PCR technieken. Op zoek naar twee resisteniegenen van Solanum

PCR technieken. Op zoek naar twee
resisteniegenen van Solanum
Tuberosum, 7 rassen.
______________________________________________________________
Klas 11VWO periode biologie, Rudolf Steinercollege, Haarlem oktober 2015.
SAMENVATTING
Bij planten van de familie Solanum is bekend dat zij beschikken over zogenaamde
resistentiegenen tegen Phytophtora Infestans. Deze genen die in hedendaagse cultivars van
aardappelen lijken te zijn verdwenen, zijn nog volop aanwezig in wilde aardappelplanten en
planten van de nachtschadefamilie.
In dit practicum, uitgevoerd door klas11V van het Rudolf Steiner College, Haarlem, worden
zeven aardappelrassen getest op de aanwezigheid van twee resistentiegenen. Er bleek enige
overeenstemming tussen deze onderzoekers ten aanzien van enkele rassen. Enkele uitslagen
verbazen wel: de meeste aardappels beschikken waak wel over gen R3a en minder vaak over
gen R1., zo ondervonden we in eerdere analyses.
INLEIDING
In dit practicum wordt onderzocht of de in
de zeven rassen (Agria (biologisch),
Cerisa, Rosa Gold, Meerlander,
Oppendoezer Ronde, Gourmandine, Jazzy
en Tomaat de Resistentiegenen R1 en R3a
aanwezig zijn.
Het resistentie gen R3a is terug te vinden
in de ncbi-database m.b.v URL:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY8
49382.1 . Resistentiegen R1 wordt
genoemd in een voor scholen ontwikkeld
practicum door de WUR, Wageningen.
Helaas vermeldde men niet de herkomst
van de gebruikte primers.
De leerlingen zijn in dit practicum op zoek
naar de aanwezigheid van deze twee
genen.
METHODEN EN TECHNIEKEN
In dit practicum werd gebruik gemaakt van
de Phire-Plant PCR-mix, code F130.
Hierbij werden 1-2 mm3 grootte samples
van het knolmateriaal van de aardappels in
tabel 1.0 en gecrushd met een losse Finntip in een oplossing van 20 uL DilutionBuffer. Nadat deze buffer min 1 minuut
had ingewerkt, werden deze gevortexted en
bij 15000 rpm gecentrifugeerd.
Van deze samples is 0,6 uL overgenomen
in een nieuw 0.2ml ep waarin
achtereenvolgens is toegevoegd: 8 uL
Dnase-vrij water, 10 uL PCR-buffer
(dNTP's, MgCl2), 0.6 ul DNA-Taqpolymerase en 0,6 uL primeroplossing A
en B (Zie tabel 2.0)
Na opnieuw vortexen en centrifugeren
werden de samples in de PCR-machine
gedaan (Techne Cyclo-gene 9600) en
gerund volgens het protocol opgesteld in
tabel 3.0.
Hierna werd van elk monster 15 uL
genomen en onder toevoeging van 6 uL
loading dye (R631) geladen in een 2%
agarose gel onder toevoeging van 0.6 uL
EtBr opdat het DNA met UV-licht te
detecteren is.
Als controle voor de werkzaamheid is ook
een sample genomen van Tomaat, onder
toevoeging van de door Phire-Plant
geleverde control-primer die voor
amplificatie zorgt van het chloroplast
DNA. Uiteraard is hierbij het groene
gedeelte van de tomaat genomen.
Aardappelras/
Plantensoort
Agria
Cerisa
Rosa Gold
Meerlander
Oppendoezer Ronde
Gourmandine
Jazzy
Tomaat
Code
Resistent volgens leverancier
A
C
R
M
P
G
J
T
nvt
Tabel 1.0. Gebruikte aardappelrassen en plantensoorten.
Locus
R1WURF
Locus
R1-A
Primer
CAACCCTGGCATGCCACG
Tm*
56.9
R1WURR
R3aF
R1-B
R3-A
CACTCGTGACATATCCTCACT
TGGAAGTAGTAGTGCCGACAA
52.9
54.6
56
R3aR
R3-B
GGAGGACCAACTGCCATAGAA
55.3
Control1
C-A
Control1
C-B
chloroplast
DNA
chloroplast
DNA
Tm
Alleles
??
size
Genbankno
??
1
288 bp
AY849382.1
56
1
288 bp
AY849382.1
AGTTCGAGCCTGATTATCCC
62
1
297 bp
GCATGCCGCCAGCGTTCATC
62
1
297 bp
Tabel 2.0, Primers gebruikt in dit practicum
PCR programma 20:
fase 1:
15 min 98 oC
fase 2:
30 sec 98 oC
30 sec 51 oC (Volgens literatuur)
60 sec 72 oC
herhaal hierna nog 39 X
fase 3:
5 min op 72 oC
Tabel 3.0, PCR-instellingen
nummer
Namen
letter
1e test
2e test
1
2
3
4
5
6
7
Aynure, Quinten
Rosa,Ezra
Phlox, Ruie
Guy, Joppe
Rosa, Elyana
Han + (onleesbaar)
Rinke, Jade
A
B
C
D
E
F
G
Tomaat, R3
RosaG, R3
Agria, R1
Meerl, R3
Jazzy R1
Agria R1
Gourm, R1
Tomaat R1
RosaG, R3
Gen aanw.
1e test
Ja
Smear..
Nee
Nee
Ja.
Nee
Vaag
8
9
10
11
HannaH, Maike
Koen, Ivo
Paloma, Mathilde
Iris, Maan
H
K
L
M
Cersa, R1
Jazzy R3
Oppend, R3
RosaG R1
Gourm, R3
Meerl, R1
Cerisa R1
RosaG R3
Smear
Nee
Smear
Nee
12
13
14
15
16
Anila, Jippe
Wie?
Ella, Barbara
Renske en Roos
Groep J ???wie???
N
P
Q
R
J
Agria R1
Tabel 4.0 Groepen leerlingen
Agria R3
Oppend, R1
Rosa R3
Cerisa, R3
Cerisa R1
Gen aanw.
2e test
smear
Smear
Ja
Ja, meer
dan 1
bandje..
Smear
Nee
Nee
Ja
Nee
Cerisa R1
Ja.
Vaag
Ja
Gen aanw.
3e test
Ja
tom: R1:
ja
RESULTATEN
De resultaten zijn gegroepeerd rond de runs van de electroforese. Hierbij is gebruik gemaakt
van de lettercodering van de leerlingen. Voor de controle is een extra dubbele serie
meegenomen waarbij de begeleidend docent een duplobepaling heeft uitgevoerd op de beide
primers t.a.v.Irene, Mona Lisa, Mozart, Texla, Bio-1 en de planten "rode paprika" en Afrikaan
(controle). Deze controle is ná het practicum uitgevoerd met hetzelfde (rest) bladmateriaal als
dat de leerlingen hebben gebruikt.
lane
groep
ras/gen
result
lane
groep
ras/gen
result
1
2
3
A
A
B
Tomaat R3
Tomaat R1
Rosa R3
10
4
5
leeg
11
Ruler 50bp
12
13
K
K
G
G
Jazzy R3
Meerl R1
Gourm R1
RosaG R3
7
8
9
C
C
D
D
Agria R1
Cerisa R3
Meerl R3
Cerisa R1
14
Ruler 50bp
7
15
16
17
18
H
H
J
J?
Cerisa R1
Gourm R3
R3
C1
Tabel 3.0. Gebruikte aardappelrassen, tomaat. Leerlingen resultaten
lane
groep
ras/gen
result
lane
groep
ras/gen
result
1
2
3
4
L
L
Q
Q
Oppend R3
Cerisa R1
Agria R3
?
10
11
12
N
F
R
Agria R1
Agria R1
Oppend R1
5
Ruler 50bp
13
14
7
7
8
M
M
M
Rosa R1
Rosa R3
Tomaat R1
15
16
Gen aanw.
2e test
smear
17
Tb?
Ruler 50bp
Tabel 4.0. Gebruikte aardappelrassen, tomaat. Leerlingen resultaten
nummer
Namen
letter
1e test
2e test
1
2
3
4
5
6
7
Aynure, Quinten
Rosa,Ezra
Phlox, Ruie
Guy, Joppe
Rosa, Elyana
Han + (onleesbaar)
Rinke, Jade
A
B
C
D
E
F
G
Tomaat, R3
RosaG, R3
Agria, R1
Meerl, R3
Jazzy R1
Agria R1
Gourm, R1
Tomaat R1
RosaG, R3
Gen aanw.
1e test
Ja
Smear..
Nee
Nee
Ja.
Nee
Vaag
8
9
10
11
HannaH, Maike
Koen, Ivo
Paloma, Mathilde
Iris, Maan
H
K
L
M
Cersa, R1
Jazzy R3
Oppend, R3
RosaG R1
Gourm, R3
Meerl, R1
Cerisa R1
RosaG R3
Smear
Nee
Smear
Nee
12
13
14
15
16
Anila, Jippe
Wie?
Ella, Barbara
Renske en Roos
Groep J ???wie???
N
P
Q
R
J
Agria R1
Tabel 4.0 Groepen leerlingen
Agria R3
Oppend, R1
Rosa R3
Cerisa, R3
Cerisa R1
Smear
Ja
Ja, meer
dan 1
bandje..
Smear
Nee
Nee
Ja
Nee
Cerisa R1
Ja.
Vaag
Ja
Gen aanw.
3e test
Ja
tom: R1:
ja
9
18
FOTO-MATERIAAL AGAROSE-GEL
1e Run:
2e Run:
3e Run:
4e Run:
nummer
Namen
letter
1e test
2e test
1
2
3
4
5
6
7
Aynure, Quinten
Rosa,Ezra
Phlox, Ruie
Guy, Joppe
Rosa, Elyana
Han + (onleesbaar)
Rinke, Jade
A
B
C
D
E
F
G
Tomaat, R3
RosaG, R3
Agria, R1
Meerl, R3
Jazzy R1
Agria R1
Gourm, R1
Tomaat R1
RosaG, R3
Gen aanw.
1e test
Ja
Smear..
Nee
Nee
Ja.
Nee
Vaag
8
9
10
11
HannaH, Maike
Koen, Ivo
Paloma, Mathilde
Iris, Maan
H
K
L
M
Cersa, R1
Jazzy R3
Oppend, R3
RosaG R1
Gourm, R3
Meerl, R1
Cerisa R1
RosaG R3
Smear
Nee
Smear
Nee
12
13
14
15
16
Anila, Jippe
Wie?
Ella, Barbara
Renske en Roos
Groep J ???wie???
N
P
Q
R
J
Agria R1
Agria R3
Oppend, R1
Rosa R3
Cerisa, R3
Cerisa R1
Gen aanw.
2e test
smear
Gen aanw.
3e test
Smear
Ja
Ja, meer
dan 1
bandje..
Smear
Nee
Nee
Ja
tom: R1:
ja
Nee
Cerisa R1
Ja.
Vaag
Ja
Ja
Tabel 4.0 Groepen leerlingen
CONCLUSIE
Op basis van deze experimenten die nu gehouden zijn valt op dat meerdere onderzoekers hier
vonden dat:
1.
Tomaat over gen R1 beschikt.
2.
Agria niet over R1 beschikt
3.
Rosa Gold over gen R3 beschikt. Er is ook een uitslag met meer bandjes????
(vervuiling?)
4.
Cerisa over gen R1 beschikt
5.
Jazzy over gen R1 beschikt (1x aangetoond)
6.
Jazzy niet over gen R3 beschikt
7.
Oppendoezer Ronde: noch op R1 noch op R3 een duidelijk beeld geeft (Smear)
DISCUSSIE
1.
Uit eerder onderzoek bleek dat Tomaat gen R3 heeft en niet R1… (Verwisseld?)
2.
Smears ondersteunen de uitslag niet, maar spreken het ook niet tegen: oorzaken
moeten worden gezocht in verstorende enzymen die het aanwezige DNA in onregematige
fragmenten stukknippen… Zo ontstaat een band van allerlei fragemente.n. Smear betekent dus
vervuiling van je PCR-buis…
3.
Groep 7: 2e test: meerdere bandjes zijn niet te verklaren..
3.
4.
De kracht van PCR-kit raakt op: bandjes worden erg vaag en onleesbaar. dNTPs
verliezen hun kracht. (Trifosfaat breekt af..)
Bijlage 1. Protocollen
1.
Het maken van de gel:
1.
25 ml 10X TBE buffer
2.
Voeg toe tot 250 ml met auqadest
3.
Hiervan 80 ml genomen voor de gel. Toevoegen 1,6 gr agarose (2%)
4.
45 sec magnetron -> swirl -> 45sec magn. -> swirl-> 30 sec magn.
5.
Cool down
6.
6 uL EtBr erbij (vanuit 1% flesje)
8.
Als de zaak gestold is: Overgieten met de rest van de buffer.
9.
Totaal zit erin de bak 300-350 ml TBE buffer met dezelfde concentratie
3.
DILUTED: Per solanum-materiaal:
1.
0.2 epje
2.
20 uL Dilutionbuffer
3.
Crush 2 mm2 met pipetpunt.
4.
vortex kort 10 sec
5.
centrifuge 30 sec
6.
Laat even staan 2 min.
7.
Neem 0.6 uL supernatant.
8.
0.2 epje
9.
10 uL PCR buffer
10.
0.6 uL primermengsel
11.
0.5 uL Polymerase
12.
voeg die 0.5 uL supernatant toe.
13.
Vul met water aan tot 20 uL
13.
vortex en centrifugeer beide kort ca 20 sec.
13.
Laat 30 min staan.
4.
5.
6.
1.
2.
3.
4.
DNA 50 bp Ladder:
1.
Neem 0.2 ml epje
2.
Voeg 3.0 uL DNA-ladder toe
3.
Voeg 3.0 uL Loading dye toe #R0631
4.
Voeg nog 12 ml H2O toe. Samen 18 uL Is meer dan genoeg voor één gel.
Gel electroforese
Nadat de PCR klaar is, wordt van de epjes 1 tm 8 15 uL genomen en toevoegen 5 uL
loading dye. Vortex en centrifuge kort.
Laden van 20 uL van elk monster in de gel:
o
ruler : 3 ul #R0631 + 3ul 50 bp ladder + 12 ul Water.
Eerste 10 min op 50 Volt
Daarna op 100 Volt tbv betere scheiding.