197 NEDERLANDSE SAMENVATTING Interacties tussen cellen en

Nederlandse samenvatting
NEDERLANDSE SAMENVATTING
Interacties tussen cellen en de extra-cellulaire matrix (ook wel cel-matrix
interacties genoemd) zijn belangrijk voor celoverleving, proliferatie en migratie.
Wanneer een primaire tumor eenmaal gevormd is, kunnen meerdere
veranderingen binnen deze tumor optreden zoals verlies van interacties tussen
cellen onderling en verandering van cel-matrix interacties qua eitwit expressie en
dynamiek. Veranderingen van de eigenschappen van cel-matrix interacties is één
van de karakteristieken van epitheliaal-naar-mesenchymale (EMT) transitie. EMT
is een cellulair proces waarbij tumor cellen de mogelijkheid verwerven om de
primaire tumor te verlaten en ergens anders in het lichaam uitzaaiingen
(=metastasen) te vormen. In dit proefschrift beschrijf ik onze bevindingen over
de rol van de cel adhesie moleculen focal adhesion kinase (FAK) en paxillin in
borstkanker progresssie en de vorming van metastasen. Ten eerste worden in
hoofdstuk 2 de verschillende licht microscopie technieken voor het volgen van
migrerende cellen in zowel 2D, 3D en in vivo gepresenteerd. In het bijzonder
introduceren we de FLIP-FRAP methode (Fluorescence loss in photobleaching
and Fluorescence recovery after photobleaching; ook wel half-FRAP methode
genoemd). Deze methode geeft inzicht in de kinetiek van cel-matrix interactie
eiwitten in een cel. Het bestuderen van de vorming van metastasen is van belang
voor het beter behandelen van kankerprogressie. In dit proefschrift heb ik
gebruik gemaakt van een nieuw muis in vivo metastaseringsmodel welke ik in
detail heb beschreven. Verder heb ik de relatie tussen het eiwit kinase c-Jun Nterminal kinase (JNK) en paxillin in het migratie- en metastasegedrag van
borsttumor cellen bestudeerd.
Een van onze doelen is het bestuderen van het metastaseproces vanuit
de primaire tumor: hoe ontvluchten de kankercellen de tumor massa en vooral
hoe intravaseren de kankercellen de bloedvaten in de tumor. Om snel te
migreren beschikken tumorcellen over kleine cel-matrix adhesies die snel moeten
worden gevormd en weer afgebroken (=turnover van cel-matrix adhesies). Om
de dynamiek van deze adhesies te bestuderen zijn er verschillende tecknieken
beschikbaar. In Hoofdstuk 3 geven we een overview van verscheidene
lichtmicroscopie tecknieken met de bijhorende beeldanalyse methoden, waarmee
we cel migratie en cel-matrix adhesies in kankercellen bestuderen in zowel 2D,
3D en in vivo. In Hoofdstuk 4, presenteren we een methodiek geschikt om de
dynamiek van de focal adhesie eiwitten te kwantificeren dankzij de zo genoemde
“bleek techniek” FRAP en/of FLIP. Hiervoor hebben we een model opgezet
waarbij we de kinetiek van GFP-gelabelde eitwitten in een cel in zowel het
cytoplasma als ook alle cell-matrix adhesies kunnen meten. De kracht van deze
methode is de mogelijkheid om de dynamiek van een eiwit op verschillende
punten in een cel afhankelijk van adhesie type en distributie te bepalen. Dankzij
het bleken van de helft van de cel kunnen we de eiwitdynamiek in kaart te
brengen en in relatie te brengen met de grootte van de focal adhesies en de
197
Miscellaneous
distributie in de zelfde cel. We hebben dit toegepast om het verschil in het
gedrag van twee zeer belangrijke cel-matrix adhesie componenten te bepalen:
paxillin en focal adhesie kinase (FAK). We laten duidelijk zien dat beiden
eiwitten verschillen in verblijftijd bij de cel-matrix adhesies: paxillin (100s) zit
langer dan FAK (60s) op cell-matrix adhesies. Bovendien, meten we dat hoe
groter de cel-matrix adhesie is des te langer verblijven de twee componenten op
focal adhesies. FAK kinetiek is ook gevoelig voor de extra-cellular matrix
dichtheid. Op laag collagen matrix dichtheid is de verblijftijd van FAK korter
dan op een hoge collageen dichtheid. Dus de kinetiek van FAK en paxillin zijn
afhankelijk van de maat van de adhesie en ook het type.
Metastase vorming is een belangrijke stap in de progressie van kanker.
De onderliggende mechanismen verantwoordelijk voor metastasering zijn nog
niet goed begrepen. In dit proces is er een belangrijk moment wanneer
tumorcellen met bepaalde eigenschappen de primaire tumor kunnen verlaten en
de bloedvaten binnen treden. Er zijn verschillende eiwitten die een rol spelen in
de dynamiek van cel-matrix adhesies en die ook betrokken zijn in de ´tumorcel
autonome´ metastaseringsprocessen; celmigratie is een van deze processen. Om
de rol van cel-matrix adhesie eiwitten in dit proces te bestuderen, hebben we een
geschikt muismodel opgezet. In Hoofdstuk 5 beschrijven we ten eerste een
geoptimaliseerd muismodel waarbij de MTLn3 cellijn met overexpressie van de
groei factor receptor EGFR gebruikt wordt. Wij vonden dat tumorcellen met een
verhoogde expressie van EGFR in een immuun-deficiënte muis meer
metastaseren dan de controle cellen met normaal EGFR expressie. Bovendien
laten we zien dat een muizenstam zonder B, T en met name NK cellen het meest
geschikte model is voor het bestuderen van metastasevorming. In onze studies
was de tumor groei niet beïnvloed door het immuunsysteem maar het aantal
long metastases wel. De EGFR GFP-MTLn3 cellen metastaseren het meest in de
Rag2-/- γc-/- muizen die helemaal geen T, B en NK cellen hebben maar wel
macrophagen. Samengevat demonstreren we dat de Rag2-/- γc-/- muis in
combinatie met de EGFR GFP-MTLn3 cellijn een goed in vivo model is om de
´tumorcel autonome´ metastaseringsprocessen te bestuderen. Deze EGFR GFPMTLn3 cellijn is verder gebruikt in Hoofdstuk 6 waarbij we de expressie van een
bepaald kandidaat pro-metastaseringseiwit specifiek in de kanker cellen tot
expressie kunnen brengen. Met behulp van doxycycline in het drinkwater van de
dieren, kunnen we, wanneer nodig, de expressie van een bepaald eiwit aanzetten
in zowel de primaire tumor als de metastasen die gevormd zijn in de long.
Bovendien kunnen we in de primaire tumor, dankzij het gebruik van de
fluoroscente eiwitten GFP (=green fluorescent protein) en CFP (=cyan fluorescent
protein), de controle en de mutante cellen met behulp van zogenaamde tweefoton microscopie volgen. Op deze manier is het effect van de overexpressie van
een bepaald eiwit op celmigratie niveau in een primaire tumor in de muis te
visualiseren en kwantificeren.
198
Nederlandse samenvatting
De progressie van borstkanker is (deels) afhankelijk van de
mogelijkheid van cellen om te ontsnappen uit de primaire tumor om vervolgens
metastasen te vormen op andere plaatsen in het lichaam. Deze metastasering kan
worden geïnitieerd door cel-matrix adhesie signalen. Cel-matrix adhesies zijn
inderdaad belangrijk in borstkankerprogressie. FAK is een belangrijke
component in de cel adhesie structuren omdat het signalen van groeifactor
receptoren en integrines doorstuurt naar andere eiwitten en op deze manier
cellulaire processen reguleert zoals proliferatie, celoverleving, de dynamiek van
adhesie en celmigratie. Verhoogde FAK expressie en activiteit wordt vaak
gevonden in verschillende typen kanker, inclusief borstkanker en correleert met
progressie van deze ziekte. In Hoofdstuk 2 hebben we de rol van FAK als
potentieel target voor kankerbestrijding beschreven. Een andere belangrijk eiwit
in het cel-matrix adhesie proces is paxillin. Dit eiwit speelt een platform-rol
binnen de cel-matrix adhesie componenten. In Hoofdstuk 7 bestuderen we de rol
van paxillin in metastase vorming; in het bijzonder analyseren we de rol van de
fosforileringsplaats Ser178 van paxillin. Om de rol van paxillin Ser178 te kunnen
bestuderen hebben we gebruik gemaakt van borsttumor MTLn3 cellen waar wild
type GFP-paxillin of een mutant GFP-paxillin-S178A die niet gefosforyleerd kan
worden tot overexpressie zijn gebracht. We laten zien dat cellen met mutant
overexpressie veel minder kunnen migreren door gereduceerd cel-matrixadhesie dynamiek. De vermindering van celmigratie is ook geassocieerd met een
vermindering van de ontwikkeling van borsttumor metastasen in de long in onze
proefdiermodellen. Tevens laten we zien dat verstoring van de paxillin-JNK
signaling pathway in verminderde expressie van de groei factor receptor EGFR
op eitwit en mRNAs niveau resulteert. Re-expressie van wt EGFR in de mutant
cellen zorgt dat de cellen weer naar de longen kunnen metastaseren. We laten
hier voor het eerst een relatie zien tussen paxillin en EGFR-gemediëerde kanker
metastasering. Wellicht dat de paxillin-JNK signaaltransductie een nieuwe target
is om kanker metastasering te voorkomen.
Samengevat laat het onderzoek beschreven in dit proefschrift zien dat
zowel FAK als paxillin een belangrijke rol spelen in cel-matrix adhesie dynamiek
en in de progressie van borstkanker. Het ontrafelen van cel-matrix adhesie
gerelateerde processen in relatie tot borstkanker zal bijdragen aan het beter
begrijpen van mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van
borstkanker en de progressie daarvan. Tevens zal de mogelijkheid van remming
van de eiwitten die cruciaal zijn in de regulatie van cel-matrix adhesies in de
behandeling van borstkanker verder moeten worden onderzocht.
199