Insuline

Endogeen en/of exogeen insuline:
wat meten we?
Insuline (1)
• polypeptide
• wordt geproduceerd in de β-cel van de pancreas
• belangrijkste regulator voor opslag en productie van koolhydraten
Mariëtte Ackermans
insuline
Glucose
α-keten
Laboratorium voor Endocrinologie
AMC, Amsterdam
β-keten
tyrosine kinase domein
GLUT 4
IRS-1 en 2
enzym veranderingen
membraan veranderingen
lipogenese
aminozuur transport
eiwit synthese
glucose transport
glycogeen synthese
Laboratory of Endocrinology
Insuline (2)
Laboratory of Endocrinology
Meten van insuline gevoeligheid
Insuline is ontdekt in de jaren 20 vorige eeuw (Banting en Best, Nobelprijs 1923)
Insuline tekort leidt tot Diabetes
Absoluut te kort: Type 1
Relatief tekort: Type 2
Insuline overmaat leidt tot hypoglycemieen
Eerste behandeling Diabetes patiënten met insuline gezuiverd uit pancreas van
koeien, paarden en varkens
Sinds ontdekking van recombinant DNA technieken: synthetische insulines:
Lispro (Humalog), Actrapid, Aspart, Novorapid, Lantus, Levemir.
Laboratory of Endocrinology
• Orale glucose tolerantie test (OGTT):
geef glucose en kijk naar het effect op insuline
• Insuline tolerantie test (ITT):
geef insuline en kijk naar het effect op glucose
• Hyperinsulinaemische euglycaemische clamp:
geef continu een bekende hoeveelheid insuline en kijk naar
het effect op glucose. Vaak in combinatie met isotoop dilutie
methode om glucose productie snelheden te meten.
Insuline concentratie is in deze proeven een belangrijke
parameter
Laboratory of Endocrinology
1
Analyse van insuline concentraties
Alle routine bepalingen zijn niet radioactieve immunoassays, veelal
op automaten
Er zijn ook nog (handmatige) radioimmunoassays beschikbaar
Assay probleem synthetische insulines:
Ann. Clin. Biochem. 44, 2007:315
Clinical Biochemistry, 33, No8, 2000:627
Veel synthetische insulines zijn volgens fabrikanten gelijk aan
humaan insuline
maar:
Clin. Chem. 50, No1, 2004: 257
Ann. Clin. Biochem. 43, 2006:306
Laboratory of Endocrinology
Waarom exogeen insuline meten?
Laboratory of Endocrinology
Doel
Klinische diagnostiek:
• insulinoom vs exogeen insuline bij hypoglycemieen
Vergelijken van prestaties van 3 binnen ons lab gebruikte insuline
assays voor de bepaling van exogeen humaan of varkens insuline na
toevoeging aan humaan of ratten plasma
Research setting:
• insuline waarden bij hyperinsulinaemische euglycaemische
clamps
Laboratory of Endocrinology
Laboratory of Endocrinology
2
Assays en insulines
Pool plasma
Assays
Chemiluminescente immunoassay Immulite 2000 (DPC)
Mercodia ratten insuline ELISA
Linco ratten insuline RIA
DPC Immulite
Humaan laag
Insulines
Actrapid (Novo Nordisk)
Varkens Insuline (Sigma)
Mercodia ELISA Linco RIA
20
n.a.
n.a.
pmol/L
Humaan hoog
131
155
160
pmol/L
Rat
n.a.
175
201
pmol/L
Laboratory of Endocrinology
Laboratory of Endocrinology
Standaardlijnen
Resultaten (1)
Verdunningen:
Insuline Imulite
800
700
Actrapid: 722, 361, 180, 90 en 45 pmol/L
Varkens insuline: 783, 392, 196, 98 en 49 pmol/L
Humane assay
Gemeten (pmol/L)
600
500
400
AH = Actrapid in humaan plasma
AR = Actrapid in ratten plasma
VR = Varkens insuline in ratten plasma
300
200
100
0
-100
0
200
Verdunningen zijn gemaakt in humaan pool plasma laag en hoog en
in ratten plasma
400
600
800
1000
Ingewogen (pmol/L)
AH
AR
VR
Insuline LINCO (rat RIA)
Insuline Mercodia (rat ELISA)
1400
1200
1200
Gemeten (pmol/L)
Ratten assays
Gemeten (pmol/L)
1000
800
600
400
200
800
600
400
200
0
0
0
200
400
600
Ingewogen (pmol/L)
AH
Laboratory of Endocrinology
1000
AR
VR
800
1000
0
200
400
600
800
1000
Ingewogen (pmol/L)
AH
AR
VR
Laboratory of Endocrinology
3
Resultaten (2)
Resultaten (3)
Gemiddelde kruisreactiviteit (%):
Humaan met Actrapid
900
800
Humaan plasma
hoog
Gemeten (pmol/L)
700
600
500
400
300
Insuline
Plasma
DPC Immulite
Mercodia ELISA
Linco RIA
Actrapid
Humaan
56
86
78
Actrapid
Rat
45
69
84
Varkens
Rat
25
79
92
200
100
0
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Ingewogen (pmol/L)
DPC
Mercodia
Linco
Rat met Varkensinsuline
Rat met Actrapid
900
1400
800
1200
1000
600
Gemeten (pmol/L)
Ratten plasma
Gemeten (pmol/L)
700
500
400
300
200
100
0
-100 0
800
600
400
200
0
100
200
300
400
500
600
700
800
-200
0
200
400
600
Ingewogen (pmol/L)
Ingewogen (pmol/L)
DPC
DPC
Mercodia
Linco
Mercodia
800
1000
Linco
Laboratory of Endocrinology
Conclusies
Laboratory of Endocrinology
Implicaties
• Afhankelijk van het soort insuline en de matrix wordt per assay een
uitslag gevonden die op zich wel reproduceerbaar is.
• De Actrapid concentraties die we meten tijdens onze
hyperinsulinaemische clamps zijn slechts 60% van de ware waarde.
• De kruisreactiviteit varieert afhankelijk van deze parameters tussen
56 en 86% in humaan plasma en tussen de 25 en 92% in ratten
plasma
• Het antilichaam ziet blijkbaar een verschil tussen endogeen en exogeen
insuline ondanks dat de fabrikant zegt dat de aminozuur volgorde
hetzelfde is.
• De kruisreactiveit van Actrapid was onafhankelijk van de
endogene insuline concentratie
• Wat betekent dit voor de biochemische diagnose van onbegrepen
hypoglycemieen?
• Onze bevindingen zijn in lijn met wat er in de literatuur gevonden
wordt
• Wat dit betekent voor de biologische activiteit van Actrapid wordt met
deze proefopzet niet beantwoord.
Laboratory of Endocrinology
Laboratory of Endocrinology
4
Mevr. S geb. 28-02-1973
Mevr. S geb. 28-02-1973
Mevrouw met onbegrepen hypoglycamieen
Tijd
Vraagstelling: Insulinoom
Gedocumenteerd:
glucose: 2.9 mmol/L
insuline: 69 pmol/L
Cpeptide: 80 pmol/L
03:37
11:00
13:00
Glucose
7.0
3.1
1.7
mmol/L
Cpeptide
530
90
50
pmol/L
Insuline Immulite
94
<15
<15
pmol/L
Laboratory of Endocrinology
Laboratory of Endocrinology
Meting Novorapid
Mevr. S geb. 28-02-1973
400
Tijd
Gemeten Novorapid (pmol/L)
350
300
RIA
y = 0.9695x - 8.3359
250
R = 0.9945
03:37
11:00
13:00
Glucose
7.0
3.1
1.7
mmol/L
Cpeptide
530
90
50
pmol/L
Insuline Immulite
94
<15
<15
pmol/L
1036
375
431
pmol/L
2
200
150
Immulite
y = 0.1245x + 1.1671
100
2
R = 0.9264
50
Insuline RIA
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
-50
ingewogen Novorapid (pmol/L)
Laboratory of Endocrinology
Laboratory of Endocrinology
5
Maat voor de biologische activiteit
We weten uit de literatuur dat:
Resultaten EGP onderdrukking
Humaan
Rat
80
EGP (μmol/kg.min)
• Insuline waarde ± 2 x basaal: Onderdrukking van de hepatische
glucose productie
• Insuline waarde ± 6 x basaal: Onderdrukking van de hepatische
en perifere glucose productie
70
60
50
40
30
20
10
0
Soeters, MR et al.
Obesity (Silver Spring). 2009 Jul;17(7):1326
Laboratory of Endocrinology
basal
clamp
Met dank aan Charlene Diepenbroek
Laboratory of Endocrinology
Take home message
Ben je er van bewust dat
synthetische insulines niet altijd
goed gemeten worden met de
commerciële insuline assays
Laboratory of Endocrinology
6