Microscopische beeldvorming in biofysisch en

Microscopische beeldvorming in
biofysisch en biomedisch onderzoek
23.01.2012
M. Ameloot
Interactieve websites
• http://www.olympusmicro.com/index.html
• http://www.microscopyu.com/index.html
• http://zeisscampus.magnet.fsu.edu/index.html
De microscoop
oculair
objectief
preparaat
De microscoop
De microscoop
Vergroting microscoop
M tot  M obj  M oc
M tot
?
Licht is een elektromagnetische golf
l
l
Elektrisch veld
l  golflengte
c = lichtsnelheid (=lf)
Animatie: elektromagnetische golf
http://www.walter-fendt.de/ph14e/emwave.htm
Situering golflengten elektromagnetische
straling
l
1 nm = 1 miljoenste deel van 1 mm
l
Blauw licht
l
l
Rood licht
Afstand
Golfkarakter van het licht
l
?
Diffractie
• http://www.olympusmicro.com/primer/java/d
iffraction/index.html
Diffractie
Diffractie
d sinq = l
(1e min)
Diffractie ronde
opening
d sinq = 1,22 l
(1e min)
d = diameter opening
q
Diffractiepatronen naburige punten
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/im
ageformation/airydiskbasics/index.html
Diffractie: Rayleigh criterium
Criterium van Rayleigh
Resolutie d
0,61l
d
n sin 
E. Abbe
1873
d
l
2
Numerieke
apertuur
Resolutie en openingshoek
P
r
e
p
a
r
a
a
t
?
Diffractie: conclusies
1. Geometrische optica: punt punt.
2. Golfkarakter van licht:punt vlekje.
3. Opening van het objectief , breedte vlekje.
4. Breedte vlekje , afstand tussen 2 naburige punten  om
afzonderlijk te worden waargenomen.
5. Resolutie mede bepaald door golflengte invallend licht
Diffractielimiet
0,61l
d
n sin 
Fundamentele beperking
d
l
2
Resolutie versus grootte-orde afmetingen
d
l
2
d  250  300 nm
1 nm = 1 miljoenste deel van 1 mm
Dikte hoofdhaar: 0,1 mm = 100 000 nm
Diameter RBC: 0,008 mm= 8000 nm
HIV virus: 90 nm
Dikte biologisch membraan: 5 nm
Optische microscopie versus
elektronenmicroscopie
1. Elektronenbundel  golflengte.
2. Snelheid elektronen  golflengte 
3. Diffractielimiet evenzeer geldig.
4. Resolutie  0,5 nm.
5. Dunne preparaten vereist.
6. Omgeving niet biologisch vriendelijk.
d
l
2
Celbiologische toepassing
Detectie van specifieke structuren en moleculen in cellen, weefsels, …?
Fluorescentie
FITC Fluorescein-5-isothiocyanaat
Fluorescentie-microscopie
Verschillende fluorescente labels
Celbiologische toepassing
Detectie van specifieke structuren en moleculen in cellen, weefsels, …
Specifieke fluorescerende merkers
Confocale fluorescentiemicroscopie
Scanning galvanometers
Point Scanning
x
y
Laser out
To
Microscope
Laser in
Scanning process
X
Y
Sequentially illuminated
sample
Sequentially generated
image
Vergelijking widefield en
confocale microscopie
http://www.olympusconfocal.com/java/
confocalvswidefield/index.html
Optical slicing
Y
Z
X
3D reconstructie
Optische secties
Mitochondria gemerkt met Mitotracker Green
MDCK cellen onder metabolische inhibitie
A
B
C
Mitochondriale calcium concentratie
• Combinatie van twee fluorescente probes:
1
Mito Tracker
Green
(200 nM)
Calcium probe: Rhod2
2
Rhod2
(4 mM)
MTG masker voor selectie Rhod2mito
MTG beeld
X
Binair MTG masker Rhod2 beeld
=
Rhod2mito
Kleinere afstanden via fluorescentie?
Door gebruik te maken:
- twee fluorescerende moleculen
- Förster Resonance Energy Transfer (FRET)
47
FRET principe
Stralingsloze
Excitatie
koppeling !!!
D
kT
Donor
fluorescentie
FD
A
A
Acceptor
fluorescentie
FDA
FDA
E  1
FD
FA
Bij langere golflengte
dan voor de donor
48
FDA
E  1
FD
1 Å = 0.1 nm
49
Spectroscopische
meetlat
50
FDA
E  1
FD
R06
1
E 6

6
R 6
R0  R
1 (
)
R0
Ro=30 Å
Ro=50 Å
Ro=70 Å
1 Å = 0.1 nm
Toepassingen FRET
52
Cyan FP & Yellow FP
R0 = 48 Å = 4,8 nm
Nature Reviews / Molecular Cell Biology
53
Cyan FP & Yellow FP
R0 = 48 Å = 4,8 nm
FRET en membraanpotentiaal
depolarizatie tot +60 mV
Acceptor
Donor
Amelie Perron, Hiroki Mutoh, Walther Akemann, Sunita Ghimire Gautam,
Dimitar Dimitrov, Yuka Iwamoto and Thomas Knöpfel
55
Diffractielimiet
FRET: indirecte wijze voor afstanden kleiner
dan de diffractielimiet
Zijn directe waarnemingen van afstanden
kleiner dan de diffractielimiet mogelijk?
Diffractielimiet
Abbe: diffractielimiet  250 - 300 nm
1-molecule detectie
Dichtheid gelabelde moleculen voldoende klein!
20 nm
Beweging in membraan
Eiwitten in lipidendubbellaag
SMT = single molecule tracking
Marguet EMBO 2006
SMT = single molecule tracking
Schmidt PNAS 1996
SMT = single molecule tracking
SMT = single molecule tracking
Van microscopie naar nanoscopie:
structuren met sub-micro resolutie?
Hot topic!
http://www.microscopyu.com/tutorials/flash/s
uperresolution/stochasticblinking/index.html
http://www.microscopyu.com/tutorials/fla
sh/superresolution/storm/index.html
Glycinereceptor
HA-GlyR α3K
HA-GlyR α3L
2,5 µm
2,5 µm
Labelvrije metingen mogelijk?
1.Dikkere preparaten moeilijk aan te kleuren.
2.Beïnvloeding door fluorofoor? (stamcellen).
3.In situ?
4.Hogere penetratiediepte.
5.Optische coupes voor 3D reconstructie.
6.Gebruik in vivo (patiënten)
7.Hot topic!
SHG straling (tweede harmonische)
Rayleigh scattering
Hyper-Rayleigh scattering
Mertz in Handbook of Biomedical nonlinear optical microscopy, ed. Masters, So. 2008
SHG straling: 2 moleculen
Constructieve
interferentie
Destructieve
interferentie
Mertz in Handbook of Biomedical nonlinear optical microscopy, ed. Masters, So. 2008
SHG stralingspatroon
Niet-coherente verstrooiing
Vermogen ~ N
Coherente verstrooiing
Vermogen ~ N2
Mertz in Handbook of Biomedical nonlinear optical microscopy, ed. Masters, So. 2008
Ultrasnelle lasers
– fs-gepulste lasers
– Laser scanning
– Beeldvorming in weefsel (“diepe”
indringing)
– Optische coupes
Sarcomeer
Sarcomeer
In vivo measurement of sarcomeres
Z-disc mitochondria
Myosin
TPEF
SHG
10 mm
10 mm
10 mm
Llewellyn et al Nature. 2008 August 7; 454(7205): 784–788.
In vivo bepaling van sarcomeren
1000 um
500 um
350 um
1 cm
25 mm
Micro-endoscoop
1 cm
Llewellyn et al Nature. 2008 August 7; 454(7205): 784–788.
In vivo measurement of sarcomeres
lateral gastrocnemius (mouse)
Llewellyn et al Nature. 2008 August 7; 454(7205): 784–788.
Gestreepte spier (rat)
Courtesy of Rik Paesen
(UHasselt)
Gestreepte spier (rat)
Courtesy of Rik Paesen (UHasselt)
Labelvrije micro-endoscopie
1. Vroegtijdige detectie van veranderingen
in de extracellulaire matrix bij kwaadaardig gezwel:
veranderingen in collageen veranderingen in SHG.
2. Veranderingen in metabolisme 
veranderingen in autofluorescentie.
Beeldvorming met SHG
Striated muscle
Starch
Rat Tail Tendon
Neurons
Flax
(Sanen & Paesen)
Cellulose
Cell-matrix interacties (tissue engineering)
Staal van Dennis Lambrechts, Prometheus, KUL
hPDC & Col I hydrogel (label vrij)
10 mm
Erkenning
Universiteit Hasselt
Prof. Dr. M. Ameloot
Dr. N. Smisdom
Drs. K. Notelaers
Drs. Ir. B. De Clercq
Drs. Ir. R. Paesen
Dra. K. Saenen
Dra. M. Bacalum
Prof. Dr. JM. Rigo
Dr. Daniel Janssen
Katholieke Universiteit Leuven
Prof. Dr. J. Hofkens
Dra. Susana Rocha
Prof. Dr. M. Roeffaers
Prof. Dr. H. Van Oosterwyck
Drs. D. Lambrechts
Prof. Dr. D. Devos
Max Delbrück Center for
Molecular Medicine, Berlin
Prof. Dr. J.C. Meier