Fytopathologie

Fytopathologie
Stand van zaken betreffende analysemethoden in de fytopathologie
Planten zijn een onmisbare schakel in de voedselketen. Door fytopathogenen veroorzaakte ziekten verstoren
daarom het evenwicht en dat heeft soms zware gevolgen voor de economie en de volksgezondheid. Om problemen, of erger nog, verspreiding ervan, te vermijden is bewaking noodzakelijk. Twee aspecten moeten daarbij
alle aandacht krijgen: internationale communicatie waarbij de ruimtefactor in aanmerking wordt genomen en de
ontwikkeling van analysemethoden die een nauwkeurige diagnose mogelijk maken.
Er bestaan op diverse niveaus, nationaal en internationaal, reeds veel organisaties die zich
bezighouden met plantengezondheid. Een opmerkelijk voorbeeld daarvan is de EPPO, de
Plantenbeschermingsorganisatie voor Europa en het gebied van de Middellandse Zee,
waarbij een vijftigtal landen betrokken zijn. Die organisatie is op meerdere niveaus actief:
werkgroepen, groepen van deskundigen die uiteenlopende onderwerpen onderzoeken,
verspreiding van diagnoseprotocols, publicatie van wetenschappelijke artikelen, lijsten en
indelingen van schadelijke organismen, verzameling van illustraties van ziekten, organisatie van conferenties, bijhouden van een jaarboek van laboratoria, enz.
Met betrekking tot de diagnosemethoden is het zo dat thans meerdere, zowel klassieke als moderne, analytische
benaderingen worden toegepast. Er duiken geregeld nieuwe methoden op die in het bijzonder een verbetering
nastreven van de 6 sleutelcriteria : snelheid, gebruiksgemak, niveau van de aangeleverde informatie (specificiteit),
gevoeligheid, betrouwbaarheid en kostprijs.
De eerste benadering van een zieke plant is vooral visueel. In een aantal gevallen kan een voordiagnose worden
gesteld op grond van de symptomen die de planten vertonen (misvormingen, letsels, verkleuringen, …) of van
de aanwezigheid van organismen of van sporen daarvan (insecten, eieren, afscheiding, gangen, …). Doorgaans
is echter een bevestiging via laboratoriumonderzoek vereist. Dat geldt des te meer aangezien sommige ziekten
latent of asymptomatisch voorkomen.
Foto links: witte roest op chrysant.
Foto in het midden: bacterievuur op peer, met zichtbare afscheiding.
Foto rechts: nest van processierupsen in een spar.
De analysemethoden van laboratoria steunen op een aantal identificatieprincipes waarvan de meeste behoren
tot een van de volgende categorieën: observeren van de ziekteverwekker (met het blote oog of met een optisch
instrument), in vitro kweek, biotest (test op planten), nucleïnezuuranalyse (DNA/RNA), eiwitanalyse, vetzuuranalyse, serologische test (met antistoffen), voedings- en enzymonderzoek. Meerdere principes kunnen in één test
worden gecombineerd. Dat gebeurt bijvoorbeeld bij immunofluorescentie waarbij onder de microscoop organismen worden bekeken die gemerkt zijn met specifieke antistoffen die gekoppeld zijn aan een fluorochroom. Naast
de tests uit de grote categorieën worden in bepaalde bijzondere gevallen nog andere tests gebruikt (bijvoorbeeld
water-streaming of test met in water lopende witte vloeistof voor ringrot, kleuring met DAPI (4,6-diamidino-2phenylindole) voor fytoplasmen, meten van stikstofgehalte en pigmentgehalte, …).
6
Foto links: in vitro kweek van de bacterievuurbacterie.
Foto in het midden: immunofluorescentie op de bruinrotbacterie.
Foto rechts: enzymonderzoek op ringrotbacterie.
Van de methoden die thans de voorkeur genieten, is de moleculaire biologie een van de belangrijkste. Ze kan
worden toegepast op alle levende organismen, vergt slechts kleine hoeveelheden materiaal en levert zeer
nauwkeurige informatie aan. De klassieke PCR-techniek wordt daarbij algemeen gebruikt, eventueel in combinatie met analyses van restrictieprofielen (enzymen die DNA afbreken), toegepast op een welbepaald doel of een
heel genoom (RFLP-, AFLP-technieken). Als moderne methode lijkt real time PCR algemeen te zullen worden
toegepast. Het gebruik van bestaande technologieën om diagnoses te stellen is ook een nieuwe benadering in
de fytopathologie, bijvoorbeeld DNA-microarray en sequentieanalyse. In verband met sequentieanalyse dient
aangestipt dat thans ook wordt gewerkt aan de ontwikkeling van nieuwe, zogenaamde tweedegeneratiemethoden die krachtiger en minder duur zijn. Tot slot wordt gewerkt aan een internationaal « Barcoding » project dat als
doel heeft aan elk levend organisme en aan alle fytopathogenen een unieke « streepjescode » toe te kennen die
bestaat uit één of meer korte DNA-sequenties om eenvoudiger en met een grotere betrouwbaarheid diagnoses
te kunnen stellen.
Foto links: real time PCR.
Foto in het midden: DNA barcoding-project.
Foto rechts: tweedegeneratiesequentieanalyse
Daarnaast worden nog andere in mindere of meerdere mate gedurfde moderne methoden voor fytopathologen
ontwikkeld of reeds toegepast, zo bijvoorbeeld de elektronische neus (herkenning van vluchtige moleculen,
analyse van het iso-elektrische punt, Lateral Flow Devices (principe van de zwangerschapstest), PCR-varianten
(LAMP-PCR bij constante temperatuur, Proximity ligation met koppeling van DNA en antistoffen, enz.), akoestische
analyses voor houtboorders, satellietbeelden om bossen te bewaken, enz.
Foto links: Lateral Flow Device tests op staafjes.
Foto in het midden: akoestische analyses.
Foto rechts: satellietbeelden
Sandrine Léonard (LFSAGx, Gembloux)
[email protected]
7
Feedback over Symposia
De European Association of Phytobacteriologists (EAP) (Europese Vereniging van
Fytobacteriologen)
De EAP werd begin 2007 opgericht door experten-fytobacteriologen uit
acht EU-lidstaten met als doel de samenwerking te bevorderen op het
gebied van de diagnose, de opsporing, de identificatie en de classificatie
van bacteriële fytopathogenen .
De vereniging richt zich in het bijzonder tot fytobacteriologen van
laboratoria, agentschappen of instellingen (specifiek van de overheid)
die actief werkend zijn in diagnosestelling en analyse van plantschadelijke bacteriën, in het bijzonder deze die wetgevend zijn gereguleerd.
Er werd een oprichtingsakte (Charter of Foundation) opgesteld die op
5 februari 2007 werd goedgekeurd door het uitvoerend comité. Op 28
oktober 2008 keurde dat comité een nieuwe versie van de akte goed.
De doelstellingen van de EAP zijn:
• ontwikkelen, verbeteren en implementeren van diagnose, opsporing, identificatie en classificatie van
bacteriële ziekteverwekkers bij planten;
• aanleren en inoefenen van de principes en methoden van de fytobacteriologie;
• advies en expertise verschaffen aan diensten die bevoegd zijn voor de plantengezondheid;
• technische en wetenschappelijke samenwerking bevorderen;
• informatie uitwisselen via communicatienetwerken.
De belangrijkste door de EAP met het oog daarop opgezette activiteiten zijn:
• ontwikkelen, standaardiseren, aanpassen, bijwerken en valideren van bestaande en nieuwe
diagnosemethoden, voor al dan niet gereguleerde bacteriële plantenziekteverwekkers;
• organiseren van ringonderzoeken, bekwaamheidsproeven voor de validatie van analysemethoden;
• inrichten van workshops over welbepaalde thema’s;
• exploreren van samenwerking in onderzoek;
• vergemakkelijken van toegang tot databanken (bijv. kweekcollecties, nucleïnezuursequenties, antistoffen,
gevalideerde testprotocollen, ...);
• een website uitbouwen en onderhouden;
• een nieuwsbrief uitgeven;
• een discussieforum oprichten en animeren;
• de aangesloten leden een jaarvergadering laten organiseren.
Lidmaatschap van de EAP is individueel. Er moet geen lidmaatschapsbijdrage worden betaald. Het uitvoerend
8
comité maakt een onderscheid tussen de volgende leden:
• gewone leden die zich op de website registreren en toegang hebben tot de belangrijkste informatiemiddelen
van de EAP;
• expertleden (“fellow members”) met ten minste 10 jaar ervaring op het gebied van diagnose, opsporing, identificatie en classificatie van bacteriële ziekteverwekkers bij planten zoals blijkt uit de aanvraag om expert-lid te
worden en zoals goedgekeurd door het uitvoerend comité van de EAP;
• ereleden, die worden benoemd door het uitvoerend comité als erkenning van hun carrière in de diagnostische
fytobacteriologiek.
J.D. Janse, fytobacterioloog bij de NAK (Nederland) is voorzitter van de vereniging.
J. Van Vaerenbergh, fytobacterioloog bij het ILVO (België) borgt het secretariaat van de EAP.
De eerste gewone vergadering van de EAP vond tegelijk plaats met het EPPO Panel on Bacterial Diseases in Izmir,
Turkije, op 4 en 5 februari 2009. De volgende onderwerpen kwamen aan bod:
• aankondiging van de website www.eapnet.eu en sollicitatieformulier voor aanmelding als expertlid. De website is tijdelijk ondergebracht op de server van het ILVO en is bereikbaar op www.ilvo.vlaanderen.be\eap.
• EUPHRESCO-projecten (interlaboratoriumonderzoek over Clavibacter & Ralstonia, test op Pantoea stewartii);
• Samenwerking bij aanlevering van resultaten van interlaboratoriumonderzoek (derdelijnscontrole) met het
oog op ISO17025 accreditatie (bijv. uitwisseling van IF-glaasjes, DNA extracten, enz...);
• Validatie van real-time PCR methoden;
• pectinolytische Erwinia (Pectobacterium en Dickeya) op pootaardappelen;
• gensequenties voor identificatie en fylogenie van fytopathogene Pseudomonas en Xanthomonas;
• bespreking van criteria voor gereglementeerde plantenziekteverwekkende bacteriën.
De tweede gewone vergadering van de EAP heeft tegelijk met de vergadering van het EPPO Panel on Bacterial
Diseases plaats gevonden op 24/25 maart 2010 in Ljubljana, Slovenië.
Johan Van Vaerenbergh (ILVO Plant, Merelbeke)
[email protected]
9