In meerdere stalen werden twee veel voorkomende SNPs teruggevonden. Deze werden gecorreleerd met de smeltprofielen en samengevat in tabel 3.4.
Tabel 3.4: Gevonden heterozygote SNPs in intronen. De nummering van de nucleotiden is gebaseerd op cDNA van de referentiesequentie van isovorm 1 van
GenBank, NM 002397.4.
Afwijking
Positie
Nr in dbSNP
Aantal patiënten
c.589+57A>C
c.590-95C>A
intron 5
intron 5
rs3729703
rs10514303
15
47
50
Resultaten
3
3.1
3. Onderzoek naar regulatorische regio’s
Onderzoek naar regulatorische regio’s
Selectie van kandidaat-regulatorische regio’s
Veertien kandidaat-regulatorische regio’s voor het MEF2C -gen werden geselecteerd uit de literatuur (Chahrour et al., 2008), de Vista Enhancer Browser en op basis van conservatie binnen
verschillende soorten. Indien minstens twee webtools conservatie van een bepaalde regio aanduiden, werd deze regio in de analyse opgenomen. Figuur 3.7 geeft aan waar deze regio’s zich
ten opzichte van het MEF2C -gen bevinden. Vista Enhancer element 789 is het gevalideerde
element dat het dichtst bij het breukpunt van de translocatie in de proband ligt en werd in alle
patiënten gesequeneerd.
Figuur 3.7: Grafische weergave van de locatie van de veertien geselecteerde
kandidaat-regulatorische regio’s. (UCSC Genome Browser, Human Feb.
2009 (GRCh37/hg19) assembly) (Chahrour et al., 2008)
3.2
Element 789
In patiënt F8H2 werd een heterozygote mutatie van T naar C ontdekt op positie 88673754(hg19).
In patiënt D2H4 werd een heterozygote mutatie van A naar G ontdekt op positie 88673594(hg19).
Figuur 3.8 geeft de elektroferogrammen van deze mutaties en hun respectievelijke referentiesequenties weer.
(a) patiënt F8H2
g.88673754T>C (gebaseerd op hg19)
(b) patiënt D2H4
g.88673594A>G (gebaseerd op hg19)
Figuur 3.8: Elektroferogrammen van mutaties en bijhorende referentiesequenties in
het element 789.
51
3. Onderzoek naar regulatorische regio’s
Resultaten
Twee veelvoorkomende heterozygote SNPs werden in meerdere patiënten geobserveerd. Tabel
3.5 geeft hier een overzicht van.
Tabel 3.5: Gevonden heterozygote SNPs in het element 789. De nummering van de
nucleotiden is gebaseerd op hg19.
3.3
Afwijking
Nr in dbSNP
Aantal patiënten
g.88673722G>T
g.88674352G>A
rs6876988
rs373000
274
14
Analyse van veertien kandidaat-regulatorische regio’s
In patiënten P84A en P94A zijn CNC12 en 14 gedeleteerd, zoals op onderstaande figuren grafisch aangetoond wordt. Ter vergelijking werd het histogram van patiënt P52B toegevoegd, die
geen deletie vertoont.
2,8
2,7
2,6
2,5
2,4
2,3
2,2
2,1
2,0
1,9
1,8
copy number
1,7
1,6
1,5
1,4
1,3
1,2
1,1
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
16
C
N
C
15
C
N
C
14
C
N
C
12
C
N
C
11
C
N
C
10
C
N
C
09
C
N
C
08
C
N
C
07
C
N
C
C
N
C
06
0,0
normal gain loss
(a) patiënt P52B
2,4
2,3
2,3
2,2
2,2
2,1
2,1
2,0
2,0
1,9
1,9
1,8
1,8
1,7
1,7
1,6
1,6
1,5
1,5
1,4
copy number
1,3
1,2
1,1
1,3
1,2
1,1
1,0
1,0
0,9
0,9
0,8
0,8
0,7
0,7
0,6
0,6
0,5
0,5
0,4
0,4
0,3
0,3
0,2
0,2
0,1
0,1
normal gain loss
(b) patiënt P84A
16
C
N
C
15
C
N
C
14
C
N
C
12
C
N
C
11
C
N
C
10
C
N
C
09
C
N
C
08
C
N
C
07
C
N
C
06
C
N
C
16
C
N
C
15
C
N
C
14
C
N
C
12
C
N
C
11
C
N
C
10
C
N
C
09
C
N
C
08
C
C
N
C
N
C
N
C
07
0,0
06
0,0
C
copy number
1,4
normal gain loss
(c) patiënt P94A
Figuur 3.9: Resultaten van de copy number analyse met behulp van qbaseP LU S . De
grijze balken duiden een normaal kopij-aantal aan (aantal = 2) en de
rode balken tonen het verlies van een kopij aan (aantal = 1).
52
4
Discussie
1
Fijnmappen van de translocatie in de proband
De translocatie in de proband werd fijngemapt door gebruik te maken van vier verschillende
technieken, waarvan de resultaten in figuren 4.7 en 4.8 geı̈llustreerd worden. In eerste instantie
werd een karyogram opgesteld, waaruit werd afgeleid dat de translocatie tussen de chromosoombanden 3p24.1 en 5p14.3 is gelegen.
Vervolgens werden de breukpuntregio’s met behulp van FISH verder verkleind tot circa 100kb.
Dit werd mogelijk gemaakt door de identificatie van breukpuntoverlappende probes die een
extra signaal vertonen op de microscopische beelden. De regio’s werden verder verkleind door
de identificatie van probes die gedeeltelijk met de breukpuntoverlappende probes overlappen,
maar naast de breukpunten gelegen zijn. De regio’s werden vervolgens vergeleken met het referentiegenoom en uit deze data kon reeds besloten worden dat op geen van beide chromosomen
genen onderbroken worden (zie figuren 4.7(a) en 4.8(a)).
Hierna werd Mate Pair Sequencing uitgevoerd en de clusters van fragmenten bepaald waarvan
de mates op de twee verschillende chromosomen mappen (zie figuur 4.1).
(a) chromosoom 3
(b) chromosoom 5
Figuur 4.1: Visualisatie in arrayCGHbase van de clusters van mate pairs gelegen
rond de breukpunten. De HH-cluster ligt telkens op derivatief 3 en de
tt-cluster op derivatief 5 (zie volgend onderdeel). (CMGG, 2011)
53
1. Fijnmappen van de translocatie in de proband
Discussie
1.1
Mate Pair Sequencing
Voor het opstellen van de Mate Pair Library van de proband werd het genoom in fragmenten
van 3kb opgedeeld en dit omwille van meerdere redenen. Ten eerste is het protocol van Illumina
opgesteld voor fragmenten van 2 tot 5 kb. Verder kunnen met de CovarisTM DNA miniTUBE
fragmenten van 2, 3 of 5kb bekomen worden naargelang welke tube gekozen wordt. Tenslotte
bestonden de libraries in voorbije studies van Korbel et al. (2007) en Kloosterman et al. (2011)
respectievelijk uit fragmenten van 3 en 2,5kb.
De fragmenten van 3kb werden vervolgens gecirculariseerd en opnieuw verknipt. De oriëntatie
van de opgezuiverde gebiotinyleerde fragmenten die het begin en het einde van de oorspronkelijke 3kb-fragmenten bevatten, is naar buiten gericht zoals weergegeven op figuur 4.2. (illumina,
2009)
Figuur 4.2: Verklaring van de aanwezigheid van naar buiten gerichte reads die op
een afstand van ∼ 3kb van elkaar liggen en van naar binnen gerichte
reads die op een afstand van 200-400bp van elkaar liggen. In een succesvolle Illumina Mate Pair Library zal de meerderheid aan data bestaan
uit de naar buiten gerichte reads. (illumina, 2009)
Op onderstaand histogram is duidelijk te zien dat voor de proband het merendeel aan reads
naar buiten gericht is en gemiddeld 3kb lang (blauwe gegevens). Er is eveneens een klein
aandeel aan korte fragmenten van gemiddeld 250bp (rode gegevens).
Figuur 4.3: Histogram van de oriëntatie van de reads van de Mate Pair Sequencing
van de proband. (CMGG, 2011)
54
1. Fijnmappen van de translocatie in de proband
Discussie
Algemeen bestaat de analyse van de verkregen data er telkens uit om na te gaan of de mates
die twee per twee bij elkaar horen en op een afstand van 3kb van elkaar in de patiënt gelegen
zijn, eveneens 3kb van elkaar mappen aan het referentiegenoom. Figuur 4.4 geeft weer hoe men
uit de afstand tussen beide mates kan afleiden of er zich een genomische afwijking voordoet.
Uit de oriëntatie van de reads is de genomische structuur van de afwijking eveneens meteen
bekend (zoals bijvoorbeeld in geval van een inversie).
Figuur 4.4: Interpretatie van Paired-end Mapping (PEM) data.
(NCBI dbVar, 2011)
Aangepast van
Voor de analyse van de sequentiegegevens van de proband werden enkel uniek gemapte reads
onderzocht. Met andere woorden werden repetitieve regio’s op deze manier buiten beschouwing
gelaten. Voorts werd er een drempelwaarde vastgelegd zodat enkel de clusters die minstens 4
mates bevatten in de lijst van afwijkingen opgenomen werden. Deze drempelwaarde werd vastgelegd om de werkelijke afwijkingen van de achtergrondruis te onderscheiden.
Uit de lijst met afwijkingen werd de reeds bekende translocatie in de proband teruggevonden.
Dankzij de informatie met betrekking tot de oriëntatie kon afgeleid worden op welk derivatief
de afwijkende clusters gelegen zijn. Figuur 4.5 illustreert dit principe.
Dankzij deze gegevens werden de regio’s waarin de breukpunten gelegen zijn verder verkleind.
Op chromosoom 3 en 5 overspannen deze regio’s respectievelijk nog circa 1,2kb en 900bp.
(a) fragmenten gelegen op derivatief 3
(b) fragmenten gelegen op derivatief 5
Figuur 4.5: Illustratie van de fragmenten die de breukpunten in de proband overspannen. H en T betekenen respectievelijk dat sequenties naar het begin
(head) of het einde (tail) van de referentiechromosomen wijzen. Op de
sense streng wordt dit aangeduid met hoofdletters en op de antisense
streng met kleine letters. Bij normale reads is de oriëntatie van de
clusters steeds tH. Bij deze patiënt is de oriëntatie van de breukpuntoverlappende clusters gelegen op derivatief 3 HH en op derivatief 5 tt.
Naast de translocatie tussen chromosoom 3 en 5 werden er eveneens andere afwijkingen gevonden zoals bijvoorbeeld kleine deleties en duplicaties (zie figuur 4.6). Ook op de circosplot
van chromosoom 3 en 5 (figuur 3.3) zijn dergelijke afwijkingen zichtbaar in de vorm van kleine
strepen.
55
1. Fijnmappen van de translocatie in de proband
Discussie
Deze afwijkingen werden vergeleken met de Database of Genomic Variants en de meerderheid
werd hier ook in teruggevonden. Deze databank tracht een duidelijke samenvatting weer te
geven van structurele afwijkingen (> 1kb) en InDels (100bp-1kb) in gezonde controle individu’s
(Zhang et al., 2006). Naar de toekomst toe zal de informatie in dergelijke databanken toenemen
dankzij de dalende sequeneringskosten en experimenten als deze. Hoe meer informatie voorhanden is, hoe correcter men de varianten identiek aan de onderzochte individuen zal kunnen
identificeren.
(a) deletie in 4q31.21
(b) duplicatie in 9q34.3
Figuur 4.6: Visualisatie in arrayCGHbase van afwijkingen in de proband en bijhorende gegevens uit de Database of Genomic Variants (blauwe lijnen).
(CMGG, 2011)
Tot slot zijn er meerdere voordelen verbonden aan het gebruik van een Mate Pair Library
(fragmenten van ∼ 3kb) ten opzichte van arrayCGH en een Paired-end Library (fragmenten
van ∼ 300bp). Zo kunnen zowel gebalanceerde als niet-gebalanceerde afwijkingen opgespoord
worden en kan de genomische structuur van de afwijkingen uit de oriëntatie van de reads
afgeleid worden. Structurele afwijkingen komen verder vaak voor in repetitieve sequenties,
die gemakkelijker overbrugd worden door grotere fragmenten, wat voor problemen kan zorgen
bij een Paired-end Library. Bovendien kan men met grotere fragmenten gemakkelijker een
fysische genoom-coverage bereiken die voldoende is om structurele afwijkingen betrouwbaar te
identificeren. (Korbel et al., 2007; Kloosterman et al., 2011)
1.2
Exacte lokalisatie breukpunten
De grootte van de regio’s (1,2kb en 900bp) liet uiteindelijk toe PCR-reacties uit te voeren die
de gehele regio overspannen, waarna de verkregen fragmenten gesequeneerd werden met behulp
van de Sanger methode. Vervolgens werden de sequenties vergeleken met het referentiegenoom
en konden de breukpunten tot op de base gelokaliseerd worden.
Wat betreft chromosoom 3 is de regio 29299919(hg19) - 29299928(hg19) zowel op derivatief 3
als 5 aanwezig, wat duidt op een duplicatie van 10bp. Wat betreft chromosoom 5 is de regio
88597847(hg19) - 88597864(hg19) op geen van beide derivatieven aanwezig, wat een deletie van
16bp inhoudt.
56
Discussie
1. Fijnmappen van de translocatie in de proband
De inserties van 13bp op derivatief 3 en van 12bp op derivatief 5 zijn waarschijnlijk te wijten
aan end-repair mechanismen. Dergelijke mechanismen treden op om breuken in het DNA te
herstellen. De geı̈nsereerde sequenties zijn niet complementair aan de breukpuntregio’s van
één van beide chromosomen en in deze regio’s werden evenmin gelijkende repetitieve sequenties
gevonden.
1.3
Vergelijking van de verschillende methoden
In figuren 4.7 en 4.8 is duidelijk te zien dat de verschillende methoden, die gebruikt werden
voor het fijnmappen, telkens de regio verkleinen waarin het breukpunt gelegen is. Hieruit kan
besloten worden dat de verschillende technieken correcte resultaten opleveren. De data-analyse
van Mate Pair Sequencing experimenten omvat nog heel wat moeilijkheden, maar deze reeks
methoden heeft aangetoond dat de technologie en de daaropvolgende data-analyse in dit geval
gevalideerd zijn.
(a) ingezoomd op de regio tussen ZCWPW2 en RBMS3
(b) ingezoomd op de Mate Pare Sequencing
Figuur 4.7: Samenvatting van de resultaten van het fijnmappen van het translocatiebreukpunt op chromosoom 3. (UCSC Genome Browser, Human Feb.
2009 (GRCh37/hg19) assembly)
(a) ingezoomd op de regio tussen MEF2C en CETN3
(b) ingezoomd op de Mate Pare Sequencing
Figuur 4.8: Samenvatting van de resultaten van het fijnmappen van het translocatiebreukpunt op chromosoom 5. (UCSC Genome Browser, Human Feb.
2009 (GRCh37/hg19) assembly)
57
Discussie
2
2.1
2. Mutatie-analyse van MEF2C
Mutatie-analyse van MEF2C
Optimalisatie van High Resolution Melting
Er werd heel wat aandacht besteed aan de optimalisatie van de HRM-technologie voor de
verschillende amplicons van MEF2C. Er zijn namelijk heel wat parameters die de interpreteerbaarheid van de verkregen smeltprofielen beı̈nvloeden.
De primers werden volgens de standaardprocedure (zie paragraaf 1.10.2 p.43) ontworpen. Er
werd wel voor gezorgd dat de amplicons maximaal 400bp lang waren, aangezien in voorgaande
studies enkel bij fragmenten van deze lengte een sensitiviteit en een specificiteit van 100%
waargenomen werd. Deze redenering is gebaseerd op het feit dat hoe kleiner de fragmenten
zijn, hoe groter de fluorescentieverschillen zijn die veroorzaakt zijn door mutaties. Dergelijke
grote verschillen zijn nauwkeuriger te detecteren en te karakteriseren. Voor de experimenten
in deze thesis varieert de ampliconlengte tussen 170 en 375bp (zie tabel A.2 in bijlage). (Reed
and Wittwer, 2004)
Bij moeilijk te amplicificeren GC-rijke amplicons werd 5% DMSO aan het reactiemengsel toegevoegd (zie tabel A.3 in bijlage). DMSO zorgt ervoor dat secundaire structuren in het dsDNA
verwijderd worden, waardoor de denaturatie gemakkelijker verloopt. DMSO verhindert eveneens de hybridisatie van gedenatureerde strengen, waardoor de primers beter kunnen aanhechten, wat een verhoogde specificiteit tot gevolg heeft.
Op aanraden van Idaho Technology Inc. werden aan de PCR-protocols steeds een extra extentiestap bij 72◦ C en een denaturatiestap bij 95◦ C ingebouwd na het doorlopen van de amplificatiecycli. Om aspecificiteit te vermijden, werden voor meerdere amplicons verschillende annealingstemperaturen getest met behulp van gradiënt-PCR. Ook werden er verschillende annealingsen extentietijden gebruikt, waarbij de optimale waarden afhangen van de lengte, de sequentie
en de secundaire structuur van het amplicon. (zie bijlage 2.3)
Voor de data-analyse werden per amplicon zoveel mogelijk gelijke normalisatiewaarden gebruikt
om de resultaten van verschillende platen zo goed mogelijk met elkaar te kunnen vergelijken.
Per amplicon werden meerdere waarden getest en wanneer de smeltprofielen twee pieken vertoonden, werden deze met behulp van de normalisatie-instellingen in twee aparte gebieden
opgedeeld (zie tabel A.4 in bijlage). Het is van belang dat de normalisatiewaarden goed gekozen worden aangezien ze de specificiteit van de analyse beı̈nvloeden.
Algemeen kan gesteld worden dat de HRM-technologie een precieze, snelle en kostenbesparende
methode is om afwijkingen in sequenties te detecteren. De experimenten in deze thesis bevestigen dat afwijkingen met deze techniek geı̈dentificeerd worden aangezien er meerdere SNPs
en twee mutaties gevonden werden. Na het verrichten van een eerste optimalisatie kan deze
techniek perfect fungeren als pre-screenmethode voor Sanger sequenering. Indien men HRM
echter wenst te gebruiken voor genotypering dient de optimalisatie nog verder uitgewerkt te
worden.
58
2. Mutatie-analyse van MEF2C
Discussie
2.2
Missense mutatie
In exon 4α2 werd een heterozygote missense mutatie gevonden waarbij op eiwitpositie 100
asparaginezuur ingebouwd wordt in plaats van asparagine. Er is geen informatie beschikbaar
met betrekking tot de ouders van de patiënt aangezien de cohorte geanonimiseerd is. Positie
100 is redelijk sterk geconserveerd. De chemische structuren van beide aminozuren worden
weergegeven in figuur 4.9.
(a) asparagine
(b) asparaginezuur
Figuur 4.9: Chemische structuren van asparaginezuur en asparagine. (Freeman,
2008)
Zoals uit de structuren af te leiden is, bezit asparagine een polaire zijketen en asparaginezuur
een negatief geladen zijketen. Overigens zijn beide structuren erg gelijkaardig. De fysicochemische verschillen/gelijkenissen worden gekenmerkt door een Grantham-score van 23. Deze
waarde is beduidend lager dan 60, vanaf wanneer men een pathogeen effect vermoedt. (Grantham, 1974)
SIFT voorspelt dat de substitutie de functie van het eiwit verstoort, en dit met een score van
0,02. Deze score betekent dat er 0,02 kans is dat op positie 100 een asparaginezuur voorkomt,
ten opzichte van een kans van 1,00 voor asparagine. Vanaf scores van 0,05 wordt voorspeld
dat substituties getolereerd worden. De mediaan van de conservatie van de alignering bedraagt
3,02, wat betekent dat de alignering voldoende niet-verwante sequenties bevat. Er werden in
deze alignering 13 sequenties opgenomen, wat niet erg veel is. (SIFT, 2011)
PolyPhen-2 voorspelt dat de gevonden mutatie hoogstwaarschijnlijk (95% kans) schadelijk is
en dit met een sensitiviteit van 62% en een specificiteit van 92%. Hiervoor werd de HumVar
trainingsset gebruikt, die bestaat uit alle humane mutaties uit UniProtKB die ziekte veroorzaken en uit vaak voorkomende humane niet-synonieme SNPs waarvan niet bekend is dat ze in
ziekte betrokken zijn (deze werden beschouwd als onschadelijk). (Adzhubei et al., 2010)
De missense mutatie is gelegen in exon 4α2. Dit exon is enkel aanwezig in isovorm 2, die
wijdverspreid geëxpresseerd wordt en waarvan de hoogste expressieniveau’s in skeletspieren
opgemeten werden. Figuur 4.10 toont de resultaten van de expressie-analyse uitgevoerd door
Zweier et al. (2010).
59
2. Mutatie-analyse van MEF2C
Discussie
Figuur 4.10: qPCR expressie-analyse van de twee verschillende isovormen van
MEF2C in verschillende humane weefsels. Isovorm 1 vertoont enkel
meetbare expressieniveaus in de hersenen en isovorm 2 komt wijdverspreid voor met de hoogste expressiewaarden in skeletspieren. (Zweier
et al., 2010)
Isovorm 1 is in de patiënt intact, waardoor de functie van MEF2C in de hersenen niet in het
gedrang komt. Verder werden bij de betrokken patiënt geen problemen gerapporteerd met
betrekking tot de skeletspieren, waar isovorm 2 het hoogst geëxpresseerd wordt.
Ondanks het feit dat SIFT en PolyPhen-2 aanduiden dat de substitutie mogelijks pathogeen
is, wordt in dit geval geconcludeerd dat de mutatie vermoedelijk niet pathogeen is, wat in
lijn is met de Grantham score. Dit omwille van verschillende redenen: (1) de geobserveerde
symptomen zijn waarschijnlijk te wijten aan problemen in de hersenen en in deze patiënt is
een werkzame kopie aanwezig, namelijk isovorm 1, (2) het exon 4α2 maakt geen deel uit van
een belangrijk functioneel domein van MEF2C, zodat met andere woorden geen domeinen
aangetast zijn en (3) de fysicochemische eigenschappen van asparagine en asparaginezuur zijn
sterk gelijkend.
2.3
Synonieme mutatie
In exon 5 werd een heterozygote synonieme mutatie gedetecteerd waarbij het codon op positie
149 verandert van AUC naar AUU, die beide coderen voor isoleucine. De substitutie gebeurt
dus op de derde positie, de Wobble-base, die het vaakst muteert.
Synonieme mutaties veranderen de aminozuursequentie van een genproduct niet. Ze kunnen
echter wel fenotypische verschillen induceren, zo zijn er al meer dan veertig synonieme mutaties
beschreven die ziekte veroorzaken (Chamary et al., 2006). Deze mutaties kunnen de transcriptie en stabiliteit van messenger RNA (mRNA) aantasten, een effect hebben op de splicing,
de binding met microRNAs (miRNAs) beı̈nvloeden, de 3-dimensionale structuur van het eiwit
veranderen, de secundaire structuur van mRNA wijzigen waardoor de eiwitexpressie verandert
enzovoort. Het aanwenden van transfer RNAs (tRNAs) die in meerdere of mindere mate voorkomen kan eveneens een effect hebben op de expressieniveau’s van eiwitten. (Czech et al., 2010)
60
3. Onderzoek naar regulatorische regio’s
Discussie
Deze mutatie heeft geen effect op de splicing, en de frequentie waarmee beide codons gebruikt
worden voor de translatie van MEF2C -mRNA is gelijkaardig. Van de 16 isoleucineresidu’s in
MEF2C worden er namelijk in het wild-type allel 9 gecodeerd door AUU en 6 door AUC. In
het mutante allel wordt isoleucine 10 maal door AUU en 5 maal door AUC gecodeerd.
Uit deze gegevens kan geconcludeerd worden dat deze mutatie geen effect uitoefent in de patiënt.
2.4
SNPs
In intron 5 werden twee SNPs aangetroffen bij meerdere patiënten. De allelfrequenties van
deze SNPs in de cohorte werden vergeleken met deze in de HapMap-CEU referentiepopulatie
en samengevat in tabellen 4.1 en 4.2. De frequenties van de geobserveerde genotypes zijn
sterk gelijkend, waaruit geconcludeerd wordt dat de SNPs geen causale effecten hebben in de
patiënten.
Tabel 4.1: Allelfrequenties van SNP rs3729703 (c.589+57A>C) in de cohorte
patiënten en de HapMap-CEU populatie. (NCBI dbSNP, 2011)
Genotype AA
Genotype AC
patiënten
HapMap-CEU
patiënten
HapMap-CEU
315/330
95,5%
108/110
98,2%
15/330
4,5%
2/110
1,8%
Tabel 4.2: Allelfrequenties van SNP rs10514303 (c.590-95C>A) in de cohorte
patiënten en de HapMap-CEU populatie. (NCBI dbSNP, 2011)
Genotype CC
3
3.1
Genotype AC
patiënten
HapMap-CEU
patiënten
HapMap-CEU
283/330
85,8%
188/226
83,2%
47/330
14,2%
38/226
16,8%
Onderzoek naar regulatorische regio’s
Element 789
Het effect van de twee gevonden mutaties op de genexpressie van MEF2C zal later met behulp
van luciferase-experimenten functioneel onderzocht worden. De conservatie van beide mutaties is eerder laag, waaruit afgeleid kan worden dat de impact van mutaties op deze posities
waarschijnlijk ook eerder laag is. De mutaties werden alvast niet teruggevonden in alle andere
patiënten (658 controle chromosomen), waaruit besloten kan worden dat dit waarschijnlijk geen
niet-gerapporteerde SNPs zijn.
61
3. Onderzoek naar regulatorische regio’s
Discussie
Verder werden er twee SNPs gevonden in meerdere patiënten. De allelfrequenties van de SNP
met ID rs6876988 in de patiënten werden vergeleken met deze in de HapMap-CEU referentiepopulatie en samengevat in onderstaande tabel. De frequenties van de geobserveerde genotypes
zijn sterk gelijkend, waaruit geconcludeerd wordt dat de SNP geen causaal effect heeft in de
patiënten. De tweede SNP, rs373000, komt voor in 14 van de 330 patiënten (= 4,3%). Voor
deze SNP zijn er echter geen frequentiedata van controle-individuen beschikbaar.
Tabel 4.3: Allelfrequenties van SNP rs6876988 (g.88673722G>T) in de cohorte
patiënten en de HapMap-CEU populatie. (NCBI dbSNP, 2011)
Genotype TT
3.2
Genotype GT
Genotype GG
patiënten
HapMap-CEU
patiënten
HapMap-CEU
patiënten
HapMap-CEU
274/330
83%
188/226
83,2%
56/330
17%
34/226
15%
0/330
0%
4/226
1,8%
Analyse van veertien kandidaat-regulatorische regio’s
Voor het onderzoek naar regulatorische regio’s met behulp van qPCR werd gebruikt gemaakt
van de sample maximisation strategie. Deze houdt in dat alle te onderzoeken regio’s per patiënt
in één plaat onderzocht worden. Alle CNCs en controles van één patiënt bevinden zich dus in
eenzelfde plaat. Op deze manier wordt het aantal platen, en dus de hoeveelheid reagentia en
runs, geminimaliseerd en zijn de verkregen resultaten per patiënt niet onderhevig aan interplaatvariaties. Deze aanpak is met andere woorden goedkoper en de verkregen data zijn van
betere kwaliteit dan wanneer men de target maximisation strategie toepast.
De copy number analyse volgens D’haene et al. (2010) en de implementatie van de data-analyse
in qbaseP LU S vormen een zeer degelijk en gebruiksvriendelijk geheel. Op deze manier kunnen
variaties in copy number snel en efficiënt geanalyseerd worden met technologiën die tegenwoordig in elk biotechnologisch laboratorium aanwezig zijn.
In twee patiënten werden deleties van CNC12 en 14 geconfirmeerd. Dit zijn de twee regio’s die
gelegen zijn binnen de 5’UTR van MEF2C. Een deletie die beide regio’s overlapt staat echter
reeds beschreven in de Database of Genomic Variants, het betreft “Variation 93139” en werd
gerapporteerd in één gezond individu (Matsuzaki et al., 2009; Zhang et al., 2006).
Er werden met andere woorden in de hele cohorte geen copy number variaties gevonden in kandidaat regulatorische regio’s die bij de proband getransloceerd zijn. Door gebrek aan dergelijke
informatie kunnen er geen afgebakende regulatorische regio’s geı̈dentificeerd worden.
62
5
Conclusie
1
Besluit
Met behulp van Mate Pair Sequencing wordt het mogelijk om gebalanceerde en niet-gebalanceerde genomische afwijkingen in patiënten met een hoge resolutie te detecteren. Deze techniek
gaat echter gepaard met enorme hoeveelheden data die gegenereerd worden, waaruit relevante
informatie van de achtergrondruis gescheiden dient te worden. Dit is een grote uitdaging
voor bio-informatici, maar de eerste belangrijke stappen werden reeds gezet. Zo werd met de
analyse-pipeline ontwikkeld in het CMGG de translocatie in de proband, die reeds bekend was
van karyotypering en FISH, duidelijk geconfirmeerd en fijngemapt.
Verder kon met behulp van Sanger sequenering de precieze lokalisatie van de breukpunten bepaald worden. Er werd een 10bp duplicatie en een 16bp deletie aan de translocatiebreukpunten
waargenomen. Beide breukpunten omvatten eveneens een insertie van 13 en 12kb, respectievelijk op derivatief 3 en 5. Deze werden waarschijnlijk veroorzaakt door end-repair mechanismen.
De HRM-technologie werd voor de verschillende amplicons van het MEF2C -gen geoptimaliseerd, en stalen met afwijkende smeltprofielen werden gesequeneerd. Dit leverde echter geen
pathogene mutaties op in de coderende regio van MEF2C. Wel bleek het aanwenden van HRM
als pre-screenmethode voor de mutatie-analyse zeer effectief. Zo werden tijd en kosten bespaard, maar accuraatheid behouden.
Tot slot werden kandidaat-regulatorische regio’s geselecteerd en onderzocht op de aanwezigheid van copy number variaties. Er werden echter geen pathogene deleties of duplicaties in
de cohorte gevonden waardoor men geen duidelijk afgebakende regulatorische regio’s van het
MEF2C -gen kon identificeren.
Wel kan het regulatorische potentieel van het gevalideerde Vista Enhancer element 789 in de
toekomst nog onderzocht worden aan de hand van twee mutaties die hierin werden gevonden.
63
Conclusie
2
2. Toekomstperspectieven
Toekomstperspectieven
Naar de toekomst toe kan met behulp van reeds uitgedachte luciferase-experimenten het functionele effect van het Vista Enhancer element 789 op de genexpressie van MEF2C onderzocht
worden.
Het MEF2C -gen zou eveneens gemakkelijk voor meer patiënten met gelijkaardige fenotypes
met dezelfde methoden getest kunnen worden, aangezien alle experimenten reeds geoptimaliseerd werden. Verder kunnen er met de samengestelde cohorte en de uitgewerkte workflow nog
meer kandidaatgenen onderzocht worden die mogelijks een rol spelen in fenotypes waarbij een
verstandelijke beperking voorkomt.
Het gebruik van de HRM-technologie als pre-screenmethode voor mutatie-analyse om de sequeneringskosten en bijhorende data-analyse te verminderen, kan in de toekomst veel mogelijkheden bieden in het onderzoek naar polygenische aandoeningen.
Last but not least, belooft de Mate Pair Sequencing technologie heel wat vooruitgang op vlak
van (medisch) genetisch onderzoek. Dankzij de dalende sequeneringskosten zal deze techniek
meer en meer toegepast kunnen worden om genomische afwijkingen met een hoge resolutie in
patiënten te ontrafelen en onbeantwoorde fundamentele vragen op te lossen. Eens de kosten
en de tijd tussen de bloedafname en het klinische rapport dalen, zal deze technologie kunnen
evolueren naar gebruik voor diagnose en patiëntspecifieke behandeling. Naarmate meer dergelijke experimenten uitgevoerd zullen worden, zal er ook meer informatie met betrekking tot
niet-pathogene afwijkingen beschikbaar worden, wat de analyse van data van patiënten enkel
ten goede kan komen.
64
Bibliografie
Adzhubei I.a., Schmidt S., Peshkin L., Ramensky V.E., Gerasimova A., Bork P., Kondrashov A.S.
and Sunyaev S.R. (2010). A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature
methods, 7(4):248–9, ISSN 1548-7105, URL http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/.
Amir R.E., Veyver I.B.V.D., Wan M., Tran C.Q., Francke U. and Zoghbi H.Y. (1999). Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2 , encoding methyl-CpG-binding protein 2. America,
23(october):185–188.
Archer H.L., Evans J., Edwards S., Colley J., Newbury-Ecob R., O’Callaghan F., Huyton M., O’Regan
M., Tolmie J., Sampson J., Clarke A. and Osborne J. (2006). CDKL5 mutations cause infantile
spasms, early onset seizures, and severe mental retardation in female patients. Journal of medical
genetics, 43(9):729–734, ISSN 1468-6244.
Ariani F., Hayek G., Rondinella D., Artuso R., Mencarelli M.A., Spanhol-rosseto A., Pollazzon M.,
Buoni S., Spiga O., Ricciardi S., Meloni I., Longo I., Mari F., Broccoli V., Zappella M. and Renieri
A. (2008). FOXG1 Is Responsible for the Congenital Variant of Rett Syndrome. Journal of Human
Genetics, (July):89–93.
Barbosa A.C., Kim M.S., Ertunc M., Adachi M., Nelson E.D., McAnally J., Richardson J.a., Kavalali
E.T., Monteggia L.M., Bassel-Duby R. and Olson E.N. (2008). MEF2C, a transcription factor that
facilitates learning and memory by negative regulation of synapse numbers and function. Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105(27):9391–6, ISSN 1091-6490.
Benko S., Fantes J.A., Amiel J., Kleinjan D.J., Thomas S., Ramsay J., Jamshidi N., Essafi A., Heaney
S., Gordon C.T., McBride D., Golzio C., Fisher M., Perry P., Abadie V., Ayuso C., Holder-Espinasse
M., Kilpatrick N., Lees M.M., Picard A., Temple I.K., Thomas P., Vazquez M.P., Vekemans M.,
Roest Crollius H., Hastie N.D., Munnich A., Etchevers H.C., Pelet A., Farlie P.G., Fitzpatrick D.R.
and Lyonnet S. (2009). Highly conserved non-coding elements on either side of SOX9 associated with
Pierre Robin sequence. Nature genetics, 41(3):359–64, ISSN 1546-1718.
Biogazelle (2011a). Advanced Copy Number Analysis. Manual, URL http://www.biogazelle.com/
files/manual/advanced_copy_number_analysis.pdf.
Biogazelle (2011b). qPCR analysis. Course, URL http://www.biogazelle.com/course/4_qPCR_
analysis.pdf.
Bioké (2011). LCGreen Melting Dyes LCGreen Melting Dyes. Tech. rep., URL http://www.bioke.com/
webshop/productpage/2830.
Black B.L. and Olson E.N. (1998). Transcriptional control of muscle development by myocyte enhancer
factor-2 (MEF2) proteins. Annual review of cell and developmental biology, 14:167–96, ISSN 10810706.
65
Bibliografie
Burd L., Vesley B., Martsolf J. and Kerbeshian J. (1991). Prevalence study of Rett syndrome in North
Dakota children. American journal of medical genetics, 38(4):565–568, ISSN 1096-8628.
Buysse K. (2009). Molecular karyotyping: a powerfull tool for the study of genetic defects in patients
with mental retardation. Ph.D. thesis, Universiteit Gent.
Calliper LifeSciences (2009). LabChip GX/GXII brochure. URL http://www.caliperls.com/assets/
015/7200.pdf.
Cardoso C., Boys A., Parrini E., Mignon-Ravix C., McMahon J.M., Khantane S., Bertini E., Pallesi
E., Missirian C., Zuffardi O., Novara F., Villard L., Giglio S., Chabrol B., Slater H.R., Moncla A.,
Scheffer I.E. and Guerrini R. (2009). Periventricular heterotopia, mental retardation, and epilepsy
associated with 5q14. 3-q15 deletion. Neurology, 72(9):784.
Chahrour M., Jung S.Y., Shaw C., Zhou X., Wong S.T.C., Qin J. and Zoghbi H.Y. (2008). MeCP2,
a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science (New York,
N.Y.), 320(5880):1224–9, ISSN 1095-9203.
Chamary J.V., Parmley J.L. and Hurst L.D. (2006). Hearing silence: non-neutral evolution at synonymous sites in mammals. Nature reviews. Genetics, 7(2):98–108, ISSN 1471-0056.
Czech A., Fedyunin I., Zhang G. and Ignatova Z. (2010). Silent mutations in sight: co-variations in tRNA
abundance as a key to unravel consequences of silent mutations. Molecular bioSystems, 6(10):1767–72,
ISSN 1742-2051.
Dermitzakis E., Reymond A. and Antonarakis S. (2005). Conserved non-genic sequences—an unexpected
feature of mammalian genomes. Nature Reviews Genetics, 6(2):151–157, ISSN 1471-0056.
D’haene B. (2009). The study of long-range genetic defects in human transcription factor remated disorders. Ph.D. thesis, UGent.
D’haene B., Vandesompele J. and Hellemans J. (2010). Accurate and objective copy number profiling
using real-time quantitative PCR. Methods (San Diego, Calif.), 50(4):262–70, ISSN 1095-9130.
Edmondson D.G., Lyons G.E., Martin J.F. and Olson E.N. (1994). Mef2 gene expression marks the
cardiac and skeletal muscle lineages during mouse embryogenesis. Development, 120(5):1251–1263,
ISSN 0950-1991.
Engels H., Wohlleber E., Zink A., Hoyer J., Ludwig K., Brockschmidt F., Wieczorek D., Moog U.,
Hellmann-Mersch B., Weber R., Willat L., Kreiß-Nachtsheim M., Firth H.V. and Rauch A. (2009).
A novel microdeletion syndrome involving 5q14. 3-q15: clinical and molecular cytogenetic characterization of three patients. European Journal of Human Genetics, 17(12):1592–1599, ISSN 1018-4813.
Ensembl (2011). Ensembl Project. URL www.ensembl.org.
Flavell S.W., Cowan C.W., Kim T.K., Greer P.L., Lin Y., Paradis S., Griffith E.C., Hu L.S., Chen C.
and Greenberg M.E. (2006). Activity-dependent regulation of MEF2 transcription factors suppresses
excitatory synapse number. Science (New York, N.Y.), 311(5763):1008–12, ISSN 1095-9203.
Floris C., Rassu S., Boccone L., Gasperini D., Cao A. and Crisponi L. (2008). Two patients with balanced
translocations and autistic disorder: CSMD3 as a candidate gene for autism found in their common
8q23 breakpoint area. European Journal of Medical Genetics, 16(6):696–704, ISSN 1018-4813.
66
Bibliografie
Follows G., Dhami P., Göttgens B., Bruce A., Campbell P., Dillon S., Smith A., Koch C., Donaldson
I., Scott M. et al. (2006). Identifying gene regulatory elements by genomic microarray mapping of
DNaseI hypersensitive sites. Genome research, 16(10):1310, ISSN 1088-9051.
Freeman S. (2008). Biological Science. Pearson/Benjamin Cummings, 3th ed., ISBN 9780321546210.
Fukuda T., Yamashita Y., Nagamitsu S., Miyamoto K., Jin J.J., Ohmori I., Ohtsuka Y., Kuwajima K.,
Endo S., Iwai T., Yamagata H., Tabara Y., Miki T., Matsuishi T. and Kondo I. (2005). Methyl-CpG
binding protein 2 gene (MECP2) variations in Japanese patients with Rett syndrome: pathological
mutations and polymorphisms. Brain & development, 27(3):211–217, ISSN 0387-7604.
GE Healthcare (2010). illlustra® Nucleid Acid Amplification. Manual, URL http://www.
gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/DFA8ED0811E8423CC12577E1000437F6/
$file/28962294AA.pdf.
Grantham R. (1974). Amino acid difference formula to help explain protein evolution. Science,
185(4154):862–4, ISSN 0036-8075.
Hagberg B. (1985a). Rett syndrome: Swedish approach to analysis of prevalence and cause. Brain &amp;
development, 7(3):276, ISSN 0387-7604.
Hagberg B. (1985b). Rett’s Syndrome: Prevalence and Impact on Progressive Severe Mental Retardation
in Girls. Acta Pædiatrica, 74(3):405–408, ISSN 1651-2227.
Hagberg B., Aicardi J., Dias K. and Ramos O. (1983). A progressive syndrome of autism, dementia,
ataxia, and loss of purposeful hand use in girls: Rett’s syndrome: report of 35 cases. Annals of
neurology, 14(4):471–479, ISSN 1531-8249.
Hiller B., Bradtke J., Balz H. and Rieder H. (2004). CyDAS Online Analysis Site. URL http://www.
cydas.org/OnlineAnalysis/.
Idaho Technology Inc. (2011a). LightScanner® System: Achieve High Throughput Mutation Discovery
and Genotyping. URL http://www.bioke.com/webshop/productpage/2820.
Idaho Technology Inc. (2011b). LightScanner® System: Manual M1258.
illumina (2009). Mate Pair Library v2: Sample preparation guide for 2–5 kb libraries.
illumina (2011). Mate Pair Sequencing. URL http://www.illumina.com/technology/mate_pair_
sequencing_assay.ilmn.
Interactive Biosystems (2011). Alamut 1.5 Splicing Prediction Module. URL http://www.
interactive-biosoftware.com/alamut/doc/1.5/splicing.html.
Janson C.G., Chen Y., Li Y. and Leifer D. (2001). Functional regulatory regions of human transcription
factor MEF2C. Molecular brain research, 97(1):70–82, ISSN 0169-328X.
Jorde L., Carey J. and Bamshad M. (2010). Medical Genetics. Mosby Elsevier, 4th ed.
Kammoun F., de Roux N., Boespflug-Tanguy O., Vallée L., Seng R., Tardieu M. and Landrieu P.
(2004). Screening of MECP2 coding sequence in patients with phenotypes of decreasing likelihood for
Rett syndrome: a cohort of 171 cases. Journal of Medical Genetics, 41(6):1–7, ISSN 1468-6244.
67
Bibliografie
Kerr A. and Stephenson J. (1985). Rett’s syndrome in the west of Scotland. British Medical Journal
(Clinical research ed.), 291(6495):579, ISSN 0959-8138.
Kleinjan D.A. and van Heyningen V. (2005). Long-range control of gene expression: emerging mechanisms and disruption in disease. American journal of human genetics, 76(1):8–32, ISSN 0002-9297.
Kleinjan D.J. and Coutinho P. (2009). Cis-ruption mechanisms: disruption of cis-regulatory control as
a cause of human genetic disease. Briefings in functional genomics & proteomics, 8(4):317–32, ISSN
1477-4062.
Kloosterman W.P., Guryev V., van Roosmalen M., Duran K.J., de Bruijn E., Bakker S.C.M., Letteboer
T., van Nesselrooij B., Hochstenbach R., Poot M. and Cuppen E. (2011). Chromothripsis as a mechanism driving complex de novo structural rearrangements in the germline. Human molecular genetics,
20(10):1916–1924, ISSN 1460-2083.
Korbel J.O., Urban A.E., Affourtit J.P., Godwin B., Grubert F., Simons J.F., Kim P.M., Palejev D.,
Carriero N.J., Du L., Taillon B.E., Chen Z., Tanzer A., Saunders a.C.E., Chi J., Yang F., Carter
N.P., Hurles M.E., Weissman S.M., Harkins T.T., Gerstein M.B., Egholm M. and Snyder M. (2007).
Paired-end mapping reveals extensive structural variation in the human genome. Science (New York,
N.Y.), 318(5849):420–6, ISSN 1095-9203.
Kozinetz C., Skender M., MacNaughton N., Almes M., Schultz R., Percy A. and Glaze D. (1993).
Epidemiology of Rett syndrome: a population-based registry. Pediatrics, 91(2):445.
Le Meur N., Holder-Espinasse M., Jaillard S., Goldenberg A., Joriot S., Amati-Bonneau P., Guichet A.,
Barth M., Charollais A., Journel H., Auvin S., Boucher C., Kerckaert J.P., David V., ManouvrierHanu S., Saugier-Veber P., Frébourgh T., Dubourgh C., Andrieux J. and Bonneau D. (2010). MEF2C
haploinsufficiency caused by either microdeletion of the 5q14.3 region or mutation is responsible for severe mental retardation with stereotypic movements, epilepsy and/or cerebral malformations. Journal
of Medical Genetics, 47(1):22–29, ISSN 1468-6244.
Leifer D., Krainc D., Yu Y.T., McDermott J., Breitbart R.E., Heng J., Neve R.L., Kosofsky B., NadalGinard B. and Lipton S.A. (1993). MEF2C, a MADS/MEF2-family transcription factor expressed
in a laminar distribution in cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, 90(4):1546–50, ISSN 0027-8424.
Li H., Radford J., Ragusa M., Shea K., McKercher S., Zaremba J., Soussou W., Nie Z., Kang Y.,
Nakanishi N. et al. (2008). Transcription factor MEF2C influences neural stem/progenitor cell differentiation and maturation in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences, 105(27):9397.
Li M.R., Pan H., Bao X.H., Zhang Y.Z. and Wu X.R. (2007). MECP2 and CDKL5 gene mutation
analysis in Chinese patients with Rett syndrome. Journal of human genetics, 52(1):38–47, ISSN 14345161.
Li Q., Barkess G. and Qian H. (2006). Chromatin looping and the probability of transcription. Trends
in genetics : TIG, 22(4):197–202, ISSN 0168-9525.
Li Q., Harju S. and Peterson K.R. (1999). Locus control regions: coming of age at a decade plus. Trends
in genetics : TIG, 15(10):403–408, ISSN 0006-4971.
68
Bibliografie
Li Q., Peterson K.R., Fang X. and Stamatoyannopoulos G. (2002). Locus control regions. Blood,
100(9):3077–86, ISSN 0006-4971.
Lin Q., Schwarz J., Bucana C. and Olson E.N. (1997). Control of Mouse Cardiac Morphogenesis and
Myogenesis by Transcription Factor MEF2C. Science, 276(5317):1404–1407, ISSN 00368075.
Lipton S.A., Li H., Zaremba J.D., McKercher S.R., Cui J., Kang Y.J., Nie Z., Soussou W., Talantova
M., Okamoto S.I. and Nakanishi N. (2009). Autistic Phenotype from MEF2C Knockout Cells. Science,
323(5911):208.
Lodish H., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaira P., Baltimore D. and Darnell J. (2000). Molecular Cell
Biology. W. H. Freeman, New York, 4th ed.
Lyons G.E., Micales B.K., Schwarz J., Martin J.F. and Olson E.N. (1995). Expression of mef2 genes in
the mouse central nervous system suggests a role in neuronal maturation. The Journal of Neuroscience,
15(8):5727–38, ISSN 0270-6474.
Makedonski K., Abuhatzira L., Kaufman Y., Razin A. and Shemer R. (2005). MeCP2 deficiency in
Rett syndrome causes epigenetic aberrations at the PWS/AS imprinting center that affects UBE3A
expression. Human molecular genetics, 14(8):1049–58, ISSN 0964-6906.
Mari F., Azimonti S., Bertani I., Bolognese F., Colombo E., Caselli R., Scala E., Longo I., Grosso S.,
Pescucci C., Ariani F., Hayek G., Balestri P., Bergo A., Badaracco G., Zappella M., Broccoli V.,
Renieri A., Kilstrup-Nielsen C. and Landsberger N. (2005). CDKL5 belongs to the same molecular
pathway of MeCP2 and it is responsible for the early-onset seizure variant of Rett syndrome. Human
molecular genetics, 14(14):1935–1946, ISSN 0964-6906.
Martin J.F., Schwarz J.J. and Olson E.N. (1993). Myocyte enhancer factor (MEF) 2C: a tissue-restricted
member of the MEF-2 family of transcription factors. Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America, 90(11):5282–6, ISSN 0027-8424.
Maston G.a., Evans S.K. and Green M.R. (2006). Transcriptional regulatory elements in the human
genome. Annual review of genomics and human genetics, 7:29–59, ISSN 1527-8204.
Matsuzaki H., Wang P.H., Hu J., Rava R. and Fu G.K. (2009). High resolution discovery and confirmation of copy number variants in 90 Yoruba Nigerians. Genome biology, 10(11):R125–R125.18, ISSN
1465-6914.
Mencarelli M.a., Spanhol-Rosseto a., Artuso R., Rondinella D., De Filippis R., Bahi-Buisson N., Nectoux
J., Rubinsztajn R., Bienvenu T., Moncla a., Chabrol B., Villard L., Krumina Z., Armstrong J., Roche
a., Pineda M., Gak E., Mari F., Ariani F. and Renieri a. (2010). Novel FOXG1 mutations associated
with the congenital variant of Rett syndrome. Journal of medical genetics, 47(1):49–53, ISSN 14686244.
Menten B., Pattyn F., De Preter K., Robbrecht P., Michels E., Buysse K., Mortier G., De Paepe A.,
Van Vooren S., Vermeesch J., Moreau Y., De Moor B., Vermeulen S., Speleman F. and J. V. (2005).
arrayCGHbase: an analysis platform for comparative genomic hybridization microarrays. BMC Bioinformatics, 6(1):124, ISSN 1471-2105.
Molkentin J.D., Black B.L., Martin J.F. and Olson E.N. (1996). Mutational analysis of the DNA binding, dimerization, and transcriptional activation domains of MEF2C. Molecular and cellular biology,
16(6):2627–36, ISSN 0270-7306.
69
Bibliografie
Morrow E.M., Yoo S.Y., Flavell S.W., Kim T.K., Lin Y., Hill R.S., Mukaddes N.M., Balkhy S., Gascon
G., Hashmi A., Al-Saad S., Ware J., Joseph R.M., Greenblatt R., Gleason D., Ertelt J.a., Apse
K.a., Bodell A., Partlow J.N., Barry B., Yao H., Markianos K., Ferland R.J., Greenberg M.E.
and Walsh C.a. (2008). Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry. Science,
321(5886):218–223, ISSN 1095-9203.
Mullis K., Faloona F., Scharf S., Saiki R., Horn G. and Erlich H. (1986). Specific enzymatic amplification
of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology,
51 Pt 1:263–73, ISSN 0091-7451.
NCBI dbSNP (2011). dbSNP, Short Genetic Variations. URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
projects/SNP/index.html.
NCBI dbVar (2011). Overview of Structural Variation. URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbvar/
content/overview/.
Noonan J.P. and McCallion A.S. (2011). Genomics of Long-Range Regulatory Elements. Annual Review
of Genomics and Human Genetics, 11:1–23.
Novara F., Beri S., Giorda R., Ortibus E., Nageshappa S., Darra F., dalla Bernardina B., Zuffardi O.
and Van Esch H. (2010). Refining the phenotype associated with MEF2C haploinsufficiency. Clinical
Genetics, 78:471–477, ISSN 1399-0004.
Nowakowska B.A., Obersztyn E., Szymańska K., Bekiesińska-Figatowska M., Xia Z., Ricks C.B., Bocian
E., Stockton D.W., Szczaluba K., Nawara M., Patel A., Scott D.A., Cheung S.W., Bohan T.P. and
Stankiewicz P. (2010). Severe mental retardation, seizures, and hypotonia due to deletions of MEF2C.
American Journal of Medical Genetetics - Neuropsychiatric Genetics, 153B(5):1042–1051.
Nussbaum R.L., McInnes R.R., Willard H.F., Thompson M.W. and Hamosh A. (2007). Thompson &
Thompson’s Genetics in Medicine. Saunders/Elsevier, 7th ed., ISBN 1416030808.
Philippart M. (2001). Rett and Angelman’s syndromes: models of arrested development. Pediatric Neurology, 25(4):288–294, ISSN 08878994.
Philippe C., Amsallem D., Francannet C., Lambert L., Saunier a., Verneau F. and Jonveaux P. (2010).
Phenotypic variability in Rett syndrome associated with FOXG1 mutations in females. Journal of
medical genetics, 47(1):59–65, ISSN 1468-6244.
Potthoff M.J. and Olson E.N. (2007). MEF2: a central regulator of diverse developmental programs.
Development, 134(23):4131–4140, ISSN 0950-1991.
Primrose S. and Twyman R. (2006). Principles of gene manipulation and genomics. Blackwell Publishing, 7th ed., ISBN 1405135441.
Reed G.H. and Wittwer C.T. (2004). Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical chemistry, 50(10):1748–54, ISSN 0009-9147.
Rett A. (1966). Uber ein zerebral-atrophisches Syndrome bei Hyperammonemie. Wiener medizinische
Wochenschrift, 116(37):723–726, ISSN 0043-5341.
Roche Applied Science (2005). LightCycler Software v4.05. Tech. rep.
70
Bibliografie
Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis K.B. and Erlich H.A.
(1988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 239(4839):487–91, ISSN 0036-8075.
Sambrook J. and Russell D.W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, third ed., ISBN 0879695773, URL http://www.worldcat.org/isbn/0879695773.
Scheffer I., Brett E.M., Wilson J. and Baraitser M. (1990). Angelman’s syndrome. Journal of medical
genetics, 27(4):275–277, ISSN 0022-2593.
SIFT (2011). SIFT Help. URL http://sift.jcvi.org/www/SIFT_help.html.
Stearns N.A., Schaevitz L.R., Bowling H., Nag N., Berger U.V. and Berger-Sweeney J. (2007). Behavioral
and anatomical abnormalities in Mecp2 mutant mice: a model for Rett syndrome. Neuroscience,
146(3):907–921, ISSN 0306-4522.
Strachan T. and Read A.P. (2004). Human Molecular Genetics. Garland Science, New York, 3th ed.
The Wittwer Lab for DNA Analysis (2011). High Resolution Melting. URL http://dna.utah.edu/
Hi-Res/TOP_Hi-Res%20Melting.html.
Thermo Scientific (2011). NanoDrop 1000 Spectrophotometer V3.8 User’s Manual and Comparison of
the NanoDrop 1000 and Microcell Cuvettes. URL http://www.nanodrop.com/.
UniProtKB/Swiss-Prot (2011). Myocyte-specific enhancer factor 2C. URL http://www.uniprot.org/
uniprot/Q06413.
Verzi M.P., Agarwal P., Brown C., McCulley D.J., Schwarz J.J. and Black B.L. (2007). The transcription
factor MEF2C is required for craniofacial development. Developmental cell, 12(4):645–52, ISSN 15345807.
Vossen R.H.a.M., Aten E., Roos A. and den Dunnen J.T. (2009). High-resolution melting analysis
(HRMA): more than just sequence variant screening. Human mutation, 30(6):860–6, ISSN 1098-1004.
Weaving L.S., Christodoulou J., Williamson S.L., Friend K.L., McKenzie O.L.D., Archer H., Evans J.,
Clarke A., Pelka G.J., Tam P.P.L., Watson C., Lahooti H., Ellaway C.J., Bennetts B., Leonard H. and
Gécz J. (2004). Mutations of CDKL5 cause a severe neurodevelopmental disorder with infantile spasms
and mental retardation. American journal of human genetics, 75(6):1079–1093, ISSN 0002-9297.
Wittwer C., Gutekunst M. and Lohmann S. (2001). Method for quantification of an analyte. US Patent
6,303,305.
Wittwer C.T., Reed G.H., Gundry C.N., Vandersteen J.G. and Pryor R.J. (2003). High-resolution
genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen. Clinical chemistry, 49(6 Pt 1):853–60, ISSN
0009-9147.
Xu J., Gong N.L., Bodi I., Aronow B.J., Backx P.H. and Molkentin J.D. (2006). Myocyte enhancer factors 2A and 2C induce dilated cardiomyopathy in transgenic mice. The Journal of biological chemistry,
281(14):9152–62, ISSN 0021-9258.
71
Bibliografie
Zahorakova D., Rosipal R., Hadac J., Zumrova A., Bzduch V., Misovicova N., Baxova A., Zeman J.
and Martasek P. (2007). Mutation analysis of the MECP2 gene in patients of Slavic origin with
Rett syndrome: novel mutations and polymorphisms. Journal of human genetics, 52(4):342–348, ISSN
1434-5161.
Zhang J., Feuk L., Duggan G.E., Khaja R. and Scherer S.W. (2006). Development of bioinformatics
resources for display and analysis of copy number and other structural variants in the human genome.
Cytogenetic and genome research, 115(3-4):205–14, ISSN 1424-859X, URL http://projects.tcag.
ca/variation/.
Zhu B., Ramachandran B. and Gulick T. (2005). Alternative pre-mRNA splicing governs expression of
a conserved acidic transactivation domain in myocyte enhancer factor 2 factors of striated muscle
and brain. The Journal of biological chemistry, 280(31):28 749–60, ISSN 0021-9258.
Zweier M., Gregor A., Zweier C., Engels H., Sticht H., Wohlleber E., Bijlsma E.K., Holder S.E., Zenker
M., Rossier E., Grasshoff U., Johnson D.S., Robertson L., Firth H.V., Kraus C., Ekici A.B., Reis A.
and Rauch A. (2010). Mutations in MEF2C from the 5q14.3q15 microdeletion syndrome region are
a frequent cause of severe mental retardation and diminish MECP2 and CDKL5 expression. Human
Mutation, 31(6):722–733.
72
A
Bijlage
1
Fijnmappen van de translocatie in de proband
1.1
Sequenties van de primers
Tabel A.1: Sequenties van de primers gebruikt voor het fijnmappen van de translocatie in de proband.
derivatief 3
derivatief 5
1.2
Forward sequentie
Reverse sequentie
CACTGAAGCACCTGACGTTG
CGCACTTTTTCATATGTGCATT
CGGAAGGGACATGACAGAAA
AGCCATGATGCTGAAGATCC
Samenstelling van de PCR-reactiemengsels
• 4,00µL KAPA-buffer 5x
• 1,20µL MgCl2
• 4,00µL dNTPs (1mM)
• 1,60µL forward primer (5ng/µL)
• 1,60µL reverse primer (5ng/µL)
• 0,13µL Taq DNA-polymerase
• 4,27µL H2 O
• 3,20µL DNA-staal (25ng/µL)
1.3
Temperatuursprotocol KAPA58
• 3 minuten bij 95◦ C
• 30 seconden bij 95◦ C
• 30 seconden bij 58◦ C
• 1 minuut bij 72◦ C
• 1 minuut bij 72◦ C







30 cycli






• 1 minuut bij 4◦ C
73
2. Mutatie-analyse
Bijlage
2
2.1
Mutatie-analyse
Sequenties van de primers
Tabel A.2: Sequenties en ampliconlengten van de primers gebruikt voor de HRManalyse.
Exon
ex2 tr2a
ex2 tr2b
ex1a
ex1b
ex2 tr1
ex3
ex4a
ex4b
ex5
ex6
ex7a
ex7b
ex8
ex9a
ex9b
ex10a
ex10b
ex11a
ex11b
Amplicon
lengte
236
170
355
287
331
375
303
300
326
300
250
281
250
250
232
230
175
243
224
Forward sequentie
Reverse sequentie
acaatgcatgacaatttcagtt
agGTGCCAAAGAAGAGTTGC
caccacccccagtcttttt
ATCGTCTCCAGCTCTCTGCT
atgatagttcttatgaaactgac
cccagggctctgacaactac
ggacagcttgaacttctttaatgc
TCAGCAGGCAAAGATTGTGTGTA
tcttgaagagcttctgttatt
tcagccatctgacttgggttgta
ttgtcccatggaggtcaaat
ACCAGGTCTGCTGGTCTCAC
ttgaaaagattttgcccaatta
tgatagggttggcagagttca
CAGTCATTGGCTACCCCAGT
cccctcccctcaaaattaaa
AGCGCTCTTCACCTTGGTT
ccaggcctccttcatctgta
AGATCTCCTGTTGACAGCTTGA
TCATTTGCCTTCCGTTCTTT
ccaaggagtttggcagtttt
GTGTACGCGTGTGCTCAAGT
tcctcgagaaatatcaggggta
tctgtacccttaacatatgtg
gtccaaactcccctgcttg
TCTTTCTTGTTCAATGCCTGCCA
ttagagaaagccatcactgagagg
gataaagcagtgttggc
atgcctctcacagatctcttaact
AAATTCATTGGGGGAGGAGA
aaggctctgtcaatggcact
cctgtgagtgatgccagaaa
CCCATTCCTTGTCCTGGTAA
ggtaatgctgcagtgctgtg
GTTGCCAGCCAGTTACTGAAC
gttaatgggatattgaagc
CCCGTCGTACGAACTGCTAC
AGCACACACACACACTGCAA
74
Bijlage
2.2
2. Mutatie-analyse
Samenstelling van de PCR-reactiemengsels
2.2.1 Standaard PCR
• 4,00µL KAPA-buffer 5x
• 1,20µL MgCl2
• 4,00µL dNTPs (1mM)
• 1,60µL forward primer (5ng/µL)
• 1,60µL reverse primer (5ng/µL)
• 0,13µL Taq DNA-polymerase
• 4,27µL H2 O
• 3,20µL DNA-staal (25ng/µL)
2.2.2 PCR voor HRM zonder DMSO
• 4,00µL KAPA-buffer 5x
• 1,20µL MgCl2
• 4,00µL dNTPs (1mM)
• 1,60µL forward primer (5ng/µL)
• 1,60µL reverse primer (5ng/µL)
• 0,13µL Taq DNA-polymerase
• 0,80µL LCGreen® Plus+
• 3,47µL H2 O
• 3,20µL DNA-staal (25ng/µL)
2.2.3 PCR voor HRM met 5% DMSO
• 4,00µL KAPA-buffer 5x
• 1,20µL MgCl2
• 4,00µL dNTPs (1mM)
• 1,60µL forward primer (5ng/µL)
• 1,60µL reverse primer (5ng/µL)
• 0,13µL Taq DNA-polymerase
• 0,80µL LCGreen® Plus+
• 1,00µL DMSO
• 2,47µL H2 O
• 3,20µL DNA-staal (25ng/µL)
75
2. Mutatie-analyse
Bijlage
2.3
Temperatuursprotocols
2.3.1 Gradiënt KAPA55-70
• 3 minuten bij 95◦ C
• 30 seconden bij 95◦ C
• 30 seconden bij 55◦ C -70◦ C







30 cycli






• 1 minuut bij 72◦ C
• 1 minuut bij 72◦ C
• 1 minuut bij 4◦ C
2.3.2 TD64-52HRM
• 2 minuten bij 96◦ C
• 20 seconden bij
96◦ C
• 15 seconden bij 64◦ C -1◦ C/cyclus
• 40 seconden bij 52◦ C
• 30 seconden bij 72◦ C
• 10 minuten bij 72◦ C
12 cycli






• 1 minuut bij 72◦ C
• 40 seconden bij 96◦ C












25 cycli




• 10 minuten bij 15◦ C
• 5 minuten bij 95◦ C
• 10 minuten bij 20◦ C
2.3.3 STS58(52)HRM
• 5 minuten bij 96◦ C
• 1 minuut bij
96◦ C
• 1 minuut bij 58(52)◦ C
• 1 minuut bij 72◦ C
• 10 minuten bij 72◦ C







40 cycli






• 10 minuten bij 15◦ C
• 5 minuten bij 95◦ C
• 10 minuten bij 20◦ C
76
2. Mutatie-analyse
Bijlage
2.3.4 KAPA56
• 3 minuten bij 95◦ C
• 30 seconden bij
95◦ C
• 30 seconden bij 56◦ C
• 1 minuut bij 72◦ C
• 1 minuut bij 72◦ C







30 cycli






• 1 minuut bij 4◦ C
2.4
Mastermixsamenstellingen en temperatuursprotocollen
Tabel A.3: Temperatuursprotocols en samenstelling van de reactiemengsels van de
amplicons van de HRM-analyse en van het element 789.
Exon
ex2 tr2a
ex2 tr2b
ex1a
ex1b
ex2 tr1
ex3
ex4a
ex4b
ex5
ex6
ex7a
ex7b
ex8
ex9a
ex9b
ex10a
ex10b
ex11a
ex11b
element789
Samenstelling reactiemengsel
Temperatuursprotocol
HRM zonder DMSO
HRM zonder DMSO
HRM met 5% DMSO
HRM met 5% DMSO
HRM met 5% DMSO
HRM zonder DMSO
HRM met 5% DMSO
HRM met 5% DMSO
HRM zonder DMSO
HRM met 5% DMSO
HRM met 5% DMSO
HRM zonder DMSO
HRM met 5% DMSO
HRM met 5% DMSO
HRM met 5% DMSO
HRM zonder DMSO
HRM zonder DMSO
HRM met 5% DMSO
HRM met 5% DMSO
standaardmix
TD64-52HRM
TD64-52HRM
TD64-52HRM
TD64-52HRM
TD64-52HRM
TD64-52HRM
STS58HRM
STS58HRM
STS52HRM
STS58HRM
TD64-52HRM
TD64-52HRM
STS58HRM
TD64-52HRM
TD64-52HRM
TD64-52HRM
TD64-52HRM
TD64-52HRM
TD64-52HRM
KAPA56
77
2. Mutatie-analyse
Bijlage
2.5
Normalisatietemperaturen
Tabel A.4: Normalisatietemperaturen van de amplicons van de HRM-analyse.
Exon
Normalisatietemperaturen in ◦ C
ex2 tr2a
ex2 tr2b
ex1a
ex1b
ex2 tr1
ex3
ex4a
ex4b
ex5
ex6
ex7a
ex7b
ex8
ex9a
ex9b
ex10a
ex10b
ex11a
ex11b
76,0-77,0
79,5-80,5
80,5-81,5
76,0-77,0
77,0-78,0
79,5-80,5
77,0-78,0
76,5-77,5
77,0-78,0
77,5-78,5
77,0-78,0
77,0-78,0
76,0-77,0
73,5-74,5
76,0-77,0
75,5-76,5
76,0-77,0
79,0-80,0
75,0-76,0
en
en
en
en
en
en
en
en
en
en
en
en
en
en
en
en
en
en
en
84,0-85,0
86,0-87,0
95,0-96,0
81,5-82,5 // 82,0-83,0 en 87,5-88,5
82,0-83,0
90,5-91,5
85,5-86,5
83,5-84,5
90,0-91,0
84,5-85,5
83,0-84,0
86,0-87,0
84,0-85,0
78,5-79,5 // 78,5-79,5 en 83,0-84,0
84,0-85,0
87,0-88,0
87,5-88,5
87,0-88,0
87,5-88,5
78
3. Onderzoek naar regulatorische regio’s
Bijlage
3
Onderzoek naar regulatorische regio’s
3.1
Sequenties van de primers
Tabel A.5: Sequenties van de CNCs en de referentiegenen voor de qPCR-analyse en
van het element 789.
Regio’s
Forward sequentie
Reverse sequentie
CNC1
CNC2
CNC3
CNC4
CNC5
CNC6
CNC7
CNC8
CNC9
CNC10
CNC11
CNC12
CNC14
CNC15
CNC16
ZNF80
GPR15
element789
TGTCCTCATTCTGGTTCTTGA
TCAGTACCCTCTCCACTGAT
CAGCCTAACTAGCTCTGTCA
AGAGTCCATGCTTCACTCAA
TGCAAGGTTTAGTCCATAAAGAG
TCTGTAAGGGCAGATTCCAA
GGTCAGCCAGTCTTACCATA
CTGGGCAGATTAGGAGGAG
CCAAGCAGTTGAAAGGACAT
AACCCATTACCACTTCCCAA
TCCCAGGAAGTCACTGAAAT
GTTCAGAGCTGCATACCATC
AAGTAACCAGACTCGTCCAG
AATCGCATGGTTTGTGTTGA
TCTAGGGAGCTGAAAGGAAA
CTGTGACCTGCAGCTCATCCT
GGTCCCTGGTGGCCTTAATT
CACCCAGGGTCCATTGCTTTTAT
AGATGCAGGATCCATGAGTT
TCCTGGAGGCTAGCTAATTG
GTGTGCAGTAAATCCAGCTC
TGATGCAAATGCCTTTCTCC
CACAACAGATGCTGTGTGAAT
CAAGACCCACCAACTTTCTC
AGAAGGCACAGAGTACAGTT
TGTCTGAATCCCAGAGTGAG
TTTGGCTTCTTATCCCAGGT
CGCACAGCTTGTGTAATGAA
GGCCTGAAATAATCCAGTGTT
CGCTGCTTTAATGTAGGGAA
TTCCCATTCGTCTTCTGTCA
ATCTTATCTGCTGCTTGGGA
CAGAACTCCTGCCTGAATAC
TAAGTTCTCTGACGTTGACTGATGTG
TTGCTGGTAATGGGCACACA
AAGCAAGAAAGGATCTTCACAGAA
3.2
Temperatuursprotocol Roche 5xMM
• 1 minuut bij 95◦ C
• 3 seconden bij 95◦ C
• 30 seconden bij 60◦ C




45 cycli



• 5 seconden bij 65◦ C
• temperatuursstijging van 65◦ C tot 95◦ C
79
B
CD-ROM
Inhoud
• Dubbelzijdige thesis
• Enkelzijdige thesis
• Figuren
80

Afwijkingen in niet-coderende regulatorische regio`s van het MEF2C

Related documents

Products

Support

Afwijkingen in niet-coderende regulatorische regio`s van het MEF2C

Related documents

Add this document to collection(s)

Add this document to saved

Suggest us how to improve StudyLib