Optimalisatie en validatie van een TaqMan Low Density Array Card
advertisement
Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Adacemiejaar 2013-2014 Optimalisatie en validatie van een TaqMan Low Density Array Card voor de moleculaire detectie van seksueel overdraagbare aandoeningen Jessie Calleeuw Promotor: Prof. Dr. Sc. Van Landschoot Anita Tutor: Dr. Reynders Marijke en Dr. Sc. Descheemaeker Patrick Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master of Science in de industriële wetenschappen: Biochemie Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Adacemiejaar 2013-2014 Optimalisatie en validatie van een TaqMan Low Density Array Card voor de moleculaire detectie van seksueel overdraagbare aandoeningen Jessie Calleeuw Promotor: Prof. Dr. Sc. Van Landschoot Anita Tutor: Dr. Reynders Marijke en Dr. Sc. Descheemaeker Patrick Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master of Science in de industriële wetenschappen: Biochemie “De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen van de scriptie te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.” “The author and the promoter give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified when using the results from this thesis”. 6 juni 2014 Auteur Calleeuw Jessie Promotor Prof. Dr. Sc Van Landschoot Anita Woord vooraf Deze scriptie is dankzij de steun en hulp van vele mensen tot stand gekomen. Graag wil ik mijn promotoren, Dr. Marijke Reynders en Dr. Sc. Patrick Descheemaeker, bedanken voor de zeer goede begeleiding en hun vrijgemaakte tijd om deze scriptie mede tot stand te brengen. Daarnaast dank ik ook de collega’s van het labo moleculaire microbiologie, Sofie, Ellen, Thomas, Charlotte, Liselotte en Sarah voor hun hulpvaardigheid tijdens het onderzoek. Ook Dr. Sc. Anita Van Landschoot, die mij heeft begeleid tijdens het academiejaar, wil ik graag bedanken. Tot slot wil ik ook mijn ouders, partner, familie en vrienden bedanken. Zij hebben mij gesteund toen het moeilijker ging, mij de moed gegeven om door te zetten tot de eindmeet in zicht was en geholpen elk op hun manier. Bedankt aan iedereen, Jessie Abstract Seksueel overdraagbare aandoeningen komen frequent voor in onze maatschappij. Het ziektebeeld gepaard gaande met een onbehandelde soa kan zeer ernstig zijn. Daarom is vroegtijdige diagnostiek gewenst. De klassieke bacteriologische diagnostiek is weinig gevoelig waardoor moleculaire detectiemethoden worden aangewend. De vaakgebruikte commerciële kits kunnen echter nog altijd onvoldoende gevoelig zijn en ze zijn vaak beperkt in hun aantal op te sporen parameters. Het doel van dit onderzoek is een brede in-huis screeningsmethode te ontwikkelen waarbij Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Haemophilus ducreyi, Herpes Simplex Virus II, Herpes Simplex Virus I, Trichomonas vaginalis, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis en Treponema pallidum simultaan kunnen worden opgespoord met een TaqMan Low Density Array Card (TAC) op basis van Real-Time PCR. Tijdens dit onderzoek wordt de nadruk gelegd op de eerste zes pathogenen, de overige vijf worden behandeld in het gelijklopende thesisonderwerp “Ontwikkeling van een TaqMan Array Card voor de simultane detectie van seksueel overdraagbare pathogenen” door Jeroom Pieters. Tijdens de ontwikkeling werden in de eerste plaats speciesspecifieke targetgenen geselecteerd waarop primer- en probesequenties werden gegenereerd. Daarna werden deze geoptimaliseerd en met bijkomende targets op de TAC geplaatst door middel van lyofyliseren. Uit de resultaten na validatie is gebleken dat een aantal targets een slechte efficiëntie hadden of kruisreactie vertoonden. Deze targets zullen bij een volgende versie van de TAC niet meer aanwezig zijn. Daarnaast is gebleken dat de TAC een gevoeliger methode is dan de huidige BD ProbeTec-methode en ze een bredere screening zal uitvoeren. De specificiteit is hoog door de meerdere targets per pathogeen en de methode is meer gecontroleerd dankzij de interne staalcontrole, inhibitie- en extractiecontrole en TAC-controle. Ook bewaarcondities en matrix geïnduceerd effect werden nagegaan maar dit is tot op heden nog niet afgerond. Seksueel overdraagbare aandoeningen, TAC, Real-Time PCR, validatie Abstract Sexually transmitted diseases are common in our society. The pathology associated with untreated STDs can be very serious. Therefore, early diagnosis is desired. The classic bacteriological diagnosis has a low sensitivity whereby molecular detection methods are used. However, the frequently used commercial kits are not always sufficiently sensitive and they tend to be restricted in their number of detectable pathogens. The purpose of this research is to develop a broader in-house screening method where Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Haemophilus ducreyi, Herpes Simplex Virus II, Herpes Simplex Virus I, Trichomonas vaginalis, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis and Treponema pallidum will be detected simultaneously with a TaqMan Low Density Array Card (TAC) based on Real-Time PCR. During this study, the focus will be on the first six pathogens, the remaining five are treated in a parallel study "Ontwikkeling van een TaqMan Array Card voor de simultane detectie van seksueel overdraagbare pathogenen" by Jeroom Pieters. The first stage during the development was the selection of species-specific target genes to generate primers and probes. These were then optimized and placed on the TAC by lyophilizing with additional targets. The results after validation have shown that a number of targets had a poor efficiency or cross-reaction was shown. These targets will not be present in the next version of the TAC. In addition, it has been found that the TAC is a more sensitive method than the current BD ProbeTec method and it will perform a wider screening. The specificity is high because of the multiple targets per pathogen and the method is more controlled through the internal controls. These controls include sample control, inhibition/extraction control and TAC control. Also, storage conditions and matrix induced effect were examined, but this has not been completed to date. Sexually transmitted diseases, TAC, Real-Time PCR, validation Inhoudsopgave 1 Inleiding ........................................................................................................................................ 13 2 Literatuurstudie ............................................................................................................................. 15 3 2.1 Seksueel overdraagbare aandoeningen .................................................................................. 15 2.2 De geselecteerde pathogenen ................................................................................................ 18 2.2.1 Neisseria gonorrhoeae .................................................................................................. 18 2.2.2 Herpes Simplex Virus II ................................................................................................ 20 2.2.3 Mycoplasma genitalium................................................................................................. 22 2.2.4 Ureaplasma urealyticum ............................................................................................... 25 2.2.5 Ureaplasma parvum ...................................................................................................... 26 2.2.6 Haemophilus ducreyi ..................................................................................................... 27 2.3 Extractie van nucleïnezuren .................................................................................................. 30 2.4 Real-Time PCR ..................................................................................................................... 32 2.4.1 Primers en probes .......................................................................................................... 35 2.4.2 Detectie via non-specific labels ..................................................................................... 37 2.4.3 Detectie via sequence specific probes ........................................................................... 41 2.4.4 ViiaTM7 Real-Time PCR system.................................................................................... 45 2.5 Gelelektroforese .................................................................................................................... 47 2.6 TaqMan Low Density Array Card ......................................................................................... 48 2.7 BD ProbeTec ......................................................................................................................... 49 Materiaal en methoden .................................................................................................................. 50 3.1 Materiaal................................................................................................................................ 50 3.1.1 Vircell controle DNA .................................................................................................... 50 3.1.2 Bacteriële culturen ......................................................................................................... 52 3.1.3 Klinische monsters ........................................................................................................ 52 3.1.4 Primers en probes .......................................................................................................... 53 3.2 Extractie van nucleïnezuren .................................................................................................. 56 3.2.1 3.3 Real-Time PCR Gene Expression Assays ............................................................................. 57 3.3.1 3.4 Werkwijze ..................................................................................................................... 56 Werkwijze ..................................................................................................................... 57 Real-Time PCR ..................................................................................................................... 58 3.4.1 Werkwijze Real-Time PCR met SYBR Select MasterMix en smeltcurveanalyse ........ 58 3.4.2 Werkwijze Real-Time PCR met TaqMan Fast Virus 1-step MasterMix ...................... 59 3.4.3 Werkwijze Real-Time PCR TAC-STD met Fast Virus 1-step MasterMix ................... 60 3.5 Gelelektroforese .................................................................................................................... 62 3.5.1 4 Werkwijze ..................................................................................................................... 62 3.6 Primer/probeselectie en optimalisatie uniplex PCR .............................................................. 64 3.7 Validatie TaqMan Low Density Array Card ......................................................................... 66 3.7.1 Matrices ......................................................................................................................... 66 3.7.2 Bepaling aanvaardbare performantiekenmerken ........................................................... 68 3.7.3 Praktische voorbereiding ............................................................................................... 74 Resultaten en discussie .................................................................................................................. 77 4.1 Selectie primers en probes ..................................................................................................... 77 4.1.1 Herpes Simplex Virus II ................................................................................................ 77 4.1.2 Haemophilus ducreyi ..................................................................................................... 77 4.1.3 Mycoplasma genitalium................................................................................................. 78 4.1.4 Ureaplasma urealyticum en Ureaplasma parvum......................................................... 78 4.1.5 Neisseria gonorrhoeae .................................................................................................. 78 4.2 Optimalisatie uniplex PCR .................................................................................................... 79 4.2.1 Functionaliteit primers .................................................................................................. 79 4.2.2 Efficiëntie PCR.............................................................................................................. 80 4.2.3 Specificiteit aan de hand van smeltcurveanalyse .......................................................... 83 4.2.4 Gelelektroforese ............................................................................................................ 86 4.2.5 Specificiteit in aanwezigheid van vreemd DNA ........................................................... 87 4.2.6 Functionaliteit probes .................................................................................................... 87 4.2.7 Specificiteit probes ........................................................................................................ 88 4.2.8 Gevoeligheid probe gebaseerde Real-Time PCR-reacties............................................. 90 4.2.9 Detectie genomisch DNA .............................................................................................. 92 4.2.10 Samenstelling TAC-STD array card ............................................................................. 95 4.3 Validatie TAC ....................................................................................................................... 98 4.3.1 Selecteren matrices ........................................................................................................ 98 4.3.2 Detectielimiet ................................................................................................................ 98 4.3.3 Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid .................................................................... 100 4.3.4 Matrix geïnduceerd effect............................................................................................ 103 4.3.5 Efficiëntie TaqMan Low Density Array Card ............................................................. 105 4.3.6 Specificiteit .................................................................................................................. 108 4.3.7 Juistheid ....................................................................................................................... 109 4.3.8 Bewaarcondities .......................................................................................................... 111 4.3.9 Vergelijking van methoden ......................................................................................... 111 4.3.10 Interne controles .......................................................................................................... 112 5 Besluit.......................................................................................................................................... 115 6 Bibliografische lijst ..................................................................................................................... 116 7 Bijlagen ....................................................................................................................................... 122 Lijst met figuren Figuur 1: N. gonorrhoeae, foto met behulp van EM (Kenneth, 2012) .................................... 18 Figuur 2: Herpes Simplex Virus, vereenvoudigde figuur van de opbouw (Wagner,2003) ..... 20 Figuur 3: M. genitalium, foto met behulp van TEM (Taylor-Robinson & Jensen,2011) ........ 22 Figuur 4: U. urealyticum, foto met behulp van TEM (BacMap,2013) .................................... 25 Figuur 5: H. ducreyi, foto met behulp van TEM (BacMap,2013) ........................................... 28 Figuur 6: Schematische voorstelling van het principe van de QIA Symphony SP van Qiagen (Descheemaeker,2013) ............................................................................................................. 31 Figuur 7: Éen cyclus tijdens PCR (polymerasekettingreactie,2014)........................................ 32 Figuur 8: Grafische representatie van Real-Time PCR-data (AB,2011) ................................. 34 Figuur 9: Spectrum en moleculaire structuur van SYBR Green (SYBR Green, 2013) ........... 37 Figuur 10: Denaturatiecurve waarbij fluorescentie daalt in functie van de temperatuur (Van Gool,1997)................................................................................................................................ 38 Figuur 11: Smeltcurveanalyse van organisme A, B en combinatie organisme A en B (naar MeltingCurveAnalysis,2013) ................................................................................................... 39 Figuur 12: Smeltcurveanalyse waarbij SNP wordt aangetoond (HighResolutionMelt,2014) . 39 Figuur 13: Proximal quenching principe (Vandesompele,2009) ............................................. 41 Figuur 14: FRET quenching principe (Vandesompele,2009) .................................................. 41 Figuur 15: Principe hybridization probes (LightCycler Real-time PCR,2014) ....................... 42 Figuur 16: Hydrolyse TaqMan-probe door hitte stabiel DNA-polymerase (Asuragen,2012) . 43 Figuur 17: Hydrolyse TaqMan MGB-probe door hitte stabiel DNA-polymerase (Kutyavin et al.,2000) .................................................................................................................................... 44 Figuur 18: Werkingsprincipe van de ViiaTM7 Real-Time PCR-system (Nollet,2013) .......... 46 Figuur 19: Taqman Low Density Array Card (Steg et al.,2006;Zheng et al.,2006) ................ 48 Figuur 20: Temperatuurstemplate PCR en smeltcurveanalyse ................................................ 59 Figuur 21: Temperatuurstemplate uniplex PCR-reactie........................................................... 60 Figuur 22: Temperatuurstemplate TAC-STD array card PCR-reactie..................................... 61 Figuur 23: Amplificatiecurve met de 4 primerparen van N. gonorrhoeae............................... 80 Figuur 24: Amplificatiecurve verdunningsreeks N. gonorrhoeae primerpaar 307-308........... 84 Figuur 25: Smeltcurve verdunningsreeks N. gonorrhoeae primerpaar 307-308 ..................... 84 Figuur 26: Smeltcurve verdunningsreeks N. gonorrhoeae primerpaar 310-311 ..................... 85 Figuur 27: Scheiding op agarosegel van alle primerparen van N. gonorrhoeae ...................... 86 Figuur 28: Amplificatiecurve U. parvum en S. aureus ............................................................ 88 Figuur 29: Multicomponent plot U. parvum en S. aureus ....................................................... 89 Figuur 30: Kruisreactie primerpaar 313-314 probe 315 met N. meningitidis .......................... 89 Figuur 31: Multicomponent plot Gene expression assay met humaan bloedstaal ................... 93 Figuur 32: Kruisreactie NG Omp AVK ................................................................................. 109 Figuur 33: Resultaten inhibitie/extractiecontrole ................................................................... 113 Figuur 34: Resultaten staalcontroles ...................................................................................... 114 Lijst met tabellen Tabel 1: Overzicht van de belangrijkste soa’s en hun etiologisch agens (De Schrijver, 2004) 17 Tabel 2: Run-type met data collecion point (AB,2011) ........................................................... 45 Tabel 3: Gegevens Vircell controle DNA ................................................................................ 51 Tabel 4: Gegevens geselecteerde primers ................................................................................ 53 Tabel 5: Gegevens geselecteerde probes .................................................................................. 55 Tabel 6: Targetgenen per organisme ........................................................................................ 64 Tabel 7: Overzicht planning precisie in verschillende matrices .............................................. 70 Tabel 8: Samenstelling mixen kruisreactie .............................................................................. 71 Tabel 9: Mogelijks kruisreactieve stalen .................................................................................. 72 Tabel 10: Samenstelling en opmaak Vircell controle DNA mix 1 .......................................... 74 Tabel 11:Samenstelling en opmaak Vircell controle DNA mix 2 ........................................... 75 Tabel 12: Samenstelling mengstaal mix 1 en mengstaal mix 2 ............................................... 76 Tabel 13: Gemiddelde Ct-waarden van ieder organisme met bijhorende efficiëntie ............... 81 Tabel 14: Geselecteerde primerparen ....................................................................................... 83 Tabel 15: Resultaten geconcentreerde urines ........................................................................... 91 Tabel 16: Invloed van verschillende matrices op de PCR-reactie ........................................... 92 Tabel 17: Resultaten Gene expression assay ........................................................................... 93 Tabel 18: Resultaten Gene expression assay met klinische stalen........................................... 94 Tabel 19: Samenstelling TAC-STD array card ........................................................................ 96 Tabel 20: Bepaling limit of detection ....................................................................................... 99 Tabel 21: Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid ............................................................... 100 Tabel 22: Verschil in resultaat bij verschillende matrices ..................................................... 104 Tabel 23: Invloed van matrix op kruisreactie......................................................................... 104 Tabel 24: De efficiëntie voor ieder targetgen per organisme ................................................. 106 Tabel 25: Kwaliteitscontroles met BD ProbTec en TAC-STD array card ............................. 110 Tabel 26: Resultaat met BD ProbeTec-methode .................................................................... 112 1 Inleiding Seksueel overdraagbare aandoeningen komen frequent voor in onze maatschappij. De symptomen van een onbehandelde soa kunnen verregaande gevolgen met zich meebrengen. Daarom is het van belang om soa’s in een vroeg stadium te diagnosticeren zodat een gepaste behandeling kan worden gestart. De klassieke bacteriologische diagnostiek kan hiervoor aangewend worden, maar deze is weinig gevoelig en niet altijd even evident. Daarom wordt er gebruikgemaakt van moleculaire detectiemethoden die een hogere gevoeligheid kennen. De moleculaire detectiemethode aangewend in het AZ Sint-Jan Brugge-Oostende is een commerciële kit, de BD ProbeTec-methode, die echter onvoldoende gevoeligheid biedt en die beperkt is tot het detecteren van twee soa’s, namelijk N. gonorrhoeae en C. trachomatis. Daarnaast wordt er ook getest op Herpes Simplex Virus als hier specifieke vraag naar is. Andere soa’s worden tijdens routinetesten niet opgespoord. Het doel van het huidige onderzoek is het ontwikkelen van een brede en gevoelige in-huis screeningsmethode waarbij Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Haemophilus ducreyi, Herpes Simplex Virus II, Herpes Simplex Virus I, Trichomonas vaginalis, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis en Treponema pallidum simultaan kunnen worden opgespoord met een TaqMan Low Density Array Card (TAC). Tijdens dit onderzoek wordt de nadruk gelegd op de eerste zes pathogenen, de overige vijf worden behandeld in het gelijklopend thesisonderwerp “Ontwikkeling van een TaqMan Array Card voor de simultane detectie van seksueel overdraagbare pathogenen” door Jeroom Pieters. Tijdens de bachelorproef werd er reeds onderzoek verricht naar speciesspecifieke targetgenen voor deze pathogenen waarbij voor ieder organisme minimum twee targetgenen werden gezocht. Specifieke primers en probes worden ontwikkeld op basis van deze targetgenen. Hierna volgt de optimalisatie van de primers en probes. De primers worden als eerste geoptimaliseerd met de SYBR Select MasterMix. Daarna worden de probes geoptimaliseerd met de TaqMan Fast Virus 1-step MasterMix. Uit deze resultaten zullen dan de twee gevoeligste primer-probe-paren per organisme geselecteerd worden om op de TAC-STD Array card te plaatsen via lyofyliseren. De overige wells worden aangevuld met interne controles en extra targets om de specificiteit te verhogen. De daaropvolgende stap is de validatie van de TAC-STD Array card. 13 Een vooropgesteld validatieplan wordt gevolgd waarbij de volgende performantiekenmerken zullen worden nagegaan: - Limit of detection - Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid - Matrix geïnduceerd effect - Efficiëntie - Specificiteit - Juistheid - Bewaarcondities - Vergelijking van methoden Daarnaast zal ook de cut-off waarde bepaald worden bij de interne controles zodat er kan worden nagegaan wanneer bijvoorbeeld de staalname onvoldoende is. Aan de hand van de bekomen resultaten kan dan een besluit worden genomen of de screeningsmethode al dan niet gevoeliger is en ter vervanging kan dienen van de huidig aangewende methode. Dit onderzoek is opgebouwd als volgt: Als eerste wordt een literatuurstudie verricht naar de behandelde soa’s en wordt er van ieder pathogeen een korte achtergrond geschetst. Ook de methoden die aangewend worden tijdens het onderzoek worden nader toegelicht in deze literatuurstudie. In ‘Materiaal en methoden’ worden de gebuikte materialen en de gevolgde methoden beschreven. Hierna volgen de resultaten van de optimalisatie en de validatie waarna een algemeen besluit kan worden genomen betreffende de nieuw ontwikkelde screeningsmethode. 14 2 Literatuurstudie 2.1 Seksueel overdraagbare aandoeningen Een seksueel overdraagbare aandoening (soa) of sexually transmitted disease (STD) is een term die wordt gebruikt voor een scala aan klinische aandoeningen die veroorzaakt worden door pathogenen die verworven en doorgegeven worden door hoofdzakelijk seksueel contact (CDC,2010). Een pathogeen dat een soa veroorzaakt, wordt overgedragen via bepaalde lichaamsvloeistoffen, zoals sperma, bloed, vaginaal vocht of bij contact tussen slijmvliezen die zich onder andere bevinden in de anus, penis, vagina en mond. In bepaalde gevallen kunnen soa’s overgedragen worden via verticale transmissie1 tijdens de bevalling van een besmette vrouw. Zo kunnen hiv, hepatitis B, hepatitis C en syfilis reeds overgedragen worden tijdens de zwangerschap van moeder op foetus. Daarnaast kunnen hiv, hepatitis B, hepatitis C, syfilis, de genitale Mycoplasma’s en Ureaplasma’s, chlamydia, herpes simplex virus en gonorroe de baby infecteren tijdens zijn of haar passage door het geboortekanaal. Een soa kan niet worden doorgegeven via speeksel, hoestbuien, insectenbeten of een onhygiënische wcbril. Ook bijvoorbeeld zwembaden vormen geen risico. Wanneer men besmet is met een soa, kan dat al dan niet gepaard gaan met klachten, zoals: - al dan niet purulente afscheiding uit de genitaliën en/of anus; - symptomen gelijkaardig aan een blaasontsteking; - zweertjes, wratjes of blaasjes op of rond de genitaliën; - jeuk aan of rond de genitaliën; - gezwollen klieren in de liezen; - pijn aan de voortplantingsorganen. Als er effectief een soa wordt vastgesteld, moet die worden behandeld ook al zijn er geen klachten of symptomen. Zonder de juiste behandeling kan een soa aanleiding geven tot ernstiger problemen (zie 2.2). De meeste soa’s zijn te genezen, andere zijn onder controle te houden met de correcte antimicrobiële behandeling (vaak een combinatietherapie) die specifiek is voor de betreffende soa. 1 Overdracht van het pathogeen van moeder op kind in de baarmoeder (in utero), tijdens de geboorte of door borstvoeding. 15 Momenteel komen soa’s opnieuw frequenter voor. Redenen hiervoor zijn bijvoorbeeld de terugval van het “safe-seksgedrag” (De schrijver, 2004). Aangezien meerdere soa’s te behandelen zijn, neemt niet iedereen de gevaren die met deze pathogenen gepaard gaan even serieus, waardoor vaker de protectieve voorbehoedsmiddelen achterwege worden gelaten. Een andere reden is ook het taboe rond soa’s. Ze zijn vaak moeilijk bespreekbaar, zeker binnen relaties waar maar één van beide partners besmet is. Als de soa wordt verzwegen, kan de partner ook besmet worden zonder dat hij of zij er enig besef van heeft. Als dit verzwegen wordt tegenover losse sekspartners, dan worden meerdere mensen geïnfecteerd tegen beter weten in. Geregeld worden meerdere mensen besmet met één of meerdere soa’s die al dan niet voor onaangename symptomen kunnen zorgen en bijkomende co-infecties met zich meebrengen die de gezondheid in het gedrang brengen. Het frequent voorkomen van soa’s ligt niet alleen aan de mensen die onverantwoord promiscue gedrag vertonen, maar ook situeert er zich actueel in België een probleem ter hoogte van de analytische beperkingen van de huidige detectiemethoden om de pathogenen op te sporen. De actuele (vaak commerciële) analysemethoden detecteren over het algemeen maar één of een beperkt aantal pathogenen, voornamelijk Neisseria gonorrhoeae en Chlamydia trachomatis, al dan niet aangevuld met Mycoplasma genitalium. Hier is zeker plaats voor de verbetering van de diagnostiek als men weet dat de meest voorkomende soa’s zich niet enkel tot die pathogenen beperken. De belangrijkste soa’s met hun respectievelijk etiologisch agens worden weergegeven in tabel 1. Zoals aangehaald in de inleiding zullen een aantal van die pathogenen verder toegelicht worden. 16 Tabel 1: Overzicht van de belangrijkste soa’s en hun etiologisch agens (De Schrijver, 2004) Aandoening Infectueus agens Chlamydia infectie Chlamydia trachomatis Condyloma acuminata/ genitale wratten Humaan papilloma virus (HPV) Donovanose / granuloma inguinale Calymmatobacterium granulomatis Gonorroe Neisseria gonorrhoeae Herpes genitalis Herpes simplex virus (HSV-I en HSV-II) Hepatitis B Hepatitis B-virus Hiv en aids Human immunodefieciency virus (HIV-I en HIV-II) Lymphogranuloma venereum Chlamydia trachomatis serovars L1 L2 L3 Scabies Sarcoptes scabiei Phthiriasis / schaamluizen Phthirius pubis Syfilis Treponema pallidum Trichomonase Trichomonas vaginalis Ulcus molle Haemophilus ducreyi Nongonococcal urethritis Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum en parvum, HSV I en HSV II, adenovirus, CMV, Mycoplasma hominis en M. genitalium, Trichomonas vaginalis en candida species Genitale infecties (Cervicitis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia endomyometritis, salpingitis, tubo-avariële trachomatis, Mycoplasma hominis en M. abcessen, PID) genitalium, Ureaplasma urealyticum en U. parvum, Trichomonas vaginalis, HSV I en HSV II, CMV, anaerobe bacteriën, Gardnerella vaginalis, Streptococci (agalactiae, pneumonia, pyogenes), enterobacteriaceae 17 2.2 De geselecteerde pathogenen De pathogenen die behandeld worden tijdens dit onderzoek zijn vijf bacteriële stammen en één virus, namelijk N. gonorrhoeae, M. genitalium, U. urealyticum, U. parvum, H. ducreyi en Herpes Simplex Virus II. Deze zes pathogenen worden hieronder kort besproken. 2.2.1 Neisseria gonorrhoeae Situering Taxonomische indeling: Rijk: Bacteria Stam: Proteobacteria Klasse: Beta Proteobacteria Orde: Neisseriales Familie: Neisseriaceae Geslacht: Neisseria Soort: Neisseria gonorrhoeae Neisseria gonorrhoeae is een Gram-negatieve, aerobe bacterie (diplococcen) die de seksueel overdraagbare aandoening gonorroe veroorzaakt. De bacterie is genoemd naar zijn ontdekker, Albert Neisser. Meerdere Neisseria species koloniseren het menselijk lichaam, waarvan de meeste commensale microflora betreffen, zoals N. cinera of N. lactamica. De twee pathogene stammen binnen het genus Neisseria zijn N. Figuur 1: N. gonorrhoeae, foto met behulp van EM gonorrhoeae en N. meningitidis. In dit (Kenneth, 2012) onderzoek zal de nadruk gelegd worden op N. gonorrhoeae, aangezien dat een soa is. N. meningitidis is een bacterie die een ernstige bacteriële meningo-encephalitis veroorzaakt, wat in het huidige onderzoek niet aan de orde is. N. gonorrhoeae is enkel terug te vinden na seksueel contact of bij direct contact met een besmet persoon. De bacterie is zeer gevoelig voor veranderingen in haar leefomgeving en groeit dus best in een stabiele omgeving waardoor het menselijk lichaam een goede gastheer is. Naast een stabiele leefomgeving biedt het menselijk lichaam ook bloed of hemoglobine alsook verschillende vitamines en aminozuren, zodat de bacterie goed kan groeien (Kenneth,2012). 18 Het natuurlijk afweermechanisme van het menselijk lichaam kan de bacterie niet volledig elimineren doordat ze slecht wordt gefagocyteerd door de aanwezigheid van het polysaccharidekapsel en de aanwezige pili of fimbriae (zie figuur 1). Ziektebeeld N. gonorrhoeae-infectie bij mannen brengt frequent een ontsteking teweeg van de muceuze membranen van het voorste deel van de urethra. Die infectie veroorzaakt de afscheiding van etter, kan moeilijk of pijnlijk urineren veroorzaken en gaat gepaard met een karakteristieke roodheid, zwelling, branderig warm gevoel en pijn in dit voorste deel van de urethra. Alternatieve infecties omvatten proctitis (na anorectale besmetting), pharyngitis (na orale besmetting) en ophthalmitis. Maar de infectie kan ook asymptomatisch verlopen waardoor deze niet of laattijdig gediagnosticeerd wordt en waardoor de risico’s op laattijdige complicaties verhogen. De man kan daardoor onbewust drager zijn van gonorroe en de ziekte verspreiden via onbeschermd seksueel contact. N. gonorrhoeae-infectie bij vrouwen geeft veelal aanleiding tot een ontsteking van de endocervix. Dat gaat gepaard met vaginale afscheiding en eventueel met klachten gelijkend aan die van een blaasontsteking. Bij zowat vijftig percent van de geïnfecteerde vrouwen verloopt de infectie asymptomatisch, wat dezelfde nadelen met zich meebrengt als bij mannen. Hiernaast zal de kans op PID2 (pelvic inflammatory disease) stijgen. N. gonorrhoeae was de eerste oorzaak van PID (CDC,2010; JM & Squifflet,2011; Boyce & Mitchell,1985) maar sinds de ontdekking en het gebruik van penicilline in de eerste helft van de twintigste eeuw, is het aantal gonorroe-gevallen op significante wijze afgenomen. Momenteel komt gonorroe ook duidelijk minder frequent voor in vergelijking met andere soa’s gelinkt aan PID, zoals Mycoplasma genitalium en Chlamydia trachomatis (zie tabel 1). Bij pasgeboren baby’s kunnen er zich, via direct contact met de geïnfecteerde moeder, ooginfecties ontwikkelen die het hoornvlies definitief beschadigen (ophthalmia neonatorum). Ook kan gonorroe in zeldzame gevallen van gedissemineerde infectie (DGI = disseminated gonococcal infection) een fatale afloop hebben bij pasgeboren baby’s, met een beeld van sepsis met secundaire infecties: artritis, huidinfectie, tenosynovitis, endocarditis, meningitis en “gonococcal scalp abcessen”. 2 PID: Ernstige ontstekingen van de vrouwelijke voortplantingsorganen, zoals onder andere de ovaria, eileiders en uterus wat littekenweefsel en verklevingen veroorzaakt met infertiliteit tot gevolg. 19 Problemen bij diagnostiek Detectie van N. gonorrhoeae kan ten gevolge van inadequate of te beperkte specificiteit van de uitgevoerde detectietechniek verwarring met zich meebrengen door vals positieve reacties met klinisch verwaarloosbare commensale Neisseria species (Boyce & Mitchell,1985). Die commensale flora komen voor op dezelfde plaatsen van het menselijk lichaam en ze hebben een gelijkaardige morfologie. Men dient er dus zeker van te zijn dat de gebruikte detectiemethode specifiek is voor N. gonorrhoeae, gezien de mogelijk zware gevolgen onder andere in het kader van verkrachting of kindermisbruik. 2.2.2 Herpes Simplex Virus II Situering Virus classificatie: Groep: Groep 1 (dsDNA) Orde: Herpesvirales Familie: Herpesviridae Subfamilie: Alphaherpesvirinae Geslacht: Simplexvirus Soort: Herpes Simplex Virus II Herpesvirussen zijn grote en complexe dsDNA-virussen die geëvolueerd zijn over minstens 400 miljoen jaar. Ondanks de verschillen in aminozuursequentie zijn ongeveer veertig genen vergelijkbaar en geconserveerd gebleven in alle herpesvirussen in zoogdieren (Norberg,2010). De genetische informatie van die virussen komt voor als een dubbelstrengig, lineair DNAmolecule aanwezig in een icosahedraal Figuur 2: Herpes Simplex Virus, vereenvoudigde figuur van de opbouw (Wagner,2003) capside (zie figuur 2). De capside wordt omgeven door een lipide dubbellaag die de envelop wordt genoemd. Tussen de envelop en de capside bevindt zich het tegument wat onder andere zorgt voor de aanhechting van de envelop en de capside. Op de envelop bevinden zich glycoproteïne spikes die dienen als herkenningselement. 20 Ze binden specifiek met receptoren die zich bevinden op het oppervlak van een gastheercel. Een viruspartikel moet namelijk specifiek binden met een gastheercel om deze te invaderen en te infecteren (Norberg,2010). Het virus wordt verspreid via direct contact, seksueel contact of via verticale transmissie tijdens de geboorte. Ziektebeeld Meer dan veertig jaar geleden werd HSV I onderscheiden van HSV II. Hierbij werd HSV II hoofdverantwoordelijk geacht voor de genitale herpes en HSV I voor herpes labialis. Wetenschappelijk onderzoek heeft echter uitgewezen dat die scheiding nog moeilijk te maken is en beide virussen verantwoordelijk kunnen zijn voor zowel genitale herpes als herpes labialis. Een virale infectie van HSV II gaat meestal gepaard met genitale laesies en genitale zweren (GUD = genital ulcer disease3). In die genitale zweren zijn de viruspartikels in overvloed aanwezig maar ook asymptomatische infectie komt frequent voor. Ruw geschat maken ongeveer veertig percent van de geïnfecteerde mensen asymptomatische infecties door. Die personen kunnen het virus overdragen, zelfs na meerdere jaren. Ook is er sprake van vaginale afscheiding, baarmoederhalsontsteking en bekkenpijn bij vrouwen (Biswas et al.,2011). In bepaalde gevallen kan er zelfs sprake zijn van neurologische klachten, zoals zenuwpijn, gevoelsstoornissen ter hoogte van de onderste ledematen, hoofdpijn en dergelijke. De eerste acute symptomatische fase kan ofwel een primaire infectie betreffen bij een persoon die nog nooit in contact kwam met het virus ofwel betreft het een klinische manifestatie bij een persoon die reeds van tevoren was geïnfecteerd. De eerste symptomen verschijnen in geval van primo-infectie ongeveer zeven dagen na de transmissie van het virus. De symptomen duren enkele weken en verdwijnen dan spontaan maar het virus zal latent in het lichaam aanwezig blijven. Opflakkering treedt op wanneer er sprake is van een lage weerstand van de gastheer. Die opflakkeringen zijn frequenter bij HSV II dan bij HSV I. Het virus kan ook ernstiger symptomen veroorzaken, zoals meningitis en zware neonatale sepsis (gekenmerkt door een multi-orgaaninfectie met viremie) waaraan een hoge mortaliteit gelinkt is. Ook zullen de genitale laesies een grote risicofactor vormen in geval van aanwezige hiv (human immunodeficiency virus) doordat de infectie de kans op parallelle hiv-Ibesmetting meer dan tweemaal zal verhogen (Biswas et al.,2011). Er wordt verondersteld dat de infectie met HSV II de genitale mucosa beschadigt en zo gevoelige plaatsen of een zekere permeabiliteit creëert voor een hiv-virus, wat leidt tot een verhoogde vatbaarheid voor dit virus bij hiv-negatieve personen. 3 Genital ulcer disease: Zwerende, erosieve, pustulaire of vesiculaire genitale laesis veroorzaakt door voornamelijk HSV, Treponema pallidum en Haemophilus ducreyi. 21 Problemen bij diagnostiek De actueel gebruikte diagnostische methoden zijn niet erg gevoelig en tegelijkertijd weinig specifiek. Enerzijds zijn de klassieke virale celcultuur en de HSV I- en HSV II-antigeen detectietest de meest gebruikte tests om het virus rechtstreeks op te sporen en simultaan te typeren. Anderzijds wordt HSV-serologie gebruikt om onrechtstreeks een voorgaand contact met HSV aan het licht te brengen door middel van antistofbepaling. Als HSV niet wordt gedetecteerd in urogenitale monsters, wil dat niet zeggen dat HSV afwezig is, omdat de virale afscheiding intermittent is. Een controletest is dus noodzakelijk om de resultaten te vergelijken. 2.2.3 Mycoplasma genitalium Situering Taxonomische indeling: Rijk: Bacteria Stam: Firmicutes Klasse: Mollicutes Orde: Mycoplasmatales Familie: Mycoplasmataceae Geslacht: Mycoplasma Soort: Mycoplasma genitalium Mycoplasma genitalium is een kleine intracellulaire bacteriesoort die de genitaliën koloniseert. Ze heeft een karakteristieke flesvorm (zie figuur 3) waarbij het binnendringen van de bacterie wordt bemiddeld door de gespecialiseerde tipstructuur. Deze soort is de kleinst zelfreplicerende bacterie en is regressief geëvolueerd door genoomreductie vanuit Gram-positieve bacteriële voorouders, namelijk clostridia (Taylor-Robinson & Jensen,2011). Figuur 3: M. genitalium, foto met behulp van TEM (Taylor-Robinson & Jensen,2011) 22 M. genitalium werd voor het eerst geïsoleerd in 1981 uit twee mannen met non-gonococcal urethritis (NGU) (Haggerty & Taylor,2011). NGU is een ontsteking van de urethra die niet door gonorroe is veroorzaakt. Intussen is Mycoplasma genitalium algemeen gekend als een pathogeen dat NGU veroorzaakt, net zoals ook Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum en Trichomonas vaginalis (Kim et al.,2011). Ziektebeeld Mycoplasma genitalium is een pathogeen dat ook regelmatig voorkomt bij vrouwen met PID (Haggerty & Taylor,2011) en kan zowel symptomatisch als asymptomatisch voorkomen. PID omvat infecties van de vrouwelijke voortplantingsorganen, zoals infectie van de uterus, de cervix, de ovaria en de tuba. Die infecties worden veroorzaakt door verscheidene types van bacteriën, waaronder de pathogenen die verantwoordelijk zijn voor gonorroe en chlamydia. Ze zullen zich uitbreiden naar de buikholte en daar ernstige complicaties tot gevolg hebben, waaronder mogelijke verklevingen van darmlissen, abcessen en obstructie van de tuba. Hoewel Chlamydia trachomatis en Neisseria gonorrhoeae vaak PID’s veroorzaken, zou tot zeventig percent van de infecties een andere nog te identificeren oorsprong hebben. M. genitalium is geassocieerd met PID, maar is onafhankelijk van een chlamydia- of gonorroebesmetting. Door deze associatie zal de risicofactor voor PID bij een individu veel hoger liggen als het individu besmet is met M. genitalium. Cervicitis (= baarmoederhalsontsteking) kan eveneens veroorzaakt worden door M. genitalium. Cervicitis is ook een veelvoorkomend antecedent voor PID (Haggerty & Taylor,2011). Dus kunnen we ervan uitgaan dat M. genitalium non-gonococcal en nonchlamydiale PID zal veroorzaken. Wetenschappelijk bewijs hiervoor werd reeds geleverd door onderzoek bij muizen. Dat toont aan dat de pathogenen stijgen van de lower genital tract naar de upper genital tract waarbij morfologische veranderingen in eileidercellen met cilia worden gedetecteerd. Ook bij vrouwen met een eileiderontsteking worden deze morfologische veranderingen waargenomen in de eileidercellen. Verder is ook aangetoond dat M. genitalium zich kan vasthechten aan menselijke spermatozoa. Hierdoor is er een hogere kans dat de bacterie meegevoerd zal worden naar de vrouwelijke upper genital tract. Via PCR (polymerase chain reaction) is er een onafhankelijk verband aan te tonen tussen M. genitalium en PID. Aanvullend observeerde men in de PEACH4-studie dat vijftien percent van de vrouwen met PID ook positief test voor M. genitalium in de baarmoederhals en het baarmoederslijmvlies. 4 PID Evaluation and Clinical Health study 23 PID kan resulteren in langdurige problemen voor de maternale reproductiviteit, zoals infertiliteit, buitenbaarmoederlijke zwangerschap en chronisch bekkenpijn. Of M. genitalium al dan niet kan resulteren in gynaecologische problemen is niet duidelijk. Zoals hierboven beschreven kan M. genitalium ook asymptomatisch voorkomen, wat de kans op ‘silent’ PID doet toenemen. Sommige studies linken M. genitalium met vaginale afscheiding en urinebuisinfectie, maar die symptomen zijn minder uitgesproken dan in geval van gonococcen-infectie. Bij asymptomatische besmetting verhoogt de kans op een te late behandeling, waardoor de ziekte blijft aanslepen. Ook is er aangetoond dat PID in combinatie met M. genitalium gelijkaardige symptomen heeft als PID in associatie met C. trachomatis maar de symptomen worden vaak later in het ziekteproces opgemerkt, waardoor er al meer schade aangericht kan zijn (Haggerty & Taylor,2011). PID in combinatie met N. gonorrhoeae zal ernstiger symptomen veroorzaken die sneller merkbaar zijn, waardoor deze bacteriële infectie sneller effectief kan worden behandeld. PID in combinatie met M. genitalium wordt behandeld met antibiotica5 waarbij rekening moet worden gehouden met de toenemende macrolide-resistentie van M. genitalium. Die resistentie kan leiden tot foute en inadequate behandeling en bijgevolg persisterende of recidiverende infecties, wat resulteert in chronische ontstekingen en secundaire infertiliteit. Bij genitale infectie in mannen, en dus voornamelijk een beeld van urethritis, ziet men dat de spermakwaliteit duidelijk afneemt, met niet enkel een effect op de mobiliteit van de spermacellen maar tevens op de structuur, de viabiliteit en de concentratie. Problemen bij diagnostiek M. genitalium is een moeilijk aantoonbare intercellulaire bacterie zonder celwand. Ze is niet aan te tonen met klassieke celkweektechnieken door de plaats van voorkomen in de cel en doordat de cellen zeer klein zijn (< 1 µm). Momenteel worden nucleic acid amplification tests (NAATs) aanbevolen om dit pathogeen te detecteren (Haggerty & Taylor,2011; Ross & Jensen,2006). 5 Ofloxacin, levofloxacin, ceftriaxone plus doxycycline of cefoxitin en probenecid plus doxycycline. 24 2.2.4 Ureaplasma urealyticum Situering Taxonomische indeling: Rijk: Bacteria Stam: Firmicutes Klasse: Mollicutes Orde: Mycoplasmatales Familie: Mycoplasmataceae Geslacht: Ureaplasma Soort: Ureaplasma urealyticum Ureaplasma urealyticum, vroeger Tmycoplasma genoemd, is een genitaal Mycoplasma dat de genitaliën koloniseert en infecties kan veroorzaken. Het is een Gram-negatief unicellulair organisme zonder celwand en het produceert kolonies die onzichtbaar zijn voor het blote oog (zie figuur 4). De bacterie wordt verspreid via seksueel contact, maar kan ook verspreid worden via speeksel, besmette naalden en bloed. Figuur 4: U. urealyticum, foto met behulp van TEM Daarom wordt U. urealyticum (BacMap,2013) voornamelijk geclassificeerd als een bacteriële infectie en niet als klassieke overdraagbare aandoening, ook al wordt ze vaak verspreid via seksueel contact (Ureaplasma urealyticum,2013) en wordt ze teruggevonden bij zowat zeventig percent van de seksueel actieve populatie. U. urealyticum kan als gevaarlijk beschouwd worden, aangezien de symptomen vaak nauwelijks merkbaar zijn. Hierdoor kan de bacterie lange tijd onopgemerkt in het lichaam verblijven en de aanleiding geven tot bepaalde ziektes, zoals urethritis. Ziektebeeld U. urealyticum wordt herkend als een pathogeen voor NGU sinds de jaren 1950. Volgens sommige artsen wordt de bacterie beschouwd als een natuurlijk voorkomend organisme (kolonisator van mucosa) in het menselijk lichaam, terwijl ze volgens andere artsen een niet te verwaarlozen pathogeen is. Dit komt door tegenstrijdige studies die beschrijven dat U. urealyticum al dan niet een causatief agens is voor NGU (Kim et al.,2011). 25 Naast NGU wordt U. urealyticum ook duidelijk geassocieerd met andere medische problemen, zoals onvruchtbaarheid, doodgeboorte, vroeggeboorte, neonatale pneumonia, bronchopulmonary dysplasia (BPD6), chorioamnionitis7 en neonatale meningitis al dan niet gepaard gaande met sepsis. De symptomen zijn niet altijd meteen merkbaar. Enkele vaak voorkomende maar vrij vage klachten zijn een brandend gevoel en pijn tijdens het urineren, vaak urineren, ontsteking van de genitaliën, genitale afscheiding, bloedverlies en pijn in de onderbuik. Mannen ondervinden vaak een ontsteking van de bijbal en zwelling van de testikels. Vrouwen ondervinden mogelijk ernstige bekkenpijn vanwege PID die hiermee gepaard gaat. Problemen bij diagnostiek Er zijn gevoelige methoden nodig, in de eerste plaats om U. urealyticum op te sporen en een onderscheid te kunnen maken met U. parvum. Klassieke methoden komen daarvoor niet in aanmerking, methoden op basis van PCR zijn hiervoor beter geschikt. 2.2.5 Ureaplasma parvum Situering Taxonomische indeling: Rijk: Bacteria Stam: Firmicutes Klasse: Mollicutes Orde: Mycoplasmatales Familie: Mycoplasmataceae Geslacht: Ureaplasma Soort: Ureaplasma parvum In 1954 werd een kleine Mycoplasma-bacterie beschreven die door Maurice C. Shepard gevonden was in het menselijk urogenitale kanaal. In 1962 werd dit bevestigd door Denys K. Ford. De bacterie is een zelf replicerende entiteit die groeit bij een lage pH. Net zoals bij U. urealyticum is het een Gram-negatief unicellulair organisme zonder celwand en het produceert kolonies die onzichtbaar zijn voor het blote oog. 6 BPD = longziekte met ontsteking en littekenweefsel bij te vroeggeboren baby’s. Chorioamnionitis = infectie van de membranen (placentaweefsels) en het vruchtwater. Kan leiden tot bacteriëmie bij de moeder en tot vroeggeboorte en ernstige infecties bij de pasgeboren baby 7 26 Binnen U. urealyticum werden er veertien serotypes8 geïdentificeerd. Binnen deze serotypes worden twee verschillende groepen erkend, namelijk biovar 1 en biovar 2. Nu wordt Ureaplasma urealyticum biovar 1 actueel U. parvum genoemd. In deze groep vallen de serotypes 1, 3, 6 en 14. De andere serotypes vallen onder Ureaplasma urealyticum biovar 2 die nu U. urealyticum wordt genoemd (Katsura et al.,2010). Beide soorten kunnen via conventionele cultuurmethoden niet van elkaar worden onderscheiden. Daarvoor zijn gevoeligere methoden nodig, zoals PCR. Ziektebeeld U. parvum wordt geassocieerd met verschillende ziektes, zoals urethritis, chorioamnionitis, infecties bij chirurgische ingrepen, neonatale meningitidis, PID en dergelijke. De bacterie kan onvruchtbaarheid veroorzaken door ontsteking van de placenta en infectie van de vruchtwaterzak. Bij bepaalde ziektes bij pasgeboren baby’s wordt de bacterie teruggevonden, zoals bij chronische longziekte, bronchopulmonary dysplasia, pneumonia en dergelijke. Ze wordt ook teruggevonden bij kinderen met het respiratory distress syndrome (RDS) (Katsura et al.,2010). Problemen bij diagnostiek Bij U. parvum treden dezelfde problemen op als bij U. urealyticum (zie 2.2.4). 2.2.6 Haemophilus ducreyi Situering Taxonomische indeling: Rijk: Bacteria Stam: Proteobacteria Klasse: Gamma Proteobacteria Orde: Pasteurellales Familie: Pasteurellaceae Geslacht: Haemophilus Soort: Haemophilus ducreyi 8 Een serotype of serovar is een specifiek subtype van een bepaald micro-organisme, ingedeeld op basis van de specifieke antigenen aanwezig op het celmembraan. 27 H. ducreyi is een Gram-negatieve streptococcus bacil (zie figuur 5) die verantwoordelijk is voor de seksueel overdraagbare aandoening “ulcus molle”, ook wel “weke sjanker” of “chancroïd” genoemd. Deze bacterie wordt uitsluitend verspreid via seksueel contact en de natuurlijke gastheer is het menselijk lichaam. Buiten het menselijk lichaam zal de bacterie vlug afsterven. Dat maakt het moeilijk om de bacterie verder te kunnen bestuderen in vitro (Alfa,2005). Figuur 5: H. ducreyi, foto met behulp van TEM (BacMap,2013) Ziektebeeld Chancroïd gaat gepaard met pijnlijke open zweren op de genitaliën en soms met gezwollen lymfeklieren in de lies. Die zweren verschijnen klassiek vanaf twee à drie dagen na besmetting, maar ze kunnen ook uitgesteld voorkomen tot één maand na infectie (Kemp et al.,2011). Zowel mannen als vrouwen worden geïnfecteerd al zullen de symptomen bij vrouwen vaak subklinisch voorkomen. Globaal gezien is H. ducreyi de meest voorkomende oorzaak voor GUD. Ze komt ook vaak voor samen met syfilis. Deze co-infectie moet worden gedetecteerd, zodat de gepaste antibioticakuur kan worden gestart. Naast GUD zal H. ducreyi een verhoogd risico op besmetting met en transmissie van hiv met zich meebrengen. De genitale zweren van chancroïd zijn namelijk geassocieerd met seksuele transmissie van het hiv-virus (EMBLEBI,2013). Problemen bij diagnostiek Chancroïd komt vooral voor in ontwikkelingslanden, zoals Centraal-Afrika, Azië en LatijnsAmerika. Aangezien de bacterie nauwelijks voorkomt in Westerse landen en GUD veroorzaakt kan worden door andere vaak voorkomende soa’s, zoals HSV I, HSV II en Treponema pallidum, is de kans op een verkeerde diagnose zeer reëel. De zweren veroorzaakt door H. ducreyi zijn namelijk zeer gelijkaardig aan die van primaire syfilis. Behandeling met antibiotica kan de infectie met H. ducreyi genezen, al moet men rekening houden met de toenemende resistentie. 28 Detectie van de ziekte gebeurt via klinisch onderzoek, microbieel nazicht van de bacteriële flora ter hoogte van de zweren en via klinische opsporing en vervolgens via een biopsie van de gezwollen lymfeknoppen. Bloedtesten zijn niet voorhanden. De detectiemethode is dus vrij ongevoelig bij gebrek aan informatie omtrent specifiek vermoeden van deze infectie, gezien de fragiliteit van de kiem9 en de multibacteriële omgeving in de liezen, waardoor de groei van H. ducreyi niet wordt opgemerkt10. Hierdoor is een betere detectiemethode gewenst. Die moet minder gevoelig zijn voor de pre-analytische fase die een klinisch monster doorloopt en minder afhankelijk zijn van het replicatievermogen van dit micro-organisme, wat het geval is bij de klassieke bacteriële kweek. 9 De kiem is erg gevoelig voor pre-analytische omgevingsfactoren en heeft nood aan specifieke groeifactoren. Dit door bacteriële overgroei door huidflora en andere bacteria. 10 29 2.3 Extractie van nucleïnezuren Het doel van een nucleïnezuurextractie (DNA/RNA-isolatie) is het opzuiveren en concentreren van nucleïnezuren (NZ) uit micro-organismen aanwezig in een klinisch monster, zodat dit kan gebruikt worden bij verdere moleculaire technieken, zoals Real-Time PCR. Er werd gebruikgemaakt van het QIASymphony SP-toestel van Qiagen waarbij de NZ-extractie aan de hand van magnetische silica beads bestaat uit volgende stappen: - lyseren van de cellen guanidiumisothiocyanaat; - degraderen van de eiwitten met proteïnase K en SDS; - binden van de vrijgekomen nucleïnezuren aan magnetische silica-micropartikels bij en denatureren/inactiveren van de eiwitten met hoge natriumchlorideconcentratie; - wegwassen van de onzuiverheden; - elueren van de nucleïnezuren in buffer met laag natriumchlorideconcentratie. Guanidium isothiocyanaat (GITC) wordt toegevoegd om de cellen te lyseren. Het is een sterk chaotroop agens dat naast eiwitten in de cel en celmembraan, ook mogelijks aanwezige DNase en RNase zal denatureren zodat hun activiteit verloren gaat. Dat zorgt ervoor dat de meeste cellen spontaan lyseren. Het is een noodzakelijke stap tijdens de NZ-extractie om de vrijgekomen nucleïnezuren te beschermen tegen afbraak van die enzymen. Een vaak gebruikt detergens is sodium dodecyl sulfaat (SDS). Het detergens zal de eiwitten denatureren en de eigen lading van de eiwitten maskeren met een negatieve lading waardoor proteïnase K makkelijker zal kunnen inwerken om de eiwitten af te breken. Proteïnase K is een endolytisch protease dat wordt gebruikt voor de afbraak van eiwitten in nucleïnezuurbereidingen. Het splitst de peptidebindingen aan het carboxyluiteinde van alifatische, aromatische of hydrofobe aminozuren. Proteïnase K werkt tot op hoge temperaturen zonder zelf te denatureren (boven 65 °C zal dit enzym denatureren). Het heeft ook een brede pH range (pH 4,0 tot 12,5 met optimum = 7,5 tot 8,0) en is ongevoelig voor de denaturerende eigenschap van SDS (Kruhøffer et al.,2010). De selectieve extractie van de nucleïnezuren gebeurt aan de hand van magnetische silicamicropartikels. Het mechanisme werkt als volgt (zie figuur 6): 30 De vrijgekomen nucleïnezuren worden gebonden op magnetische silica-micropartikels, die vooraf aan het staal zijn toegevoegd, door middel van gevormde kationbruggen bij een hoge natriumchlorideconcentratie. De magnetische silica-micropartikels worden vervolgens aangetrokken door een magnetische (roer)staaf die wordt beschermd door een beschermhuls (rod cover) die in het gelyseerde staal gedompeld is. De staaf met zijn beschermhuls wordt overgebracht in een ander recipiënt met wasbuffer waarna de magnetische staaf wordt verwijderd uit zijn beschermhuls en de magnetische silica-partikels loslaten van de beschermhuls. Dit zal meerdere malen gebeuren om onzuiverheden weg te wassen, aangezien deze onzuiverheden een inhiberend effect kunnen teweegbrengen in verdere moleculaire technieken, zoals Real-Time PCR. De laatste stap is de elutie van nucleïnezuren in een elutiebuffer met laag natriumchloridegehalte waarbij de kationbruggen worden verbroken. Hierbij worden de nucleïnezuren gescheiden van de magnetische silica-micropartikels en wordt een zuiver staal verkregen na afzonderen van de magnetische silica-micropartikels (Descheemaeker,2013). Het extract is nu klaar voor verder gebruik. Figuur 6: Schematische voorstelling van het principe van de QIA Symphony SP van Qiagen (Descheemaeker,2013) Tijdens extractie wordt altijd een interne controle meegenomen in het staal wat verder wordt besproken bij 3.2.1. 31 2.4 Real-Time PCR PCR (= Polymerase Chain Reaction) is een efficiënte methode om DNA-moleculen te vermenigvuldigen op gecontroleerde wijze (= amplificeren) en zo het doelwit-DNA tot detecteerbare proporties te brengen. De te amplificeren sequenties (= de targets) zijn de regio’s die uniek en geconserveerd zijn binnen de genetische variabiliteit van ieder (micro-) organisme. Bij een conventionele PCR zal er enkel een kwalitatieve bepaling plaatsvinden, terwijl bij Real-Time PCR ook een accurate, gevoelige en vlugge kwantitatieve bepaling mogelijk is (Pestana et al.,2010). Om een PCR-reactie uit te voeren, zijn verscheidene basiselementen nodig: template-DNA, primers, buffer, MgCl2, dNTPs en hitte-stabiel DNA-polymerase. Verscheidene cycli worden doorlopen (40 à 45) bij een PCR-reactie waarbij iedere cyclus bestaat uit drie stappen (zie figuur 7): 1. Denaturatie (= melting) Het template-DNA wordt gedenatureerd bij 95 °C. 2. Aanhechting (= annealing) Primers hechten zich aan de gedenatureerde strengen waarna DNA-polymerase kan aanhechten. Dit gebeurt bij een temperatuur die een vijftal graden onder de smelttemperatuur van de primers ligt. 3. Synthese (= elongation) Hittestabiel DNA-polymerase zal de streng verlengen in de 5’-3’-richting bij de optimale temperatuur van het DNA-polymerase. Figuur 7: Éen cyclus tijdens PCR (polymerasekettingreactie,2014) 32 De drie verschillende stappen tijdens een PCR-cyclus gebeuren in veel PCR-reacties op drie verschillende temperaturen, wat een drie-staps-PCR wordt genoemd. Tijdens het onderzoek werd echter gebruikgemaakt van een twee-staps-PCR, wat wil zeggen dat de annealing van de primers en de elongatie beide op dezelfde temperatuur gebeuren, namelijk 60 °C (zie 3.4). Binnen een korte tijd worden (exponentieel) exacte kopieën aangemaakt van de targetsequentie die in overvloed aanwezig zullen zijn. Het geamplificeerde DNA is beschikbaar voor verdere analyse. Theoretisch gezien zal de hoeveelheid amplificatieproduct tijdens iedere cyclus verdubbelen, maar in de realiteit zal de geamplificeerde hoeveelheid een plateauwaarde bereiken na een aantal cycli door uitputting van bepaalde basiselementen. Bij conventionele PCR zal de analyse van het geamplificeerde DNA gebeuren na het beëindigen van de PCR-reactie aan de hand van bijvoorbeeld agarosegelelektroforese van het amplicon in aanwezigheid van ethidiumbromide. Dat resulteert in een kwalitatieve bepaling en een semi-kwantitatieve bepaling als men de intensiteit van de bekomen bandjes vergelijkt. Bij Real-Time PCR is het mogelijk om de amplicons al tijdens een vroeg stadium van de PCR-reactie te meten, namelijk in de exponentiële fase waar er wel een kwantitatieve relatie is met het inputmateriaal. Hier zal dus naast een kwalitatieve bepaling ook een kwantitatieve bepaling plaatsvinden. Om deze meting te realiseren, wordt er gebruikgemaakt van fluorescente probes of fluorescente intercallerende stoffen die tijdens de reactie een meetbaar signaal genereren dat proportioneel is met de hoeveelheid van het geamplificeerde product (Pestana et al., 2010). De standaard grafische weergave van een PCR-reactie is de amplificatiecurve zoals weergegeven in figuur 8 (AB,2011). In weergave A van figuur 8 wordt Rn (= normalized reporter signal) weergegeven tegenover het PCR-cyclusnummer. Rn is de fluorescentie van de reporterkleurstof gedeeld door de fluorescentie van de passieve referentiekleurstof11. Op deze grafiek wordt de baseline aangeduid welke als volgt wordt verkregen: Tijdens de PCR-reactie kunnen veranderende reactiecondities de fluorescentie beïnvloeden. Hierdoor verkrijgen we een achtergrondsignaal. Dit achtergrondsignaal komt voor tijdens de initiële cycli van de PCR-reactie die voorafgaat aan de significante accumulatie van het amplicon. Het achtergrondsignaal wordt dan gebruikt om de baseline fluorescentie te bepalen van de reactieplaat. Eenmaal het amplificatiesignaal boven deze achtergrond uitkomt, worden meer accurate en betrouwbare resultaten bekomen van de fluorescentiemetingen. 11 De interne referentiekleurstof wordt gebruikt om de reporterkleurstof te normaliseren tijdens de data-analyse, wat noodzakelijk is om fluorescentie-fluctuaties door veranderingen in concentratie of volume door pipetteerfouten te corrigeren. 33 Op weergave B van figuur 8 wordt de deltaRn (= Rn minus de baseline) weergegeven ten opzichte van het PCR-cyclusnummer. Hierop kan de threshold aangeduid worden. De threshold is de numerieke waarde die toegekend wordt aan iedere run welke een statistisch significant punt boven de baseline weergeeft. De intersectie tussen de amplificatiecurve en de thresholdlijn wordt de threshold cycle (Ct) genoemd. Kort samengevat geeft de Ct-waarde het punt weer waar het signaal wordt gedetecteerd boven het achtergrondsignaal van de reactie. Vanaf dit punt zal de reactie zich ook in de exponentiële fase bevinden. De Ct-waarde kan worden beïnvloed door verschillende factoren. Daarom kunnen Ct-waarden van verschillende PCR-reacties met verschillende condities of reagentia niet vergeleken worden. De factoren die de Ct-waarde kunnen beïnvloeden zijn de mastermix componenten, de beginconcentratie van het target-DNA, de ROX passieve referentiekleurstof en de efficiëntie van de PCR-reactie. Figuur 8: Grafische representatie van Real-Time PCR-data (AB,2011) Naast de bekomen amplificatiecurve wordt ook een multicomponentplot weergegeven waarbij de fluorescentie wordt uitgezet in functie van het aantal cycli. Beide dienen bekeken te worden om een goede interpretatie te geven van het resultaat (zie 4 Resultaten en discussie). 34 2.4.1 Primers en probes Tijdens de PCR-reactie zijn forward en reverse primers nodig zodat amplificatie kan plaatsvinden. Primers zijn kleine enkelstrengige DNA-fragmenten die complementair zijn aan de 3’- en 5’-uiteinden van het gewenste DNA-fragment, waarbij de forward primer bindt aan de anti-sense12-streng van het template-DNA en de reverse primer aan de sense13-streng van het template-DNA. Om die primers synthetisch aan te maken, moet de gensequentie van de flankerende regio’s van het te amplificeren DNA-fragment gekend zijn en moet er zo goed mogelijk voldaan worden aan de volgende voorwaarden (Pestana et al.,2010): - De primers moeten specifiek zijn voor de gewenste doelwitsequentie en er een stabiele duplex mee vormen. Primer Blast NCBI werd gebruikt om de specificiteit van alle primers na te gaan waarbij geen enkele bekende sequentie in de databank meer dan 98 % Query Coverage en Max Identity mag vertonen om kruisreactie te voorkomen. - Als de primer te kort is, stijgt de kans dat de primer bindt op verschillende sequenties wat nadelig is voor de specificiteit. Is de primer echter te lang, is dit ten voordele van de specificiteit maar nadelig voor de PCR-reactie, aangezien er zich secundaire structuren kunnen voordoen in de primersequentie waardoor de primer niet meer kan binden met de gewenste DNA-sequentie. Een goede primerlengte die vaak wordt gebruikt is tussen de 18 en 24 baseparen lang maar dit wordt hoofdzakelijk bepaald door de smelttemperatuur ervan. - De smelttemperatuur14 voor de forward en reverse primer moet ongeveer gelijk zijn en ligt meestal tussen 52 °C en 58 °C, afhankelijk van de lengte van de primer (tijdens het onderzoek is dit 60 °C). Secundaire structuren zoals hairpins, self dimers en cross dimers moeten minimaal zijn. Om deze parameters na te gaan, werd gebruikgemaakt van drie gelijkaardige programma’s: IDT OligoAnalyzer, uMELT en SeqMan. - De verhouding van de baseparen, AT=GC, moet evenredig zijn en verspreid liggen ten opzichte van elkaar. Hierbij worden repeats vermeden daar deze mispriming veroorzaken. Het GC % ligt best tussen de 40 % en 60 % voor een optimale PCRreactie. Meer dan drie G’s of C’s worden het best vermeden in de laatste vijf basen aan het 3’-uiteinde van de primer, omdat deze zogenaamde GC clamp formation ervoor zal zorgen dat de primer niet volledig kan dissociëren van het template-DNA. 12 Afleesrichting komt niet overeen met het mRNA, de complementaire streng wel. Afleesrichting komt overeen met het mRNA. 14 Smelttemperatuur is de temperatuur waarbij 50 % van de strengen gedissocieerd zijn. 13 35 - De baseparing aan het 3’-uiteinde van de primer is cruciaal, aangezien het DNApolymerase hier moet aanhechten en de verlenging hier start. Bij slechte complementariteit zal het DNA-polymerase de ketenverlenging niet starten. - Ook de primerconcentratie moet in acht worden genomen. Wanneer deze te hoog is, zal de kans op mispriming stijgen waardoor er zich aspecifieke amplificatie zal voordoen. Als de concentratie te laag is, zal dit inefficiënte PCR-reacties veroorzaken. De gebruikte probes die ook worden aangehaald in punt 3.1.4 zijn net als de primers sequentiespecifiek en worden gesynthetiseerd op basis van de sequenties die worden afgebakend door de geselecteerde forward en reverse primers. Ook de probes moeten aan bepaalde voorwaarden voldoen vooraleer ze gebruikt kunnen worden in een PCR-reactie (Pestana et al.,2010): - De probe bestaat gemiddeld uit een 20 à 30-tal baseparen. - De smelttemperatuur moet een tiental graden Celcius hoger liggen dan de smelttemperatuur van de primers. - De GC-verhouding ligt tussen de 30 à 80 %. - De probe wordt zo dicht mogelijk bij de primer geplaatst zonder ze te overlappen om zo vlugger een detectiesignaal te genereren. - De verhouding van de baseparen, AT=GC, moet evenredig zijn en verspreid liggen ten opzichte van elkaar. - Probedimeervorming, mismatchen tussen probe en target en G op het 5’-uiteinde moet vermeden worden. 36 2.4.2 Detectie via non-specific labels De meest gebruikte fluorescerende kleurstof voor niet-specifieke kwantitatieve detectie is SYBR Green. Dit is een asymmetrische cyanine kleurstof, die fluorescent wordt als het intercaleert met DNA. Het resulterende DNA-kleurstofcomplex absorbeert blauw licht bij een golflengte van λmax = 497 nm en zendt groen licht uit met een golflengte λmax = 520 nm (Vanderstraeten,2010) (zie figuur 9). Figuur 9: Spectrum en moleculaire structuur van SYBR Green (SYBR Green, 2013) Bij voorkeur zal SYBR Green intercaleren in de kleine groeve van dsDNA. Het kan ook reageren met enkelstrengig DNA of RNA maar dat zal in veel mindere mate gebeuren en ook een veel lagere fluorescentie weergeven. Als SYBR Green intercaleert met dsDNA, zal de intensiteit van de fluorescente emissie verhogen. Als er tijdens de PCR-reactie meer dsDNA wordt gevormd, zal het signaal dat SYBR Green veroorzaakt ook verhogen. Op die manier kan een kwantitatieve bepaling plaatsvinden. Het nadeel van deze methode is dat SYBR Green zal intercaleren met eender welke dubbelstrengige DNA-molecule. Dus aspecifieke amplificatie en primerdimeren worden ook gedetecteerd wat een vertekend signaal teruggeeft. Om de specificiteit van het amplicon te controleren, wordt vaak gebruikgemaakt van een smeltcurveanalyse na PCR-reactie bij deze detectiemethode. Dit is een kinetische analyse van de thermische denaturatie van dubbelstrengig DNA tot complementaire enkelstrengige DNA-moleculen door temperatuursverhoging. 37 Naarmate de temperatuur stijgt, zal het dubbelstrengig DNA meer dissociëren wat leidt tot een daling van de fluorescentie door vrijkomen van de SYBR Green-moleculen (SYBR Green zal een factor 1000 meer fluoresceren bij intercalleren aan dubbelstrengig DNA). Op basis hiervan wordt het denaturatieproces gevolgd. De denaturatiecurve verloopt sigmoïdaal (zie figuur 10) en wordt gekarakteriseerd door het smeltpunt, Tm, van de dubbelstrengige DNAmolecule. De Tm-waarde wordt bepaald door de thermische stabiliteit van het dubbelstrengig DNA die afhangt van en rechtstreeks evenredig is met het GC %. Het smeltpunt is geen traditioneel smeltpunt zoals dat van ijs, maar het is hier de temperatuur waarbij 50 % van het DNA gedenatureerd is (Van Gool,1997). Figuur 10: Denaturatiecurve waarbij fluorescentie daalt in functie van de temperatuur (Van Gool,1997) Bij een uniplex PCR-reactie zal ieder amplicon dezelfde Tm-waarde hebben afhankelijk van zijn grootte en basesamenstelling. Afhankelijk van de intensiteit en de bijhorende smelttemperatuur kan dan bepaald worden of het gewenste amplicon werd gedetecteerd en of er al dan niet contaminatie of primerdimeren aanwezig zijn. Bij een multiplex PCR-reactie zal er een verscheidenheid zijn aan amplicons waarbij de smeltcurveanalyse kan worden gebruikt ter differentiatie (zie figuur 11). Een goed signaal is een unieke welgedefinieerde piek op de smeltcurve, waarbij de afgeleide van de fluorescentie wordt uitgezet in functie van de temperatuur. Op de linker grafiek is de fluorescentie uitgezet in functie van de temperatuur, op de rechter grafiek is de afgeleide van de fluorescentie uitgezet in functie van de temperatuur waarbij de typische smeltpiek van ieder organisme wordt bekomen. 38 Figuur 11: Smeltcurveanalyse van organisme A, B en combinatie organisme A en B (naar MeltingCurveAnalysis,2013) De informatie bekomen door smeltcurveanalyse kan ook gebruikt worden om single nucleotide polymorphisms (SNP)15 op te sporen. DNA met een hoger GC % door een SNP zal een hogere smelttemperatuur hebben dan DNA met een hoger AT % (zie figuur 12). Om SNP’s op te sporen wordt gebruikgemaakt van High Resolution Melting (HRM) wat eigenlijk een smeltcurveanalyse is met zeer hoge gevoeligheid (door de trage temperatuursstijging tijdens de analyse) en waarbij het proces in real-time wordt gevolgd. Met die gevoelige techniek worden ook mutaties en epigenetische verschillen in dubbelstrengig DNA opgespoord en kan onderscheid worden gemaakt tussen homozygote wildtype allelen, heterozygote wildtype allelen en homozygote mutante allelen. Figuur 12: Smeltcurveanalyse waarbij SNP wordt aangetoond (HighResolutionMelt,2014) 15 SNP is een variatie in de DNA-sequentie wanneer één nucleotide in het genoom verschillend is ten opzichte van de andere gelijke species of van het gepaarde chromosoom. 39 SYBR Green is aanwezig in de SYBR Select MasterMix die gebruikt wordt tijdens het onderzoek en hierin zijn volgende componenten aanwezig (AB,2013): - SYBR Green - DNA-polymerase met hot start-mechanisme - UDG (Uracil-DNA glycosylase) of UNG (Uracil-N-glycosylase) - ROX kleurstof passieve referentie - dNTP blend met dUTP/dTTP - geoptimaliseerde buffercomponenten Het DNA-polymerase is aanwezig in een inactieve toestand wat flexibiliteit toelaat in de reactie-opzet. Zo is het vooraf mengen van PCR-reagentia mogelijk op kamertemperatuur zonder kans op vroegtijdige start van de PCR-reactie. Het DNA-polymerase wordt gereactiveerd na twee minuten bij 95 °C. Het hitte labiel UNG zal kruiscontaminatie met reeds geamplificeerd DNA minimaliseren alvorens de PCR-reactie start. Tijdens de PCR-reactie worden dUTP’s als bouwsteen gebruikt in plaats van dTTP’s. De amplicons zijn dus opgebouwd uit de basen A, G, C en U. De uracil glycosidebinding in de amplicons wordt herkend door UNG, waarbij UNG de glycosidische binding zal verbreken en de base vervolgens wordt verwijderd. Als een PCR-reactie wordt opgestart, zal het templateDNA aanwezig zijn alsook UNG die in de mastermix aanwezig is. Alvorens de PCR-reactie start, zal een eerste stap plaatsvinden bij een lagere temperatuur van 50 °C, zodat UNG werkzaam is om eventuele aanwezige amplicons van voorgaande PCR-reacties af te breken. De amplicons worden gesplitst in kleinere stukken en kunnen niet meer geamplificeerd worden doordat ze nu te klein zijn voor binding met de primers. Het template-DNA blijft intact, want het bevat geen dUTP ingebouwde bouwstenen. Ook eventueel aanwezig RNA zal niet afgebroken worden, want RNA bevat als bouwsteen UTP in plaats van dUTP. Na deze stap zal de reactie opgewarmd worden naar 95 °C om het polymerase te activeren en het UNG te inactiveren. Als interne referentie tijdens de Real-Time PCR-reactie is de ROX kleurstof passieve referentie aanwezig in de mastermix. Die interne referentie wordt gebruikt om de reporterkleurstof (SYBR Green) te normaliseren tijdens data-analyse, wat noodzakelijk is om fluorescentie-fluctuaties door veranderingen in concentratie of volume door pipetteerfouten te corrigeren. 40 2.4.3 Detectie via sequence specific probes Een probe is een oligonucleotide die een quenching molecule (= quencher) bevat op het 3’uiteinde en/of een fluorofoor (= reporter) op het 5’-uiteinde. Een fluorofoor is een molecule die licht van een bepaalde golflengte emitteert na absorptie van licht met een specifieke maar kortere golflengte waarbij de emissiegolflengte altijd hoger is dan de absorptiegolflengte. Een quencher is een molecule die de energie van de fluorofoor grotendeels zal capteren waardoor fluorescentie van de fluorofoor zal worden onderdrukt. Dit proces gaat door wanneer de quencher en de reporter zich in elkaars nabijheid bevinden en wordt proximal quenching genoemd. Een fluorofoor kan gecombineerd worden met verscheidene quenchers, maar het absorptiespectrum van de quencher moet een goede overlap hebben met het emissiespectrum van de fluorofoor om een optimale quenching te bekomen. Wanneer de quencher de opgenomen energie omzet in warmte (zie figuur 13), zal er geen fluorescentie plaatsvinden door de quencher waardoor een beter signal-to-noise verhouding wordt bekomen. Er wordt gesproken van een dark quencher of black hole quencher welke tijdens dit onderzoek gebruikt worden (Vandesompele,2009). Figuur 13: Proximal quenching principe (Vandesompele,2009) De opgenomen energie door de quencher kan ook geëmitteerd worden als fluorescentie van een hogere golflengte (zie figuur 14). Het effect wordt fluorescence resonance energy transfer genoemd (FRET) en er wordt gesproken van FRET quenching in dit geval (Vandesompele,2009). Figuur 14: FRET quenching principe (Vandesompele,2009) 41 Twee soorten probes worden onderscheiden namelijk hydrolysis probes en hybridization probes. Hybridization probes zijn twee probes die, aangrenzend aan elkaar, binden aan de targetsequentie. De ene heeft een 3’-uiteinde gelabeld met een reporter terwijl de tweede probe een 5’-uiteinde heeft gelabeld met een quencher. Wanneer de probes niet gebonden zijn aan de targetsequentie, zal het fluorescentiesignaal van de reporterkleurstof gedetecteerd worden bij een bepaalde golflengte. Als de probes echter beide hybridizeren met de targetsequentie tijdens de annealingsfase in de PCR-reactie, bevinden de fluoroforen van beide probes zich op korte afstand van elkaar wat energietransfer tussen reporter en quencher toelaat (zie figuur 15). De quencher zal op zijn beurt licht emitteren wat als fluorescentiesignaal wordt gedetecteerd bij een bepaalde golflengte afhankelijk van de quencher (Vandesompele,2009;Teo et al.,2002). Figuur 15: Principe hybridization probes (LightCycler Real-time PCR,2014) Bij hydrolysis probes wordt gebruikgemaakt van één enkelstrengig molecule complementair aan de targetsequentie. Een vaak gebruikte probe is de TaqMan probe of double-dye probe genoemd. Aan het 5’-uiteinde bevindt zich de reporter (=fluorofoor) en aan het 3’-uiteinde bevindt zich de quencher. Bij excitatie van de reporter wordt de energie via FRET doorgegeven naar de quencher en erdoor gecapteerd waarbij als reporter vaak FAM (= 6carboxyfluoresceïne) wordt gebruikt en als quencher TAMRA (= tetramethylrhodamine) of BHQ (= black hole quencher). Tijdens de annealingsfase van de PCR-reactie zal de probe binden aan de targetsequentie. De fluorescentie van TAMRA wordt gedetecteerd met een verschillende golflengte als van FAM waardoor het achtergrondsignaal van FAM laag zal zijn. Wanneer het DNA-polymerase begint met de elongatiefase, zal het de probe vanaf het 5’-uiteinde wegduwen en afbreken met zijn 5’-3’-exonucleaseactiviteit. De probe wordt gehydrolyseerd waardoor de reporter en quencher zich niet meer in elkaars nabijheid bevinden en de fluorescentie van de reporter niet meer wordt gecapteerd door de quencher (zie figuur 16). Dit leidt tot een irreversibele verhoging in fluorescentie van FAM en een verlaging van het TAMRA-signaal. 42 De probes worden zo dicht mogelijk bij de primers geplaatst waardoor fluorescentie vrijwel onmiddellijk plaatsvindt als de elongatie start op de bewuste strengen. Naast TAMRA wordt nu voornamelijk een BHQ gebruikt. Hierbij zal de gecapteerde fluorescentie omgezet worden naar warmte en wordt er geen signaal gedetecteerd. Bij hydrolyse van de probe zal enkel het fluorescentiesignaal van de reporter irreversibel verhogen en zal het achtergrondsignaal minimaal zijn (Vandesompele,2009). Figuur 16: Hydrolyse TaqMan-probe door hitte stabiel DNA-polymerase (Asuragen,2012) Tijdens het onderzoek wordt gebruikgemaakt van een TaqManMGB-probe, wat een variant is van de TaqMan-probe. Bij die probe is er op het 3’-uiteinde een Minor Groove Binder (MGB) toegevoegd die de smelttemperatuur van de probe zal stabiliseren (verhogen) waardoor een kortere probe kan worden gebruikt (zie figuur 17). 43 Die MGB is een chemische modificatie die specifiek bindt in de minor groove van dubbelstrengig DNA waardoor de binding zeer specifiek is en een hoge affiniteit heeft (Vandesompele,2009). Dat maakt de probe beter geschikt om een single nucleotide polymorfhism (SNP) te detecteren en het zal de specificiteit sterk doen toenemen. De probes zijn hierdoor zeer geschikt voor zowel kwalitatieve als kwantitatieve detectie. Figuur 17: Hydrolyse TaqMan MGB-probe door hitte stabiel DNA-polymerase (Kutyavin et al.,2000) In de TaqMan Fast Virus 1-step MasterMix gebruikt tijdens het onderzoek bevinden zich volgende componenten (AB,2011): - AmpliTaq® Fast DNA Polymerase; - thermostabiel MMLV enzyme (= reverse transcriptase); - dNTP’s (dATP, dGTP, dCTP en dTTP); - RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor; - geoptimaliseerde buffercomponenten voor maximale gevoeligheid. Deze oplossing blijft vloeibaar bij -20 °C opslagtemperatuur. 44 RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor is een niet-competitieve inhibitor en wordt gebruikt om RNA-degradatie door RNase A, RNase B en RNase C te vermijden. Het is van toepassing bij cDNA-synthese, Real-Time PCR en in vitro transcriptie en translatie (LifeTechnologies,2014). 2.4.4 ViiaTM7 Real-Time PCR system In het lab wordt er gebruikgemaakt van het ViiaTM7 Real-Time PCR system (Viia7 genoemd) (AB,2011). Dit toestel maakt gebruik van fluorescente reagentia tijdens de PCR-reactie met volgende toepassingen: - kwantitatieve detectie van nucleïnezuursequenties via Real-Time analyse; - kwalitatieve detectie van de targets via post-PCR-analyse (= eindpuntanalyse); - kwalitatieve analyse van de PCR-producten via smeltcurve-analyse die post-PCR plaatsvindt. Het toestel verzamelt ruwe fluorescente data gedurende verschillende tijdstippen tijdens de PCR-reactie (=data collection points) welke afhankelijk zijn van het type run die wordt uitgevoerd (zie tabel 2). Tabel 2: Run-type met data collecion point (AB,2011) Run type Standaardcurve Real-time runs Relatieve standaardcurve Comparatieve CT Smeltcurve Post-PCR runs (eindpunt) Genotypering Aanwezigheid/afwezigheid Data collection point Data worden verzameld tijdens iedere stap van de PCR 1. Voor de PCR 2. Tijdens de PCR 3. Na de PCR Ongeacht het type run zal een data collection point bestaan uit drie fases: - Excitatie: Alle wells van de reactieplaat in het toestel worden belicht waardoor de fluoroforen in iedere aanwezige reactie zullen exciteren. - Emissie: Het toestel bevat een optisch gedeelte dat de residuele fluorescentie vanuit de wells van de reactieplaat verzamelt. 45 - Collectie: Er wordt een digitale representatie geassembleerd van de verzamelde fluorescentie over een bepaald tijdsinterval wat dan kan worden geanalyseerd via de aanwezige software van het toestel. Het principe kan voorgesteld worden zoals op figuur 18. Figuur 18: Werkingsprincipe van de ViiaTM7 Real-Time PCR-system (Nollet,2013) Het licht van een halogeenlamp wordt door een excitatiefilter gestuurd en door een dichroïsche beam splitter gericht op de PCR-reactieplaat die op zijn plaats wordt gehouden door de thermische blok van het systeem. Die blok wordt omgeven door optische elementen om het fluorescente licht te collecteren, het licht afkomstig van plaatsen verschillend van de wells te onderdrukken en om verdamping en condensatie tijdens de PCR-reactie te voorkomen. Het excitatielicht zal de aanwezige fluorescerende kleurstoffen in iedere gebruikte reactiewell doen exciteren waardoor emissie zal plaatsvinden. Dit geëmitteerde fluorescentielicht wordt dan door een serie optische lenzen en een corresponderende emissiefilter gestuurd waarna het wordt gedetecteerd door een charge coupled device camera (CCD-camera). De bekomen gegevens worden doorgestuurd naar de pc ter verwerking (Nollet,2013). 46 2.5 Gelelektroforese Onder elektroforese verstaat men het migreren van een deeltje met een bepaalde lading in een viskeus midden onder invloed van een elektrisch veld. Als het viskeus midden een gel is, spreekt men van gelelektroforese wat een scheidingstechniek is waarmee nucleïnezuren en eiwitten bijvoorbeeld op grootte worden gescheiden. Nucleïnezuren dragen een negatieve lading (bij neutrale pH) door de ionisatie van de fosfaatgroep. Ieder nucleotide levert een bijdrage waardoor de scheiding afhankelijk is van het aantal ladingen en dus van de grootte van het fragment. De twee meest gebruikte gelen zijn polyacrylamidegelen en agarosegelen. Polyacrylamidegelen zijn vooral bruikbaar voor kleinere DNA- of eiwitfragmenten door hun kleinere poriegrootte maar worden vaak vervangen door agarosegelen omwille van de toxiciteit en de cancerogeniciteit van de bestanddelen om een polyacrylamidegel te maken. Voor grotere fragmenten, zoals DNA-moleculen, wordt gebruikgemaakt van agarosegelen die een groter scheidingsgebied hebben. De negatieve DNA-fragmenten zullen naargelang hun grootte migreren met een bepaalde snelheid van de negatieve pool naar de positieve pool waarbij de kleinste fragmenten het snelst migreren. Door gebruik te maken van baseparenladders kan de grootte van die DNA-fragmenten ingeschat worden. Om de gescheiden nucleïnezuren zichtbaar te maken, wordt een intercalerend fluorochroom toegevoegd voor of na de elektroforese waardoor het bandenpatroon na de elektroforese zichtbaar wordt, wat zich leent tot kwalitatieve identificatie. 47 2.6 TaqMan Low Density Array Card Een TaqMan Low Density Array Card, of kort gezegd TAC, is een 384 wells reactieplaat opgedeeld in 8 zones die per staal 48 individuele uniplex Real-Time PCR-analyses mogelijk maakt (zie figuur 19). Hierdoor kunnen verscheidene pathogenen en controles simultaan geanalyseerd worden (Kodani et al.,2011). Analyses gebaseerd op PCR hebben doorgaans het nadeel dat bij elke verandering van een bestaande primer of bij nieuwe primers en probes, de volledige assay moet gerevalueerd worden. Of als er nieuwe informatie beschikbaar is in verband met de gensequentie van de bewuste pathogenen die geanalyseerd worden, kan het zijn dat de gebruikte primers en probes moeten aangepast of vervangen worden. Dit is een duur en moeilijk proces. TAC biedt daarvoor een oplossing. Het is namelijk een gesloten systeem met geïntegreerde uniplex Real-Time PCR wat de flexibiliteit geeft om nieuwe primers en probes toe te voegen zonder dat de andere geïntegreerde primers en probes dienen gerevalueerd te worden. Een ander voordeel is dat de primers en probes vooraf toegewezen zijn aan de wells door middel van lyofyliseren, waardoor het staal maar één keer moet toegevoegd worden samen met bijhorende mastermix. Het monster zal zich dan verspreiden over die wells, ook wel spiked samples genoemd. Dit alles zal de gevoeligheid van die analyse verhogen en een specifieke simultane Real-Time PCR-analyse mogelijk maken. Figuur 19: Taqman Low Density Array Card (Steg et al.,2006;Zheng et al.,2006) 48 2.7 BD ProbeTec De BD ProbeTecTM ET geamplificeerde DNA-analysen maken een directe, kwalitatieve detectie mogelijk van Chlamydia trachomatis en Neisseria gonorrhoeae (CT/GC) DNA in endocervicale en mannelijke urethrale uitstrijkjes en mannelijke en vrouwelijke urinemonsters die worden afgenomen bij symptomatische of asymptomatische patiënten. De techniek maakt gebruik van de homogene Strand Displacement Amplification (SDA)technologie voor een directe en kwalitatieve detectie waarbij fluorescente energietransfer wordt gebruikt om de aanwezigheid van Chlamydia trachomatis en Neisseria gonorrhoeae te detecteren. Het BD ProbeTec ET-instrument detecteert iedere minuut over een tijdsduur van 60 minuten fluorescente signalen (ruwe data) van de microwells waarin de reacties plaatsvinden. Het signaal wordt gerelateerd aan de hoeveelheid amplificatieproduct in de microwell. Een verhoging in het signaal wijst op een verhoging van de hoeveelheid amplificatieproduct en wijst dus op een positieve reactie. Een negatieve reactie zal geen amplificatieproduct teweegbrengen en dus zal er geen verandering in signaal plaatsvinden. De aan- of afwezigheid van CT en/of GC wordt bij deze analyse bepaald aan de hand van de MOTA16-score. Dit is een beoordeling voor de omvang van het bekomen signaal en wordt gerelateerd aan vooraf gedetermineerde cut off values om een besluit te nemen over het al dan niet aanwezig zijn van het pathogeen (Skovgaard et al.,2012) 16 Method Other Than Acceleration 49 3 Materiaal en methoden 3.1 Materiaal 3.1.1 Vircell controle DNA Gezuiverd microbieel DNA van vijf verschillende organismen met gekende concentratie (uitgedrukt als kopieën genomisch DNA/µl) werd aangekocht bij de firma Vircell (zie tabel 3). Aan de hand van dat referentiemateriaal werd tijdens de optimalisatie van de verschillende uniplex PCR’s de functionaliteit van de primers en probes, de gevoeligheid en eventuele kruisreactie tussen de verschillende detectiemethoden uitgetest. Alsook werd de limit of detection (LOD) tijdens de validatie van de TaqMan Low Density Array Card (TAC) met dat referentiemateriaal bepaald. 50 Tabel 3: Gegevens Vircell controle DNA Amplirun Mycoplasma genitalium DNA control LOT: 12MBC085002 1x Vircell MGE DNA control 1x 500 µl Vircell control reconstitution solution Concentration (copies/µl) LOT: 12MBC085102 LOT: 12MBCR003 14500 Amplirun Neisseria gonorrhoeae DNA control LOT: 12MBC075002 1x Vircell NGO DNA control LOT: 12MBC075102 1x 500 µl Vircell control reconstitution solution Concentration (copies/µl) LOT: 12MBCR003 12920 Amplirun Haemophilus ducreyi DNA control LOT: 12MBC021001 1x Vircell HDU DNA control 1x 500 µl Vircell control reconstitution solution Concentration (copies/µl) LOT: 12MBC021101 LOT: 12MBCRS002 12670 Amplirun Ureaplasma urealyticum DNA control LOT: 13MBC112001 1x Vircell UUR DNA control 1x 500 µl Vircell control reconstitution solution Concentration (copies/µl) LOT: 13MBC112101 LOT: 12MBCRS003 15230 Amplirun Herpes Simplex Virus II DNA control LOT: 12MBC024002 1x Vircell HSV2 DNA control 1x 500 µl Vircell control reconstitution solution Concentration (copies/µl) LOT: 12MBC024102 LOT: 12MBCRS003 19300 51 3.1.2 Bacteriële culturen Voor het testen van de specificiteit werd gebruikgemaakt van DNA geïsoleerd uit 42 verschillende bacteriële culturen, namelijk: Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis, Salmonella groep C, beta hemolytische streptococcen groep C, Streptococcus pneumoniae, Campylobacter jejuni, Shigella sonnei, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter koseri, Salmonella groep B, Sphingomonas paucimobilis, Enterococcus faecalis, Morganella morganii, Actinomyces israellii, Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Clostridium difficile, Shigella boydi, Candida tropicalis, Bacteriodes fragilis, Enterococcus faecium, Neisseria meningitidis, Salmonella groep D, vancomycine resistente enterococcen, Streptococcus agalactiae, Vibrio, Campylobacter coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Proteus vulgaris, Streptococcus oralis, Mycobacterium smegmatis, Serratia liquefaciens, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Citrobacter freundii, Shigella flexneri, Staphylococcus epidermidis, Lactobacillus paracasei, Streptococcus pneumoniae (zie bijlage 1 “Bacteriële stammen (negatief referentiemateriaal)”). 3.1.3 Klinische monsters Naast het Vircell controle DNA werd als positief referentiemateriaal gebruikgemaakt van een reeks klinische monsters (vaginale, cervicale, rectale en urethra wissers, urines, peritoneum, ulcus, anaal secreet en biopt) correct geïdentificeerd door middel van een referentietechniek. Chlamydia en/of gonorroe positieve monsters werden bekomen via het AZ Sint-Jan BruggeOostende AV17. Positieve monsters voor Ureaplasme urealyticum, Ureaplasma parvum, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma genitalium, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum en Trichomonas vaginalis werden bekomen via het Sint-Augustinus Ziekenhuis Antwerpen, Az Damiaan Oostende, Labo Microbiologie Universiteit Brussel en het Instituut voor Tropische Geneeskunde Antwerpen (zie bijlage 2 “klinische monsters (positief referentiemateriaal)”). Deze monsters werden gebruikt voor het uittesten van de efficiëntie, de herhaalbaarheid, reproduceerbaarheid en kruisreactie van de verschillende PCR-reacties. 17 Identificatie aan de hand van de BD Probetec-methode. 52 3.1.4 Primers en probes De gegevens van de geselecteerde primers voor de specifieke detectie van de verschillende organismen zijn terug te vinden in tabel 4. De primers zijn aangekocht bij de firma IDT (Integrated DNA Technologies) aan een concentratie van 100 µM. Tabel 4: Gegevens geselecteerde primers Naam Tm MW (Da) Forward Reversed 304 NGPorA1 Fw 305 NGPorA1 Rv 55,2 °C 56,6 °C 6716,4 5803,8 Primerpaar 2 Forward Reversed 307 NGPorA2 Fw 308 NGPorA2 Rv 54,0 °C 55,2 °C 6700,4 6716,4 Primerpaar 3 Forward Reversed 310 NGOmp Fw 311 NGOmp Rv 54,6 °C 56,5 °C 7342,8 7394,9 Primerpaar 4 Forward Reversed 313 NGOpaD Fw 314 NGOpaD Rv 57,7 °C 55,6 °C 5477,6 6994,6 Herpes Simplex Virus II Primerpaar 1 (totaal) Forward Reversed 249 HSV tot1 Fw 250 HSV tot1 Rv 59,2 °C 60,2 °C 7058,6 6486,3 Primerpaar 2 (II) Forward Reversed 258 HSV2#1 Fw 259 HSV2#1 Rv 61,6 °C 59,4 °C 7129,7 6100 Primerpaar 3 (Routine) Forward Reversed 015 HSV2 Fw 016 HSV2 Rv 55,8 °C 55,2 °C 5741,8 5803,8 Forward Reversed 261 HDp27 Fw 262 HDp27 Rv 53,6 °C 52,2 °C 7129,7 7016,6 Forward Reversed 264 HDhdA Fw 265 HDhdA Rv 54,9 °C 53,6 °C 6814,5 7882,2 Forward 282 MG pdhD Fw 54,9 °C 8251,4 Neisseria gonorrhoeae Primerpaar 1 Haemophilus ducreyi Primerpaar 1 Primerpaar 2 Mycoplasma genitalium Primerpaar 1 53 Primerpaar 2 Ureaplasma urealyticum Primerpaar 1 Primerpaar 2 Haemophilus ducreyi Primerpaar 3 Primerpaar 4 Ureaplasma parvum Primerpaar 1 Reversed 283 MG pdhD Rv 55,6 °C 7745,1 Forward Reversed 285 MGMgPa Fw 286 MGMgPa Rv 55,9 °C 54,1 °C 7417,9 10076,6 Forward Reversed 288 UUureD Fw 289 UUureD Rv 61,6 °C 55,1 °C 6167 7956,3 Forward Reversed 291 UUure Fw 292 Uuure Rv 52,4 °C 54,9 °C 7888,2 7318,8 Forward Reversed 264 HDHdA Fw 265 HDHdA Rv 54,9 °C 53,6 °C 6814,5 7888,2 Forward Reversed 319 Hdtox Fw 320 Hdtox Rv 55,2 °C 56,2 °C 7641,1 7736,1 Forward Reversed 326 UP Fw 327 UP Rv 54,1 °C 55,1 °C 7120,7 7956,3 54 De gegevens van de geselecteerde MGB-probes zijn terug te vinden in tabel 5. De probes zijn aangekocht bij de firma Thermo Fisher (voormalig Life Technologies) aan een concentratie van 100 µM. Tabel 5: Gegevens geselecteerde probes Naam MW (Da) Neisseria gonorrhoeae p306_NGPorA1 MGB p315_NGOpaD MGB 6559 7348 p018,2_HSV2 MGB p251_HSV tot MGB 7461 6583 p263_HDp27 Rev MGB 7106 p287_MGMgPa MGB p284_MGpdhD MGB 7180 8483 p290_UUureD MGB p293_UUure MGB 6810 6896 p328_UP MGB 6788 p315.2_NGOpaD MGB 6740 Herpes Simplex Virus II Haemophilus ducreyi Mycoplasma genitalium Ureaplasma urealyticum Ureaplasma parvum Neisseria gonorrhoeae 55 3.2 Extractie van nucleïnezuren 3.2.1 Werkwijze Er wordt gebruikgemaakt van twee extractieprotocollen op het QiaSymphony-toestel: pathogen complex 400 en pathogen complex 800. Dit houdt in dat er een volume van 400 µl respectievelijk 800 µl staal wordt geëxtraheerd en geëlueerd in een vooraf bepaald volume van 60 µl, 85 µl of 110 µl. Om rekening te houden met het doodvolume van het toestel, wordt een staalvolume van 550 µl, respectievelijk 1000 µl aangeboden aan het toestel. Tijdens de extractie wordt een interne controle toegevoegd aan ieder staal, namelijk SHV ( = Seal Herpesvirus, Phocine Herpes virus 1). SHV is een DNA-virus zonder sequentiegelijkenissen met het menselijk genoom, menselijke virussen of andere pathogenen die bij mensen voorkomen en dient ter controle voor een correcte DNA-extractie en eventuele inhibitie van het staal tijdens amplificatie. Voorbereiding staal: Stap 1: Homogeniseren van het staal. Stap 2: Afhankelijk van het protocol wordt 550 µl of 1000 µl staal in een 2 ml tube gepipetteerd. Stap 3: 2 ml tube zonder dop wordt in het elutie(thermo)blok geplaatst waarin het eluaat wordt opgevangen na extractie. Dat blok wordt op de voorziene plaats gezet in de QIA Symphony waarna die ter controle wordt gescand. Stap 4: De tube met het staal wordt in het rek gestoken waarna het rek in de QIA Symphony wordt opgeladen. Ook het rek met de interne controles wordt opgeladen. Hierna worden de parameters; zoals staalplaats, soort tube… ingelezen of handmatig ingevuld en het gewenste protocol wordt aangeduid. Na het instellen worden alle verbruiksgoederen en reagentia gescand om na te gaan of alles nog in voldoende mate aanwezig is en of alles juist geplaatst is. Stap 5: Start de extractie. 56 3.3 Real-Time PCR Gene Expression Assays Drie gene expression assays werden besteld bij de firma Life Technologies (Cat no Hs04260456_s1, Hs04260457_s1, Hs04260458_s1) voor de specifieke amplificatie van humaan genomisch DNA (AB,2010). In iedere tube bevinden zich volgende elementen: - twee ongelabelde primers (1x finale concentratie van 900 nM per primer uit 20x stockconcentratie van 18 µM per primer) - één 6-FAM™ dye-labeled TaqMan® MGB probe (1x finale concentratie van 250 nM uit 20x stockconcentratie van 5 µM) - één 6-VIC® dye-labeled TaqMan MGB probe (1x concentratie van 250 nM uit 20x stockconcentratie van 5 µM) 3.3.1 Werkwijze Stap 1: Extraheer het staal, zodat het kan gebruikt worden om een PCR-reactie uit te voeren. Stap 2: Pipetteer het volgende in een microcentrifuge tube van 1,5 ml: PCR-reactie mix component Volume voor één reactie (µl) 20x TaqMan® Gene Expression Assay 4x TaqMan Fast Virus 1-step MasterMix RNase vrij water 1,0 5,0 9,0 Stap 3: Inverteer de tube een aantal keer om te homogeniseren. Stap 4: Kort afcentrifugeren (short spin). Stap 5: Breng 15 µl in de PCR-reactieplaat en voeg 5 µl DNA-template (geëxtraheerd staal) toe. Stap 6: Sluit de plaat af. Stap 7: Vortex kort de plaat, centrifugeer deze af en plaats de plaat in het toestel. Stap 8: Start de PCR-reactie (Fast template). Uit deze drie assays zal de gevoeligste worden uitgekozen om op de TAC-STD array card te plaatsen als staalcontrole. Hiernaast zullen nog twee targetgenen gebruikt worden voor de staalcontrole, namelijk RNaseP en 18S-Hs99999901_s1. 57 3.4 Real-Time PCR 3.4.1 Werkwijze Real-Time PCR met SYBR Select MasterMix en smeltcurveanalyse De primers worden bewaard bij -30 °C en dienen eerst ontdooid te worden voor gebruik. De mastermix wordt bewaard bij 4 °C en is klaar voor gebruik. Samenstelling SYBR Select MasterMix: - SYBR Green - DNA-polymerase met hot start-mechanisme - UDG (Uracil-DNA glycosylase) of UNG (Uracil-N-glycosylase) - ROX kleurstof passieve referentie - dNTP mengsel met dUTP/dTTP - geoptimaliseerde buffercomponenten Werkwijze: Stap 1: De primers worden verdund van 100 µM naar 20 pmol/µl: 20 µl primer + 80 µl H2O (RNase vrij). Stap 2: De mix met SYBR Select MasterMix wordt gemaakt in een Sarstedt-tube en bestaat voor één PCR-reactie uit: Reagentia Hoeveelheid (µl) Concentratie in oplossing Forward primer (20 pmol/µl) 0,30 300 nM Reverse primer (20 pmol/µl) 0,30 300 nM SYBR Select MasterMix 2x 10 1x H2O (RNase vrij) 4,4 Stap 3: Maak deze mix voor het gewenste aantal reacties + 1. Stap 4: Homogeniseer de mix door de Sarstedt-tube te inverteren of kort te vortexen. Stap 5: Centrifugeer de tube (short spin), zodat het volledige volume onderaan de tube zit. Stap 6: Verdeel de mix uit in de reactieplaat of een strip per 15 µl. Stap 7: Voeg aan iedere well 5µl van het gewenste DNA toe van het geëxtraheerde staal (extractieprotocol complex 400). Stap 8: Sluit de reactieplaat of de strips goed af, vortex kort en voer een short spin uit. Stap 9: De reactieplaat of wells worden nu ingezet in het ViiaTM7 Real-Time PCR system met een vooropgestelde template die de cyclus uit figuur 20 doorloopt. 58 Figuur 20: Temperatuurstemplate PCR en smeltcurveanalyse 3.4.2 Werkwijze Real-Time PCR met TaqMan Fast Virus 1-step MasterMix De primers, probes en mastermix worden bewaard bij -30 °C en dienen eerst ontdooid te worden voor gebruik. Die mastermix is 4x geconcentreerd en is zeer viskeus, de tube moet 2 tot 3x geïnverteerd worden om een homogene oplossing te bekomen na ontdooien. Samenstelling TaqMan Fast Virus 1-step MasterMix: - AmpliTaq® Fast DNA-Polymerase - thermostabiel MMLV enzyme (= reverse transcriptase) - dNTP’s (dATP, dGTP, dCTP en dTTP) - RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor geoptimaliseerde buffercomponenten voor maximale gevoeligheid - Werkwijze: Stap 1: De probes worden verdund van 100 µM naar 20 pmol/µl: 5 µl probe + 20 µl H2O (RNase vrij). Stap 2: De mix met de TaqMan Fast Virus 1-step MasterMix (4x) wordt gemaakt in een Sarstedt-tube en bestaat voor één PCR-reactie uit: Reagentia Forward primer (100 µM/ml) Reverse primer (100 µM/ml) Probe (20 pmol/µl) H2O (RNase vrij) Taqman Fast Virus 1-step MasterMix (4x) Hoeveelheid (µl) Concentratie in oplossing 0,2 0,2 0,25 4,4 5 1000 nM 1000 nM 250 nM 1x Stap 3: Maak deze mix voor het gewenste aantal reacties + 1. Stap 4: Homogeniseer de mix door de Sarstedt-tube te inverteren of kort te vortexen. 59 Stap 5: Centrifugeer de tube (short spin), zodat het volledige volume onderaan de tube zit. Stap 6: Verdeel de mix uit in de reactieplaat per 10 µl. Stap 7: Voeg aan iedere well 10 µl van het gewenste DNA toe van het geëxtraheerde staal (extractieprotocol complex 400). Stap 8: Sluit de reactieplaat goed af, vortex kort en voer een short spin uit. Stap 9: De reactieplaat of wells worden nu ingezet in het ViiaTM7 Real-Time PCR system met een vooropgestelde template die de cyclus uit figuur 21 doorloopt. Bij iedere plaat dient ook een positieve controle en negatieve controle / blanco meegenomen te worden per targetorganisme. Figuur 21: Temperatuurstemplate uniplex PCR-reactie 3.4.3 Werkwijze Real-Time PCR TAC-STD met Fast Virus 1-step MasterMix De Fast Virus 1-step MasterMix wordt bewaard bij -30 °C en dient ontdooid te worden voor gebruik. Deze mastermix is 4x geconcentreerd en zeer viskeus. De tube moet 2 tot 3x geïnverteerd worden om een homogene oplossing te bekomen na ontdooien. 60 Stap 1: Haal een TAC-STD array card uit de koelkast en laat deze aanpassen aan de kamertemperatuur. Stap 2: De TaqMan Fast Virus 1-step MasterMix wordt uitverdeeld per 26 µl in een strip van 8 wells. Stap 3: Aan iedere well wordt 78 µl van het gewenste geëxtraheerde staal toegevoegd (extractie protocolcomplex 800). Stap 4: Pipetteer 5x op en neer om de oplossingen te homogeniseren. Stap 5: Uit iedere well wordt 100 µl geladen op de TAC-STD array card. Stap 6: Centrifugeer de kaart 2x 2 minuten aan 1200 rpm (= 314 rcf) en seal hierna de kaart. Stap 7: De slots aan de bovenkant van de TAC worden afgeknipt. Stap 8: Breng de kaart in de array houder van het ViiaTM7 Real-Time PCR system en start de PCR-reactie met de vooraf opgestelde STD-template die de cyclus uit figuur 22 doorloopt. Het gepipetteerde volume in de TAC-STD array card verdeelt zich over alle laantjes en de 48 wells. In iedere well zal er één µl aanwezig zijn waarmee de PCR-reactie zal plaatsvinden. Het resterend volume bevindt zich in de verbindingslaantjes. Figuur 22: Temperatuurstemplate TAC-STD array card PCR-reactie 61 3.5 Gelelektroforese 3.5.1 Werkwijze DNA-fragmenten (amplicons met een grootte van 90-120 bp) bekomen na PCR-reactie worden gescheiden op een 3 % agarosegel. Bereiding gel: Stap 1: Plak de randen van de gelhouder goed af met plakband, zodat het gel niet kan lekken en plaats het kammetje in de houder. Stap 2: Breng 3,0 gram agarose in 100 ml 0,5x TBE-buffer (Tris/Boraat/EDTA18) en verwarm dit in de microgolfoven tot de vloeistof net niet kookt. Stap 3: Meng goed en kijk of alle agarose is opgelost. Er mag geen vaste agarose meer aanwezig zijn in de vloeistof. Stap 4: Laat licht afkoelen in een warmwaterbad tot de erlenmeyer waarin de vloeistof zich bevindt, kan worden vastgehouden. Stap 5: Breng 10 µl SybrSafe in het vloeibare gel en meng. Stap 6: Giet het gel vanuit één hoek in de afgeplakte houder om een homogene gel te bekomen. Stap 7: Laat het gel hard worden (30 min – 1 uur). Stap 8: Verwijder het plakband en het kammetje en plaats de houder met het gel in het elektroforesetoestel. Stap 9: Voeg TBE-buffer toe in het elektroforesetoestel tot het gel volledig onderstaat. Voorbereiding en laden staal: Stap 1: Meng 10 µl van ieder staal met 3 µl laadbuffer (= broomfenol loading dye) en homogeniseer goed. Stap 2: Meng 3 µl 100bp-ladder met 3 µl laadbuffer en homogeniseer goed. Stap 3: Laad de stalen en de basepaarladder op het gel. 18 ethyleendiaminetetra-azijnzuur 62 Elektroforese starten: De negatieve pool van het toestel wordt aangesloten op de kant van de geladen stalen en de positieve pool op de andere zijde. Het voltage wordt ingesteld op 100 mVolt en de tijd op 30 minuten waarna de spanning wordt aangelegd. Tijdens de elektroforese moet tijdig gecontroleerd worden of de (gekleurde) laadbuffer niet van het gel migreert. Als de stalen na 30 minuten ver genoeg gemigreerd zijn, wordt de spanning afgezet en kan het gel geïnterpreteerd worden onder uv-licht. Aan de hand van de basepaarladder op het gel kan de grootte van de gemigreerde stalen geschat worden. Hiervan wordt een foto genomen en de opname wordt gedigitaliseerd. 63 3.6 Primer/probeselectie en optimalisatie uniplex PCR Per organisme zijn targetgenen geselecteerd om specifieke primers en probes te ontwikkelen. De behandelde organismen tijdens dit onderzoek zijn in tabel 6 in vet gedrukt. Tabel 6: Targetgenen per organisme Organisme Afkorting Target Herpes simplex virus HSV TOTAL DNA-polymerasegen HSV1 glycoproteïne G-gen glycoproteïne D-gen HSV2 Haemophilus ducreyi HD 27 kDa H. ducreyi-specific protein Mycoplasma genitalium MG dihydrolipoamide dehydrogenase major surface protein MgPa Ureaplasma urealyticum UU ureD subunit van het urease gen Ureaplasme parvum UP ureD subunit van het urease gen Neisseria gonorrhoeae NG porine pseudogen outer membrane protein opacity gene Treponema pallidum TP 47 kDa membrane lipoprotein DNA polymerase I gene Trichomonas vaginalis TV 2-kb repetitief sequentie beta-tubulin protein. Mycoplasma hominis MH membrane protein translocase elongation factor Tu (EF-TU) Chlamydia trachomatis CT cryptische plasmide 16S outer membrane protein polymorphic membrane protein H gene 64 Na selectie van de targetgenen, worden tijdens de optimalisatie de volgende onderdelen doorlopen: Deel 1: Uittesten van de geselecteerde primers (zie 3.1.4 tabel 4) met SYBR Select MasterMix in uniplex formaat (detectie via niet-selectief label, geen probe aanwezig). - De functionaliteit en specificiteit van de primers worden met het Vircell controle DNA (zie 3.1.1 tabel 3) als referentiemateriaal getest. - 10-voudige verdunningsreeksen van de verschillende vircellcontroles worden opgesteld. Minstens drie verdunningen in de reeks moeten aanleiding geven tot een positieve reactie. Per pathogeen worden de bekomen Ct-waarden per primerpaar uitgezet ten opzichte van de concentratie van het inputmateriaal in een grafiek waaruit de efficiëntie en gevoeligheid per primerpaar kan worden afgeleid. - De smeltcurves van de bekomen resultaten worden opgesteld en vergeleken. - Gelelektroforese kan toegepast worden op het geamplificeerde materiaal ter confirmatie of bij afwijkende smeltcurves. - De specificiteit van de primerparen wordt getest met DNA van bacteriële stammen die niet positief zijn voor de geselecteerde pathogenen (0,5 en 1 MF suspensies, zie 3.1.2). Als kruisreactie voorkomt, wordt dit verder onderzocht. - De primers worden eventueel aangepast en de meest geschikte primerparen worden geselecteerd om te testen in combinatie met de respectievelijke probes. Deel 2: Uittesten van de geselecteerde primers en probes met de TaqMan Fast Virus 1-step MasterMix (detectie met sequentie-specifieke probe). - De geselecteerde primers en probes (zie 3.1.4 tabel 4 en 5) worden getest met TaqMan Fast Virus 1-step MasterMix in combinatie met de verschillende vircellcontroles in uniplex PCR-reacties. - De specificiteit van de primers en probes wordt getest met dezelfde bacteriële stammen als in deel 1. De dubbelzinnige resultaten hiervan uit deel 1 worden hier opnieuw getest. Ook positieve stalen vanuit verschillende labs worden getest en de resultaten worden vergeleken. Deel 3: de Gene expression (GEx) assay, besproken in 3.3. - De assay om genomisch humaan DNA op te sporen wordt getest. De PCR-reacties worden ingezet met en zonder de reverse transcriptase stap om eventueel verschil tussen beide PCR-reacties aan te tonen. 65 3.7 Validatie TaqMan Low Density Array Card 3.7.1 Matrices Soa’s kunnen opgespoord worden in verschillende matrices of een staalname kan gebeuren via een (urogenitale) wisser die al of niet in een transportmedium naar het lab gebracht wordt. Tijdens de validatie van de TAC-STD array card wordt de invloed van volgende matrices op de Real-Time PCR-reacties uitgetest: 19 - 1x TE-buffer (pH 8): Dit is een medium waarin getransporteerde urogenitale wissers kunnen uitgedrukt worden. De 100x stockoplossing bestaat uit 1M Tris (= (hydroxymethyl)aminomethaan), wat een pH-buffer is, en 0,1M EDTA (ethyleendiaminetetra-azijnzuur), wat een chelerend agens is. De TE-buffer wordt verdund tot 1x TE-buffer met moleculair grade water wat een finale samenstelling geeft van 0,01M Tris en 0,001 EDTA. - E-swab (= Elution Swab): Dit is een collectie- en transportmedium voor afname van klinische specimens die aerobe en anaerobe bacteriën bevatten. Dit medium bestaat uit anorganische fosfaatbuffer, natriumchloride, kaliumchloride, calciumchloride, magnesiumchloride, monokaliumfosfaat, dinatriumfosfaat, natriumthioglycollaat en gedestilleerd water. - Preserve Cyt: Dit is een gebufferd methanol gebaseerd transportmedium waarin cervicale wissers voor de detectie van HPV (humaan papillomavirus) en soa’s ingebracht worden. - UTM (= Universal transport medium): Dit is een collectie- en transportmedium voor virussen, Chlamydia, Mycoplasma en Ureaplasma. Het bestaat uit een gemodificeerde Hank’s gebalanceerde zoutoplossing waaraan BSA (= bovin serum albumin), cysteïne, gelatine, sucrose en glutaminezuur is toegevoegd. De pH wordt gebufferd met HEPES (= 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer en fenolrood wordt gebruikt voor pH-indicatie. Vancomycine, amphotericine B en colistine zijn geïncorporeerd in het medium om groei van competitieve bacteriën en gisten te inhiberen. De aanwezigheid van sucrose fungeert als een cryoprotectant 19 wat helpt bij het bewaren als het staal in dit medium wordt ingevroren. - First voided urine: Dit is de eerste ochtendurine. Bescherming tegen beschadiging bij bevriezing 66 - Weefselbiopt (chronische ulcera, klierbiopt, huidbiopt, placenta…): Er wordt gebruikgemaakt van de gentleMACS-dissociator (Miltenyi,2014) om een celsuspensie te bekomen van placenta. Voor dit toestel zijn specifieke tubes ontworpen, namelijk gentleMACS™ C-Tubes, die voor een zachte en efficiënte dissociatie van het weefsel zorgen waardoor een celsuspensie wordt verkregen. Placenta wordt versneden in kleine stukken, waarna het in de gentleMACS™ C-Tubes wordt overgebracht (tussen 20 – 4000 mg weefsel, afhankelijk van de weefselconsistentie en het gentleMACSprotocol). Er wordt een fosfaatbuffer pH 6,8 toegevoegd tot ongeveer 10 ml, wat het maximaal volume is dat aanwezig mag zijn in de tube. De tubes worden op de gentleMACS-dissociator geplaatst om de stukjes placenta te versnijden waardoor de cellen zullen loskomen in de fosfaatbuffer. De celsuspensie (fosfaatbuffer + cellen) wordt hierna overgebracht naar een propere tube en een kleine hoeveelheid hiervan wordt naar de Unicel DxH 800 (Beckman Coulter) gebracht, waar een celtelling uitgevoerd wordt. Afhankelijk van de telling wordt de celsuspensie doorverdund tot ongeveer 1.000.000 cellen/ml. - Serum: De vloeistof die overblijft als bloed stolt en wordt afgecentrifugeerd, is serum. De samenstelling is vergelijkbaar met bloedplasma maar bij serum zijn de coagulatiefactoren (stollingseiwitten, zoals fibrogeen, kunnen interfereren met de metingen) grotendeels verwijderd. Dit wordt verkregen van de dienst serologie in het AZ Sint-Jan en wordt samengebracht in één volume, zodat er één samenstelling wordt verkregen van het serum. - Vol bloed: werd niet getest in dit eindwerk. Er wordt nagegaan of alle matrices negatief zijn voor alle te testen pathogenen. Ze worden getest met de uniplex PCR-reacties alvorens te valideren op de TAC-STD array card. TEbuffer, E-swab, Preserve Cyt en UTM zijn steriele transportmedia die niet op voorhand moeten getest worden. Het first voided urine, het serum en de placenta worden wel getest omdat deze media niet noodzakelijk steriel zijn en er kans is dat de organismen die we wensen te spiken hierin al aanwezig zijn. Dit zorgt voor vals-positief resultaat tijdens de validatie en moet vermeden worden. Als de te testen media negatief zijn, worden deze uitverdeeld per 900 µl in Sarstedt-tubes van 1,5 ml om mengstaal mix 1 en mengstaal mix 2 (zie 3.7.3 tabel 12) hierin te spiken. Die stalen worden geëxtraheerd met het Complex 800 protocol en getest op de TAC-STD array card om het matrix geïnduceerd effect na te gaan. 67 3.7.2 Bepaling aanvaardbare performantiekenmerken De performantiekenmerken worden als volgt gedefinieerd: Detectielimiet (= analytische sensitiviteit) “Limit of detection (LOD) is de laagste concentratie of hoeveelheid van een analiet waar meer dan 95 % van de tests positieve resultaten geven na seriële verdunningen van internationaal referentiemateriaal, gekalibreerd referentiemateriaal of een monster (Raymaekers et al.,2011).” De LOD wordt bepaald op basis van: - verdunningen om en bij de LOD, tien maal herhalen over minstens vier verschillende runs. - (verdunningsreeksen in iedere matrix) - (QCMD-gegevens) Het Vircell controle DNA worden samengevoegd volgens de samenstelling in tabel 10 en 11 (zie 3.7.3) en hiervan worden de verdunningsreeksen gemaakt als volgt: De Vircellcontroles werden doorverdund tot 200 kopieën/µl per organisme. Volgens de werkwijze van de TAC-STD array card (3.4.3) wordt er 78 µl staal gebruikt dus zullen er (200x78) 15600 kopieën aanwezig zijn. Die 78 µl wordt gehomogeniseerd met 26 µl mastermix en 100 µl hiervan wordt aangebracht op de TAC-STD array card. In ieder cupje van de TAC-STD array card kan 1 µl dus zullen er in ieder cupje ongeveer 156 kopieën aanwezig zijn. We verdunnen door naar 100 kopieën/µl, 50 kopieën/µl, 25 kopieën/µl, 4 kopieën/µl en 2 kopieën/µl: Stock mix1-1 mix1-2 mix1-3 mix1-4 mix1-5 200 15600 156 100 7800 78 50 3900 39 25 1950 19,5 4 312 3,12 2 156 1,56 Het totale volume van iedere verdunning is 2 ml. De gebruikte volumes vertrekkende vanuit de stockoplossing om de verdunningen te bekomen zijn de volgende: mix1-1 volume mix 1000 volume H2O 1000 mix1-2 mix1-3 mix1-4 mix1-5 500 1500 250 1750 20 1980 10 1990 68 Het totale volume van de stockoplossing die gebruikt wordt, is 1780 µl. Met deze waarde kan dan het aantal kopieën per ml staal berekend worden (kopieën in 78 µl x 1,78 ml): Stock mix 1-1 mix 1-2 mix 1-3 mix 1-4 mix 1-5 27768 13884 6942 3471 555,36 277,68 Op deze berekeningen zit een fout door de veralgemening van 200 kopieën per µl. In tabel 10 en 11 uit 3.7.3 zien we dat dit niet overal exact 200 kopieën zijn maar deze veralgemening is een goede benadering waarmee zal worden verder gewerkt. De precisie “De precisie is de mate van overeenstemming van de individuele testresultaten binnen een enkele run (intra-assay precision of herhaalbaarheid) en vanuit de ene run naar de andere (inter-assay precision of reproduceerbaarheid). Dit wordt gekenmerkt door de standaardafwijking van de metingen en de correlatiecoëfficiënt (Raymaekers et al.,2011).” De herhaalbaarheid (zie tabel 7) is een maat voor de spreiding van meetwaarden die onder dezelfde omstandigheden worden uitgevoerd. Daaronder verstaat men: door dezelfde persoon, met dezelfde methode, met dezelfde meetapparatuur en hulpstoffen en binnen een kort tijdsbestek (één dag). Binnen dit kort tijdsbestek worden de zes stalen van mengstaal mix 1 en mengstaal mix 2 (zie 3.7.3 tabel 12) in TE-buffer driemaal geëxtraheerd waarna de drie extracten worden samengevoegd per verdunning. Iedere verdunning wordt driemaal getest met de TAC-STD array card binnen dezelfde dag. De resultaten van de herhaalbaarheid moeten voldoen aan %CV20 < 5 %. De reproduceerbaarheidsmetingen (zie tabel 7) worden onder verschillende omstandigheden uitgevoerd, dit wil zeggen door verschillende personen of met verschillende meetapparaten, verspreid over een langere periode (dag twee, drie en vier). Het restant van het extract uit dag één wordt één keer getest met de TAC-STD array card op dag twee. Iedere verdunning van mengstaal mix 1 en mengstaal mix 2 (zie 3.7.3 tabel 12) wordt bijkomend geëxtraheerd en getest op dag drie en vier. De resultaten van de reproduceerbaarheid moeten voldoen aan %CV < 10 %. Matrix geïnduceerd effect De drie sterkste verdunningen van mengstaal mix 1 en mengstaal mix 2 (zie 3.7.3 tabel 12), dit zijn de drie laagste concentraties die nog positief resulteren, worden herhaald in de verschillende matrices en dit in drievoud. 20 Variatiecoefficiënt 69 Dat gebeurt door de verdunningsreeks in TE-buffer 1 op 10 door te verdunnen in de respectievelijke matrix (zie tabel 7), deze te extraheren en te detecteren in drievoud met de TAC-STD array card. Onder ideale omstandigheden is er geen effect van de matrix op de LOD. Tabel 7: Overzicht planning precisie in verschillende matrices Lineariteit “De lineariteit wordt gedefinieerd als de bepaling van het lineaire bereik van de kwantificering. Dit wordt gekenmerkt door de regressiecoëfficiënt na lineaire regressie (Raymaekers et al.,2011).” De lineariteit wordt geverifieerd door een seriële dilutiereeks van een positief staal te analyseren (10-voudige dilutiereeks met minstens 3 dilutiestappen) in duplicaat. De resultaten worden onderworpen aan lineaire regressie-analyse met een ideale regressiecoëfficiënt van één. De resultaten moeten voldoen aan: Regressiecoëfficiënt R2 > 0,95 over de 4 diluties Efficiëntie van de PCR 0,9 ≤ E ≤ 1,1 (ïƒ -3,3 ≤ slope ≤ -3,6) Analytische specificiteit (interferentie studie) “De analytische specificiteit wordt gedefinieerd als het vermogen van de methode om negatieve resultaten te verkrijgen in concordantie met negatief resultaat verkregen door de referentiemethode (Raymaekers et al.,2011).” 70 De resultaten voor de analytische specificiteit moeten voldoen aan volgende voorwaarden: - 98 % concordantie met het referentiemateriaal (alle negatieven zijn negatief). - Geen kruisreactiviteit in de monsters met andere micro-organismen die simultaan in hetzelfde monster aanwezig kunnen zijn. - Geen enkel bekende sequentie in de NCBI databank mag 100 % “Query Coverage” en “Max Identity” vertonen voor de primers en probes. Om kruisreactie te testen, wordt op de TAC-STD array card ieder positief monster getest voor alle parameters waaruit onderlinge kruisreactie binnen het soa-panel moet volgen. Minstens twintig soa-negatieve monsters, mogelijke kruisreactieve stalen21, moeten ook negatief testen. Nauw verwante species en kiemen die urogenitaal frequent voorkomen, worden ook getest op eventuele kruisreactie. De bacteriële stammen die hiervoor worden gebruikt, worden samengebracht in vijf verschillende mixen (zie tabel 8) die per mix worden geëxtraheerd en getest op de TAC-STD array card. De samenstelling is als volgt: Tabel 8: Samenstelling mixen kruisreactie Staalnummer Identificatie Mix 137542621 137540619 137540321 137541520 137542508 140009719 140009922 140009142 Salmonella enteritidis Salmonella groep C beta hemolytische strep groep C (dysgalactiae) Streptococcus pneumoniae Campylobacter jejuni Shigella sonnei Klebsiella pneumoniae Citrobacter koseri Mix 1 Mix 1 Mix 1 Mix 1 Mix 1 Mix 1 Mix 1 Mix 1 142024517 142023128 142025608 144303918 146335567 148854813 148854329 Salmonella groep B Sphingomonas paucimobilis Enterococcus faecalis Morganella morganii Actinomyces israellii Escherichia coli Yersinia enterocolitica Mix 2 Mix 2 Mix 2 Mix 2 Mix 2 Mix 2 Mix 2 21 Stalen die positief testen voor virussen van dezelfde familie, stalen die geënt zijn met potentieel kruisreactief referentiemateriaal of stalen die besmet zijn met pathogenen die dezelfde kliniek veroorzaken en dus aanwezig kunnen zijn in het te analyseren monster. 71 148855303 Clostridium difficile Mix 2 153309325 154088428 155497115 155499908 168719417 171096216 169238519 171316411 Shigella boydi Candida tropicalis Bacteriodes fragilis Enterococcus faecium Salmonella groep D Vancomycine-resistente enterococcen Streptococcus agalactiae Vibrio (genus) Mix 3 Mix 3 Mix 3 Mix 3 Mix 3 Mix 3 Mix 3 Mix 3 166524807 165591714 167261314 Campylobacter coli Enterobacter cloacae Klebsiella oxytoca Mix 4 Mix 4 Mix 4 168467805 173788113 161891616 161889320 168998315 Enterobacter aerogenes Proteus vulgaris Streptococcus oralis Mycobacterium smegmatis Serratia liquefaciens Mix 4 Mix 4 Mix 4 Mix 4 Mix 4 171048015 154464116 163596024 160094218 137427714 Serratia marcescens Citrobacter freundi Shigella flexneri Staphylococcus epidermidis Lactobacillus paracasei Mix 5 Mix 5 Mix 5 Mix 5 Mix 5 176632005 176515619 Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae Mix 5 Mix 5 Mogelijke kruisreactieve stalen (zie tabel 9) die apart werden getest op de TAC-STD array card zijn de volgende: Tabel 9: Mogelijks kruisreactieve stalen Staalnummer Identificatie 137542222 144304812 158225915 158139610 173047716 168718012 ATCC 13077 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis 72 Juistheid “De juistheid wordt gedefinieerd als de mate van overeenstemming van een gemeten of berekende hoeveelheid tot zijn werkelijke waarde en kan worden geschat door analyses van referentiematerialen of vergelijkingen van de resultaten met die bekomen van een referentiemethode. Dit wordt gekenmerkt door het percentage van overeenstemming met de referentiemethode (Raymaekers et al.,2011).” De minimale vereisten zijn hier het testen van 20 stalen (7 positieve, 6 laag positieve en 7 negatieve) in parallel met de TAC-STD array card. Bijkomende validatie-experimenten zijn noodzakelijk om het mogelijke matrix-geïnduceerd effect na te gaan. Op zijn minst moeten 9 monsters (3 positieve, 3 laag positieve en 3 negatieve) getest worden voor ieder bijkomende matrix (zie 3.7.1). Bij goede resultaten voor juistheid moeten alle kwaliteitscontroles correct gedetecteerd worden en alle stalen die positief zijn met de referentietechniek, moeten ook positief zijn met de TAC-STD array card. De gebruikte kwaliteitscontrole, QCMD 2014 Neisseria gonorrhoeae DNA EQA programme A, bestaat uit 10 gevriesdroogde stalen, 6 urines en 4 swabs met verschillende concentraties aan N. gonorrhoeae of negatieve stalen. De gevriesdroogde stalen werden gereconstitueerd door toevoeging van 4 ml molecular grade water en getest met de huidige routinetest BD Probetec CT/NG test en de TAC-STD array card. Bewaarcondities monstermateriaal De verdunningsreeks van mengstaal mix 1 en mengstaal mix 2 (zie 3.7.3 tabel 12) wordt opgemaakt in de verschillende matrices en die worden bewaard gedurende verschillende dagen onder verschillende condities: Van iedere verdunningsreeks worden per matrix en per mix vier reeksen opgemaakt. De eerste reeks wordt getest op dag 0 (zie matrix geïnduceerd effect). De overige drie reeksen worden vier dagen bewaard op kamertemperatuur (25 °C) om staaltransport na te bootsen. Op dag vier wordt de eerste reeks geëxtraheerd en getest met de TAC-STD array card. Reeks 2 en 3 worden nu vier bijkomende dagen bewaard in de koelkast (4 °C). Op de achtste dag wordt reeks 2 geëxtraheerd en getest, reeks 3 wordt nu zeven bijkomende dagen bewaard in de diepvries (-30 °C). Op dag 15 wordt reeks 3 ontdooid, geëxtraheerd en getest. De bedoeling hiervan is het nabootsen van de transportcondities en de bewaartijden in het lab. Onder ideale omstandigheden zou er geen achteruitgang van het monstermateriaal mogen plaatsvinden. Bewaarcondities reagentia Niet van toepassing, bewaarcondities van de firma worden overgenomen. 73 Vergelijking van methoden Alle resultaten bekomen met de referentiemethode moeten ook positief zijn met de te valideren methode: CT/NG BD ProbeTec vs TAC-STD array card. Om dit na te gaan, worden volgende testen uitgevoerd: - De verdunningsreeksen van mengstaal mix 1 en mengstaal mix 2 in TE-buffer worden getest met de BD-methode. - Minimum 10 NG stalen die positief zijn met de BD-methode worden hertest met de TAC-STD array card. - Minimum 20 stalen die negatief zijn met de BD-methode worden hertest met de TACSTD array card. 3.7.3 Praktische voorbereiding Aankoop Vircell controle DNA Tien verschillende vircellcontroles werden aangekocht met gekende DNA-concentratie. Deze zijn weergegeven in tabel 3 onder punt 3.1.1. Opmaak van Vircell controle DNA mixen Om de detectielimiet te bepalen van alle individuele Real-Time PCR-reacties worden 2 mixen gemaakt van verschillende Vircell controle DNA’s (samenstelling zie tabel 10 en 11). Per mix worden vijf verschillende vircellcontroles verdund en samengevoegd, zodat er in de finale mix nog ongeveer 200 kopieën per µl van ieder organisme aanwezig zijn. De benodigde volumes voor het opmaken van deze mixen worden weergegeven in tabellen 10 en 11. Tabel 10: Samenstelling en opmaak Vircell controle DNA mix 1 Organisme Kopieën/µl Verdunnings- Volume Vircell Volume H2O Kopieën/µl Kopieën/µl Stock factor (µl) (µl) na verdunning in mix HSV II 19300 19 40 720 1015 203,158 HD 12670 12,5 40 460 1013 202,72 MG 14500 14,5 40 540 1000 200 UU 15230 15 40 560 1015 203,066 NG 12920 12,5 40 460 1033 206,72 74 Tabel 11:Samenstelling en opmaak Vircell controle DNA mix 2 Organisme Kopieën/µl Verdunnings- Volume Vircell Volume H2O Kopieën/µl Kopieën/µl Stock factor (µl) (µl) na verdunning in mix TVA 10000 10 40 360 1000 200 CT 12680 12,5 40 460 1014 202,88 MHO 17100 17 40 640 1005 201,176 HSV I 12117 12 40 440 1009 201,95 300 1323 66,15 TPA 1323 / 22 100 Aankoop QCMD-kwaliteitscontroles (voor zover beschikbaar) NgDNA14A CTDNA14A HSVDNA14 NgDNA14B CTDNA14B Scheduled: FEB 2014 Scheduled: FEB 2014 Scheduled: MAR 2014 Scheduled: JUN 2014 Scheduled: JUN 2014 Verzamelen positieve klinische stalen Klinische stalen die sterk positief zijn voor de verschillende organismen worden verzameld. Er wordt nagegaan of het staal positief is voor één enkel organisme met de verschillende uniplex PCR-reacties en de lading ervan wordt ingeschat aan de hand van de Ct-waarde. Stalen met een Ct-waarde < 25 komen in aanmerking. Van de verzamelde stalen die in aanmerking komen, worden mengstalen (zie tabel 12) en verdunningsreeksen opgemaakt in verschillende matrices voor de evaluatie van het extractieen amplificatieproces. 22 Ander volume doordat veel minder kopieën per µl aanwezig zijn in het aangekochte Vircell controle DNA. 75 Tabel 12: Samenstelling mengstaal mix 1 en mengstaal mix 2 Organisme Mix 1 HSV I (klinisch staal) HSV II (kwaliteitscontrole) Mix 2 X X (HD) MG (kweek) X UU (kweek en klinisch staal) X UP (kweek en klinisch staal) X NG (kweek) X (TP) TV (klinisch staal) X MH (kweek) X CT (klinisch staal) X HD en TP zijn niet aanwezig in de mixen doordat sterk positief klinische stalen niet beschikbaar waren. 76 4 Resultaten en discussie 4.1 Selectie primers en probes Vals positieve resultaten voor de detectie van Neisseria gonorrhoeae door bepaalde commerciële testen (COBAS AMPLICOR (NG/CT) Test (Roche Diagnostics)) zijn een significant probleem, vooral bij de STD-screening in relatief laag prevalente populaties. De lage positief predictieve waarde van de gebruikte test maakt het noodzakelijk alle positieve resultaten te confirmeren door een ander, meer specifieke test. Daarom werd voor deze studie het principe aangenomen om voor alle te detecteren pathogenen simultaan meerdere targets per pathogeen (minstens twee) op te sporen, wat de specificiteit en de positief predictieve waarden van de test verhoogt en tevens minder vatbaar maakt voor het vals negatief rapporteren van varianten die kunnen optreden in de natuur. De resultaten van de literatuurstudie beschreven in de bachelorproef was de basis voor het selecteren van minstens twee species specifieke targetgenen en in voorkomend geval ook het selecteren van de reeds beschreven primers en probes. De sequenties en details van de hieronder geselecteerde primers en probes en de wijzigingen ten opzichte van de sequenties beschreven in de literatuur worden niet weergegeven wegens confidentialiteit. 4.1.1 Herpes Simplex Virus II Voor HSV II was er reeds een gevalideerde multiplex voorhanden in het lab op basis van de sequenties beschreven door van Doornum et al (JCM 2003, 41;576-580) gelegen in het glycoproteïne D-gen. Na NCBI genbankanalyse werd zowel in de forward als in de reversed primers een degeneratie toegevoegd om alle varianten op te pikken. De beschreven FAMTamra probe werd aan het 3’-uiteinde ingekort en omgevormd tot een MGB-probe. Verder werden niet gepubliceerde sequenties bekomen via Dr. M. Curran (Addenbrooks Hospital, Cambridges University, UK) voor het specifiek opsporen van HSV II en het opsporen van HSV zonder onderscheid te maken tussen zowel HSV I als HSV II. Deze sequenties zijn gelegen in het HSV DNA-polymerasegen. 4.1.2 Haemophilus ducreyi Uit de literatuur bleek dat vooral het 16S rRNA-gen, het p27-gen en het hemolytic cyrtotoxine-gen de meest voorkomende doelwitgenen zijn voor de specifieke detectie van HD. De Primers en probes beschreven door Orle et al (JCM 1996) werden aangepast door Suntoke et al (STI 2009) en amplificeren een 439 bp-fragment. 77 Deze PCR werd niet weerhouden daar de meest efficiënte Real-Time PCR-reactie een zo kort mogelijk fragment amplificeert. Op basis van de hemi-nested PCR beschreven door TekleMichael et al (2001) die specifiek het p27-gen detecteert, werden eigen primers en probe ontwikkeld met behulp van het Primer Express programma (Life Technologies). Bijkomende sequenties die specifiek het hemolytic cytotoxin (HhdA) gen detecteren, werden bekomen via het PHA reference lab (Cambridge), initieel gebaseerd op een CDC23 protocol. 4.1.3 Mycoplasma genitalium Het MgPa (major surface protein MgPa)-gen en het 16S rRNA-gen zijn de meest gebruikte doelwitsequenties in MG-qPCR. Echter wegens het gebrek aan specificiteit met de 16S rRNA primers ontwikkelde Müller et al. (2012) een kwantitatieve Real-Time Rotor-Gene PCR (qPCR) assay met het pdhD gene van MG als target, die codeert voor het dihydrolipoamide dehydrogenase. De beschreven probe werd terug omgevormd tot een MGB-probe. Als alternatief targetgen werd gekozen voor MgPa-target daar dit in vele studies gebruikt werd, Müller et al. (2012) beschreef echter een zeker varaibiliteit in het MgPa-gen. Door het invoeren van een degeneratie in de primers wordt deze variabiliteit grotendeels opgevangen. 4.1.4 Ureaplasma urealyticum en Ureaplasma parvum Van Cutsem et al (J Mol Diag 2011) beschreef een gemodifieerde PCR voor de detectie en differentiatie van UU en UP, gebaseerd op de sequenties gepubliceerd door Xuan Cao et al (Diag Microb Infect Dis 2007) gelegen in de ureD subunit van het ureasegen van UP en UU. Een alternatief targetgen, buiten het ureasegen, werd niet gevonden. K. Mallard, et al (J Microbiol Meth 2005) beschreef ook een Real-Time PCR ter differentiatie van UU en UP gelegen in het UreB subunit van het ureasegen, deze diende als basis voor de tweede target voor de detectie van UU en UP. 4.1.5 Neisseria gonorrhoeae NG vertoont nauwe verwantschap met N. meningitidis en andere commensale Neisseria species (N. subflava, N. cinerea, N. lactamica…). Een multitarget aanpak is hier dan ook uiterst belangrijk. Hjelmevoll (2012) heeft zijn PhD studie gewijd aan het specifiek detecteren van NG wat resulteerde in meerdere publicaties waaruit bleek dat het opsporen van het pseudogen (PorA) aanleiding gaf tot de meest specifieke en efficiëntste PCR. 23 CDC = Center for Disease Control and Prevention 78 Een ander veelgebruikt targetgen, het outer membrane protein gen (OMP), blijkt toch wat kruisreactiviteit te vertonen met andere commensale Neisseria species en werd daarom niet gekozen als targetgen. De outer membrane opacity (opa) genen zijn een aantrekkelijke keuze als targetgenen daar alle stammen van NG deze opa-proteinen tot expressie brengen. Iedere stam bevat multiple opa gene kopieën (11-13), commensale Neisseria species bevatten echter homologe sequenties waardoor de keuze van de primers en probes zeer zorgvuldig moet gebeuren. Geraats-Peters (JCM,2005) beschreef een PCR-reactie die specifiek NG opa-gen detecteert. Later bleek echter dat er een Australisch NG variant bestaat die 5 nucleotiden mismatch vertoont ten opzichte van de oorspronkelijk 19 nucleotide tellende probe. Om deze variant ook op te pikken worden beide probes uitgetest in de huidige studie. 4.2 Optimalisatie uniplex PCR 4.2.1 Functionaliteit primers In eerste instantie werden alle aangekochte primerparen getest op hun functionaliteit. Alle primers vermeld in tabel 4 (zie 3.1.4) werden besteld bij de firma IDT (Integrated DNA Technologies) en werden geleverd aan een concentratie van 100 µM. Deze werden doorverdund naar 20 pmol/µl als werkoplossing. De functionaliteit van de verschillende primerparen werd getest in een Real-Time PCR-reactie met SYBR Green MasterMix waarbij de finale concentratie van de primers 250 nM bedroeg. Dit gebeurde met de respectievelijke Vircell controle DNA’s in duplicaat. Voor alle primerparen, behalve voor HD, werd een goede amplificatiecurve bekomen (zie figuur 23) waaruit kon besloten worden dat de primers functioneel waren en kunnen gebruikt worden voor verdere evaluatie. Primerpaar HD261-262 (p27-gen) leverde een positief resultaat op met het HD Vircell controle DNA terwijl primerpaar HD264-265 (HhdA-gen) niet functioneel bleek. Deze primers werden opnieuw aangekocht in de veronderstelling dat er misschien een fout was gebeurd in de productie ervan. Ook met dit nieuwe lot primers werd er een negatief resultaat bekomen. Deze PCR werd verlaten en er werd op zoek gegaan naar een alternatief targetgen. In de weinige literatuur omtrent dit organisme werd een primerpaar op basis van het DNApolymerasegen teruggevonden (Liu et al.,2005). Dit primerpaar werd ook aangekocht en getest maar bleek opnieuw niet functioneel in combinatie met het Vircell controle DNA. Volgens Ricotta et al (J. bact 2011) kan HD taxonomisch opgesplitst worden in twee verschillende species. Een mogelijke reden voor het falen van voorgaande PCR-reacties is dat het aangekochte HD Vircell controle DNA behoort tot één van de twee mogelijke verwante species en dat de beschreven PCR het andere species als target heeft. 79 Daar HD uiterst zelden voorkomt in onze contreien en hoofdzakelijk beschreven wordt in Centraal-Afrika, Azië en Latijns-Amerika (zie 2.2.6), besluiten we om geen andere functionele PCR te ontwikkelen voor dit pathogeen. Figuur 23: Amplificatiecurve met de 4 primerparen van N. gonorrhoeae (Van links naar rechts: 313-314 ; 310-311 ; 307-308 ; 304-305) 4.2.2 Efficiëntie PCR Per pathogeen werden meerdere primerparen getest op hun functionaliteit. De volgende stap in het optimalisatieproces was per pathogeen en per targetgen de meest gevoelige, efficiëntste PCR te kiezen die finaal op de TAC zal gespot worden. Er werden 10-voudige verdunningsreeksen gemaakt van de verschillende Vircell controle DNA’s en deze werden met de overeenkomstige primerparen in drievoud ingezet in een RealTime PCR-reactie met SYBR Select MasterMix, gevolgd door smeltcurveanalyse. De bekomen Ct-waarden en de smelttemperaturen voor iedere verdunning werden geregistreerd en de gemiddelde Ct-waarden per verdunning in functie van de log10 van de concentratie werden grafisch uitgezet. Uit deze grafische weergave kan de efficiëntie van de betreffende PCR berekend worden, welke gecorreleerd is met de gevoeligheid van de test (zie tabel 13). 80 Tabel 13: Gemiddelde Ct-waarden van ieder organisme met bijhorende efficiëntie Herpes Simplex Virus II HSV249 - 250 Ureaplasma parvum HSV258-259 HSV15-16 UP326-327 Ct-waarde Tm-waarde Ct-waarde Tm-waarde Ct-waarde Tm-waarde Ct-waarde Tm-waarde 1x verdunning 22,81 83,77 22,72 87,69 22,47 80,31 18,60 73,57 10x 26,57 84,20 26,48 87,99 25,94 80,70 22,27 73,57 100x 30,34 84,26 29,97 88,09 29,48 80,73 26,80 73,64 1000x 35,41 84,36 34,71 88,15 34,63 80,80 29,27 73,64 10000x ND ND ND ND 35,06 80,78 32,76 73,64 Helling -4,16 -3,92 -3,68 -3,32 R² 0,99 1,00 0,97 0,99 Efficiëntie % 74,02 79,92 88,87 102,42 Neisseria gonorrhoeae NG304-305 NG307-308 NG310-311 NG313-314 Ct-waarde Tm-waarde Ct-waarde Tm-waarde Ct-waarde Tm-waarde Ct-waarde Tm-waarde 1x verdunning 20,44 80,30 20,07 79,17 20,10 83,34 19,09 77,16 10x 23,75 80,51 23,42 79,39 23,45 83,61 22,65 77,34 100x 27,26 80,57 26,63 79,46 26,91 83,61 26,17 77,43 1000x 31,16 80,60 30,59 79,49 30,58 83,61 29,90 77,40 10000x 34,20 80,60 33,30 79,51 34,07 83,68 34,39 77,47 Helling -3,45 -3,43 -3,51 -3,56 R² 1,00 1,00 1,00 0,99 Efficiëntie % 96,87 96,15 93,20 91,03 81 Mycoplasma genitalium MG282-283 Ureaplasma urealyticum MG285-286 UU288-289 UU291-292 Ct-waarde Tm-waarde Ct-waarde Tm-waarde Ct-waarde Tm-waarde Ct-waarde Tm-waarde 1x verdunning 23,21 75,90 24,71 73,75 22,65 75,70 22,82 73,95 10x 26,47 76,20 27,79 74,04 26,21 75,66 26,36 73,92 100x 30,08 76,26 31,73 74,11 29,84 75,66 30,32 73,95 1000x 33,84 76,30 35,96 74,17 33,94 75,72 34,61 73,98 10000x 35,10 76,23 37,05 74,26 36,95 75,75 36,95 73,99 Helling -3,38 -3,67 -3,74 -3,86 R² 0,99 0,99 1,00 0,99 Efficiëntie % 98,10 89,15 85,45 82,92 Haemophilus ducreyi HD261-262 HD264-265 HD264-265 HD319-320 Ct-waarde Tm-waarde Ct-waarde Tm-waarde Ct-waarde Tm-waarde Ct-waarde Tm-waarde 1x verdunning 26,01 75,28 ND ND ND ND ND ND 10x 29,60 75,68 ND ND ND ND ND ND 100x 32,91 75,74 ND ND ND ND ND ND 1000x 36,16 75,84 ND ND ND ND ND ND 10000x ND ND ND ND ND ND ND ND Helling -3,35 -2,76 R² 1,00 0,96 Efficiëntie % 98,98 171,71 82 Naast de gevoeligheid werd ook de ampliconlengte, kans op vormen van primerdimeren, kans op vormen van tweedimensionele structuren etc. (zie bijlage 4 “Primers en probes”) in rekening gebracht. Volgende primerparen werden geselecteerd (tabel 14) voor verdere evaluatie (ruwe resultaten zie bijlage 5 “Selectie primerparen”): Tabel 14: Geselecteerde primerparen Herpes Simplex Virus II DNA-polymerase glycoproteïne G-gen primerpaar 249-250 primerpaar 15-16 Mycoplasma genitalium pdhD-gen MgPa-gen primerpaar 282-283 primerpaar 285-286 Ureaplasma urealyticum ureD subunit urease-gen Urease-gen (ureB) primerpaar 288-289 primerpaar 291-292 Ureaplasma parvum Urease-gen primerpaar 326-327 Haemophilus ducreyi Hemolytic cytotoxin primerpaar 261-262 Neisseria gonorrhoeae Por A (pseudogen) Opa-gen primerpaar 304-305 primerpaar 313-314 4.2.3 Specificiteit aan de hand van smeltcurveanalyse De Real-Time PCR-reacties beschreven onder 4.2.2 werden steeds gevolgd door een smeltcurveanalyse. Hierbij wordt de smeltcurve van iedere PCR bekeken ten opzichte van de respectievelijke amplificatiecurve (zie figuur 24 en 25). 83 Figuur 24: Amplificatiecurve verdunningsreeks N. gonorrhoeae primerpaar 307-308 Figuur 25: Smeltcurve verdunningsreeks N. gonorrhoeae primerpaar 307-308 84 Bij de amplificatieplot is er een duidelijke correlatie tussen de hoeveelheid input-materiaal (DNA-concentratie) en de Ct-waarde. Eventuele aspecifieke amplificaties kunnen hier niet uit afgeleid worden. Door het amplificatieproces te laten volgen door een smeltcurveanalyse, werd een smeltcurve gegenereerd die onafhankelijk is van de input-concentratie maar die wel informatie geeft over de specificiteit van het gegenereerde amplicon. Alle primerparen genereerden één unieke smeltpiek (Tm weergegeven in tabel 13) behalve primerpaar NG310-311. Er werd bij herhaling een abnormaliteit waargenomen in de smeltcurve (zie figuur 26) wat niet terug te vinden was in de blanco waardoor vorming van primerdimeren wordt uitgesloten. Mogelijk is dit te wijten aan aspecifieke amplificatie. Om hierover uitsluitsel te kunnen geven, werden de amplicons onderworpen aan gelelektroforese (zie 4.2.4) Figuur 26: Smeltcurve verdunningsreeks N. gonorrhoeae primerpaar 310-311 85 4.2.4 Gelelektroforese Gelelektroforese werd toegepast op de bekomen amplicons van N. gonorrhoeae (zie figuur 27): Figuur 27: Scheiding op agarosegel van alle primerparen van N. gonorrhoeae In het eerste en laatste laantje bevinden zich de 100bp-ladders om het moleculair gewicht van de amplicons in te schatten. Bij alle NG primerparen, inclusief NG310-311; zien we in ieder laantje een mooi te onderscheiden bandje, wat wil zeggen dat enkel de targetsequentie van het organisme werd geamplificeerd en geen aspecifieke amplificatie of primerdimeerformatie kon aangetoond worden. Een mogelijke verklaring kan zijn dat er geen homogene verspreiding van het GC% is waardoor de kleine piek wordt gegenereerd bij uitsmelten. Verder onderzoek hiernaar werd niet gedaan wegens gebrek aan tijd en materiaal en aangezien er geen aspecifieke amplificatie is, vormt dit geen obstakel tijdens het onderzoek. 86 4.2.5 Specificiteit in aanwezigheid van vreemd DNA Om de specificiteit te testen, werd gebruikgemaakt van DNA geïsoleerd uit bacteriële stammen vermeld in 3.1.2. Alle bacteriële stammen werden getest met de SYBR Green MasterMix in combinatie met alle primerparen. De bekomen resultaten zijn terug te vinden in bijlage 1. Een species-specifieke PCR-reactie met DNA-input afkomstig van een 0,5 McF (1McF = 1x108 CFU/ml) cultuur resulteert in een Ct-waarde van om en bij de Ct 12. Zo werd voor de N. gonorrhoeae PCR een Ct-waarde bekomen van 13,55 en 12,45 met een 0,5 McF NG-input. Bij een zeer specifieke reactie wordt dan ook geen amplificatie verwacht in aanwezigheid van vreemd DNA. De meerderheid van de reacties (omtrent 65 %) gaf geen enkele amplificatie, een minderheid van de reacties (omtrent 34 %) resulteerde in een zeer zwakke amplificatie met een Tm die al of niet meer dan 2 °C afwijkend was van de beoogde Tm. Deze inefficiënte reacties werden als niet significant beschouwd. Van de 48 organismen getest met alle primerparen werd echter in een tiental reacties een zwakke amplificatie bekomen met een Ct-waarde om en bij de LOD van de species-specifieke PCR-reactie en een Tm identiek (± 1 °C) aan de Tm van het te detecteren amplicon. Dit kan wijzen op een niet efficiënte aspecifieke amplificatie waar er een zekere kruisreactie is van de gebruikte primers met het genoom verschillend van het te detecteren genoom. Deze probleemgevallen zullen verder onderzocht worden aan de hand van Real-Time PCR met een species-specifieke probe. Een snelle screening van de invloed van de verschillende matrices werd uitgevoerd door naast de bacteriële stammen, positieve controles (Vircell controle DNA) en de blanco’s (water, RNase vrij) ook blanco’s te testen van de broths waarin de bacteriële stammen gesuspendeerd zijn, dit om na te gaan of de broth interfereert met de PCR-reactie, wat niet het geval blijkt te zijn. 4.2.6 Functionaliteit probes Voor de zes te detecteren organismen werden tien primerparen geselecteerd op basis van efficiëntie en specificiteit (zie tabel 14) door middel van Real-Time PCR in aanwezigheid van SYBR Green. De volgende stap in het proces van optimalisatie is het invoeren van een fluorescente detectieprobe en het nagaan als deze probe in combinatie met de geselecteerde primers leidt tot een sterk en specifiek signaal. Dit gebeurt bij een vaste concentratie aan primers (1000 nM) en probe (250 nM) samen met de TaqMan Fast Virus 1-step MasterMix. Deze concentraties en mastermix zullen gebruikt worden op de TAC-STD array card waardoor in deze fase de concentraties niet gevarieerd worden ter optimalisatie. 87 Een aantal resultaten uit bijlage 1 wijzen op een mogelijke kruisreactie van het primerpaar met het genoom van een ander, of verwant, organisme wat bevestigd werd bij herhaling. Deze resultaten worden opnieuw getest met hetzelfde primerpaar en de respectievelijke probe en geven hierbij een negatief resultaat behalve primerpaar NG313-314 met probe 315 in combinatie met N. meningitidis en primerpaar UP326-327 met probe 328 in combinatie met S. aureus. Dit wijst op kruisreactie en wordt verder besproken bij 4.2.7. Naast deze bacteriële stammen wordt ook een negatieve controle, een positieve controle en een blanco (water, RNase vrij) meegenomen bij iedere run. Iedere positieve controle is positief, wat aangeeft dat de probes werken bij hun specifiek organisme en iedere negatieve controle negatief, wat aangeeft dat er geen contaminatie is. De resultaten zijn opgenomen in bijlage 1. 4.2.7 Specificiteit probes Kruisreactie tussen U. urealyticum en U. parvum wordt nagegaan door de primerparen en probe van U. urealyticum te testen met Vircell controle DNA van U. parvum en omgekeerd. Uit deze resultaten blijkt geen kruisreactie tussen deze organismen. Zoals aangehaald in 4.2.6 vindt er wel een zwakke aspecifieke amplificatie plaats tussen de primer- en probesequentie van U. parvum met het S. aureus genoom hoewel dit niet het geval was volgens de literatuur waarop de sequentie is gebaseerd (BRON: zie artikel Van Cutsem et al). Zes S. aureus stammen werden bekomen via de dienst microbiologie van het AZ Sint-Jan om deze kruisreactie na te gaan (zie bijlage 1). DNA werd geëxtraheerd uit 0,5 McF culturen van deze S. aureus stammen en ingezet met primerpaar UP326-327 en probe 328. Het gegenereerde signaal in aanwezigheid van S. aureus DNA resulteert niet in een mooie exponentiële amplificatiereactie zoals dit het geval is bij een UP positief staal (zie figuur 28). Dit wordt duidelijker interpreteerbaar bij het bekijken van de multicomponent plot (figuur 29). Hierop is duidelijk te zien dat het UP positief staal een mooie sigmoïdale curve genereert terwijl de curve van S. aureus betrekkelijk vlak blijft. Om deze aspecifieke reactie weg te werken, zal op de TAC-STD array card de reversed sequentie van de probe gespot worden. Figuur 28: Amplificatiecurve U. parvum en S. aureus 88 Figuur 29: Multicomponent plot U. parvum en S. aureus Ook is er kruisreactie aangetoond tussen de primer- en probesequentie (NG313-314;315) van N. gonorrhoeae met het genoom van N. meningitidis (zie figuur 30). Hier is er sprake van een zwak positief resultaat aangezien er in vergelijking met het positief staal exponentiële amplificatie plaatsvindt. Ook op de multicomponent plot zien we een duidelijke stijging die weliswaar zwakker is maar toch duidelijk waarneembaar. Figuur 30: Kruisreactie primerpaar 313-314 probe 315 met N. meningitidis De gegenereerde amplicons van dit positief signaal werden gesequeneerd en er werd inderdaad N. meningitidis vastgesteld (zwak positief). Als de sequenties van de gebruikte primers en probe nogmaals werden geblast, werd er bij de reversed primer complementariteit gevonden met het N. meningitidis genoom in beperkte mate (95 % Max Identity, 91 % Query Coverage) en bij de probe (94 % Max Identity en 94 % Query Coverage), bij de forward primer was dit niet het geval. 89 Theoretisch gezien zou amplificatie niet mogen plaatsvinden maar in de praktijk is dit wel het geval, echter zeer inefficiënt. Om deze aspecifieke amplificatie te beperken werd de sequentie van de probe aangepast zodat het aantal mismatches met het N. meningitidis genoom groter werd. Deze probe werd opnieuw besteld en getest waarna geen kruisreactie meer aanwezig was (ruwe resultaten zie bijlage 1). Bij de andere organismen was er geen kruisreactie bij de geteste bacteriële stammen. 4.2.8 Gevoeligheid probe gebaseerde Real-Time PCR-reacties De gevoeligheid wordt bepaald aan de hand van verdunningsreeksen met Vircell controle DNA, net zoals bij de primers in punt 4.2.2, en met positieve klinische monsters. De klinische monsters werden reeds getest in het lab van herkomst en deze resultaten werden vergeleken met de eigen bekomen resultaten (resultaten zie bijlage 2). 1. Resutlaat verdunningsreeksen a. LOD Vircell controle DNA 10x, 100x en 1000x verdund werd in iedere Real-Time PCR-reactie gedetecteerd met een Ct-waarde van Ct 29 tot Ct 36, afhankelijk van de startconcentratie van het Vircell controle DNA. Hieruit kunnen geen conclusies getrokken worden betreffende de LOD. Meer gestandaardiseerde concentraties zullen gebruikt worden om de LOD te bepalen op de TaqMan Low Density Array Card. b. Intensiteit fluorescentie Bij de resultaten van de verdunningsreeksen werd ook de signal to noise ratio van de bekomen fluorescentie bekeken (zie bijlage 3 “Fluorescentie”). Hoe groter het verschil tussen begin- en eindgehalte van de fluorescentie (delta Rn), hoe gevoeliger en eenduidiger de detectie van het organisme. De minimale vereiste signal to noise ratio werd arbitrair vastgelegd op 1 000 000. Alle primer/probecombinaties resulteerden in een voldoende sterk signaal behalve de primer/probecombinatie voor M. genitalium (MG282-283;284) die minder sterke signalen genereerden dan bij de andere organismen. De detectie van het MgPa-gen van M. genitalium gaf een delta Rn waarde > 2 000 000. De detectie van het pdhD-gen van M. genitalium gaf een delta Rn waarde < 1 000 000. Hier bleek dat de probe aan zijn 5’-uiteinde startte met 3 G’s wat de oorzaak was van deze verlaagde intensiteit. Een nieuwe probe werd gezocht binnen het te amplificeren fragment welke op de TaqMan Low Density Array Card zal geëvalueerd worden. 90 2. Positieve klinische stalen De resultaten bekomen bij het analyseren van klinische stalen positief voor Herpes simplexvirus II en N. gonorrhoeae (NG304-305) tonen dezelfde gevoeligheid aan als de resultaten bekomen in het lab van herkomst en de resultaten voor U. urealyticum , U. parvum en N. gonorrhoeae (NG313-314) wijzen op een hogere gevoeligheid (zie bijlage 2). Van H. ducreyi waren geen klinische stalen ter beschikking dus hiervan zijn enkel de resultaten van de verdunningsreeks ter beschikking. Analyse van 12 M. genitalium positieve stalen (AZ Damiaan ziekenhuis Oostende) tonen een duidelijk lagere gevoeligheid aan ten opzichte van de techniek gebruikt in Oostende. Bij MG282-283/284 werden 2 van de 12 stalen niet gedetecteerd, bij MG 285-286/287 waren dit 4 van de 12 stalen (steeds stalen met een Ct > 35). De stalen die wel gedetecteerd werden, hadden een hogere Ct-waarde dan de Ct-waarden bekomen in Oostende (tussen de 1 à 3,5 eenheden hoger). Daar het uitsluitend zwak positieve stalen zijn die niet gedetecteerd werden kan dit te wijten zijn aan verschillende factoren, zoals staalname, bewaarcondities, transport, extractieprotocol, mastermix en sequentie van de primers en probes. De klinische stalen in Oostende worden geconcentreerd alvorens PCR-reactie uit te voeren, maar verder zijn er weinig details bekend van de gevolgde procedures dus de oorzaak voor deze mindere gevoeligheid kon niet exact vastgesteld worden. Validatie van de TAC-STD array card zal grondiger het matrix geïnduceerd effect en bewaarcondities nagaan. Er werd ook nagegaan als de gevoeligheid kon verbeterd worden door het concentreren van het staal of als de matrix een invloed heeft op het resultaat: a. Concentreren urinestalen Uit drie positieve en drie negatieve urinestalen werd DNA geëxtraheerd uit 550 µl origineel staal, uit 2 ml staal (geconcentreerd naar 550 µl) en uit 4 ml staal (geconcentreerd naar 550 µl). Dit geeft volgende resultaten (tabel 15): Tabel 15: Resultaten geconcentreerde urines Neisseria gonorrhoeae Klinische stalen p304-305 p313-314 Nieuwe probe urine Staal 2 ml 4 ml Staal 2 ml 4 ml Staal 2 ml 4 ml 166033602 NG + 19,79 18,24 17,79 16,08 14,43 13,96 18,16 16,39 15,95 177779801 NG + 25,89 24,92 23,96 22,49 21,42 20,44 25,51 24,61 23,16 142518403 NG + 24,83 22,98 22,03 21,26 19,96 18,55 24,53 22,54 21,35 91 Er is dus een verschil van gemiddeld 3Ct tussen het oorspronkelijk staal en het meest geconcentreerde staal wat de detectie ten goede kan komen om zwak positieve stalen te detecteren. Uit praktische overwegingen (beschikbare tubes, beschikbare centrifuges…) wordt geopteerd om in de toekomst 15 ml urine of PreservCyt transportmedium te concentreren naar 1 ml. b. Invloed verschillende matrices Een aantal veel voorkomende matrices worden getest om na te gaan of deze interfereren in de PCR-reactie. Hiervoor wordt een klinisch staal (staalnummer urine 33650558, positief voor NG en CT) met Ct-waarde 23,14 bij NG304-305/306 en Ct-waarde 19,42 bij NG313-314/315 gespiked in urine, E-swab en TE-buffer en doorverdund in deze media. De resultaten hiervan zijn de volgende (tabel 16): Tabel 16: Invloed van verschillende matrices op de PCR-reactie NG304-305/probe 306 NG313-314/probe 315 Urine E-swab TE-buffer Urine E-swab TE-buffer 10x 100x 1000x 10 000x 27,6 31,59 36,55 NA 27,29 32,13 34,39 NA 27,77 31,91 35,47 NA 24,01 28,09 32,37 34,79 23,93 28,87 32,68 34,81 24,42 28,3 32,94 36,21 100 000x NA NA NA 35,44 NA NA Hieruit wordt besloten dat de betreffende media niet interfereren met de PCR-reactie. Dit wordt verder uitgebreid bestudeerd bij de validatie van de TAC-STD array card. 4.2.9 Detectie genomisch DNA Een correcte staalname impliceert dat ook humane epitheliale cellen, eventueel witte bloedcellen, aanwezig zijn in het staal. Door het detecteren van een minimale hoeveelheid humaan DNA in het staal, kan er een besluit gevormd worden betreffende de correcte staalname en eventuele bewaarcondities. Er wordt een controle ingebouwd op de TAC-STD array card om de integriteit van het staal te beoordelen. Verschillende Gene expression (GEx) assays zijn commercieel beschikbaar bij de firma Life Technologies. Drie assays werden aangekocht die gebaseerd zijn op de detectie van een genvrij genomische regio die niet wordt afgeschreven. 92 Alle drie de assays worden getest met twee verschillende runprotocollen (met en zonder reverse transcriptase stap (zie tabel 17)) op twee verschillende stalen, bloed en urine, waaruit DNA geëxtraheerd werd. Daarnaast werd ook een staal getest waar geen humaan DNA aanwezig is ter controle, namelijk Bacteriodes fragilis. Tabel 17: Resultaten Gene expression assay Hs04260456 Hs04260457 Hs04260458 Met RT Zonder RT Met RT Zonder RT Met RT Zonder RT Bloedstaal 22,03 21,72 22,91 23,15 21,8 21,96 01660336 (urine) Bact frag (neg) Blanco 20,95 NA NA 21,1 NA / 20,27 NA NA 20,11 NA NA 20,77 NA NA 21,2 NA NA Er is geen significant verschil tussen beide runs. Dit wil zeggen dat het niet coderend gen inderdaad niet wordt afgeschreven naar mRNA en dat we inderdaad te maken hebben met een genvrij genomische regio die niet wordt afgeschreven. Daarnaast wordt het bacterieel DNA van Bacteriodes fragilis niet gedetecteerd, enkel het humaan DNA in bloed en urine. De assay voldoet dus aan de voorwaade om humaan DNA aan te tonen. Er wordt ook besloten dat assay Hs04260458_s1 op de TAC-STD array card wordt gezet door de hogere fluorescentie bij het humane bloedstaal wat goed te zien is op de multicomponent plot (zie figuur 31). Figuur 31: Multicomponent plot Gene expression assay met humaan bloedstaal Ter confirmatie werden eerder geteste positieve stalen ook getest met deze assay met beide runprotocollen (zie tabel 18). Hierbij werden geen significante verschillen waargenomen tussen de twee amplificatieprotocollen. Ook bij deze resultaten is het duidelijk te zien dat de derde assay, Hs04260458_s1, een hogere fluorescentie genereert wanneer er wordt gekeken naar de multicomponent plot, deze curve zal telkens duidelijker tot uiting komen zoals op voorgaande figuur (zie figuur 31). 93 Tabel 18: Resultaten Gene expression assay met klinische stalen Met RT Met RT Met RT Zonder RT Hs04260456 Hs04260457 Hs04260458 Hs04260458 22,89 24,23 Klinische stalen 3272-0922 (CT) 22,53 22,66 Sint Augustinus Antw 3331-0023 (CT) 21,85 21,36 21,6 22,16 bf32440509 (CT) 24,67 24,89 24,95 26,15 ur32021253 (CT) 24,41 23,94 24,01 24,93 3361-1008 (CT) 19 18,77 19,35 19,45 3271-1204 (CT) 21,63 21,23 21,77 22,15 3084-0025 (CT) 26,02 25,71 25,33 25,82 3242-1197 (CT) 30,08 29,15 29,96 30,25 ut30831211 (NG) 20,71 20,97 21,57 21,98 ut33340206 (NG) 28,07 27,55 28,14 29,31 3246-0567 (NG) 25,03 25,39 25,4 26,48 33650558 (NG en CT) 20,64 20,5 20,51 20,67 11111797 (NG) 26,37 26,25 26,7 26,72 11112284 (NG) 26,47 26,2 26,79 27,51 11111355 (NG) 26,17 26,27 26,55 27,13 176465001 (II) 24,62 24,65 25,15 26,53 163113502 (I) 20,94 20,43 21,43 21,66 171170501 (II) 27,74 28,03 28,07 30,01 161794601 (I) 24,44 24,08 24,76 25,82 170452401 (II) 26,49 26,6 26,88 27,97 163114202 (II) 23,23 23,19 23,52 24,41 178306601 (I) 23,76 23,52 24,17 25,12 176298802 (I) 21,61 21,36 21,9 22,66 173870401 (I) 22,82 22,25 22,61 22,79 165952401 (I) 24,61 24,24 24,78 26,01 174460800 (II) 32,2 32,18 32,29 33,75 Volbloed (pos) 25,36 26,58 25,22 26,39 Camp jej (neg) NA NA NA NA Blanco NA NA NA NA Klinische stalen Brugge HSV 94 4.2.10 Samenstelling TAC-STD array card Na de optimalisatie van de primers en probes worden deze gespot op de TAC-STD array card. De resterende plaatsen worden aangevuld met andere aangekochte of niet gevalideerde primers en probes teruggevonden in de literatuur (zie tabel 19). 95 Tabel 19: Samenstelling TAC-STD array card Assay Name Targetgen Primer Forward Primer Reverse Probe 1 HSV TOTAL #1** DNA polymerasegen p249_HSVtot1Fw p250_HSVtot1Rv p251_HSVtot1MGB 2 HSV1 Bruges** 3 HSV2 Bruges** glycoproteïne G-gen glycoproteïne D-gen p011_HSV1fw p015_HSV2fw p013_HSV1rv p016_HSV2rv p014,2_HSV1probe p018_HSV2probe 4 HSV TOTAL #2 DNA polymerasegen p252_HSVtot2Fw p253_HSVtot2Rv p254_HSVtot2MGB 5 HSV1 #1 6 HSV2 #1 DNA polymerasegen DNA polymerasegen p255_HSV1#1Fw p256_HSV1#1Rv p257_HSV1#1MGB 7 HD P27** 27 kDa H. ducreyi-specific protein p261_HDp27Fw p262_HDp27Rv p263_HDp27RevMGB 8 HD ABI Ongekend, commercieel beschikbaar via Life Technologies 9 MG pdhD** 10 MG MgPa** dihydrolipoamide dehydrogenase major surface protein MgPa p282_MGpdhDFw p285_MGMgPaFw p283_MGpdhDRv p286_MGMgPaRv anders ingekort p287_MGMgPaMGB 11 UU ureD** ureD subunit van het urease gen p288_UUureDFw p289_UUureDRv p290_UUureDMGB 12 UU ureB** 13 UU ABI ureB subunit van het urease gen Ongekend, commercieel beschikbaar via Life Technologies p291_UUureFw p292_UUureRv p293_UUureMGB 14 UP ureD** ureD subunit van het urease gen p326_UPFw: p327_UPRv p328_UPMBGprobe 15 UP ureD_rev 16 UP ureB ureD subunit van het urease gen ureB subunit van het urease gen p326_UPFw: p327_UPRv reversed probe 17 NG PorAHjel** porine pseudogen p304_NGPorA1Fw p305_NGPorA1Rv p306_NGPorA1MGB 18 NG PorAAVK 19 NG Omp AVK porine pseudogen outer membrane protein p307_NGPorA2Fw p308_NGPorA2Rv p309_NGPorA2MGB p313_NGOpaDFw p314_NGOpaDRv p315_2_NGOpaDMGB 20 NG OpaDPDS_2** 5' untranslated region of the opa genes that encode opacity proteins. 21 NG Opa G-P1 opacity gene 22 NG Opa G-P2 opacity gene 23 TP tpp47PDS** 24 TP tpp47 Schields 47 kDa membrane lipoprotein 47 kDa membrane lipoprotein 25 TP tpp47Gay 47 kDa membrane lipoprotein p243_TPSY767Fw p244_TPSY834Rv p245_TPMGB 26 TP polA** 27 TP polA ITG DNA polymerase I gene DNA polymerase I gene p246_TPpolAFw p247_TPpolARv p248_ TPpolAMGB 96 28 TV 2kb** 2-kb repetitief sequentie 29 TV repeat 29 TV repeat rev repaeted segment repaeted segment p267_TV2kbFw p268_TV2kbRv p269_TV2kbMGB 30 TV Btub beta-tubulin protein, a major component of the T. vaginalis cytoskeleton. p273_TVbtFw p274_TVbtRv p275_TVbtMGB 32 MH Yid** a membrane protein translocase p276_MHyidCFw p277_MHyidCRv p278_MHyidCMGB 33 MH tuf** elongation factor Tu (EF-TU) p279_MHtufFw p280_MHtufRv p281_MHtufMGB 34 CT crPAVK** cryptische plasmide p294_CTCP1Fw p295_CTCP1Rv p296_CTCP1MGB 35 CT crPAVKrev 36 CT crPBennet cryptische plasmide cryptische plasmide p294_CTCP1Fw p298_CTCP2Fw p295_CTCP1Rv p299_CTCP2Rv p297_CTCP1RevMGB p300_CTCP2MGB 37 CT crP PHA 38 CT 16S** cryptische plasmide 16S p301_CT16SFw p302_CT16SRv probe anders ingkort 39 CT Omp1PVL 40 CT Omp1 outer membrane protein outer membrane protein 41 CT LGV polymorphic membrane protein H gene (pmp gene 42 CT LGV ABI Ongekend, commercieel beschikbaar via Life Technologies 43 CMV Bruges 44 PDV 45 SHV 46 RNAseP ABI RNAse P 47 Hs04260458_s1 genomic DNA, ongekend, commercieel beschikbaar via Life Technologies 48 Hs99999901_s1 18S controle ABI, ongekend, commercieel beschikbaar via Life Technologies ** In deze studie gevalideerde primer en probesequentie, de niet gemarkeerde zijn varianten op de gevalideerde sequenties of volledig nieuw geselecteerde sequentie 97 4.3 Validatie TAC 4.3.1 Selecteren matrices De geselecteerde matrices zijn TE-buffer, E-swab, Preserve Cyt, UTM, serum, first voided urine en weefselbiopt. De niet-steriele matrices (serum, urine en weefsel) werden getest met de verschillende uniplex PCR-reacties en bleken alle negatief te zijn behalve het first voided urine en het weefselbiopt. First voided urine: In totaal werden negen verschillende urines getest op de aanwezigheid van de te detecteren pathogenen. Één urinestaal bleek positief te zijn voor U. urealyticum. De overige vijf urinestalen waren negatief en konden gebruikt worden voor het spiken met de verschillende pathogenen. Weefselbiopt: Het eerste weefselbiopt was een linker- en rechter amandel die werden versneden met de gentleMACS-dissociator om een celsuspensie te bekomen. Het celaantal werd bepaald op de coulter en daarna doorverdund naar 1 000 000 cellen per ml. De suspensie hiervan testte positief op M. hominis en U. urealyticum. Deze suspensie was dus niet geschikt om te gebruiken tijdens de validatie. Een andere suspensie van placenta verkregen via de keizersnede werd gemaakt volgens hetzelfde principe. Het celaantal werd bepaald en bedroeg 1 156 000 cellen per ml, wat niet meer moest doorverdund worden. Na testen met de uniplex PCR-reacties bleek de suspensie negatief te zijn voor alle organismen en was dus geschikt om te gebruiken tijdens de validatie. 4.3.2 Detectielimiet De detectielimiet werd bepaald aan de hand van de twee Vircell controle DNA mixen (zie 3.7.3 tabel 10 en 11). De vijf verdunningen van Vircell controle DNA mix 1 en Vircell controle DNA mix 2 werden 10x bepaald op de TAC-STD array card. Uitgaande van deze resultaten werd de LOD bepaald (ruwe resultaten zie bijlage 6 “Limit of Detecton”). In tabel 20 wordt het aantal positieve testen van de 10 bepalingen per organisme en per targetgen weergegeven met de bijhorende LOD. 98 Tabel 20: Bepaling limit of detection Targetgen Mix 1-1 Mix 1-2 Mix 1-3 Mix 1-4 Mix 1-5 LOD Gemiddelde 13884 6942 3471 555 277 kopieën/ml kopieën/ml kopieën/ml kopieën/ml kopieën/ml kopieën/ml HD ABI 8/10 8/10 6/10 / / 6942-3471 32,584 HD P27 10/10 8/10 3/10 / / 6942-3471 33,281 HSV TOTAL #1 10/10 10/10 10/10 5/10 / 3471-555 32,282 33,565 Ct-waarde HSV TOTAL #2 10/10 10/10 10/10 6/10 2/4 3471-555 HSV2 #1 10/10 10/10 9/10 2/10 1/4 3471-555 34,5 HSV2 Bruges 10/10 10/10 10/10 7/10 / 3471-555 30,76 MG MgPa 10/10 10/10 10/10 2/10 1/4 3471-555 32,838 MG pdhD 10/10 10/10 10/10 5/10 1/4 3471-555 31,213 NG Omp AVK 10/10 10/10 10/10 6/10 1/4 3471-555 30,627 NG Opa G-P1 10/10 10/10 10/10 10/10 3/4 555-277 33,466 NG Opa G-P224 / / / / / / / NG OpaD PDS 2 10/10 10/10 10/10 10/10 4/4 < 277 33,375 NG PorAAVK 10/10 10/10 10/10 5/10 / 3471-555 31,594 NG PorA Hjel 10/10 10/10 10/10 5/10 2/4 3471-555 30,876 UU ABI 10/10 10/10 10/10 6/10 2/4 3471-555 31,504 UU ureB 10/10 10/10 10/10 6/10 3/4 3471-555 30,632 UU ureD 10/10 10/10 10/10 4/10 / 3471-555 31,625 Per pathogeen hebben de verschillende targets een gelijkaardige gevoeligheid, behalve voor N. gonorrhoeae waar OpaD PDS het gevoeligste blijkt. Dit kan te wijten zijn aan het feit dat de Opa-genen multycopy genes zijn (Geraats-Peters et al.,2005). Op basis van het Vircell controle DNA wordt een schatting gemaakt van de LOD. Voor alle organismen ligt de LOD voor de targetgenen tussen de 3471-555 kopieën per ml behalve voor volgende targets: NG Opa G-P1: 555-277 kopieën per ml NG OpaD PDS 2: < 277 kopieën per ml Beide targetgenen zijn gevoeliger. De targetgenen van H. ducreyi zijn duidelijk minder gevoelig, de LOD ligt hier tussen de 6942-3471 kopieën per ml. Voor dit organisme zal in de toekomst een betere target gezocht worden. 24 Australische variant, geeft geen resultaat met NG van hier. 99 Voor alle targetgenen ligt de LOD hoger dan bij een klassieke uniplex Real-Time PCR waar meestal een LOD van 100 à 200 kopieëen per ml wordt bekomen. Dit kan te wijten zijn aan het verschil in reactievolume waarbij de TAC-STD array card een reactievolume beschikbaar is van 1 µl (0,75 µl DNA en 0,25 µl mastermix) en bij de klassieke uniplex PCR een reactievolume van 50 µl (20 µl DNA en 30 µl mastermix). 4.3.3 Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid De positieve klinische stalen die gebruikt werden om mengstaal mix 1 en mengstaal mix 2 (zie 3.7.3 tabel 12) te maken in TE-buffer, werden eerst getest met de uniplex PCR-reacties om een schatting te maken van de lading op basis van de Ct-waarden (zie bijlage 7 “Ctwaarden klinische monsters”). Mengstaal mix 1 en mengstaal mix 2 werden samengesteld op basis hiervan en doorverdund. Iedere verdunning werd drie keer bepaald binnen eenzelfde run (herhaalbaarheid) en bijkomend twee keer herhaald in twee bijkomende runs (reproduceerbaarheid) (zie 3.7.2). De resultaten zijn terug te vinden in bijlage 8 “Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid”. De herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid worden standaarddeviatie en variatiecoëfficiënt in tabel 21. samengevat met bijhorende Tabel 21: Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid -1 10 HSV2 #1 gem 25,27 Std 0,711 % CV 2,8 HSV2 Bruges gem 19,91 Std 0,480 % CV 2,4 HSV TOTAL # 1 gem 20,68 Std 0,240 % CV 1,2 HSV TOTAL # 2 gem 21,52 Std 1,021 % CV 4,7 Herhaalbaarheid Reproduceerbaarheid -3 -4 -5 -1 10 10 10 10 10 10-2 10-3 10-4 Resultaat Herpes Simplex Virus II -2 10-5 28,67 0,416 1,5 30,50 1,826 6,0 33,03 1,403 4,2 34,94 / / 25,02 0,791 3,2 28,28 0,685 2,4 30,05 1,458 4,9 33,03 1,009 3,1 34,89 0,064 0,2 23,79 0,690 2,9 26,84 1,096 4,1 29,78 0,156 0,5 33,91 1,427 4,2 19,07 1,428 7,5 23,52 0,655 2,8 26,74 0,793 3,0 29,94 0,655 2,2 33,06 2,409 7,3 24,07 0,120 0,5 27,25 1,341 4,9 30,89 0,188 0,6 33,87 0,400 1,2 20,56 0,262 1,3 23,88 0,363 1,5 27,13 0,965 3,6 30,50 0,566 1,9 34,04 1,061 3,1 25,65 1,506 5,9 28,42 2,702 9,5 33,47 0,428 1,3 34,79 1,910 5,5 21,51 1,162 5,4 25,39 1,190 4,7 28,84 2,011 7,0 33,20 0,481 1,4 34,97 1,123 3,2 100 Resultaat Mycoplasma genitalium MG MgPa gem 21,48 Std 0,329 % CV 1,5 MG pdhD gem 20,35 Std 1,248 % CV 6,1 UP ureB X 27,13 Std 2,551 % CV 9,4 UP ureD_rev gem 27,99 Std 0,321 % CV 1,1 UP ureD gem 28,72 Std 0,326 % CV 1,1 NG Omp AVK gem 19,22 Std 0,312 % CV 1,6 NG Opa G-P1 gem 18,02 Std 0,652 % CV 3,6 NG Opa G-P2 gem / Std / % CV / NG OpaD PDS_2 gem 17,13 Std 0,569 % CV 3,3 NG PorAAVK gem 20,62 Std 0,589 % CV 2,9 24,60 0,246 1,0 27,51 0,588 2,1 33,45 0,759 2,3 34,36 0,949 2,8 21,06 0,704 3,3 24,22 0,731 3,0 27,19 0,663 2,4 33,25 0,784 2,4 34,44 0,788 2,3 23,55 0,771 3,3 26,19 1,502 5,7 32,01 32,94 19,79 22,83 0,758 4,796 1,161 1,186 2,4 14,6 5,9 5,2 Resultaat Ureaplasma parvum 25,70 1,258 4,9 31,58 0,832 2,6 33,36 3,449 10,3 32,16 1,783 5,5 34,28 1,711 5,0 34,35 / / / / / 27,68 1,976 7,1 32,53 1,360 4,2 34,25 1,398 4,1 34,35 / / / / / 32,32 1,125 3,5 32,67 / / / / / / / / 28,05 0,253 0,9 31,94 1,019 3,2 34,21 2,169 6,3 / / / / / / 33,01 0,488 1,5 34,28 / / / / 28,32 32,18 / / 0,594 1,212 / / 2,1 3,8 Resultaat Neisseria gonorrhoeae 34,35 0,129 0,4 / / / / / / 23,04 0,466 2,0 26,72 0,684 2,6 29,88 0,431 1,4 36,81 2,639 7,2 18,81 0,607 3,2 22,33 1,136 5,1 26,15 0,926 3,5 29,48 0,679 2,3 34,68 3,083 8,9 20,75 0,802 3,9 24,50 1,397 5,7 27,79 0,667 2,4 32,47 0,709 2,2 17,43 0,962 5,5 20,45 0,810 4,0 24,16 1,094 4,5 27,54 0,590 2,1 31,87 0,964 3,0 / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / 20,98 0,217 1,0 24,42 0,700 2,9 24,33 0,931 3,8 31,75 1,582 5,0 16,61 0,883 5,3 19,90 1,680 8,4 23,51 1,602 6,8 24,90 1,256 5,0 31,17 1,432 4,6 24,23 0,077 0,3 27,23 0,934 3,4 30,06 1,358 4,5 34,36 1,008 2,9 31,17 0,891 2,9 23,66 0,779 3,3 26,42 1,517 5,7 29,67 1,155 3,9 33,46 1,800 5,4 101 NG PorA Hjel gem 19,70 Std 0,354 % CV 1,8 UU ABI gem Std % CV UU ureB gem Std % CV UU ureD gem Std % CV 23,48 0,496 2,1 26,59 30,48 34,01 19,50 23,24 1,638 0,662 1,016 0,379 0,500 6,2 2,2 3,0 1,9 2,2 Resultaat Ureaplasma urealyticum 26,30 1,296 4,9 30,32 0,543 1,8 34,42 1,652 4,8 25,25 0,526 2,1 29,34 0,277 0,9 33,12 2,504 7,6 33,12 / / / / / 25,11 0,504 2,0 28,61 1,083 3,8 32,36 2,071 6,4 33,12 / / / / / 24,19 0,563 2,3 28,44 1,046 3,7 33,89 0,631 1,9 / / / / / / 24,60 0,697 2,8 28,29 0,816 2,9 33,06 1,294 3,9 34,45 / / / / / 23,45 1,050 4,5 28,09 0,104 0,4 31,87 0,592 1,9 33,35 0,654 2,0 / / / 23,58 0,883 3,7 27,89 0,291 1,0 31,78 0,447 1,4 33,88 1,334 3,9 / / / De standaarddeviatie is een maat voor de spreiding van de waarden rond het gemiddelde. Hoe beter de herhaalbaarheid en hoe dichter de waarden bijeen liggen, hoe lager de standaarddeviatie zal zijn. Aan de hand van die waarde en het gemiddelde werd de variatiecoëfficiënt berekend. Die moet voldoen aan de vooropgestelde waarde voor herhaalbaarheid (< 5 % CV) en voor reproduceerbaarheid (< 10 % CV). De reproduceerbaarheid geeft voor ieder organisme een CV < 10 % behalve bij targetgen MG pdhD is dit 10,3 %. Bij de hoogste verdunning om en bij de LOD is het normaal dat de CV wat hoger uitvalt door de stochastische verdeling van het te amplificeren materiaal. Bij de herhaalbaarheid is te zien dat een aantal targetgenen een CV hebben hoger dan de grenswaarde van 5 %. Als dit voorvalt bij hoger geconcentreerd materiaal, moet nagegaan worden of de cycle treshold correct ingesteld werd of als er afwijkende curven bekomen werden. In het algemeen zien we bij de targetgenen waar afwijkende %CV bekomen werden, dat de baseline curve fluctueert (= fluorescentie gemeten in de cycli voor er werkelijk amplificatie gedetecteerd wordt). Soms is dit minimaal, soms is dit meer uitgeproken bij probes die een hogere achtergrondwaarde hebben. De delta Rn wordt bekomen door de verhouding van de gemeten flurescentie (Rn) t.o.v. de fluorescentie van Rox (passive reference dye). Door deze waarde uit te zetten tov de cycli kan de Ct waarde bepaald worden. Bij een fluctuerende baseline kan dit tot een lagere Ct leiden, met een grotere %CV tot gevolg. 102 Daar het hier om een kwalitatieve detectie gaat, werd opgemerkt dat de hoger %CV bekomen bij een lagere verdunning van het input materiaal niet gecorreleerd is met de afwezigeheid van een Ct-waarde. Met andere woorden, bij de lagere verduningen werd de traget steeds kwalitatief gedetecteerd, echter soms met een afwijkende Ct waarde. De afwijkende %CV heeft geen invloed op het kwalitatief resultaat. Waarom deze baselinefluorescentie fluctueert is niet eenduidig te verklaren en kan mogelijk iets te maken hebben met de tweedimentionele structuur die de probe kan aannemen in oplossing. Verdere optimalisatie van de probe zou hierover mogelijks uitsluitsel geven. Bij de targetgenen van UP en UU werden de metingen uitgevoerd dichter bij de LOD waardoor hogere Ct-waarden werden bekomen bij de eerste verdunningen. Dit kan een verklaring zijn voor de hoge CV van het UP ureB targetgen en het UU ABI targetgen. De reproduceerbaarheid is over het algemeen goed voor alle organismen, de herhaalbaarheid is kwalitatief gezien goed, maar kwantitatief geeft dit uiteenlopende waarden voor de aangehaalde targetgenen. Daarnaast werd opgemerkt dat de gemiddelde Ct-waarden van de sterkst verdunde klinische stalen (zie tabel 21) hogere gemiddelde Ct-waarden vertonen dan de Ct-waarden bekomen tijdens de bepaling van de detectielimiet (zie tabel 20). Een mogelijke verklaring hiervoor kan zijn dat een deel van het aangekochte DNA van de vircellcontroles waaruit een verdunningsreeks gemaakt werd in molecular grade water, blijft “plakken” aan de wand van de tubes waarin de LOD verdunningsreeksen gemaakt werden. Bij bepaling van de herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid werd er gebruikgemaakt van mixen van positieve klinische stalen die naast het geëxtraheerd DNA van het targetorganisme en mastermix ook nog ander DNA en andere componenten bevatten door het extractieprotocol. Hierdoor zal er minder van het targetDNA achterblijven in de wells en kunnen latere Ct-waarden bekomen worden. 4.3.4 Matrix geïnduceerd effect Mengstaal mix 1 en mengstaal mix 2 (zie 3.7.2 tabel 12) werden doorverdund in verschillende matrices (zie 3.7.2 tabel 7). Serum en placenta werden nog niet gebruikt wegens tekort aan TAC-STD array cards. Aan de hand van verdunning 10-3 en 10-4 werd een representatief resultaat gegenereerd om te kunnen vergelijken met de herhaalbaarheid in TE-buffer. Verdunning 10-4 is altijd positief tijdens testen van de herhaalbaarheid in TE-buffer (behalve bij UP), verdunning 10-5 niet. 103 Als de resultaten van de twee verdunningen in de verschillende matrices positief resultaat leveren, is het niet nodig om verdunning 10-2 en 10-1 te testen aangezien deze verdunningen nog sterker zijn en dus zeker positief zullen zijn. De resultaten van de geteste matrices zijn terug te vinden in bijlage 9 “Matrix geïnduceerd effect”. Wanneer de resultaten van de herhaalbaarheid in TE-buffer en de verschillende matrices werden vergeleken, bleken deze elkaar (kwalitatief) te bevestigen. Alle PCR-reacties voor de detectie van NG, HSV II en MG vertonen geen invloed van de matrices op de gevoeligheidheid van de detectie. Enkel UU en UP vertonen een invloed en worden weergegeven in tabel 22. Als er meer positieve resultaten zijn in de betreffende matrix ten opzichte van de TE-buffer, wordt dit weergegeven in een groene kleur. Wanneer er minder positieve resultaten zijn, wordt dit weergegeven in een rode kleur. Tabel 22: Verschil in resultaat bij verschillende matrices UP ureB -3 UP ureD_rev -4 Verdunning 10 10 10 TE-buffer 3/3 1/3 E-swab 0/3 Preserve Cyt -3 -4 UP ureD -3 UU ABI -4 -3 UU ureB 10-4 0/3 3/3 2/3 3/3 0/3 3/3 1/3 1/3 3/3 0/3 3/3 2/3 2/3 1/3 3/3 2/3 3/3 0/3 0/3 3/3 1/3 3/3 1/3 3/3 2/3 0/3 0/3 1/3 0/3 1/3 1/3 0/3 0/3 1/3 0/3 3/3 1/3 3/3 3/3 3/3 1/3 10 -3 UU ureD 10-3 10 -4 10 10 10 10 1/3 0/3 1/3 0/3 3/3 1/3 3/3 0/3 2/3 0/3 1/3 0/3 3/3 1/3 0/3 0/3 1/3 0/3 3/3 0/3 3/3 UTM 1/3 0/3 1/3 0/3 2/3 0/3 Urine 2 2/3 0/3 1/3 0/3 3/3 Urine 3 0/3 0/3 0/3 0/3 Urine 5 1/3 1/3 0/3 0/3 10 -4 Ook wordt er bij deze targetgenen kruisreactie waargenomen (zie 4.3.5), wat ook verschilt van matrix tot matrix (zie tabel 23). Tabel 23: Invloed van matrix op kruisreactie UP ureB -3 UP ureD_rev -4 Verdunning 10 10 10 TE-buffer 1/3 0/3 E-swab 0/3 Preserve Cyt -3 -4 UP ureD -3 UU ABI -4 -3 UU ureB 10-4 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 2/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 3/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 10 -3 UU ureD 10-3 10 -4 10 10 10 10 2/3 1/3 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 2/3 0/3 1/3 UTM 0/3 0/3 0/3 0/3 2/3 0/3 Urine 2 0/3 0/3 1/3 0/3 2/3 Urine 3 0/3 0/3 0/3 0/3 Urine 5 2/3 0/3 0/3 0/3 10 -4 104 Voor sommige van deze zes targetgenen wordt er een minder goed resultaat bekomen, maar de matrices blijken dan wel weer een positief effect te hebben op kruisreactie. De verschillende matrices blijken geen kwalitatief effect te hebben op de organismen behalve op U. urealyticum en U. parvum. Dit kan echter te wijten zijn aan de concentratie van beide organismen. Er werd namelijk gestart van een hogere Ct-waarde voor beide organismen waardoor de reacties doorgaan om en bij de LOD. Dit kan van invloed zijn op de resultaten en zal in de toekomst herbekeken worden. Er kan dus besloten worden dat staalname kan gebeuren in deze matrices. 4.3.5 Efficiëntie TaqMan Low Density Array Card De lineariteit werd nagegaan aan de hand van de resultaten van de herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid (zie bijlage 10 “Efficiëntie”): De gemiddelde Ct-waarde per verdunning werd grafisch uitgezet in functie van de log10 van de concentratie. Uit deze grafische weergave werd de helling bepaald en de efficiëntie van de betreffende PCR berekend, welke gecorreleerd is met de gevoeligheid van de test (zie tabel 24). Zoals aangehaald in 3.7.2 moeten de resultaten voldoen aan: Regressiecoëfficiënt R2 > 0,95 over de (minstens 3) diluties. Efficiëntie van de PCR 0,9 ≤ E ≤ 1,1 105 Tabel 24: De efficiëntie voor ieder targetgen per organisme Herpes Simplex Virus II Targetgen Helling R2 Efficiëntie % HSV2 #1 -2,4504 0,9907 155,92% HSV2 Bruges** -3,4397 0,9944 95,31% HSV TOTAL #1** -3,3594 0,9997 98,46% HSV TOTAL #2 -3,4731 0,9871 94,06% Mycoplasma genitalium Targetgen Helling R2 Efficiëntie % MG MgPa** -3,5766 0,9694 90,37% MG pdhD** -4,0864 0,9742 75,68% Ureaplasma parvum Targetgen Helling R2 Efficiëntie % UP ureB -2,1742 0,8036 188,36% UP ureD_rev -3,0801 0,9772 111,19% UP ureD ** -3,0272 0,9756 113,96% Neisseria gonorrhoeae Targetgen Helling R2 Efficiëntie % NG Omp AVK -3,8892 0,9936 80,77% NG Opa G-P1 -3,5963 0,9965 89,70% NG OpaD PDS_2** -3,4136 0,9636 96,31% NG PorAAVK -3,284 0,9975 101,61% NG PorAHjel** -3,6928 0,9975 86,55% Ureaplasma urealyticum Targetgen Helling R2 Efficiëntie % UU ABI -3,626 0,996 88,71% UU ureB** -4,2291 0,9945 72,37% UU ureD** -3,4778 0,9787 93,88% **In deze studie geoptimaliseerde primer- en probesequenties Bij ieder targetgen werd een realtief goede regressiecoëfficiënt waargenomen behalve bij UP ureB. Voor de helling en daaruit afgeleide efficiëntie zijn er meerdere resultaten die niet voldoen aan de vooropgestelde waarden. Deze waarden zijn aangeduid in het rood in tabel 24. De verkregen amplificatiecurves en multicomponent plots zijn echter duidelijk positief, wat ook belangrijk is bij de kwalitatieve bepaling van de TAC-STD array card. 106 HSV II: Bij targetgen HSV2 #1 en HSV2 Bruges waren alle testen positief tot en met verdunning 10-4. Bij verdunning 10-5 werd het signaal niet meer gedetecteerd bij iedere run en bij verdunning 10-6 was alles negatief. De efficiëntie van HSV2 #1 is zeer slecht en zal bij een volgende versie van de TAC-STD array card weggelaten worden. De andere twee targetgenen testten voor alles positief tot en met verdunning 10-5, bij een verdunning verder was het resultaat negatief. Ook de efficiëntie heeft een goede waarde die valt binnen de vooropgestelde waarden. MG: Tot en met verdunning 10-5 was alles positief (op één resultaat na bij MG MgPa) voor beide targetgenen. De efficiëntie van het targetgen MG MgPa ligt wat aan de lage kant maar toch nog binnen de vooropgestelde waarden, de efficiëntie van het targetgen MG pdhD is veel te laag. Tijdens de optimalisatie werd er besloten om voor dit targetgen een andere probe op de TAC-STD array card te plaatsen door de lage fluorescentie. Deze target zal dus nog verder bekeken worden in de toekomst tijdens de validatie zodat de efficiëntie kan verbeterd worden. UP: Targetgen UP ureB verkreeg betere resultaten bij verdunning 10-3 dan de andere twee targetgenen. Maar UP ureB heeft wel de slechtste efficiëntie en als enige een slechte regressiecoëfficiënt. Ook de andere targetgenen hebben een slechte efficiëntie. Dit kan toegeschreven worden aan de verdunningen die uitgaan van een hogere Ct-waarde in vergelijking met de andere organismen. Hierdoor worden resultaten bekomen rond de LOD en kan de efficiëntie niet goed bepaald worden. Deze verdunningen dienen opnieuw te gebeuren in de toekomst tijdens de validatie, want nu kan nog geen uitspraak gedaan worden omtrent de efficiëntie. NG: Targetgen NG Omp AVK en NG PorAHjel vertonen een minder goede efficiëntie maar praktisch iedere verdunning was positief, net zoals bij de andere targetgenen. Targetgen NG OpaG verkreeg geen resultaat aangezien dit een Australische variant is waarvan het DNA niet aanwezig is. UU: Targetgen UU ureD heeft een lagere maar goede efficiëntie, de andere targetgenen niet. Dit targetgen was ook positief tot en met verdunning 10-4, in tegenstelling tot de andere targetgenen die tot verdunning 10-3 allemaal positief waren. Hier stelt zich hetzelfde probleem als bij UP en kan nog geen uitspraak worden gedaan omtrent de efficiëntie. De efficiëntie vertoond uiteenlopende waarden waarvan de meeste binnen de aanvaardbare grenzen liggen. De uitschieter van HSV2 #1 wordt verwijderd van de TAC-STD array card door de onaanvaardbaar hoge efficiëntie. Daarnaast kon de efficiëntie van UP en UU nog niet bepaald worden doordat de resultaten bij de LOD werden bekomen en dus geen accurate metingen hebben plaatsgevonden om de efficiëntie te bepalen. 107 Targetgen MG pdhD zal nog verder worden bekeken maar de verhoogde %CV (besproken bij 4.3.3) kan ook aan de basis liggen van een verminderde efficiëntie. De andere targets vertonen een aanvaardbare efficiëntie. 4.3.6 Specificiteit Tijdens de optimalisatie werd de specificiteit nagegaan van alle Real-Time PCR-reacties ten opzichte van een reeks met bacteriële stammen die simultaan in hetzelfde klinische monster kunnen aanwezig zijn. Deze stammen werden samengebracht in verschillende mixen (zie 3.7.2 tabel 8) en getest met de TAC-STD array card. De stammen specifiek voor N. meningitidis en S. aureus worden elk apart getest omdat hier bij de optimalisatie problemen waren met kruisreactie (zie 3.7.2 tabel 9). Er werd geen kruisreactie gedetecteerd bij de 43 verschillende Real-Time PCR-reacties, behalve voor UU ABI, NG OmpAVK en alle targetgenen van UP. - NG Omp AVK De vijf stammen voor N. meningitidis werden als positief gedetecteerd met de NG Omp AVK PCR (zie figuur 32). Alle andere NG-PCR’s vertoonden geen kruisreactie met N. meningitidis, S. aureus en de bacteriële stammen. Deze target zal bij een volgende versie van de TAC-STD array card weggelaten worden. 108 Figuur 32: Kruisreactie NG Omp AVK - UU ABI Tijdens het testen van de herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid werden vals-positieve resultaten bekomen bij UU ABI (zie bijlage 8). De targetsequentie is blijkbaar speciesspecifiek maar maakt geen onderscheid tussen UU en UP. Deze PCR werd verkregen via de firma Applied Biosystems en zal verwijderd worden van de TAC-STD array card. - UP Alle targetgenen van U. parvum vertoonden vals-positieve resultaten bij het testen van de herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid (zie bijlage 8). Dit werd toegewezen aan het feit dat de gebruikte mixen hiervoor bestaan uit positief klinische stalen die niet hoofdzakelijk zijn getest op U. parvum en hier wel positief kunnen voor zijn aangezien dit organisme vaak voorkomt. We kunnen stellen dat als de target NG Omp AVK en UU ABI van de TAC-STD array card verwijderd worden, de gewenste specificiteit wordt bekomen. 4.3.7 Juistheid Kwaliteitscontroles voor beide methoden werden gelijktijdig uitgevoerd. Om een goede juistheid te bekomen, moeten de kwaliteitscontroles een juist resultaat weergeven (zie tabel 25). 109 Tabel 25: Kwaliteitscontroles met BD ProbTec en TAC-STD array card kwaliteitscontrole BD CT QCMD 14 NG-01 QCMD 14 NG-02 QCMD 14 NG-03 QCMD 14 NG-04 QCMD 14 NG-05 QCMD 14 NG-06 QCMD 14 NG-07 QCMD 14 NG-08 QCMD 14 NG-09 QCMD 14 NG-10 Urine Urine Urine Urine Urine Urine swab swab swab swab neg pos (39945) neg neg neg neg neg neg neg neg NG pos (52086) neg neg pos (31700) pos (49335) neg neg neg neg neg TAC-STD CT neg pos (33-37) neg neg neg neg neg neg pos (31-35) neg NG pos (29-34) neg neg pos (32-32 ) pos (29) neg neg pos (39) neg neg Bij de resultaten bekomen met de kwaliteitscontroles in urine werden alle resultaten bevestigd. Bij de swabs daarintegen werden bij de TAC-STD array card twee extra positieve resultaten bekomen. Ct-waarde 39 is zeer zwak positief en kan niet gedetecteerd geweest zijn door de BD ProbeTec-methode, maar Ct-waarde 31-35 is duidelijk positief (meerdere targets waren hier positief) en deze controle is dan ook duidelijk gemist door de BD ProbeTec methode. Het finaal rapport moet afgewacht worden om hier een duidelijk oordeel over te vellen. Door een positieve reactie in meerdere targetgenen zijn we echter overtuigd van de positiviteit van de TAC-STD array card die een hogere gevoeligheid aangeeft ten opzichte van de huidige BD ProbeTec methode Naast de kwaliteitscontroles moeten minstens 20 stalen getest worden (7 positieve, 6 laag positieve en 7 negatieve) met beide methoden. De resultaten hiervan zijn terug te vinden in bijlage 11 “Juistheid”. 61 stalen zijn in het dubbel geanalyseerd. De 17 (zwak) positieve stalen werden geconfirmeerd met de TAC-STD array card. Bijkomstig werden binnen deze set positieve stalen ook nog positief resultaat bekomen voor 1x MG, 4x MH, 2x UU, 6x UP, 1x TP en 1x HSV II met de TAC-STD array card. De 38 stalen die negatief waren met de BD ProbeTecmethode werden geconfirmeerd en 21 van de 38 stalen waren positief voor één of meerdere van de andere parameters op de TAC-STD array card (1x MG, 5x MH, 3x UU, 12x UP, 1x TV, 2x HSV I en 1x HSV II). De juistheid werd enkel nog maar geanalyseerd voor N. gonorrhoeae (en C. trachomatis) op basis van 10 QCMD stalen en 54 klinische stalen. Alle werden correct gedetecteerd door de TAC-STD array card (100 % specificiteit) met zelf twee zwak positieve resultaten extra gedetecteerd in de QCMD stalen. 110 Hierdoor verwachten we een betere gevoeligheid voor de TAC-STD array card ten opzichte van de BD ProbeTec-methode. Voor de andere pathogenen zullen in de toekomst alle beschikbare QCMD stalen voor de overige organismen geanalyseerd worden met de TACSTD array card, inclusief klinische stalen geanalyseerd door een referentietechniek. Dit onderdeel is dus nog verder af te werken. 4.3.8 Bewaarcondities - Kamertemperatuur (25 °C) De resultaten zijn terug te vinden in bijlage 12 “Bewaarcondities”. De targetgenen van U. parvum en U. urealyticum vertoonden een minder goede werking ten opzichte van de resultaten van herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid. Er werden meer negatieve resultaten bekomen. Bij het matrix geïnduceerd effect werd ook een negatieve invloed waargenomen voor deze targetgenen, dus dit is niet per se te wijten aan de bewaarcondities. In urine 3 bleek de bewaarconditie ook een negatieve invloed te hebben. Naast de targetgenen van U. parvum en U. urealyticum, vertoonden de targetgenen van Herpes Simplex Virus II en Neisseria gonorrhoeae meer negatieve resultaten. Hieruit kan besloten worden dat bewaren op kamertemperatuur een negatieve invloed kan hebben op een urinestaal, wat in rekening moet gebracht worden. - Koelkast (4 °C) Nog geen resultaten wegens tekort aan TAC-STD array cards. - Diepvries (-30 °C) Nog geen resultaten wegens tekort aan TAC-STD array cards. 4.3.9 Vergelijking van methoden De BD ProbeTec-methode werd vergeleken met de TAC-STD array card zoals beschreven in 3.7.2. De resultaten hiervan zijn terug te vinden in bijlage 13 “Vergelijking van methoden”. De verdunningsreeksen die getest werden met de BD ProbeTec-methode, genereerden volgend kwalitatief resultaat (tabel 26): 111 Tabel 26: Resultaat met BD ProbeTec-methode Verdunning NG -1 + 10 -2 + 10-3 + -4 + -5 + 10 10 10 De resultaten werden kwalitatief bevestigd maar kwantitatief kon er geen vergelijking bekomen worden. De klinische stalen die hertest zijn met de TAC-STD array card (zie bijlage 13) bevestigden ieder positief resultaat. Twijfelachtige resultaten met de BD ProbeTec methode bleken overduidelijk positief met de TAC-STD array card wat te wijten kan zijn aan een hogere gevoeligheid van de TAC. Daarnaast werden er ook telkens bij de meeste klinische stalen, extra pathogenen gedetecteerd die met de BD ProbeTec-methode niet kunnen aangetoond worden. De negatieve stalen die opnieuw werden getest met de TAC-STD array card, zijn ook allemaal negatief met een paar uitzonderingen waarbij er toch detectie is maar met een hoge Ct-waarde, wat ook nog eens duidt op een betere gevoeligheid van de TAC. Hieruit besluiten we dat de TAC-STD array card gevoeliger is dan de BD ProbeTec-methode, wat ook werd aangetoond bij de juistheid van de methode (zie 4.3.7). De zwak positieve kwaliteistcontroles werden nog altijd gedetecteerd net zoals de zwak positief klinische stalen duidelijk positief zijn bij de TAC-STD array card. Ook worden alle positieve resultaten met de BD ProbeTec methode bevestigd. De TAC-STD array card kan de huidige methode vervangen op basis van de goede prestatiekenmerken en de beduidende grotere hoeveelheid aan informatie die verkregen wordt voor de andere pathogenen. 4.3.10 Interne controles Op de TAC-STD array card staan drie interne controles. a) Extractie en inhibitiecontrole: Seal Herpes Virus SHV wordt met een bepaalde concentratie toegevoegd aan ieder staal tijdens extractie. Dit wil dan ook zeggen dat SHV met een bepaalde Ct-waarde moet teruggevonden worden indien er geen inhibitie optreedt. Over 205 runs (zie bijlage 14 “Interne controles”) wordt een gemiddelde Ct-waarde bekomen van Ct 29,34 met (std=1,04). 112 Bij deze waarde wordt er nog 3,32 Ct bijgerekend wat overeenkomt met ongeveer 1 log10 verschil. Afgerond wordt een Ct-waarde 33 bekomen (zie figuur 34). Dus voor de TAC-STD array card wordt inhibitie vastgesteld bij SHV > Ct 33. Indien er toch positieve waarden gedetecteerd worden bij SHV> 33 zal dit wel correct zijn, maar kunnen we mogelijke andere pathogenen die aanwezig zijn in lagere concentraties, missen. SHV 100 aantal 80 60 SHV 40 gem -3SD 20 +3SD 0 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Ct Figuur 33: Resultaten inhibitie/extractiecontrole b) Staalcontroles Aan de hand van deze controles kan nagegaan worden of er een voldoende hoeveelheid celmateriaal aanwezig is om een efficiënte PCR-reactie op uit te voeren. 3 staalcontroles worden momenteel uitgevoerd op de TAC-STD array card: HS04260458_s1 Het prefix Hs verwijst naar de species Homo sapiens en het suffix _s staat voor de volgende definitie: “Een assay waarbij de primers en probes zijn ontworpen binnen een exon. Dergelijke assays detecteren per definitie genomisch DNA.” RNAseP Ribonuclease P gen wordt gebruikt als targetsequentie om humaan DNA op te sporen. 18S-Hs99999901_s1 18S rRNA is eukaryoot. De primers en probe liggen in een enkel exon en de assay zal genomisch DNA detecteren. Deze controle wordt steeds op de kaart gespot door LifeTech als kwaliteitscontrole van hun productieproces. 113 Het resultaat van deze drie controles is te zien op figuur 34. RNAseP en HS04260458_s1 zijn beide bruikbaar ter beoordeling van de integriteit van het staal. 18S-Hs99999901_s1 zal niet bruikbaar zijn door de te lage Ct-waarden. De voorkeur gaat uit naar HS04260458_s1 wegens de grotere frequentie aan waarden tussen Ct-waarde 20 en Ct-waarde 23. De Ct-waarden bij RNAseP zijn meer gespreid zoals te zien aan de minder scherpe piek op figuur 34. aantal controles 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Hs04260458 RNAse P 18S-Hs99999901_s1 9 101112131415161718192021222324252627282930 Ct Figuur 34: Resultaten staalcontroles Alhoewel het aantal urinestalen nog steeds vrij beperkt is, en een opvolgstudie dit zal moeten confirmeren, blijkt uit de resultaten dat urines steeds hogere Ct-waarden hebben. Na concentratie van urinestalen blijkt dat dit een aanleiding geeft tot een verschuiving van ongeveer 3 Ct. Wanneer stalen (en vooral urinestalen) een Ct-waarde hebben die groter is dan 30, worden deze als “ongeschikt staal” gerapporteerd. Als dit het geval is voor urinestalen, zal het staal hoogstwaarschijnlijk een midstream urine zijn in plaats van een first voided urine. Verdere validatie zal nodig zijn om na te gaan als extreme bewaarcondities een invloed hebben op de staalcontroles waardoor de Ct-waarde groter wordt dan 30. c) TAC controle 18S-Hs99999901_s1: Het 18S rRNA is eukaryoot. De primers en probes liggen in een enkel exon en de assay zal genomisch DNA detecteren. Deze controle wordt steeds op de kaart gespot door LifeTech als kwaliteitscontrole van hun productieproces. 114 5 Besluit We zijn gestart met het selecteren van speciesspecifieke targetgenen (cfr bachelorproef) voor de zes behandelde pathogenen. De primers voor deze targetgenen werden eerst getest op functionaliteit, specificiteit en gevoeligheid met de SYBR Select MasterMix. Op basis van de gevoeligheid werden dan twee primerparen per organisme geselecteerd. De probes behorend bij de geselecteerde primerparen werden hiena getest op functionaliteit, specificiteit en gevoeligheid met de TaqMan Fast Virus 1-step MasterMix. Hier werd kruisreactie waargenomen bij bepaalde primer-probe combinaties waarna deze werden aangepast. Na deze aanpassingen was de specificiteit terug 100 % en kon overgegaan worden naar de validatie. De bedoeling van deze voorafgaande optimalisatie was om op een kostenefficiënte manier Real-Time PCR’s te selecteren die op de TAC-STD array card kunnen gespot worden. Een TaqMan Low Density Array Card is namelijk een zeer duur gegeven en door op deze manier te werken is er een grotere zekerheid van effectief werkende Real-Time PCR’s op de TACSTD array card. Uit de validatie bleek dat de TAC-STD array Card een aantal targetgenen bevatte die ofwel kruisreactie vertoonden ofwel zeer inefficiënt bleken te zijn. Die targetgenen zullen verwijderd worden bij een volgende versie waarna de vrijgekomen wells kunnen aangevuld worden met nieuwe targets. We bekomen een methode die gevoeliger is dan de BD ProbeTecmethode en een hoge specificiteit handhaaft dankzij meerdere targets per pathogeen. Daarnaast zullen met deze methode simultaan 11 pathogenen opgespoord worden tegenover de 2 pathogenen die opgespoord worden met de BD ProbTec-methode. Ook is de methode zeer gecontroleerd met de drie verschillende interne controles waar er bij andere commerciële kits vaak maar twee aanwezig zijn. Tot slot dient nog vermeld te worden dat de validatie nog steeds voortgaand is. Bepaalde aspecten dienen nog afgewerkt te worden en nieuwe targets die op de volgende versie van de TAC-STD array card geplaatst worden, dienen opnieuw gevalideerd te worden. Eenmaal de validatie afgerond is, zal deze methode gebruikt worden in de routine van het AZ Sint-Jan Brugge-Oostende en zal de BD ProbeTec-methode hierdoor vervangen worden. 115 6 Bibliografische lijst AB applied biosystems by life technologies. (2010). TaqMan Gene Expression Assay Protocol [pdf]. AB applied biosystems by life technologies. (2011). Applied Biosystems Viia 7 Real-Time PCR System – Getting Started Guides [pdf]. AB applied biosystems by life technologies. (2011). Applied Biosystems Viia 7 Real-Time PCR System – User Guide [pdf]. AB applied biosystems by life technologies. (2011). Real-time PCR: Understanding Ct. [application note]. Life Technologies Corporation. AB applied biosystems by life technologies. (2011). TaqMan Fast Virus 1-Step MasterMix [pdf]. Geraadpleegd via http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/cms_085892.pdf; http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_084608.pdf; http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_083989.pdf. AB applied biosystems by life technologies. (2013). SYBR Select Master Mix – User Guide [pdf]. Alfa, M. (2005). The laboratory diagnosis of Haemophilus ducreyi. The Canadian Journal of Infectious Diseases & Medical Microbiology, 16(1), 31. Asuragen. (2012). AB TaqMan Gene Expression Services. Geraadpleegd in februari 2014 via http://asuragen.com/ BacMap: an interactive atlas for exploring bacterial genomes – Haemophilus ducreyi. (2013). Geraadpleegd op 13 februari 2014 via http://wishart.biology.ualberta.ca BacMap: an interactive atlas for exploring bacterial genomes – Ureaplasma urealyticum. (2013). Geraadpleegd op 13 februari 2014 via http://wishart.biology.ualberta.ca Biswas, D., Borkakoty, B., Mahanta, J., Walia, K., Saikia, L., Akoijam, B. S., ... & Zomawia, E. (2011). Seroprevalence and risk factors of herpes simplex virus type-2 infection among pregnant women in Northeast India. BMC infectious diseases, 11(1), 325. 116 Boyce, J. M., & Mitchell, E. B. (1985). Difficulties in differentiating Neisseria cinerea from Neisseria gonorrhoeae in rapid systems used for identifying pathogenic Neisseria species. Journal of clinical microbiology, 22(5), 731-734. Cao, X., Wang, Y., Hu, X., Qing, H., & Wang, H. (2007). Real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for quantitative detection and differentiation of Ureaplasma urealyticum and Ureaplasma parvum. Diagnostic microbiology and infectious disease, 57(4), 373-378. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). (2010). Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2010. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. De Schrijver, K. (2004). De epidemiologie van seksueel overdraagbare aandoeningen in België. FARMACEUTISCH TIJDSCHRIFT VOOR BELGIE, (1), 13-19. Descheemaeker, P. (2013). QIAsymphony [SOP]. AZ Sint-Jan Brugge. EMBL-EBI. Bacteria Genomes – Haemophilus ducreyi. (2013). Geraadpleegd op 13 februari 2014 via http://www.ebi.ac.uk Geraats-Peters, C. W. M., Brouwers, M., Schneeberger, P. M., van der Zanden, A. G. M., Bruisten, S. M., Weers-Pothoff, G., ... & Hermans, M. H. A. (2005). Specific and sensitive detection of Neisseria gonorrhoeae in clinical specimens by real-time PCR. Journal of clinical microbiology, 43(11), 5653-5659. Haggerty, C. L., & Taylor, B. D. (2011). Mycoplasma genitalium: an emerging cause of pelvic inflammatory disease. Infectious diseases in obstetrics and gynecology, 2011. High Resolution Melt. (2014). In Wikipedia. Geraadpleegd in april 2014 via http://en.wikipedia.org/wiki/High_Resolution_Melt Hjelmevoll, S. O. (2012). Molecular diagnostics and characterization of Neisseria gonorrhoeae. JM, F., & Squifflet, J. M. (2011). Pelvic Infections in Women: Belgian guidelines. Katsura, C., Larsen, R., Pogliano, K. Ureaplasma parvum. (2010). Geraadpleegd op 13 februari 2014 via http://microbewiki.kenyon.ecu 117 Kemp, M., Christensen, J. J., Lautenschlager, S., Vall-Mayans, M., & Moi, H. (2011). European guideline for the management of chancroid, 2011.International journal of STD & AIDS, 22(5), 241-244 Kenneth, T. (2012). Pathogenic Neisseriae: Gonorrhea. Todar’s Online Textbook of Bacteriology. Geraadpleegd op 13 februari 2014 via http://textbookofbacteriology.net Kim, S. J., Lee, D. S., & Lee, S. J. (2011). The prevalence and clinical significance of urethritis and cervicitis in asymptomatic people by use of multiplex polymerase chain reaction. Korean journal of urology, 52(10), 703-708. Kodani, M., Yang, G., Conklin, L. M., Travis, T. C., Whitney, C. G., Anderson, L. J., ... & Fields, B. S. (2011). Application of TaqMan low-density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens. Journal of clinical microbiology, 49(6), 2175-2182. Kruhøffer, M., Voss, T., Beller, K., Scherer, M., Cramer, J., Deutschmann, T., ... & Lenz, C. (2010). Evaluation of the QIAsymphony SP Workstation for Magnetic Particle—Based Nucleic Acid Purification from Different Sample Types for Demanding Downstream Applications. Journal of the Association for Laboratory Automation, 15(1), 41-51. Kutyavin, I. V., Afonina, I. A., Mills, A., Gorn, V. V., Lukhtanov, E. A., Belousov, E. S., ... & Hedgpeth, J. (2000). 3′-minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic acids research, 28(2), 655-661. Life Technologies. (2014). RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor. Geraadpleegd in maart 2014 via http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10777019 LightCycler Real-time PCR. (2014). Geraadpleegd in februari 2014 via https://dna.utah.edu/LightCycler/Top_LightCycler.html Liu, A. Y., Jiang, M. J., Yin, Y. P., & Sun, J. F. (2005). Detection of pathogens causing genital ulcer disease by multiplex polymerase chain reaction. Chinese medical sciences journal= Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih/Chinese Academy of Medical Sciences, 20(4), 273-275. Mallard, K., Schopfer, K., & Bodmer, T. (2005). Development of real-time PCR for the differential detection and quantification of Ureaplasma urealyticum and Ureaplasma parvum. Journal of microbiological methods, 60(1), 13-19. 118 Melting Curve Analysis.(2013). In Wikipedia. Geraadpleegd in februari 2014 via http://en.wikipedia.org/wiki/Melting_curve_analysis Miltenyi Biotec GmbH. (2014). GentleMACS C Tubes [pdf]. Geraadpleegd via https://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001400/IM0001425.ashx Müller, E. E., Venter, J. M., Magooa, M. P., Morrison, C., Lewis, D. A., & Mavedzenge, S. N. (2012). Development of a rotor-gene real-time PCR assay for the detection and quantification of Mycoplasma genitalium. Journal of microbiological methods, 88(2), 311315. Nollet, F. (2013). Viia7 Life Technologies [SOP]. AZ Sint-Jan Brugge Norberg, P. (2010). Divergence and genotyping of human α-herpesviruses: An overview. Infection, genetics and evolution, 10(1), 14-25. Orle, K. A., Gates, C. A., Martin, D. H., Body, B. A., & Weiss, J. B. (1996). Simultaneous PCR detection of Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum, and herpes simplex virus types 1 and 2 from genital ulcers. Journal of Clinical Microbiology, 34(1), 49-54. Pestana, E. A., Belak, S., Diallo, A., Crowther, J. R., & Viljoen, G. J. (2010). Real-Time PCR–The Basic Principles. In Early, rapid and sensitive veterinary molecular diagnosticsreal time PCR applications (pp. 27-46). Springer Netherlands. Polymerasekettingreactie. (2014). In Wikipedia. Geraadpleegd in februari 2014 via http://nl.wikipedia.org/wiki/Polymerasekettingreactie Raymaekers, M., Bakkus, M., Boone, E., de Rijke, B., El Housni, H., Descheemaeker, P., ... & Vankeerberghen, A. (2011). Reflections and proposals to assure quality in molecular diagnostics. Acta Clinica Belgica,66(1), 33-41. Ricotta, E. E., Wang, N., Cutler, R., Lawrence, J. G., & Humphreys, T. L. (2011). Rapid divergence of two classes of Haemophilus ducreyi. Journal of bacteriology, 193(12), 29412947. Ross, J. D. C., & Jensen, J. S. (2006). Mycoplasma genitalium as a sexually transmitted infection: implications for screening, testing, and treatment.Sexually transmitted infections, 82(4), 269-271. 119 Skovgaard, S., Kiellberg Larsen, H., Sand, C., Friis-Møller, A., Schønning, K., Skov Jensen, J. 3., & Westh, H. (2012). Genital and extra-genital screening for gonorrhoea using the BD Probetec ET system with an in-house PCR method targeting the porA pseudogene as confirmatory test. Acta dermato-venereologica, 92(1). Steg, A., Wang, W., Blanquicett, C., Grunda, J. M., Eltoum, I. A., Wang, K., ... & Johnson, M. R. (2006). Multiple gene expression analyses in paraffin-embedded tissues by TaqMan low-density array: Application to hedgehog and Wnt pathway analysis in ovarian endometrioid adenocarcinoma. The Journal of Molecular Diagnostics, 8(1), 76-83. Suntoke, T. R., Hardick, A., Tobian, A. A. R., Mpoza, B., Laeyendecker, O., Serwadda, D., ... & Reynolds, S. J. (2009). Evaluation of multiplex real-time PCR for detection of Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum, herpes simplex virus type 1 and 2 in the diagnosis of genital ulcer disease in the Rakai District, Uganda. Sexually transmitted infections, 85(2), 97-101. SYBR Green. (2013). In Wikipedia. Geraadpleegd op 13 februari 2014 via http://wikipedia.org/wiki/SYBR_Green Taylor-Robinson, D., & Jensen, J. S. (2011). Mycoplasma genitalium: from Chrysalis to multicolored butterfly. Clinical microbiology reviews, 24(3), 498-514. Tekle-Michael, T., Van Dyck, E., Abdellati, S., & Laga, M. (2001). Development of a heminested polymerase chain reaction assay for the detection of Haemophilus ducreyi in clinical specimens. International journal of STD & AIDS, 12(12), 797-803. Teo, I. A., Choi, J. W., Morlese, J., Taylor, G., & Shaunak, S. (2002). LightCycler qPCR optimisation for low copy number target DNA. Journal of immunological methods, 270(1), 119-133. Ureaplasma urealyticum.com. (2013). Geraadpleegd op 13 februari 2014 via http://www.ureaplasmaurealyticum.com Van Doornum, G. J. J., Guldemeester, J., Osterhaus, A. D. M. E., & Niesters, H. G. M. (2003). Diagnosing herpesvirus infections by real-time amplification and rapid culture. Journal of clinical microbiology, 41(2), 576-580. Van Gool, A. P. (1997). Van nucleotide tot genoom. Het genetisch elan. Garant. 120 Vancutsem, E., Soetens, O., Breugelmans, M., Foulon, W., & Naessens, A. (2011). Modified Real-Time PCR for Detecting, Differentiating, and Quantifying Ureaplasma urealyticum and Ureaplasma parvum. The Journal of Molecular Diagnostics, 13(2), 206-212. Vanderstraeten, V. (2010). Genetische diagnostiek van 15 volledige doofheidsgenen via second generation sequencing [afstudeerwerk]. Universiteit Gent, Faculteit Farmaceutische Wetenschappen. Vandesompele, J. (2009). qPCR guide. [pdf]. Geraadpleegd via http://www. eurogentec. com/uploads/qPCR-guide Wagner, E. (2003). Herpes Simplex Virus general properties. Geraadpleegd op 13 februari 2014 via http://darwin.bio.uci.edu Zheng, J., Jin, H., Xingang, L., Yuquan, J., Wei, Z., & Daru, L. (2006). Expression analyses of 27 DNA repair genes in astrocytoma by TaqMan low-density array. Neuroscience letters, 409(2), 112-117. 121 7 Bijlagen Alle bijlagen zijn terug te vinden op bijgevoegde CD-ROM wegens de omvang van de tabellen. Onderstaand overzicht geeft de volgorde van de bijlagen weer. Bijlage 1: Bacteriële stammen (negatief referentiemateriaal) Tabblad 1: Bacteriële stammen testing = Bacteriële stammen getest met de in deze thesis geselecteerde primers en probes. Tabblad 2: Resultaten met alle primerparen = Bacteriële stammen getest met alle geselecteerde primers en probes die op de TAC zullen geplaatst worden. Bijlage 2: Klinische monsters (positief referentiemateriaal) Tabblad 1: Positieve klinische stalen (1) = Positieve klinische stalen getest met de in deze thesis geselecteerde primers en probes. Tabblad 2: Positieve klinische stalen (2) = Positieve klinische stalen getest met de primers en probes geselecteerd door Pieters Jeroom (zie gelijklopend onderzoek “Ontwikkeling van een TaqMan Array Card voor de simultane detectie van seksueel overdraagbare pathogenen”) Bijlage 3: Fluorescentie Tabblad 1: Verdunningsreeksen Fluorescentie = Resultaten omtrent de fluorescentie van de geselecteerde primers en probes in deze thesis. Bijlage 4: Primers en probes Tabblad 1: Gegevens = Alle theoretische gegevens omtrent ampliconlengte, primerlengte, probelengte, GC%, Tm amplicon, dimeervorming … Bijlage 5: Selectie primerparen Tabblad 1: Primerparen = Resultaten omtrent de gevoeligheid. Hieruit werden de gevoeligste primerparen geselecteerd (aangeduid in groen). Onderaan het bestand zijn de grafieken terug te vinden in verband met de gevoeligheid. Bijlage 6: Limit of Detection Tabblad 1: LOD = Resultaten van de limit of detection voor alle targets op de TACSTD array card. Bijlage 7: Ct-waarden klinische monsters Tabblad 1: Ct-waarden = De bekomen Ct-waarden van positief klinische stalen om mengstaal mix 1 en mengstaal mix 2 te maken. 122 Bijlage 8: Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid Tabblad 1: Reproduceerbaarheid = Resultaten van de runs over twee dagen. Tabblad 2: Herhaalbaarheid = Resultaten van 3 runs over eenzelfde dag. Tabblad 3: R en H samen = Resultaten van herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid in één tabel. Bijlage 9: Matrix geïnduceerd effect De tabellen zijn gelijkaardig opgemaakt als deze van herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid. Tabblad 1: Eswab herhaalbaarheid = Resultaten van de herhaalbaarheid in Eswab als matrix. Tabblad 2: Preserve Cyt herhaal = Resultaten van de herhaalbaarheid in PreservCyt als matrix. Tabblad 3: UTM herhaal = Resultaten van de herhaalbaarheid in UTM als matrix. Tabblad 4: Urine2 herhaal = Resultaten van de herhaalbaarheid in urine als matrix. Tabblad 5: Urine3 herhaal = Resultaten van de herhaalbaarheid in urine als matrix. Tabblad 6: Urine 6 herhaal = Resultaten van de herhaalbaarheid in urine als matrix. Bijlage 10: Efficiëntie Tabblad 1: R en H samen = De resultaten van herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid worden samen gezet en het gemiddelde wordt berekend (samen met de standaarddeviatie). Uit deze resultaten wordt de grafiek opgesteld waarvan de helling wordt gebruikt om de efficiëntie te berekenen van iedere PCR. Bijlage 11: Juistheid Tabblad 1: Klinische stalen = Het aantal klinische stalen die in het dubbel zijn getest om de juistheid na te gaan. Tabblad 2: QCMD = De geteste kwaliteitscontroles voor NG en CT. Bijlage 12: Bewaarcondities Tabblad 1: 25 °C = Resultaten van de geteste bewaarconditie bij kamertemperatuur. Tabblad 2: 4 °C = Resultaten nog niet bekomen bij 4 °C. Tabblad 3: -30 °C = Resultaten nog niet bekomen bij -30 °C. Bijlage 13: Vergelijking van methoden 123 Tabblad 1: Klinische stalen = De klinische stalen die gebruikt zijn om beide methoden te vergelijken met elkaar. Tabblad 2: Verdunning met BD = De resultaten van mengstaal mix 1 en mengstaal mix 2 getest met de BD ProbeTec methode. Bijlage 14: Interne controles Tabblad 1: Ruwe data = De ruwa data van alle runs Tabblad 2: Analyse Tabblad 3: Grafiek analyse Tabblad 4: Analyse controles Tabblad 5: Grafiek analyse controles 124
