Samenvatting

Samenvatting
Elk organisme heeft vetten en andere lipiden nodig, aangezien deze componenten
functioneren als bouwstenen van membranen, en als signaalmoleculen, energiebron en
energiereserve. De slechte oplosbaarheid van lipiden in water bemoeilijkt echter hun
transport. Dieren hebben een unieke oplossing gevonden om desondanks lipiden te
kunnen distribueren via hun lichaamsvloeistof: lipoproteïnen.
Lipoproteïnen zijn partikels met een doorsnee tot circa 1 micrometer, die bestaan
uit één of enkele eiwit-moleculen en vele lipid moleculen, in sommige gevallen
honderden. Ze zijn vooral bestudeerd in zoogdieren in verband met hun rol in medische
aandoeningen zoals atherosclerose, obesitas, en diabetes. Lipoproteïnen zijn echter ook
onderzocht in andere, sterk verschillende dierklassen, met name in insecten. In deze oude
en diverse diergroep is het functioneren van lipoproteïnen vooral bestudeerd in de context
van langdurige vliegactiviteit, onder meer bij de treksprinkhaan Locusta migratoria
tijdens diens massale trekvluchten.
Het (enige) lipoproteïne van insecten, genaamd lipoforine, beschikt in vergelijking
met de vet-transporterende lipoproteïnen van zoogdieren over enkele opmerkelijke
functionele en structurele eigenschappen. Zo is het herbruikbaar, waardoor lipid transport
niet afhankelijk is van de synthese van nieuwe lipoproteïnen. Tevens verschillen de
lipoproteïnen van insecten in hun componenten. Terwijl triacylglycerol het voornaamste
lipid in zoogdier lipoproteïnen is, bevat lipoforine met name diacylglycerol, en bindt het
ook beduidend minder lipid moleculen. Bovendien bevat lipoforine twee eiwitten, apoLp-I
en apoLp-II, terwijl de vet-transporterende lipoproteïnen van zoogdieren gestabiliseerd
worden door één eiwitcomponent, apoB. Het is echter gebleken dat apoLp-I en -II
ontstaan uit de klieving van een precursor eiwit, genaamd apoLp-II/I, dat evolutionair
verwant is aan apoB. ApoLp-II/I en apoB maken deel uit van de familie van ‘large lipid
transfer’ eiwitten, de LLTP, die gekarakteriseerd worden door homologie in de Nterminale ~900 aminozuren van deze eiwitten, de LLT module.
De specifieke eigenschappen van insect lipoproteïne ten opzichte van de vettransporterende zoogdier lipoproteïnen vinden mogelijk hun oorsprong in verschillen
tussen de structuren waaruit ze zijn opgebouwd, en vanuit dit perspectief zijn de
biosynthese van lipoforine, de evolutie van lipoproteïne precursors, alsmede de diversiteit
in hun receptoren onderzocht in dit proefschrift.
135
Lipoforine biosynthese heeft twee opvallende kenmerken: 1) klieving van apoLpII/I in apoLp-I en –II, en 2) lipidatie van apoLp-II/I of de klievingsproducten daarvan tot
een lipoproteïne. Deze processen vinden plaats in het vetlichaam, een weefsel dat functies
van de lever en het vetweefsel van zoogdieren (en andere gewervelde dieren) combineert.
In Hoofdstuk 2 wordt de klieving van apoLp-II/I in apoLp-I en apoLp-II nader
bestudeerd. Hiertoe werd een recombinant insecten systeem opgezet dat een N-terminaal
deel van apoLp-II/I, overeenkomend met het volledige apoLp-II en een deel van apoLp-I,
tot expressie brengt. Door specifieke aminozuren in apoLp-II/I te wijzigen kon klieving
worden voorkomen, evenals door incubatie van recombinante cellen met een remmer voor
proproteïne convertases (een groep van eiwit-klievende enzymen). Deze experimenten
ondersteunen de betrokkenheid van een furine-achtige proproteïne convertase bij de
klieving van apoLp-II/I. In vitro incubatie van de klievingsremmer met L. migratoria
vetlichaam wees uit dat klieving niet essentieel is voor de secretie en lipidatie van
lipoforine, aangezien ongekliefd apoLp-II/I tevens een hoge-dichtheids lipoforine blijkt te
vormen. Deze vinding roept de vraag op wat dan de functie van apoLp-II/I klieving is.
Modellering van de LLT module van apoLp-II/I, inclusief apoLp-II en een deel
van apoLp-I, gaf structurele gelijkenis aan met apoB, het structurele eiwit van vele
zoogdier lipoproteïnen (Hoofdstuk 2). Uitgaande van kennis over apoB lipoproteïne
biosynthese werd de lipidatie van apoLp-II/I nader onderzocht in Hoofdstuk 3.
Amfipatische structuren spelen een zeer belangrijke rol in de associatie van lipid, zowel in
apoB als in vele andere ongerelateerde lipid-bindende eiwitten. Voorspelling van de
structuur wijst op de aanwezigheid van clusters verrijkt in amfipatische α-helices danwel
amfipatische β-strands in apoLp-II/I. Deze zijn, bezien vanaf de N- tot de C-terminus,
georganiseerd als α-β-α, enigszins gelijkend op een verkorte versie van apoB, dat de
organisatie α-β-α-β-α bezit. Recombinant expressie van truncaties van apoLp-II/I wijst
uit dat de sequentie van het β cluster noodzakelijk is voor lipidatie tot een lipoproteïne.
De factor MTP (microsomaal triglyceride transfer proteïne) speelt een essentiële
rol in de lipidatie van apoB tot een lipoproteïne. Aangezien insecten ook een MTP gen
bezitten, werd de mogelijke rol daarvan in lipoforine biosynthese onderzocht (Hoofdstuk
3). Co-expressie van een insecten MTP blijkt de lipoproteïne vorming te stimuleren. Niet
alleen de secretie van apoLp-II/I en diens klievingsproducten bleek toe te nemen, maar
ook hun lipidatie. Hoewel het belang van MTP in lipoproteïne biosynthese nog
vastgesteld dient te worden in vivo, wijzen deze vinding én de rol van het amfipatische β
cluster in lipid binding er sterk op dat de biosynthese van lipoproteïnen in zowel insecten
als zoogdieren afhankelijk is van dezelfde structurele componenten. De huidige
mechanismen van lipoproteïne biogenese vinden dus hun oorsprong in de eerste dieren.
Om inzicht te verwerven in de origine en de huidige variatie van lipoproteïnen in dieren
werd de evolutie en diversiteit van de familie waartoe apoB en apoLp-II/I behoren, de
136
LLTP familie, nader bestudeerd (Hoofdstuk 4). Hoewel de oorsprong van deze familie
niet getraceerd kon worden, kwam uit fylogenetische analyse naar voren dat de LLTP
familie opgedeeld kan worden in 3 subfamilies, te weten de apoB-achtige LLTP, de
vitellogenine-achtige LLTP, én de MTP’s. ApoLp-II/I en apoB behoren tot de apoBachtige LLTP, evenals een nieuw geïdentificeerd LLTP in insecten, voorlopig het ‘apoLpII/I-related protein’ genoemd. Opvallend genoeg behoort het voornaamste dooiereiwit in
eicellen van een groep van kreeftachtigen, dat daar vitellogenine was genoemd, ook tot de
apoB-achtige LLTP. De apoB-achtige LLTP vertonen unieke gelijkenissen in de LLT
module alsmede in een geconserveerd motief daar juist buiten, en in de relatieve grootte
van hun amfipatische clusters. De functionele en structurele diversiteit van LLTP wordt
bediscussieerd vanuit een evolutionair perspectief.
Waar de LLTP de structurele basis vormen voor lipoproteïnen en hun biogenese, wordt de
cellulaire opname van lipoproteïnen gemedieerd door leden van de LDLR familie. De
huidige classificatie van nieuw-ontdekte LDLR familieleden is vaak gebaseerd op het
aantal cysteïne-rijke eenheden in het ligand-bindend domein. In Hoofdstuk 5 laten we zien
dat ze ook geclassificeerd kunnen worden (en wellicht beter) op basis van hun Cterminale niet-repetitieve domeinen. Op deze wijze worden insect lipoforine receptoren,
die onderling verschillen in het aantal cysteïne-rijke eenheden in het ligand-bindend
domein, gekarakteriseerd als een aparte groep. De unieke sequentiekarakteristieken van
LpR’s in deze domeinen worden besproken in relatie tot hun functionele eigenschappen
ten opzichte van de LDLR familieleden in zoogdieren.
Samengevat zijn de belangrijkste resultaten beschreven in dit proefschrift: (1) het
structurele eiwit van lipoforine, apoLp-II/I, wordt gekliefd door een insecten furine, (2)
klieving is niet essentieel voor de vorming van apoLp-II/I tot een hoge-dichtheids
lipoproteïne, (3) lipoproteïne vorming is afhankelijk van de aanwezigheid van een regio
die voorspeld werd verrijkt te zijn in amfipatische β-strands, (4) MTP stimuleert de
secretie en lipidatie van lipoforine in een recombinant expressie systeem, (5) apoLp-II/I is
een apoB-achtige LLTP, en (6) LDLR familie leden kunnen worden geklassificeerd op
basis van hun niet-repetitieve domeinen.
Aldus toont dit proefschrift dat de biogenese van lipoproteïnen en het lipid
transport in zowel zoogdieren als insecten geregeerd wordt door gemeenschappelijke
moleculaire structuren en mechanismen. Modificatie van deze elementen, door een
samenspel van evolutie en biosynthese, resulteert in de compositionele en functionele
verschillen tussen lipoproteïnen. Vanuit dit inzicht alsmede de ontwikkelde methode tot
recombinant lipoforine expressie kan nu worden voortgegaan naar het begrijpen van de
moleculaire achtergrond van de opmerkelijke eigenschappen van de lipoproteïnen en het
lipid transport in insecten.
137