Samenvatting Elk organisme heeft vetten en andere lipiden nodig, aangezien deze componenten functioneren als bouwstenen van membranen, en als signaalmoleculen, energiebron en energiereserve. De slechte oplosbaarheid van lipiden in water bemoeilijkt echter hun transport. Dieren hebben een unieke oplossing gevonden om desondanks lipiden te kunnen distribueren via hun lichaamsvloeistof: lipoproteïnen. Lipoproteïnen zijn partikels met een doorsnee tot circa 1 micrometer, die bestaan uit één of enkele eiwit-moleculen en vele lipid moleculen, in sommige gevallen honderden. Ze zijn vooral bestudeerd in zoogdieren in verband met hun rol in medische aandoeningen zoals atherosclerose, obesitas, en diabetes. Lipoproteïnen zijn echter ook onderzocht in andere, sterk verschillende dierklassen, met name in insecten. In deze oude en diverse diergroep is het functioneren van lipoproteïnen vooral bestudeerd in de context van langdurige vliegactiviteit, onder meer bij de treksprinkhaan Locusta migratoria tijdens diens massale trekvluchten. Het (enige) lipoproteïne van insecten, genaamd lipoforine, beschikt in vergelijking met de vet-transporterende lipoproteïnen van zoogdieren over enkele opmerkelijke functionele en structurele eigenschappen. Zo is het herbruikbaar, waardoor lipid transport niet afhankelijk is van de synthese van nieuwe lipoproteïnen. Tevens verschillen de lipoproteïnen van insecten in hun componenten. Terwijl triacylglycerol het voornaamste lipid in zoogdier lipoproteïnen is, bevat lipoforine met name diacylglycerol, en bindt het ook beduidend minder lipid moleculen. Bovendien bevat lipoforine twee eiwitten, apoLp-I en apoLp-II, terwijl de vet-transporterende lipoproteïnen van zoogdieren gestabiliseerd worden door één eiwitcomponent, apoB. Het is echter gebleken dat apoLp-I en -II ontstaan uit de klieving van een precursor eiwit, genaamd apoLp-II/I, dat evolutionair verwant is aan apoB. ApoLp-II/I en apoB maken deel uit van de familie van ‘large lipid transfer’ eiwitten, de LLTP, die gekarakteriseerd worden door homologie in de Nterminale ~900 aminozuren van deze eiwitten, de LLT module. De specifieke eigenschappen van insect lipoproteïne ten opzichte van de vettransporterende zoogdier lipoproteïnen vinden mogelijk hun oorsprong in verschillen tussen de structuren waaruit ze zijn opgebouwd, en vanuit dit perspectief zijn de biosynthese van lipoforine, de evolutie van lipoproteïne precursors, alsmede de diversiteit in hun receptoren onderzocht in dit proefschrift. 135 Lipoforine biosynthese heeft twee opvallende kenmerken: 1) klieving van apoLpII/I in apoLp-I en –II, en 2) lipidatie van apoLp-II/I of de klievingsproducten daarvan tot een lipoproteïne. Deze processen vinden plaats in het vetlichaam, een weefsel dat functies van de lever en het vetweefsel van zoogdieren (en andere gewervelde dieren) combineert. In Hoofdstuk 2 wordt de klieving van apoLp-II/I in apoLp-I en apoLp-II nader bestudeerd. Hiertoe werd een recombinant insecten systeem opgezet dat een N-terminaal deel van apoLp-II/I, overeenkomend met het volledige apoLp-II en een deel van apoLp-I, tot expressie brengt. Door specifieke aminozuren in apoLp-II/I te wijzigen kon klieving worden voorkomen, evenals door incubatie van recombinante cellen met een remmer voor proproteïne convertases (een groep van eiwit-klievende enzymen). Deze experimenten ondersteunen de betrokkenheid van een furine-achtige proproteïne convertase bij de klieving van apoLp-II/I. In vitro incubatie van de klievingsremmer met L. migratoria vetlichaam wees uit dat klieving niet essentieel is voor de secretie en lipidatie van lipoforine, aangezien ongekliefd apoLp-II/I tevens een hoge-dichtheids lipoforine blijkt te vormen. Deze vinding roept de vraag op wat dan de functie van apoLp-II/I klieving is. Modellering van de LLT module van apoLp-II/I, inclusief apoLp-II en een deel van apoLp-I, gaf structurele gelijkenis aan met apoB, het structurele eiwit van vele zoogdier lipoproteïnen (Hoofdstuk 2). Uitgaande van kennis over apoB lipoproteïne biosynthese werd de lipidatie van apoLp-II/I nader onderzocht in Hoofdstuk 3. Amfipatische structuren spelen een zeer belangrijke rol in de associatie van lipid, zowel in apoB als in vele andere ongerelateerde lipid-bindende eiwitten. Voorspelling van de structuur wijst op de aanwezigheid van clusters verrijkt in amfipatische α-helices danwel amfipatische β-strands in apoLp-II/I. Deze zijn, bezien vanaf de N- tot de C-terminus, georganiseerd als α-β-α, enigszins gelijkend op een verkorte versie van apoB, dat de organisatie α-β-α-β-α bezit. Recombinant expressie van truncaties van apoLp-II/I wijst uit dat de sequentie van het β cluster noodzakelijk is voor lipidatie tot een lipoproteïne. De factor MTP (microsomaal triglyceride transfer proteïne) speelt een essentiële rol in de lipidatie van apoB tot een lipoproteïne. Aangezien insecten ook een MTP gen bezitten, werd de mogelijke rol daarvan in lipoforine biosynthese onderzocht (Hoofdstuk 3). Co-expressie van een insecten MTP blijkt de lipoproteïne vorming te stimuleren. Niet alleen de secretie van apoLp-II/I en diens klievingsproducten bleek toe te nemen, maar ook hun lipidatie. Hoewel het belang van MTP in lipoproteïne biosynthese nog vastgesteld dient te worden in vivo, wijzen deze vinding én de rol van het amfipatische β cluster in lipid binding er sterk op dat de biosynthese van lipoproteïnen in zowel insecten als zoogdieren afhankelijk is van dezelfde structurele componenten. De huidige mechanismen van lipoproteïne biogenese vinden dus hun oorsprong in de eerste dieren. Om inzicht te verwerven in de origine en de huidige variatie van lipoproteïnen in dieren werd de evolutie en diversiteit van de familie waartoe apoB en apoLp-II/I behoren, de 136 LLTP familie, nader bestudeerd (Hoofdstuk 4). Hoewel de oorsprong van deze familie niet getraceerd kon worden, kwam uit fylogenetische analyse naar voren dat de LLTP familie opgedeeld kan worden in 3 subfamilies, te weten de apoB-achtige LLTP, de vitellogenine-achtige LLTP, én de MTP’s. ApoLp-II/I en apoB behoren tot de apoBachtige LLTP, evenals een nieuw geïdentificeerd LLTP in insecten, voorlopig het ‘apoLpII/I-related protein’ genoemd. Opvallend genoeg behoort het voornaamste dooiereiwit in eicellen van een groep van kreeftachtigen, dat daar vitellogenine was genoemd, ook tot de apoB-achtige LLTP. De apoB-achtige LLTP vertonen unieke gelijkenissen in de LLT module alsmede in een geconserveerd motief daar juist buiten, en in de relatieve grootte van hun amfipatische clusters. De functionele en structurele diversiteit van LLTP wordt bediscussieerd vanuit een evolutionair perspectief. Waar de LLTP de structurele basis vormen voor lipoproteïnen en hun biogenese, wordt de cellulaire opname van lipoproteïnen gemedieerd door leden van de LDLR familie. De huidige classificatie van nieuw-ontdekte LDLR familieleden is vaak gebaseerd op het aantal cysteïne-rijke eenheden in het ligand-bindend domein. In Hoofdstuk 5 laten we zien dat ze ook geclassificeerd kunnen worden (en wellicht beter) op basis van hun Cterminale niet-repetitieve domeinen. Op deze wijze worden insect lipoforine receptoren, die onderling verschillen in het aantal cysteïne-rijke eenheden in het ligand-bindend domein, gekarakteriseerd als een aparte groep. De unieke sequentiekarakteristieken van LpR’s in deze domeinen worden besproken in relatie tot hun functionele eigenschappen ten opzichte van de LDLR familieleden in zoogdieren. Samengevat zijn de belangrijkste resultaten beschreven in dit proefschrift: (1) het structurele eiwit van lipoforine, apoLp-II/I, wordt gekliefd door een insecten furine, (2) klieving is niet essentieel voor de vorming van apoLp-II/I tot een hoge-dichtheids lipoproteïne, (3) lipoproteïne vorming is afhankelijk van de aanwezigheid van een regio die voorspeld werd verrijkt te zijn in amfipatische β-strands, (4) MTP stimuleert de secretie en lipidatie van lipoforine in een recombinant expressie systeem, (5) apoLp-II/I is een apoB-achtige LLTP, en (6) LDLR familie leden kunnen worden geklassificeerd op basis van hun niet-repetitieve domeinen. Aldus toont dit proefschrift dat de biogenese van lipoproteïnen en het lipid transport in zowel zoogdieren als insecten geregeerd wordt door gemeenschappelijke moleculaire structuren en mechanismen. Modificatie van deze elementen, door een samenspel van evolutie en biosynthese, resulteert in de compositionele en functionele verschillen tussen lipoproteïnen. Vanuit dit inzicht alsmede de ontwikkelde methode tot recombinant lipoforine expressie kan nu worden voortgegaan naar het begrijpen van de moleculaire achtergrond van de opmerkelijke eigenschappen van de lipoproteïnen en het lipid transport in insecten. 137