Bioveiligheid in het laboratorium - Institute Born

VLAAMS INTERUNIVERSITAIR INSTITUUT
VOOR BIOTECHNOLOGIE
UNIVERSITEIT
GENT
Universiteit Antwerpen
Bioveiligheid
in het
laboratorium
3de herziene editie
Bioveiligheid
in het
laboratorium
3e herziene editie, mei 2004
Uitgave van VIB,
Vlaams Interuniversitair
Instituut voor Biotechnologie
Redactie:
René Custers,
regulatory affairs manager, VIB
VIB
Rijvisschestraat 120
9052 Zwijnaarde
tel.: 09 244 66 11
fax.: 09 244 66 10
e-mail: [email protected]
web: http://www.vib.be
Verantwoordelijke uitgever:
Jo Bury, VIB
Rijvisschestraat 120
9052 Zwijnaarde
Niets uit deze uitgave mag worden
verveelvuldigd en/of openbaar gemaakt
voor commerciële doeleinden.
Voor educatieve doeleinden dient steeds
de bron vermeld te worden.
© Mei 2004
VOORWOORD
Dit is de derde, herziene editie van het boekje ‘Bioveiligheid in het laboratorium’. In dit
boekje vindt u alle informatie terug uit de eerste en tweede editie. Er zijn slechts lichte
aanpassingen en aanvullingen gedaan, met name in de tekst over ontsmetting en inactivatie.
Moderne biotechnologie is een belangrijke technologie in het huidige biologische en biomedische onderzoek. Duizenden onderzoekers in de levenswetenschappen gebruiken
dagelijks micro-organismen, planten of dieren op zoek naar de antwoorden op relevante
wetenschappelijke vragen. Het gebruik van genetisch gemodificeerde organismen (GGO’s)
neemt daarin toe.
Het is de onderzoekswereld zelf die in het verleden gewezen heeft op het belang van het
veilig werken met GGO’s. Vandaag zijn er heel wat wetgevingen en richtlijnen van toepassing op GGO’s die het doel hebben mens en milieu te beschermen.
We willen het belang van het veilig en verantwoord werken met biologisch materiaal en
GGO’s onderstrepen. Het behoort tot de maatschappelijke verantwoordelijkheid van de
onderzoeker om de nodige veiligheidsregels na te leven. Daarnaast behoort het tot de verantwoordelijkheid van de onderzoeker om studenten, of andere mensen die nog weinig
werkervaring hebben, op te leiden in de theoretische en praktische aspecten van de bioveiligheid.
We hopen dat dit boekje, samen met praktische instructies en begeleiding, een nuttig
werkinstrument blijkt om mensen op een veilige manier te verwelkomen in de fascinerende wereld van het biotechnologisch onderzoek.
Jo Bury en Rudy Dekeyser
algemene directie VIB
Voorwoord
3
INHOUDSOPGAVE
1. INLEIDING . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5
2. BIOVEILIGHEID
6
......................................................................................
3. INDELING IN RISICOKLASSEN EN RISICO-ANALYSE
9
.....................................
4. DE VERSPREIDING VAN ORGANISMEN IN HET LABORATORIUM
14
..................
5. INPERKING: EEN COMBINATIE VAN INFRASTRUCTUUR EN
WERKVOORSCHRIFTEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20
6. BESMETTING, ACCIDENTEN, ONTSMETTING EN INACTIVATIE
29
....................
7. WERKEN MET ENKELE VEELGEBRUIKTE LABORATORIUM-ORGANISMEN . . . . .35
8. REFERENTIES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45
9. VERKLARENDE WOORDENLIJST . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46
BIJLAGE 1:
INPERKINGSVEREISTEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47
BIJLAGE 2:
VIB RICHTLIJNEN VOOR INSCHALING VAN ACTIVITEITEN MET GGO’S
56
.........
BIJLAGE 3 :
DE BIOLOGISCHE RISICOKLASSE VAN ENKELE RELEVANTE PATHOGENEN
64
...
BIJLAGE 4:
LEESCOMMISSIE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .68
BIJLAGE 5:
INFORMATIEBLAD
69
................................................................................
BIJLAGE 6:
ZELFTOETS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .70
4
Inhoudsopgave
1. INLEIDING
In veel biotechnologisch en biomedisch onderzoek wordt gewerkt met biologisch materiaal. In steeds grotere mate wordt daarbij gebruik gemaakt van moderne moleculair biologische technieken zoals recombinant-DNA technologie. In dit boekje wordt een kort overzicht gegeven van de basisprincipes die van belang zijn voor het veilig werken met genetisch gemodificeerde en/of ziekteverwekkende organismen. Daarbij zijn drie typen van
beschermende veiligheidsmaatregelen te onderscheiden:
a. bescherming van de onderzoeker,
b. bescherming van het experiment, en
c. bescherming van mens en milieu
De verschillende maatregelen zullen in dit boekje zowel worden uitgewerkt voor microorganismen als voor planten en dieren. Iedereen die in een laboratorium met deze
organismen werkt moet de basisbegrippen van bioveiligheid kennen en er in de dagelijkse
laboratoriumpraktijk naar handelen. Alleen op die manier kan een werksituatie worden
gecreëerd die veilig is voor uzelf, voor de medemens en voor het milieu.
Het veilig werken met biologisch materiaal wordt bovendien vereist vanuit twee typen van
wetgeving die aan de basis liggen van de voorschriften zoals deze in dit boekje worden
uitgewerkt:
1. De wetgeving voor de bescherming van de medewerker bij de uitvoering van zijn werk.
2. De milieuwetgeving voor het werken met genetisch gemodificeerde organismen.
Voor beide bestaat een Europese wetgeving die in de nationale wetgeving is omgezet.
Figuur 1 : Het biohazard teken. Dit teken geeft aan dat er met biologisch
risicohoudend materiaal wordt gewerkt (vanaf risicoklasse 2)
Inleiding
5
2. BIOVEILIGHEID
Wat is bioveiligheid?
De bioveiligheid van laboratoriumwerk staat centraal in dit boekje. Daarbij gaat het om de
intrinsieke gevaren van levende organismen en hoe deze veilig te hanteren. Ook genetisch
materiaal zoals ‘naakt’ DNA kan gevaarlijk zijn. Voordat werk met pathogene of genetisch
gemodificeerde organismen (GGO’s) in een laboratorium wordt gestart, moet stilgestaan
worden bij de eigenschappen van die organismen en moeten waar nodig maatregelen
worden getroffen om eventuele risico’s voor mens of milieu tot een minimum te beperken.
…‘Safety first!’…
Welke gevaren?
Biologisch materiaal en levende organismen zijn noch intrinsiek gevaarlijk, noch intrinsiek
veilig. Eventueel gevaar hangt af van de eigenschappen van een organisme.
Eigenschappen van organismen die gevaar inhouden, zijn de volgende:
• Pathogeniteit
De pathogeniteit geeft aan of een organisme - bijvoorbeeld een bacterie, virus, schimmel, of parasiet - in staat is een ziekte te veroorzaken bij een plant, dier of mens.
Factoren zoals infectiedosis, virulentie en productie van toxines door de ziekteverwekker
spelen een rol in de mate waarin het organisme in staat is een ziekte te veroorzaken.
Infectiedosis
Besmetting met één pathogeen betekent nog niet automatisch een
infectie. De infectiedosis verschilt van pathogeen tot pathogeen.
Hieronder volgen enkele voorbeelden van enkele voor de mens relevante
infectiedosissen van pathogenen wanneer zij via hun natuurlijke verspreidingsweg verspreid worden:
Pathogeen
Infectieuze dosis
adenovirus
influenza virus
tuberculose bacteriën
typhus bacteriën
> 150 pfu (intranasaal)
790 pfu (nasopharyncheaal)
10 bacillen (inhalatie)
105 bacteriën (ingestie)
pfu = plaque forming units
Bron: Material Safety Data Sheets, Health Canada
• Toxiciteit
Toxiciteit is vergiftiging. De meeste stoffen zijn bij normaal gebruik niet in staat een
vergiftiging te veroorzaken. De mate van toxiciteit wordt meestal aangegeven in een
6
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
LD50 waarde voor vertebraten uitgedrukt in gewichtseenheden per kg lichaamsgewicht.
De LD50 (LD staat voor: Lethal Dose) is de waarde waarbij blootstelling aan het agens
tot gevolg heeft dat 50% van de blootgestelde proefdieren dood gaat. Als het gaat om
levende organismen (voornamelijk bacteriën), dan gaat toxinevorming vaak gepaard met
pathogeniteit.
• Allergeniteit
Allergeniteit is een niet-toxische, door het immuunsysteem gemedieerde, ongewenste
reactie van het lichaam op een stof of agens. Immuunglobuline E (IgE) en mestcellen
(cellen van het immuunsysteem die onder meer heparine produceren) spelen vaak een
rol in de allergische reactie. Een allergische reactie kan zich onder meer uiten in huidirritaties, niezen, astmatische aanvallen, chronische longaandoeningen en kan soms zelfs
leiden tot een levensbedreigende shock.
Ter voorkoming van long- en huidaandoeningen bij laboratoriumpersoneel
dient de mogelijkheid van een allergische reactie mee in overweging genomen te worden en dient ernaar gestreefd te worden om rechtstreeks contact (inademen, huidcontact) van het personeel met allergene stoffen te
vermijden.
• Verstoring van ecologische evenwichten
Hier is het met name van belang om mogelijke verstoringen van ecologische evenwichten die verband houden met activiteiten met genetisch gemodificeerde organismen
(GGO’s) te bespreken. Verstoring van een ecologisch evenwicht zou kunnen gebeuren
wanneer een GGO met een bepaalde eigenschap zich ongewenst naar het milieu
verspreidt, of wanneer er vanuit dat organisme verspreiding plaatsheeft van genetisch
materiaal naar andere organismen in het milieu. Aan de potentiële gevaren die
verbonden zijn aan recombinant-DNA technologie en de risico-inschatting daarrond zal
verderop in dit boekje dieper worden ingegaan.
• Andere schadelijke effecten
Soms zijn er ook andere ongewenste effecten die maken dat extra voorzichtigheid
geboden is bij het hanteren van biologisch materiaal. Het is niet mogelijk een limitatieve
lijst te maken van dergelijke effecten. Waar het echter om gaat is dat men stil moet
staan bij de eigenschappen van materiaal voor ermee te gaan werken. Als belangrijkste
categorie kunnen misschien de genen aangeduid worden die immuunmodulerende
eigenschappen bezitten. Daarbij is echter lang niet elke immuunmodulatie schadelijk.
Om uitsluitsel te geven over het gevaar moeten de eventuele effecten worden nagegaan
en is vaak overleg aangewezen. Ter illustratie kan het voorbeeld gegeven worden van
het werken met een vacciniavirus waarin een gen gekloneerd is dat voor immuunsuppressie zorgt. De immuunsuppressie zou ervoor kunnen zorgen dat het lichaam een
mogelijke infectie met dat virus niet goed kan bestrijden. Infecties met vacciniavirus
kunnen in uitzonderlijke gevallen leiden tot een dodelijke encephalitis.
Bioveiligheid
7
Werken met ‘naakt’ DNA
We worden in onze leefomgeving dagelijks geconfronteerd met DNA. In
het laboratorium wordt vooral gewerkt met DNA in de vorm van plasmiden, gedigesteerd DNA, of primers. DNA op zich is ongevaarlijk. Maar
toch is het werken met DNA niet altijd ongevaarlijk. Met name wanneer
het DNA codeert voor een cellulair oncogen. Met een oncogen wordt in dit
geval een ‘dominant transformerend’ gen bedoeld: een gen dat na incorporatie in het genoom de transformatie* van de cel als directe gevolg heeft.
Transformatie – de omvorming naar een snel en oneindig delende cel - is
de belangrijkste eerste stap in tumorvorming. Een prikaccident met dergelijk materiaal brengt een risico met zich mee. Medewerkers die met dit
materiaal werken dienen zich bewust te zijn van het risico, dienen handschoenen te dragen en moeten het werken met scherpe voorwerpen tot
een minimum beperken. Eenmaal dit DNA in een bacterie of een cel
geïncorporeerd is, brengt het niet langer een verhoogd risico met zich mee.
Tenzij de cel een packagingcel is waarin het oncogen door een virale vector
kan worden opgenomen die het oncogen verder kan verspreiden.
Oncogenen en virale vectoren
Het kloneren van DNA dat codeert voor een dominant transformerend cellulair oncogen brengt met name een extra risico met zich mee wanneer het
in een virale vector wordt gezet die in het genoom integreert. Daarbij
wordt onderscheid gemaakt tussen amphotrope en ecotrope virale vectoren
aangezien de laatste alleen muizencellen kunnen infecteren. Amphotrope
vectoren kunnen ook mensen infecteren en brengen dus een hoger risico
met zich mee dan ecotrope.
*zie verklarende woordenlijst
8
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
3. INDELING IN RISICOKLASSEN
EN RISICO-ANALYSE
Pathogene organismen
Organismen worden ingedeeld in vier risicoklassen. Organismen die geen ziekten verwekken horen thuis in risicogroep 1. Ziekteverwekkers horen thuis in de groepen 2, 3 en 4,
afhankelijk van de mate van ziekteverwekkendheid en de mate waarin therapieën beschikbaar zijn. Om een onderscheid aan te kunnen geven met de risicoklassen voor GGO’s
wordt de risicoklasse van een natuurlijk pathogeen vaak aangeduid als de biologische
risicogroep. Hieronder volgt een overzicht van de definities van de verschillende risicogroepen:
Groep 1
Groep 2
Groep 3
Zeer onwaarschijnlijk dat het agens een ziekte veroorzaakt in mensen, dieren of planten.
(micro-)organismen die bij de mens een ziekte kunnen verwekken en
Humane
een gevaar vormen voor de personen die er rechtstreeks mee in conpathogenen
tact komen. Hun verspreiding in de gemeenschap is onwaarschijnlijk.
Er bestaat meestal een profylaxis of een effectieve behandeling.
(micro-)organismen die bij dieren een ziekte kunnen veroorzaken en
Dierpathogenen
die in verschillende mate één van de volgende eigenschappen bezitten:
beperkte geografische belangrijkheid, overdracht naar andere zwakke
of onbestaande species, afwezigheid van vectoren of dragers. Er is een
beperkte economische en/of medische impact. Men beschikt meestal
over profylactische middelen en/of over efficiënte behandelingen.
(micro-)organismen die bij planten een ziekte kunnen veroorzaken,
Fytopathogenen
maar waarbij in geval van accidentele verspreiding in het Belgisch leefmilieu geen verhoogd risico voor epidemie bestaat. Het betreft overal
voorkomende pathogenen waarvoor er profylactische of therapeutische
middelen voorhanden zijn. De niet-inheemse of exotische fytopathogenen, (micro-)organismen die niet in staat zijn om in het Belgische
leefmilieu te overleven vanwege de afwezigheid van targetplanten of
vanwege ongunstige weersomstandigheden, behoren eveneens tot
deze risicogroep.
(micro-)organismen die bij de mens een ernstige ziekte kunnen verHumane
wekken en een gevaar vormen voor de personen die er rechtstreeks
pathogenen
mee in contact komen. Er is een mogelijk risico voor verspreiding in de
gemeenschap. Er bestaat meestal een profylaxis of een efficiënte
behandeling
(micro-)organismen die bij dieren een ernstige ziekte of een epizoötie
Dierpathogenen
kunnen veroozaken. Er kan een belangrijke overdracht tussen verschillende species optreden. Bepaalde van deze pathogene agentia vereisen
het instellen van sanitaire reglementeringen voor de door de overheid
van elk land in kwestie geïnventariseerde species. Er bestaan meestal
medische en/of sanitaire profylaxen.
(micro-)organismen die bij planten een ziekte kunnen veroorzaken die
Fytopathogenen
effect heeft op de economie of op het leefmilieu en waarvoor
Indeling in risicoklassen en risico-analyse
9
Groep 4
Humane
pathogenen
Dierpathogenen
Fytopathogene
quarantaineorganismen
een behandeling ofwel zeer duur uitvalt, ofwel moeilijk toe te passen
is, ofwel zelfs niet bestaat. Accidentele verspreiding van deze (micro-)
organismen kan het risico op lokale epidimieën doen toenemen.
Exotische stammen van fytopathogene (micro-)organismen die
gewoonlijk voorkomen in het Belgische leefmilieu en niet opgenomen werden in de lijst van quarantaineorganismen maken eveneens
deel uit van deze risicogroep.
(micro-)organismen die bij de mens een ernstige ziekte kunnen
verwekken en een ernstig gevaar vormen voor de personen die er
rechtstreeks mee in contact komen. Er is een verhoogd risico voor
verspreiding in de gemeenschap. Er bestaat meestal geen profylaxis
of geen efficiënte behandeling.
(micro-)organismen die bij dieren een uiterst ernstige panzoötie of
epizoötie kunnen veroorzaken met een erg hoog sterftecijfer of met
dramatische economische gevolgen voor de getroffen teeltstreken.
Ofwel beschikt men niet over medische profylaxis, ofwel is één exclusieve sanitaire profylaxis mogelijk of verplicht
Schadelijke (micro-)organismen waarvan het gebruik is onderworpen
aan de maatregelen van federale besluiten inzake de bestrijding van
voor planten en plantaardige producten schadelijke organismen.
Belgische definities van de verschillende risicogroepen. De meeste
definities zijn afgeleid van de WHO classificatie van infectieuze
micro-organismen.
Naast de indeling van een pathogeen in een risicogroep is het altijd van belang te vermelden welke gastheer het pathogeen heeft. Infectieziekten zijn namelijk een wisselwerking
tussen pathogeen en gastheer. Bepaalde pathogenen hebben een breed gastheerbereik,
andere kunnen slechts één of enkele gastheren infecteren. Ook kan de biologische risicoklasse van een bepaald pathogeen dat zowel de mens als het dier kan infecteren, per gastheer verschillen. Zo is voor de mens de biologische risicoklasse van Herpes virus B klasse 3
en voor het dier klasse 2.
Van de indeling van pathogenen in de biologische risicoklassen zijn lijsten gepubliceerd,
waarin de biologische risicoklasse van de verschillende organismen kan worden opgezocht.
In België zijn de volgende lijsten relevant:
• hoofdstuk 5.51. aan Vlarem II (http://www.biosafety.be), en
• bijlage 1 aan het Koninklijk Besluit van 4 augustus 1996 betreffende de bescherming
van de werknemers tegen de risico’s bij blootstelling aan biologische agentia op het
werk (alleen humaan pathogenen; Belgisch Staatsblad 01/10/1996).
In bijlage 3 is de biologische risicogroep weergegeven van enkele relevante pathogenen.
Opportunistische pathogenen zijn organismen die alleen een ziekte kunnen veroorzaken in
mensen of dieren waarvan het immuunsysteem onvoldoende functioneert. Deze organismen worden ingedeeld in groep 1.
10
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
Aan het werken met niet-genetisch gemodificeerde klasse 1 organismen worden in de
wetgeving geen eisen gesteld. Toch is het voor niet-genetisch gemodificeerde klasse 1
micro-organismen en cellen sterk aanbevolen om de basisprincipes van Veilige
Microbiologische Technieken (VMT) te hanteren (zie hst 5). Het werken met klasse 2, 3 en
4 agentia mag alleen in speciaal daarvoor uitgeruste laboratoria.
Genetisch gemodificeerde organismen (GGO’s)
Recombinant-DNA technologie is niet meer uit moderne biologische en biomedische
onderzoekslaboratoria weg te denken. Escherichia coli K12 is daarbij het werkpaard onder
de laboratoriumorganismen en wordt door bijna iedereen gebruikt als middel om DNA te
kloneren of tot expressie te brengen.
Definitie van een GGO
GGO’s zijn organismen waarvan het genetisch materiaal is gewijzigd op een
wijze die niet mogelijk is door voortplanting of natuurlijke recombinatie.
Technieken die leiden tot de vorming van een GGO zijn in ieder geval:
* recombinant DNA- en RNA- technieken waarbij gebruik wordt gemaakt
van gastheer/vectorsystemen;
* technieken waarbij genetisch materiaal dat buiten het organisme is
geprepareerd, rechtstreeks in een organisme wordt gebracht, daaronder
begrepen micro-injectie, macro-injectie en micro-encapsulatie;
* celfusie- of hybridisatietechnieken waarbij levende cellen met nieuwe
combinaties van genetisch materiaal worden gevormd die van nature niet
voorkomen.
De volgende technieken worden niet geacht te leiden tot genetische modificatie, op de voorwaarde dat bij de technieken geen gebruik gemaakt
wordt van recombinant DNA moleculen of GGO’s:
* in vitro bevruchting;
* conjugatie, transductie, virale infectie, transformatie
* polyploïde-inductie.
Uitzonderingen op de regels
De volgende GGO’s zijn uitgezonderd van de regelgeving en vallen ook niet onder de
richtlijnen in dit boekje op voorwaarde dat daarbij geen andere recombinant-nucleïnezuurmoleculen of GGO’s worden gebruikt dan die welke geproduceerd zijn door middel
van één of meer van de hieronder genoemde technieken:
* Mutagenese.
* Celfusie (met inbegrip van protoplastfusie) van prokaryotische soorten die genetisch
materiaal uitwisselen door middel van bekende fysiologische processen.
* Celfusie (met inbegrip van protoplastfusie) van cellen van eukaryotische soorten, met
inbegrip van de productie van hybridoma’s en de fusie van plantencellen.
Indeling in risicoklassen en risico-analyse
11
* Zelfklonering, dat wil zeggen het verwijderen van nucleïnezuursequenties uit een cel
van een organisme, al dan niet gevolgd door de reïnsertie van dit nucleïnezuur of een
deel daarvan (of een synthetisch equivalent) – eventueel na een aantal voorafgaande
enzymatische of mechanische bewerkingen – in cellen van dezelfde soort of cellen van
een fylogenetisch nauw verwante soort waarmee eerstgenoemde soort genetisch materiaal kan uitwisselen door middel van bekende fysiologische processen, voorzover het
onwaarschijnlijk mag worden geacht dat het resulterende micro-organisme een ziekte
kan verwekken bij mens, dier of plant. Bij zelfklonering mag gebruik worden gemaakt
van recombinante vectoren waarvan het gebruik in combinatie met de betrokken microorganismen in de loop der tijd veilig is gebleken.
Recombinant-DNA GGO’s
Inmiddels kan een groot aantal organismen genetisch gemodificeerd worden, bijvoorbeeld: bacteriën, gisten, schimmels, insecten (fruitvlieg), parasieten, nematoden, planten,
kikkers of zoogdieren (muizen, ratten, konijnen, geiten, schapen, varkens, runderen).
Bij genetische modificatie zijn altijd de volgende componenten betrokken:
1. Een gastheer (het te modificeren organisme);
N.B. De term ‘gastheer’ heeft hier een andere betekenis dan in de context van pathogenen (zie
verklarende woordenlijst)
2. Een donorsequentie (of insert), afkomstig uit een bepaald organisme (het donororganisme). Ook wordt steeds vaker gewerkt met een synthetisch vervaardigde sequentie. Deze
sequentie kan ofwel van nature in een bepaald organisme voorkomen, ofwel volledig
nieuw zijn.
3. En in veel, maar niet alle gevallen een (genetische) vector.
Voor transformatie van bacteriën worden meestal plasmiden als vector gebruikt. In
andere gevallen worden virussen of virale vectoren gebruikt. Voorbeelden van gevallen
waarin geen genetische vector wordt gebruikt zijn de micro-injectie van DNA in de pronucleus van een bevruchte eicel, of de modificatie van een plant met behulp van het
genenkanon. Afhankelijk van het gebruikte systeem zal een vector al dan niet aanwezig
blijven in het uiteindelijke GGO.
De risico-analyse
GGO’s zijn (net als niet-GGO’s) noch intrinsiek gevaarlijk, noch intrinsiek veilig. Daarom
wordt per geval een risico-analyse uitgevoerd. De risico-analyse is een drietrapsproces
waarin achtereenvolgens:
1. De eigenschappen van de gastheer, vector en donorsequenties die gevaar met zich
meebrengen zoals pathogeniteit, toxiciteit, mogelijkheden tot verspreiding van het
organisme en overdracht van genetisch materiaal worden geïdentificeerd. Dit leidt tot
een eerste identificatie van het niveau van risico.
2. Vervolgens wordt vastgesteld welke maatregelen nodig zijn om het organisme veilig te
kunnen hanteren. Daarbij wordt rekening gehouden met:
12
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
*
*
*
3.
De eigenschappen van het milieu dat aan het GGO zou kunnen worden blootgesteld.
Het type en de schaal van de activiteit.
Eventuele niet-standaard handelingen.
Aan de hand van de uitkomst van de stappen 1 en 2 wordt dan de risicoklasse vastgesteld.
Net als bij pathogenen worden GGO’s ingedeeld in vier risicoklassen, en wel als volgt:
Risicoklasse 1 GGO’s die geen of een verwaarloosbaar risico inhouden
Risicoklasse 2 GGO’s die weinig risico inhouden
Risicoklasse 3 GGO’s die een matig risico
inhouden
Risicoklasse 4 GGO’s die veel risico inhouden
Activiteiten waarvoor inperkingsniveau 1
voldoende is om zowel de mens als het milieu
te beschermen
Activiteiten waarvoor inperkingsniveau 2
voldoende is om zowel de mens als het milieu
te beschermen
Activiteiten waarvoor inperkingsniveau 3
voldoende is om zowel de mens als het milieu
te beschermen
Activiteiten waarvoor inperkingsniveau 4 voldoende is om zowel de mens als het milieu
te beschermen
De risicoklassen bepaald door de Europese richtlijn 98/81/EG betreffende het ingeperkt
gebruik van genetisch gemodificeerde micro-organismen.
Er is inmiddels al heel wat ervaring met de risico-analyse van GGO’s. Dit heeft geleid tot
richtlijnen voor het indelen van GGO’s. Deze richtlijnen zijn weergegeven in bijlage 2. Ze
zijn niet wettelijk bindend, maar het volgen van deze richtlijnen en de hierboven weergegeven principes voor de risico-analyse vergemakkelijken de implementatie van de wettelijke vereisten. Afhankelijk van het type en de schaal van de activiteit dient nog nagegaan te
worden of er bijzondere aanvullende maatregelen nodig zijn of dat er maatregelen van het
basisinperkingsniveau achterwege kunnen blijven. De vier inperkingsniveaus voor laboratoria, proefdierverblijven en serres zijn beschreven in bijlage 1.
Hieronder wordt een vergelijking gemaakt tussen de indeling van pathogenen en GGO’s in
risicoklassen en de bijbehorende basisinperkingsniveaus.
Klasse
Risicoklasse 1
Pathogenen
Niet-pathogenen
GGO’s
Geen of verwaarloosbaar risico
Risicoklasse 2
Risicoklasse 3
Risicoklasse 4
Zwak pathogenen
Matig pathogenen
Zware pathogenen
Weinig risico
Matig risico
Veel risico
Basisinperking
Niveau 1 voor GGO’s, VMT voor
niet-gemodificeerde
micro-organismen of cellen*
Niveau 2
Niveau 3
Niveau 4
* N.B.: niveau 1 omschrijft vereisten voor zowel de infrastructuur als werkvoorschriften, ook al zijn
de eisen aan de infrastructuur zeer beperkt. VMT (Veilige Microbiologische Technieken) omschrijft
alleen een werkwijze.
Indeling in risicoklassen en risico-analyse
13
4. DE VERSPREIDING VAN
ORGANISMEN IN
HET LABORATORIUM
Natuurlijke besmettingswegen
Pathogenen hebben elk hun eigen besmettingsweg via welke ze van het ene naar het
andere organisme overgedragen worden. Hieronder volgen enkele belangrijke besmettingswegen:
Besmettingsweg
Huidcontact
Via de lucht of via aërosolen
Prikken (insecten, injectienaalden)
Bloed-bloed contact
Via wonden
Via faecaal materiaal
voorbeeld
schimmels
mazelenvirus
griepvirus
malariaparasiet
gele koorts parasiet
HIV-virus
hepatitis B virus
Staphylococcen
Typhus bacteriën
Poliovirus
Al deze besmettingswegen kunnen, afhankelijk van het type werk dat gedaan wordt, in
het laboratorium voorkomen. Bij organismen die zich via de lucht kunnen verspreiden,
spelen kleine druppeltjes of druppelkernen een rol, maar kan verspreiding ook plaatsvinden via direct contact met bijvoorbeeld de handen, zakdoeken en kleren.
contact
druppeltjes
druppelkernen
druppels
contact
stof
secundaire reservoirs
zakdoeken
kleren
beddegoed
contact
Figuur 2: Verspreiding van micro-organismen via de lucht
14
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
Verspreidingswegen
Blootstelling van laboratoriummedewerkers aan organismen kan op verschillende manieren
gebeuren. In principe kan elke open bron van organismen (bijv. een geopende petrischaal)
een bron van verspreiding van deze organismen zijn. Nu zal een houder in de praktijk
alleen geopend worden wanneer er geen besmetting van het materiaal in de houder kan
plaatsvinden, dus bij een vlam, of in een veiligheidskabinet. De praktijk laat zien dat van
de meeste laboratoriuminfecties de oorzaak onbekend is. In de gevallen dat de oorzaak
wel bekend is gaat het om prikaccidenten, morsen, kapot glaswerk, met de mond pipetteren en om het bijten of krabben door een proefdier.
Aërosolen
Binnen de verschillende verspreidingswegen verdienen aërosolen bijzondere aandacht.
Aërosolen zijn zeer fijne vloeistofdruppeltjes die zich via de lucht kunnen verspreiden.
Aërosolen ontstaan bijvoorbeeld bij het openen van flesjes met vloeistoffen waarop een
natte stop zit, of bij vortexen, blenden, bij het leegblazen van een pipet of het uitgloeien
van een natte entnaald. Aërosolvorming moet zoveel mogelijk worden vermeden. Bij werk
met organismen die een bepaald gevaar inhouden (vanaf risicoklasse 2) moeten aërosolproducerende werkzaamheden zoveel mogelijk in een veiligheidskabinet worden uitgevoerd.
Gieten van vloeistof
Vallende druppels
Uitblazen van pipetten
Openen van vochtige stoppen
Centrifugeren
van open buizen
te warme entogen
Figuur 3: aërosolproducerende handelingen
Ongewenste verspreiding
van organismen of van genetisch materiaal
Zoals hierboven duidelijk mag zijn geworden betekent de verspreiding van voor de mens
gevaarlijke organismen een risico voor de medewerker (uzelf of uw collega’s). Wanneer
verspreiding naar een medewerker mogelijk is, is ook verspreiding naar het milieu niet uitgesloten. Verspreiding van organismen of van genetisch materiaal naar het milieu toe is
De verspreiding van organismen in het laboratorium
15
vaak ongewenst omdat dit een risico met zich mee kan brengen in de zin van verspreiding
van pathogeniteit, toxiciteit of verstoring van een ecologisch evenwicht. Dit geldt zeker
voor de pathogenen en de GGO’s die in de risicoklassen 2, 3 en 4 thuishoren. Voor de
organismen (en hun genetisch materiaal) die thuishoren in risicoklasse 1 - zij brengen
geen of een verwaarloosbaar risico met zich mee - geldt ook dat de verspreiding van het
organisme of van genetisch materiaal naar het milieu toe moet worden beperkt.
Bacteriën, gisten, schimmels
Bacteriën zijn in veel gevallen in staat genetisch materiaal over te dragen. Zeker wanneer
gewerkt wordt met vectoren die zelfoverdraagbaar zijn. Om te voorkomen dat genetisch
materiaal makkelijk wordt overgedragen wordt daarom in de praktijk in de meeste gevallen
gewerkt met vectoren die moeilijk of helemaal niet mobiliseerbaar zijn.
The plasmid
contains
genes that
code for the
sex piliproteins
sex pili
chromosome
Single stand DNA is
transferred through
the pilus to
the receiver
Figuur 4: Overdracht van een zelfoverdraagbaar plasmide door middel van conjugatie
Zelfoverdraagbaarheid
Natuurlijke plasmiden uit bacteriën bezitten soms de eigenschap om
zichzelf over te kunnen dragen naar verwante bacteriën. Dit betekent dat
zij de genen dragen die zorgen voor de aanmaak van de structuren (‘pilli’)
waarmee de ene bacterie een verbinding legt met de andere bacterie.
Het plasmide wordt dan door dit kanaal overgedragen. De frequentie van
overdracht van zelfoverdraagbare plasmiden ligt ook relatief hoog (10-3 tot
10-5).
Dierlijke en menselijke cellen
Dierlijke en menselijke cellen kunnen zich niet zomaar naar het milieu verspreiden. Nietbesmette cellen kunnen ook geen genetisch materiaal ongewenst naar het milieu overdragen. Dierlijke en menselijke cellen zijn ten dode opgeschreven wanneer zij aan een niet-
16
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
steriele omgeving worden blootgesteld. Een uitzondering wordt gevormd door cellen die
van nature in een niet-steriele omgeving moeten overleven, zoals bijvoorbeeld vissen- of
kikkereicellen. In het geval van niet-besmette cellen zijn de maatregelen die getroffen
worden om de celkweek te beschermen ook voldoende om het milieu te beschermen. De
overdracht van genetisch materiaal vanuit dierlijke en menselijke cellen naar de omgeving
kan alleen wanneer de cellen besmet zijn met biologische agentia - bijv. virussen - die in
staat zijn het genetisch materiaal te mobiliseren. De vraag of cellen al dan niet geïnfecteerd zijn is uit oogpunt van bioveiligheid belangrijk. Eventueel aanwezige virussen kunnen een gevaar vormen voor de medewerker of het milieu en maatregelen dienen daarop
afgestemd te zijn.
‘Besmette’ dierlijke cellen en menselijke cellen
Bij activiteiten met dierlijke cellen kan onderscheid gemaakt worden tussen
primaire celculturen en ‘established cell lines’. Primaire celculturen worden
gemaakt door een biopt van een dier of mens in cultuur te brengen. Vaak kan
van dergelijke cellen niet op voorhand uitgesloten worden dat ze besmet zijn
met een ziekteverwekker, bijv. een virus. Daarom dient met primaire cellen
altijd enige voorzichtigheid te worden betracht. Established cell lines zijn culturen die al langer in kweek zijn en die geïmmortaliseerd zijn zodat ze oneindig blijven delen. Meestal is gekend of ze vrij zijn van ongewenste besmettingen. De immortalisatie van dergelijke cellen kan op verschillende manieren tot
stand zijn gekomen:
• spontaan (zoals bijv. bij NIH-3T3 cellen),
• als gevolg van een natuurlijke virale infectie (bijv. HELA cellen, waarin enkele genen van het HPV virus aanwezig zijn),
• of door de cellen te transfecteren met een factor die immortalisatie tot
gevolg heeft.
Bij het hanteren van viraal geïmmortaliseerde cellijnen in combinatie met vectoren waarin virale componenten aanwezig zijn, moet altijd nagegaan worden
of het mogelijk is dat er viruspartikels gevormd worden. Als dat zo is dient de
cellijn ingeschaald te worden in de risicoklasse van het betreffende virus.
Virussen
Bij virussen kan onderscheid gemaakt worden tussen wild type virussen en virale vectoren
(van virus afgeleide virale constructies). Het gebruik van virussen of virale vectoren impliceert ook altijd het gebruik van gastheercellen. Zonder gastheercellen geen vermenigvuldiging van het virus. In de praktijk komen er drie typen handelingen voor: (1) celkweek om
virus te produceren, (2) het hanteren van virus bevattende supernatanten (voor kwaliteitscontrole, etc…) en (3) het transduceren van een te onderzoeken cellijn, proefdier of plant.
Zeker in de virussupernatanten kan het virus in grote hoeveelheden en geconcentreerd
aanwezig zijn. Voorzichtigheid bij het hanteren van de supernatanten is geboden. Na
infectie van cellen, plant of proefdier hangt het gevaar af van de mogelijkheden van het
virus of de virale vector om zich nog te kunnen vermenigvuldigen. Soms wordt gewerkt
met replicatiedefectief virus, wat betekent dat het virus wel de cellen kan infecteren, maar
De verspreiding van organismen in het laboratorium
17
zich niet meer kan vermenigvuldigen. De verspreidings- en overlevingsmogelijkheden verschillen van virus tot virus. Sommige viruspartikels kunnen via de lucht verspreiden en
kunnen soms buiten de gastheer lang overleven. Andere virussen, zoals bijvoorbeeld HIV,
zijn buiten de gastheer zeer kwetsbaar. Plantenvirussen hebben soms een ‘vector’ nodig
om zich te kunnen verspreiden: vaak een insect die het virus opzuigt en zo de verspreiding
naar andere planten bewerkstelligt.
Transgene planten
Transgene planten worden in-vitro gekweekt, in fytotrons/kweekcellen en in serres en ze
lopen niet zomaar weg. Toch verdient de ongewenste verspreiding naar het milieu bijzondere aandacht. Zonder de juiste maatregelen kunnen pollen (stuifmeel) zich via de lucht of
met behulp van insecten naar het milieu verspreiden. Of dit een reëel risico vormt hangt af
van de vraag of de plant een zelfbevruchter is of een kruisbevruchter. Bij een strikte zelfbevruchter blijft de verspreiding van pollen immers zonder effect. In het geval van een
kruisbevruchter is van belang na te gaan of er bloeiende verwante planten in het milieu
voorkomen waarmee de plant zou kunnen hybridiseren (kruisbevruchten). Daarnaast kunnen zaden van transgene planten zich soms gemakkelijk ongewenst verspreiden. Zaden
kunnen heel fijn of kleverig zijn en worden dan gemakkelijk meegenomen door een
onderzoeker die een kweekcel of serre verlaat.
pollen
zaad
stengelbasis
Figuur 5: de reproductieve delen van Brassica
Niet alleen pollen en zaden kunnen aanleiding geven tot de ongewenste verspreiding van
genetisch materiaal van planten. Ook bepaalde plantendelen kunnen soms, afhankelijk van
de plant, nog gemakkelijk uitgroeien tot een hele plant. Zo kan een takje van een wilg
nog uitgroeien tot een hele boom en kan de stronk van kool nog wortel schieten. Dit
betekent dat bij het hanteren van transgene planten of transgeen plantenmateriaal speciale aandacht moet worden besteed aan de mogelijke verspreiding van de delen van de plant
die (nog) reproductief zijn. Indien er een reële kans bestaat dat de plant zich in het milieu
kan vestigen of indien uitkruising naar (bloeiende) verwanten mogelijk is, dient reproductief plantenmateriaal eerst gedood te worden voordat het als afval wordt afgevoerd.
18
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
De verspreiding van transgene planten of transgeen plantenmateriaal
Pollen
Zaden
Zandraket
In een serre is Arabidopsis een
zelfbevruchter. De kans dat verspreiding van pollen een effect
heeft is uitermate klein
Tabak
Zelfbevruchter. De kans dat verspreiding van pollen een effect
heeft is uitermate klein.
Zelfbevruchter. De kans dat verspreiding van pollen een effect
heeft is uitermate klein.
Insectbestuiver / zelfbevruchter.
Bestuivende insecten moeten
worden geweerd.
Zelfbevruchter. De kans dat verspreiding van pollen een effect
heeft is uitermate klein.
Insectbestuiver / zelfbevruchter.
Bestuivende insecten moeten
worden geweerd.
Windbestuiver. De verspreiding van
stuifmeel vanuit een serre is ononwaarschijnlijk, zeker als ramen
voorzien zijn van insectengaas.
Zelfbevruchter. De kans dat verspreiding van pollen een effect
heeft is uitermate klein.
De zaden zijn erg klein. Bij aanra- Alleen pollen en zaden.
king springen de hauwen open en
worden de zaden de lucht in geschoten. Speciale ‘aracons’ of andere
gelijkwaardige middelen zijn nodig
om de verspreiding tegen te gaan.
Geen speciale opmerkingen
Alleen pollen en zaden.
Rijst
Tomaat
Aardappel
Brassica
Maïs
Tarwe
Reproductieve delen
Geen speciale opmerkingen
Alleen pollen en zaden.
Geen speciale opmerkingen
Alleen pollen en zaden.
Geen speciale opmerkingen
De verspreiding van knollen
moet ook worden tegengegaan.
Geen speciale opmerkingen
De verspreiding van wortels
en stronken moet ook worden
tegengegaan.
Alleen pollen en zaden.
Geen speciale opmerkingen
Geen speciale opmerkingen
De verspreiding van wortels en
stronken moet ook worden
tegengegaan.
Transgene dieren
Bij transgene dieren moet voorkomen worden dat de dieren zich ongewenst verspreiden.
Afhankelijk van het dier is dit gemakkelijk of soms moeilijker te voorkomen. Kleine knaagdieren zoals de muis dienen in degelijke kooien gehuisvest te worden en de dierverblijven
dienen zo ontworpen te zijn dat ontsnapping niet zomaar mogelijk is. Bij toepassing van
een genetisch gemodificeerd micro-organisme of een wildtype pathogeen in een dier dient
per geval bepaald te worden op welke wijze het micro-organisme of het pathogeen zich
zou kunnen verspreiden vanuit het proefdier en dienen de inperkende maatregelen daarop
afgestemd te worden. Het kan dan soms nodig zijn de dieren in individueel geventileerde
kooien te huisvesten en al het materiaal dat in aanraking is geweest met de dieren te ontsmetten. Bij gebruik van cellen of ander biologisch materiaal in dieren dient bijzondere
aandacht besteed te worden aan de mogelijke aanwezigheid van pathogene virussen in dit
materiaal. Sommige cellijnen zijn besmet met virussen. Zijn dergelijke virussen aanwezig,
dan dienen de inperkende maatregelen aangepast te worden indien de mogelijkheid
bestaat dat het virus zich verspreidt.
De verspreiding van organismen in het laboratorium
19
5. INPERKING: EEN COMBINATIE
VAN INFRASTRUCTUUR EN
WERKVOORSCHRIFTEN
Aan de vier risicoklassen voor activiteiten met pathogene of genetisch gemodificeerde
organismen zijn vier basisinperkingsniveaus gekoppeld. Inperking van de gevaren wordt
bereikt door de toepassing van een combinatie van maatregelen van infrastructuur en het
hanteren van speciale werkvoorschriften.
Inperking van gevaren
=
Infrastructuur + werkvoorschriften
Wanden, deuren, veiligheidskabinet,
werkoppervlakken, etc…
Niet eten, drinken of roken,
handen wassen, etc…
Elke trede in de inperkingsniveaus (bijv. van niveau 1 naar 2, of van 2 naar 3) voegt een
aantal eisen toe aan de eisen aan infrastructuur en werkvoorschriften van het voorgaande
niveau. Niet alleen voor laboratoria zijn deze inperkingsniveaus gedefinieerd, ook voor
serres, proefdierverblijven en grootschalige procesinstallaties zijn de verschillende niveaus
van inperking uitgeschreven. Een overzicht van de eisen aan de inperkingsniveaus van
laboratoria, serres en proefdierverblijven zijn te vinden in de bijlagen aan dit boekje.
De eisen voor procesinstallaties zijn op te vragen bij de bioveligheidsverantwoordelijke en
terug te vinden op www.biosafety.be.
ventilation
sink
laboratory coat
closed
door
desinfection
of benches
Figuur 6: inperking in een laboratorium
20
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
Inperking aan de bron
Zoals bij elke activiteit die een risico kan inhouden, dient een risico zoveel mogelijk bij de
bron te worden aangepakt. Dit betekent onder meer dat wanneer hetzelfde bereikt kan
worden met een organisme, gastheer of vector die minder risico’s met zich mee brengt, dit
altijd de voorkeur heeft. Om inperking aan de bron te realiseren moet de onderzoeker
indien mogelijk:
• een ingeperkte laboratoriumstam nemen in plaats van een wild type stam;
• een niet- mobiliseerbare vector gebruiken in plaats van een
zelfoverdraagbare;
• een replicatiedefectief virus of virale vector gebruiken in plaats van een
replicatiecompetent virus.
Fysische inperking
Bij fysische inperking gaat het om alle fysieke maatregelen die genomen worden om een
organisme van de buitenwereld af te schermen (en omgekeerd). Dit begint met de houder
waarin het organisme zich bevindt maar daarnaast gaat het om een laboratoriumconstructie met een vloer, wanden en een plafond, en deuren en ramen die dicht kunnen. Ook
gaat het om werkoppervlakken die geschikt zijn voor het werken met de betreffende
pathogenen of GGO’s. Om te kunnen werken met micro-organismen moeten de werkoppervlakken glad zijn afgewerkt en goed ontsmet kunnen worden. Een wasbak moet
aanwezig zijn om na de werkzaamheden de handen te kunnen wassen. Voor de hogere
inperkingsniveaus 2, 3 en 4 worden er afhankelijk van het risico van de activiteit fysieke
maatregelen toegevoegd aan het basisniveau zoals bijvoorbeeld:
• veiligheidskabinet (klasse I, II of III)
• onderdruk in het lokaal
• een sas (sluis)
• een douche
• HEPA-filtering van de afgevoerde lucht
• speciale bekers en apparatuur om de verspreiding van aërosolen tegen te gaan
• gasdichtheid van het lokaal om het met een gas te kunnen ontsmetten
• etc…
Een overzicht van de fysische inperkingseisen is opgenomen in de bijlage 1.
Veiligheidskabinetten
Een veiligheidskabinet is een belangrijke vorm van fysische inperking. In feite wordt hiermee een veilige werkplaats in een laboratorium gecreëerd. Veiligheidskabinetten zijn in
eerste instantie ontworpen met het oog op de bescherming van de medewerker en in
tweede instantie met het oog op de bescherming van het milieu. Er wordt een onderscheid gemaakt in drie klassen: I, II en III. Een klasse I veiligheidskabinet is een afzuigkast,
waarbij de afgezogen lucht over een HEPA-filter wordt geleid. Dit kabinet geeft alleen
bescherming aan de medewerker, maar niet aan het experiment.
Inperking: een combinatie van infrastructuur en werkvoorschriften
21
A
B
C
D
front opening
sash
exhaust HEPA
exhaust plenum
Room air
Contaminated air
HEPA-filtered air
Figuur 7: Veiligheidskabinet klasse I
Klasse II
Een veiligheidskabinet van klasse II (een ‘downflow’kast) beschermt zowel de medewerker,
het experiment, als het leefmilieu. Deze kasten hebben een neerwaartse laminaire luchtstroom. Van dit type kabinet bestaan er heel veel verschillende uitvoeringen.
A
B
C
D
E
F
front opening
sash
exhaust HEPA filter
rear plenum
supply HEPA filter
blower
Room air
Contaminated air
HEPA-filtered air
Figuur 8: Veiligheidskabinet klasse II
De goede werking van een klasse II veiligheidskabinet
De bescherming die een veiligheidskabinet van klasse II aan de medewerker, het experiment en het milieu geeft, staat of valt met de goede werking van het kabinet. Hiervoor is
het noodzakelijk dat de luchtstromen in het kabinet zo min mogelijk verstoord worden.
Dit betekent het volgende:
22
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
Richtlijnen voor het correct gebruik van een veiligheidskabinet van klasse II
1.
Bereid een experiment terdege voor en verzamel alle benodigde spullen
vooraleer te starten;
2.
Laat het kabinet 10 minuten draaien vooraleer met het experiment
te starten;
3.
Ontsmet het werkoppervlak en de luchtaanzuigroosters met een
desinfectans (bijvoorbeeld 70% alcohol);
4.
Zet alleen de noodzakelijke spullen in het kabinet;
5.
Zet nooit materialen op de luchtaanzuigroosters aan weerszijden van het
werkoppervlak;
6.
Werk van links naar rechts of omgekeerd, maar zorg in ieder geval voor
een ‘schone’ kant en een ‘vuile’ kant (met kleine houder voor biologisch
besmet afval zoals pipetpunten);
7.
Maak rustige, beheerste bewegingen om de luchtstromen zo min mogelijk
te verstoren;
8.
Werk diep genoeg in het kabinet, niet er half buiten;
9.
Werk nooit met een bunzenbrander, omdat deze de luchtstroom te veel
verstoort, maar gebruik wegwerp-entnaalden voor het overenten.
10. Ontsmet na het experiment de materialen (aan de buitenzijde) voordat
deze uit het kabinet worden verwijderd;
11. Ontsmet het werkoppervlak en de luchtaanzuigroosters;
12. Laat het kabinet na het experiment nog minimaal 5 minuten in werking.
13. Sluit de opening van het kabinet af.
Inperking: een combinatie van infrastructuur en werkvoorschriften
23
Klasse III
Een veiligheidskabinet van klasse III geeft een optimale bescherming aan zowel medewerker als milieu, maar geeft een iets minder goede bescherming aan het experiment
vanwege het ontbreken van de neerwaartse luchtstroom in het kabinet. De klasse III kast
is volledig afgesloten en manipulaties in het kabinet geschieden via afgesloten rubber
manchetten. Materiaal wordt in de kast gebracht via doorgeefautoclaaf of een kleine
goederensas.
A
B
C
D
E
Room air
Contaminated air
glove ports with O-ring
for attaching armlenght gloves to cabinet
sash
exhaust HEPA filter
supply HEPA filter
double-ended autoclave
or pass-through box
HEPA-filtered air
Figuur 9: Veiligheidskabinet klasse III
veiligheidskabinet
Klasse I
Klasse II
Klasse III
medewerker
goed
goed
uitstekend
Bescherming
milieu
goed
goed
uitstekend
experiment
slecht
goed
goed
Horizontale laminaire flowkasten en crossflowkasten
In laboratoria waar met dierlijke cellen of met in-vitro plantenkweek wordt gewerkt, wordt
veel gebruik gemaakt van horizontale laminaire flow- en crossflowkasten. Dit zijn kasten
waarin een steriele luchtstroom horizontaal of verticaal de kast in wordt geblazen maar
waar de ‘vuile’ lucht de laboratoriumruimte in wordt geblazen. Dit betekent dat de medewerker in de luchtstroom zit. Dergelijke kasten geven dus geen enkele bescherming aan de
medewerker en ook niet aan het milieu. Het zijn dus geen ‘veiligheidskabinetten’ en het
gebruik ervan moet in de meeste gevallen afgeraden worden. Dergelijke kasten kunnen
niet gebruikt worden voor werk dat een risico voor de medewerker of voor het milieu
inhoudt. Het gebruik van dergelijke kasten is uitzonderlijk toegestaan zolang er niet
gewerkt wordt met open bronnen van GGO’s of met pathogenen, zoals bijvoorbeeld open
petrischalen met gemodificeerde of pathogene bacteriën of geopende erlenmeyers met
bacteriekweken.
24
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
Room air
Contaminated air
HEPA-filtered air
Figuur 10:
laminaire
flowkast
A
B
C
D
front opening
sash
supply HEPA filter
blower
horizonale
laminaire flowkast
HEPA filters
HEPA staat voor ‘High Efficiency Particulate Air’ filter. Dit is een filter
waarin een matrix vele keren opgevouwen zit zodat een heel groot oppervlak teruggebracht wordt tot een relatief klein volume. Een HEPA filter kan
met zeer grote efficiëntie deeltjes afvangen: slechts maximaal 0.03% van
de deeltjes met een doorsnee van 0.3 micrometer mogen door het filter
passeren. De eigenschappen van de filter zijn zodanig dat zowel de deeltjes
die groter zijn als de deeltjes die kleiner zijn dan 0.3 micrometer, met een
grotere efficiëntie worden afgevangen.
De werkzaamheid van HEPA filters
De HEPA filters in veiligheidskabinetten dienen jaarlijks door specialisten
gecontroleerd te worden op hun werkzaamheid, en zonodig vervangen.
Werkvoorschriften
Fysieke maatregelen alleen zijn niet voldoende om een veilige werksituatie te creëren. Het
gaat juist om de combinatie met een speciale werkwijze. Dit betekent dat voor elk niveau
ook specifieke werkvoorschriften zijn uitgeschreven.
Basiswerkvoorschriften: Veilige Microbiologische Technieken
Voor het basisinperkingsniveau vormen de werkvoorschriften de belangrijkste bijdrage aan
de inperking. Deze basisvoorschriften vormen de principes van “Veilige Microbiologische
Technieken” (VMT). Iedereen die in een laboratorium met micro-organismen en cellen
werkt moet deze voorschriften tot de dagelijkse routine maken.
Inperking: een combinatie van infrastructuur en werkvoorschriften
25
Veilige Microbiologische Technieken:
1. Deuren en ramen zijn gesloten tijdens de werkzaamheden.
2.
Tijdens het werk wordt een laboratoriumjas gedragen.
3.
Eten, drinken, roken en de opslag van eet- en drinkwaren in het
laboratorium zijn verboden.
4.
Draag geen sieraden of horloges en houdt de handen schoon en
de nagels kort.
5.
Na het morsen van GGO’s wordt direct ontsmet.
• Neem vloeistoffen op met tissues of papier en gooi dit in de bak voor
biologisch afval.
• Ontsmet met 70% alcohol het oppervlak waarop gemorst is. Alternatieven
zijn detol of decontamine. Gebruik hiervoor een tissue of papier.
• Was de handen na afloop.
6.
Het ontstaan en verspreiden van aërosolen wordt geminimaliseerd.
• Centrifugeer alleen met dichte buizen.
• Voorkom dat doppen van buizen nat zijn.
• Gloei natte entnaalden op de juiste manier uit; d.w.z. eerst de steel en
dan pas het entoog.
• Laat entnaalden eerst afkoelen voor ze weer in cultuurvloeistof te steken.
• Druk pipetten niet met kracht leeg, maar laat ze leeglopen.
• Giet vloeistoffen geleidelijk (en nooit van grote hoogte) uit.
7.
Met de mond pipetteren is verboden.
• Gebruik altijd een pipetteerballon of een mechanische pipet.
• Voor kleine hoeveelheden wordt een mechanische micropipet gebruikt.
8.
Gebruikte materialen worden ontsmet voordat ze worden gewassen of
hergebruikt.
• Dit kan door ze te autoclaveren of door ze in gevalideerde
ontsmettende vloeistof te dompelen.
9.
Biologisch afval wordt geïnactiveerd.
• Deponeer hiertoe het afval in de verzamelbak voor biologisch afval. Dit
moet worden afgevoerd naar de autoclaaf of naar een verbrandingsoven die geschikt is voor de verbranding van ziekenhuisafval.
10. De handen worden gewassen voordat het laboratorium wordt verlaten.
• Gebruik hierbij desinfecterende zeep.
26
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
Naast het hanteren van deze basiswerkvoorschriften zijn ook belangrijk:
1. Het bijhouden van een gedetailleerd labjournaal, waarin per dag beschreven wordt met
welk biologisch materiaal u heeft gewerkt en welke handelingen u heeft verricht;
2. Het controleren van het biologisch materiaal waarmee gewerkt wordt. Wanneer materiaal van collega-onderzoekers wordt verkregen dient eerst gecontroleerd te worden dat
het inderdaad om het bedoelde materiaal gaat (stamcontrole, controle (van restrictiepatronen) van vectoren), en bovendien dienen ook de eigen stammen regelmatig
gecontroleerd te worden. Een alternatief is om regelmatig vanuit een schone stock te
werken of stammen regelmatig opnieuw in te kopen.
Elk eenvoudig laboratorium waarin de VMT-werkwijze wordt toegepast, voldoet aan het
inperkingsniveau 1. Het laboratorium hoeft niet meer dan de simpele basisvoorzieningen
te hebben als een vloer, wanden, plafond, glad afgewerkte, goed te reinigen werkoppervlakken en een wasbak. Voor de inperkingsniveaus 2, 3 en 4 worden aan de basisvoorschriften eisen toegevoegd zoals bijvoorbeeld:
•
•
•
•
•
Tijdens de uitvoering van de werkzaamheden worden handschoenen gedragen.
Toegang tot de werkruimte is voorbehouden aan bevoegden.
Er is een controleprogramma voor insecten en knaagdieren.
Inactivering van de effluenten van wasbakken en douches.
Specifieke maatregelen om de vorming van aërosolen tegen te gaan, bijvoorbeeld het
uitvoeren van mogelijks aërosolproducerende handelingen in een veiligheidskabinet.
• Ontsmetting van kleren vooraleer men de inperkingszone verlaat.
• etc…
Een overzicht van de eisen aan de inperkingsniveaus 1 t/m 4 is gegeven in de bijlage 1.
Het gebruik van handschoenen
Er bestaan veel misverstanden over het gebruik van handschoenen en in veel gevallen
geven handschoenen een vals gevoel van veiligheid. Voor risicoklasse 1 activiteiten is het
gebruik van handschoenen niet vereist. De toepassing van de Veilige Microbiologische
Technieken is voldoende om veilig te werken. Zelf voor risicoklasse 2 activiteiten zijn
handschoenen geen standaardvereiste. Handschoenen moeten wel gebruikt worden in het
geval dat huidcontact met het biologisch materiaal een gevaar betekent, of wanneer prikof snijaccidenten kunnen gebeuren, bijvoorbeeld wanneer gewerkt wordt met scalpels of
injectienaalden in combinatie met biologisch risicovol materiaal. Handschoenen worden
ook vaak gebruikt om de besmetting van onderzoeksmateriaal met micro-organismen,
DNA of RNA dat op je handen zit te voorkomen. Je moet echter niet vergeten dat dit
materiaal net zo goed op de handschoenen kan zitten, vooral als ze gedurende langere
tijd worden gedragen en wanneer ze in contact zijn geweest met allerlei materiaal.
Inperking: een combinatie van infrastructuur en werkvoorschriften
27
Dus als handschoenen worden gebruikt moet altijd rekening worden gehouden met het
volgende:
• draag handschoenen alleen wanneer het echt nodig is, dus enkel wanneer er een reëel
gevaar bestaat dat jij of het experiment besmet raken.
• Draag de handschoenen alleen wanneer je daadwerkelijk het experiment uitvoert, en
niet wanneer je allerlei ander materiaal hanteert zoals gesloten houders, of wanneer je
in je labjournaal schrijft.
• Als je handschoenen draagt, vervang ze dan regelmatig.
Beperkte toegang
Vanaf risicoklasse 2 geldt voor de toegang tot het laboratorium een wettelijke beperking.
Deze houdt in dat alleen het personeel toegang heeft tot het laboratorium dat voldoet
aan specifieke toegangsvereisten. Om te voorkomen dat niet-toegelaten personeel toch in
dat laboratorium kan geraken, dient de deur op slot te zijn als er niet in het laboratorium
wordt gewerkt. En dat geldt zeker voor klasse 3 en 4 activiteiten.
Personeel zou enkel de toelating mogen verkrijgen om klasse 2, 3 en 4 laboratoria binnen
te gaan, wanneer zij voldoende kennis hebben van veilige werkpraktijken en wanneer zij
alle specifieke veiligheidsprocedures voor het betreffende laboratorium kennen en weten
hoe deze in de praktijk toe te passen. Er moet altijd een up-to-date register of lijst zijn
van de mensen die toegang hebben tot het laboratorium.
Om de onopgemerkte toegang tot klasse 2, maar vooral ook klasse 3 en 4 laboratoria te
verhinderen verdient het aanbeveling deze laboratoria niet dicht bij de in- of uitgang van
een verdieping of gebouw te plaatsen.
28
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
6. BESMETTING, ACCIDENTEN,
ONTSMETTING
EN INACTIVATIE
Een besmetting is gauw gebeurd. Er kan gemorst worden bij het overgieten van vloeistof
of er kunnen een paar druppels wegspatten. Het is zaak een besmetting direct ongedaan
te maken. Ook andere ongelukjes zoals het stukvallen van een glazen houder, een prikaccident met een naald of een snijwond van een mes of scalpel zitten in een klein hoekje.
Bij elke besmetting of elk ongeluk is blootstelling aan het organisme het gevolg. Dit is niet
meteen een direct gevaar wanneer het om onschadelijke organismen gaat. Toch dient ook
dan een besmetting opgeruimd te worden. Gebeurt dit niet, dan betekent dit dat resten
van micro-organismen zich in het laboratorium ophopen en zo een potentiële bron van
besmetting vormen voor het werk van anderen.
Er kan echter ook sprake zijn van ongelukjes met organismen die ofwel direct voor de mede-werker (alle humane pathogenen), ofwel voor het leefmilieu (GGO’s en pathogenen van
risicoklasse 2, 3 en 4) een risico inhouden. Dan is het zeker zaak gemorst materiaal snel op te ruimen en oppervlakken te ontsmetten. Het morsen op niet-intacte huid of het morsen van bijvoorbeeld pathogeen-virusconcentraat op de intacte blote huid mag niet onopgemerkt voorbijgaan.
Voorkoming
Het is zaak om ongelukjes zoveel mogelijk te voorkomen. Dit kan alleen door voorzichtig
en doordacht te werken. Experimenten dienen zorgvuldig van tevoren te worden gepland,
materialen van tevoren verzameld en na afloop dient alles weer te worden opgeruimd.
Slordigheid is de belangrijkste oorzaak van ongelukjes. Scalpels niet rond laten slingeren,
maar opbergen in een veilige houder. Op injectiespuiten de naalden niet herkappen, maar
de naalden deponeren in een speciaal daarvoor voorziene container.
Melding
Het is zaak om accidenten waarbij medewerkers aan gevaarlijke menselijke pathogenen zijn
blootgesteld te melden. En niet alleen wanneer het bloed eruit spuit. Ook wanneer er een
kleine kans op besmetting is geweest, of wanneer er twijfels zijn over de karakterisatie van
het materiaal (denk aan niet-getest humaan bloed) moet een melding gedaan worden. De
verantwoordelijke personen voor de bioveiligheid en/of de interne dienst voor preventie en
bescherming en indien nodig ook de arbeidsgeneesheer en de verzekeringsdienst (in verband
met de eventuele terugbetaling van dure geneesmiddelen) dienen op de hoogte te worden
gesteld. Na het ongeluk dienen meteen passende maatregelen te worden genomen. Antivirale
geneesmiddelen moeten bijvoorbeeld waar nodig kort na de besmetting worden ingenomen.
Besmetting, accidenten, ontsmetting en inactivatie
29
Handelen na prik- of snijaccident
Bij een prik- of snijaccident, of een spat in het oog of op de mucose met materiaal dat
infectieus is voor de mens moet het volgende worden gedaan:
1. De wonde laten bloeden.
2. Uitwassen.
3. Ontsmetten.
4. Eventuele verdere verzorging.
5. Noteren in het EHBO register.
Afhankelijk van het type agens waaraan men is blootgesteld dienen eventueel aanvullende
maatregelen te worden genomen. Bij opname van ongekarakteriseerd menselijk bloed
dient bijvoorbeeld bepaald te worden of er besmetting geweest is met Hepatitis B,
Hepatitis C of HIV en moet bepaald worden hoe dit te bestrijden.
Ontsmetting van werkoppervlakken en dergelijke
Voor de ontsmetting van materialen en werkoppervlakken zijn verschillende middelen
beschikbaar die elk hun eigen werkingsmechanisme hebben. Globaal bekeken zijn er twee
algemene werkingsmechanismen:
(1) door de lipide membraan van het micro-organisme aan te tasten met als gevolg dat de
celinhoud vrij komt;
(2) door eiwitten en enzymen noodzakelijk voor de overleving van het micro-organisme
aan te tasten.
Ethanol, quaternaire ammoniumzouten, en oppervlakte-actieve stoffen (zoals detergenten
en zepen) hanteren de eerste werkingsmethode. Sterk oxiderende stoffen zoals chloor of
waterstofperoxide hanteren de tweede methode. Phenolen zoals lysol werken door zowel
eiwitten als de lipide membraan te vernietigen.
Wat meer informatie over een aantal specifieke ontsmettingsmiddelen:
• Alcohol
Alcoholen zijn effectief tegen vegetatieve bacteria, schimmels en virussen met een lipide
membraan, maar niet tegen sporen. De werkzaamheid tegen non-lipide virussen is sterk
variabel. Het moet als een 70% oplossing gebruikt worden. Mengsels met andere agentia zijn effectiever dan alcohol alleen, bijvoorbeeld 70% alcohol met 100g formaldehyde
per liter of alcohol met 2g/liter chlorine. N.B.: de ontaarde alcohol die in laboratoria
wordt gebruikt is giftig. Ook alcoholoplossingen vergaan en daarom dienen ze minimaal
één keer per maand ververst te worden.
• Natrium hypochloriet (bleekwater)
Het vrijkomende chlorine werkt sterk oxiderend en is effectief tegen alle typen van
micro-organismen. Natrium hypochloriet moet toegepast worden in een concentratie
30
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
van 20 ml/l tot 100ml/l afhankelijk van de vraag of het gaat om ‘vuile condities’
(vb. een 1 op 10 oplossing van bleekwater). Oplossingen met chlorine vergaan snel.
Om er zeker van te zijn dat ze goed werken dienen de oplossingen één keer per week
ververst te worden.
• Formaldehyde
Formaldehyde is een gas dat werkzaam is tegen alle micro-organismen, mits gebruikt bij
een temperatuur hoger dan 20°C en een luchtvochtigheid van ten minste 70%. Het is
geschikt voor het ontsmetten van vloeistoffen en voor de decontaminatie van veiligheidskabinetten of van hele ruimten via verneveling. N.B.: formaldehyde is een vermoed
carcinogeen. Bovendien is het irriterend en mag het niet worden ingeademd.
Formaldehyde wordt alleen in uitzonderlijke gevallen gebruikt wanneer een lokaal of
een veiligheidskabinet in zijn geheel ontsmet moet worden, bijvoorbeeld een luchtdicht
L3 laboratorium waar een besmetting heeft plaatsgevonden of een luchtdicht proefdierverblijf waar gevaarlijke micro-organismen op de vloeren en wanden kunnen zitten.
Ontsmetting met formaldehyde is een tijdrovende en gevaarlijke onderneming die alleen
door specialisten veilig kan worden uitgevoerd. Overleg met de preventiedienst is daarom aangewezen alvorens op te starten.
• Waterstofperoxide
Net als hypochloriet werkt dit tegen alle typen van micro-organismen vanwege zijn oxiderende werking. Het wordt gebruikt als een oplossing van 6%. Het is niet geschikt voor
gebruik op aluminium, koper, zink of brons.
• Moderne breedspectrum ontsmettingsmiddelen
Er zijn vandaag veel verschillende moderne breedspectrum ontsmettingsmiddelen op de
markt. De meeste bevatten een combinatie van stoffen met verschillende werkingsmechanismen tegen micro-organismen. Ze kunnen oxiderende stoffen bevatten, quaternaire ammoniumzouten, oppervlakte-actieve en andere stoffen. Deze middelen kunnen
voor ontsmetting gebruikt worden op voorwaarde dat ze gevalideerd zijn voor de microorganismen waarmee je werkt. Raadpleeg niet alleen de gebruiksaanwijzing van deze
middelen, maar controleer ook welke werkzame stoffen in welke concentratie aanwezig
zijn, en welke werkingsmechanismen vertegenwoordigd zijn in het middel.
Ontsmetting, zeker als het gaat om de ontsmetting van oppervlakken, geschiedt nooit
voor de volle 100%. Ontsmetting leidt slechts tot een sterke reductie van het aantal
kiemen (bij goede ontsmetting van een bacteriële besmetting om en nabij de 90%, virale
besmetting is meestal beter te verwijderen). Ook is het zo dat bij het gebruik van ontsmettingsmiddelen de lijken van de micro-organismen en het vuil vaak achterblijven. Daarom is
het van belang dat bij de (wekelijkse) schoonmaak van de ruimten de werkoppervlakken,
vloeren en deurknoppen worden afgenomen met warm water en zeep. Twee keer ontsmetten leidt dus eigenlijk pas tot een echt goede ontsmetting.
Besmetting, accidenten, ontsmetting en inactivatie
31
De werkzaamheid van verschillende ontsmettingsmiddelen
schimmels bacteriën
Alcohol
Hypochloriet
Formaldehyde
Peroxide
* boven de 40 °C
+
+++
+
+++
+++
+++
+++
mycobacteria
sporen
+++
++
+++
++
++
+++*
++
lipide
virussen
+
+
+
+
non-lipide
virussen
V
+
+
+
V = variabel
Inactivatie
De doding van biologisch materiaal is vaak niet eenvoudig. Bacteriesporen zijn bijvoorbeeld resistent tegen temperaturen van 100°C. Autoclaveren is dan aangewezen: verhitting
van water onder druk bij 121°C gedurende 20 minuten. Soms worden ook temperaturen
van 134°C gehanteerd. De doding van micro-organismen is zeer goed, op de voorwaarde
dat de hete stoom overal goed bij kan. Luchtzakken zijn een bekend probleem. Dierlijke
cellen zijn soms in staat in een luchtzak de autoclavering levend te doorstaan. Het beladen van een autoclaaf dient daarom zorgvuldig te gebeuren en deksels dienen losgedraaid
te worden. Autoclavering is de aangewezen methode om bacteriën, gisten en schimmels te
doden. Voor andere organismen zoals cellen van planten en dieren en soms ook van virussen zijn eenvoudiger alternatieven beschikbaar. Verhitting tot 80°C of de blootstelling aan
een zeepoplossing zijn vaak voldoende om de cellen te doden. Het is van belang om na te
gaan of de toe te passen methode een gevalideerde methode is: dat wil zeggen dat nagegaan moet worden dat de doding effectief is. Inactivatie geeft een veel betere doding dan
ontsmetting: een juist uitgevoerde inactivatie geeft een doding van 100%.
Vaak wordt voor de doding van vloeistoffen met bacteriën gebruik gemaakt van Natrium
hypochloriet. Daarbij moet opgelet worden dat de finale concentratie chlorine in de oplossing voldoende is om de bacteriën te doden (20-100ml/l). Opgemerkt moet worden dat
autoclavering nog altijd een veel milieuvriendelijker methode van inactivatie is. De vloeistoffen met chloor worden in de praktijk (te) vaak door de gootsteen gegooid. Er mogen
in principe geen stoffen in het bedrijfsafvalwater terechtkomen die de werking van een
afvalwaterzuiveringsstation negatief zouden kunnen beïnvloeden.
Voor een goede doding van micro-organismen is ook belangrijk dat het ontsmettingsmiddel voldoende lang in contact is met de micro-organismen. Over het algemeen geldt dat
een blootstelling van 15 tot 30 minuten vereist is.
32
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
De aangewezen ontsmetting en inactivatiemethode voor enkele relevante organismen
E.coli
Lactobacillus
Salmonella
Aspergillus
Adenovirus
Influenzavirus
HIV
Vaccinia
Ontsmetting
1%
2%
NaOCI
glutaraldehyd
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
70%
ethanol
x
x
x
x
x
Inactivatie
Formal- natte hitte droge hitte Verhitdehyd 121 °C, 20’ 160 °C, 60’ ting
60 °C
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x, 30’
x, 30’
x
x**
* geldt alleen voor kleine volumina serum
** alleen voor heat-labile antigen vaccinia
Biologisch afval
Biologisch afval moet afgevoerd worden. Een belangrijk onderscheid moet gemaakt
worden tussen biologisch afval dat geïnactiveerd is voordat het wordt afgevoerd en biologisch afval dat niet geïnactiveerd is voordat het wordt afgevoerd. Deze laatste categorie
moet als risicohoudend medisch afval worden beschouwd en afgevoerd worden naar een
vuilverbrandingsinstallatie die geschikt is voor de verbranding van risicohoudend medisch
afval.
Onder biologisch afval wordt verstaan:
Wel:
• alle genetisch gewijzigd en/of pathogeen biologisch materiaal: celculturen, culturen van
micro-organismen, weefsel, bloed….
• typisch labo-afval van organische aard: gels………
• alle mogelijks biologisch besmet materiaal: handschoenen, doekjes of papier, wegwerp
kweekrecipiënten, pipetten, ….
• en alle zaken die niet noodzakelijk besmet zijn, maar die niet in een gewone vuilzak
mogen worden geworpen omdat ze scherp zijn, of er vies uitzien (beenderen, bloed,…)
Niet:
• radio-actief besmet afval (dit dient apart te worden afgevoerd).
Hoe met biologisch afval om te gaan
Er kan een onderscheid gemaakt worden tussen vast (en pasteus) en vloeibaar biologisch
afval. Afhankelijk van de vragen of het afval geïnactiveerd is en/of chemisch verontreinigd,
wordt het biologisch afval op de volgende manier ingedeeld:
Besmetting, accidenten, ontsmetting en inactivatie
33
Soort afval
Vast/pasteus
Vast/pasteus
Vast/pasteus
Vloeibaar
Vloeibaar
Vloeibaar
Geïnactiveerd Chemisch verontreinigd
+
+
+
+ of +
+
+
+ of -
Bestemming
=> restafval
=> chemisch afval
=> risicohoudend medisch afval
=> bedrijfsafvalwater
=> chemisch afval
=> risicohoudend medisch afval
Risicohoudend medisch afval (RMA) wordt verzameld in speciale gele containers die
geschikt zijn voor het transport van dit afval. Eenmaal gesloten, kunnen deze containers
niet meer geopend worden. Ze zijn bovendien zo stevig dat het vallen van hoogtes geen
probleem vormt. Deze speciale RMA containers moeten op regelmatige basis door een
erkende vervoerder afgevoerd worden naar een vuilverbrandingsoven die geschikt is voor
de verbranding van ziekenhuisafval. De volgende richtlijnen gelden voor de tijdelijke
opslag van de containers, voor afvoer naar de vuilverbranding:
- maximaal 2 maanden, bij een maximale temperatuur van 4 °C;
- maximaal 2 weken, bij een maximale temperatuur van 20 °C
- maximaal 1 week, indien de temperatuur van de opslagruimte boven de 20 °C uit kan komen.
Biologisch afval afkomstig uit proefdierverblijven
Het afval afkomstig uit proefdierverblijven behoort tot dezelfde categorieën als hierboven aangegeven. Transgene laboratoriumdieren zoals ratten en muizen moeten worden gedood en in
een RMA container worden afgevoerd naar de vuilverbranding. Het beddingmateriaal en de uitwerpselen van deze transgene dieren hoeven niet als GGO-afval te worden beschouwd. Dit kan
afgevoerd worden als restafval of GFT, zonder het vantevoren te inactiveren. Het wordt echter
anders wanneer het gaat om materiaal van dieren die behandeld zijn met genetisch gemodificeerde en/of pathogene micro-organismen. De gebruikte micro-organismen kunnen dan het
beddingmateriaal en de uitwerpselen besmetten. Voor de met micro-organismen behandelde
dieren geldt hetzelfde als voor de transgene dieren: ze moeten worden gedood en als RMA
worden afgevoerd. Al het beddingmateriaal en de uitwerpselen moeten verzameld worden en
geïnactiveerd. Dit kan ofwel in-huis worden gedaan, of het materiaal wordt verzameld in RMA
containers en afgevoerd naar de vuilverbranding.
Afval van planten
Er moet ook voorzichtig worden omgegaan met afval van transgene planten. Alle bloemen
(die stuifmeel bevatten), zaden, en – afhankelijk van de plantensoort – de reproductieve delen
(zie hst 4 van dit boekje) moeten worden verzameld en geïnactiveerd.
Er zijn verschillende mogelijkheden om dit materiaal te doden: sterilisatie is de meest rigoreuze
methode, maar ook eenvoudiger methoden kunnen soms volstaan, zoals het verhakselen van
materiaal. Ook stomen is voor plantaardig materiaal en voor grond die in contact is gekomen
met transgeen plantenmateriaal, een uiterst geschikte methode van inactivatie.
Al het niet-reproductief materiaal kan worden gecomposteerd (nat of droog) en kan na de
compostering worden afgevoerd als restafval of tuinafval.
Wanneer planten zijn geïnfecteerd of behandeld met genetisch gemodificeerde en/of pathogene micro-organismen dan moeten ze als geheel worden geïnactiveerd, zowel als de grond en
ander materiaal dat mogelijks besmet is.
34
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
7. WERKEN MET ENKELE
VEELGEBRUIKTE
LABORATORIUMORGANISMEN
Werken met genetisch gemodificeerde
Escherichia coli en met fagen
Inschaling
Genetisch gemodificeerde E.coli K12, B en C stammen en alle fagen kunnen onder L1
omstandigheden (zie bijlage 1) gehanteerd worden op de voorwaarde dat:
• de gebruikte vectoren niet zelfoverdraagbaar zijn
• de gekloneerde genen geen schadelijke genproducten aanmaken (bijv. een toxine), of
niet tot expressie komen
Deze K12, B en C stammen zijn geattenueerde (verzwakte) laboratoriumstammen die ten
opzichte van de wildtype E.coli stammen biologisch ingeperkt zijn en niet langer pathogeen zijn. Hieronder zijn enkele inschalingen gegeven, waarbij ter illustratie is aangegeven
volgens welke inschalingsregel uit bijlage 2 deze inschaling tot stand is gekomen. Omdat
deze inschalingen uitgaan van onschadelijke inserts is uit bijlage 2 het subartikel steeds e
of j (afhankelijk van de vraag of het insert al gekarakteriseerd is). Het spreekt voor zich dat
het insert sterk medebepalend is voor de inschaling. Dit betekent dat in het geval met
inserts gewerkt wordt die niet-onschadelijk zijn, bijvoorbeeld wanneer het insert codeert
voor de productie van een toxine, een ander subartikel van toepassing wordt en dan gaat
de inschaling minimaal één trede omhoog.
* uitgaande van onschadelijke inserts, schadelijke inserts verhogen de risicoklasse
Stam
vectoren
Behorend tot
E. coli K12,
B of C
Behorend tot
E. coli K12,
B of C
Overige E. coli
stammen
Niet-zelfoverdraagbare L1
vectoren (tra-)
zelfoverdraagbare
vectoren (tra+)
inschaling*
Inschalingsregel**
1.e of j
L2
2.e of j
Niet-zelfoverdraagbare L2
vectoren (tra-)
3.e of j
Opmerkingen
bijna alle gebruikte
coli systemen vallen
hieronder
een voorbeeld is
sommige miniTn5
systemen
er moet vanuit worden
gegaan dat deze
stammen nog
pathogeen zijn
** het gaat hierbij om de uit de schema’s in bijlage 2 van toepassing zijnde inschalingsregel
Werken met enkele veelgebruikte laboratoriumorganismen
35
Laboratoriumvoorzieningen
In veel gevallen wordt met E.coli K12, B of C stammen gewerkt in combinatie met nietzelfoverdraagbare vectoren en dan is een eenvoudig L1 laboratorium met basisvoorzieningen voldoende. Vanzelfsprekend moeten de werkoppervlakken goed ontsmet kunnen worden. Open handelingen met E. coli kunnen op een bench gebeuren, mits de vorming van
aërosolen geminimaliseerd wordt (zie VMT voorschriften). Enten en dergelijke kunnen bij
een vlam. Een alternatief voor het werken met open bronnen op de bench is om deze
handelingen in een veiligheidskabinet uit te voeren. De voorschriften van Veilige
Microbiologische Technieken dienen te worden nageleefd.
Afval
Alle vaste materialen (voedingsbodems) en alle vloeistoffen die gemodificeerde coli’s
bevatten en alle met coli’s besmette materialen dienen geïnactiveerd of ontsmet te
worden. Er mag geen levende coli in het huishoudelijk afval terechtkomen. Zorg daarom
voor afvalbakken die duidelijk gemarkeerd zijn voor biologisch afval. Vloeistoffen dienen
geautoclaveerd te worden voordat ze door de gootsteen verdwijnen. Een alternatief is
inactivatie met hypochloriet, maar dit is een minder milieuvriendelijk alternatief. Een uitzondering op deze regel zijn E.coli K12 stammen die een vector dragen die niet mobiliseerbaar (mob-) en goed gekarakteriseerd is, een gen dragen dat goed gekarakteriseerd is
(herkomst, grootte, genproduct, functie, etc…) en bovendien een genproduct aanmaken
dat volstrekt onschadelijk is. In dat geval is inactivering niet nodig. Dit behoort echter tot
de uitzonderingsgevallen die in een researchsetting nauwelijks voorkomen. Bovendien is
een expliciete en specifieke toelating vereist die bevestigt dat inactivatie niet nodig is.
Bijzonderheden
Met enige regelmaat (2x per jaar) dienen de gebruikte stammen gecontroleerd te worden
(stamcontrole). Een alternatief is om regelmatig opnieuw te starten vanuit een schone cultuurstock.
Een praktisch voorbeeld
Om de bepaling van de risicoklasse en de inperkingsmaatregelen te illustreren en tevens
aan te geven hoe dit boekje kan worden gebruikt worden hieronder enkele concrete praktijkvoorbeelden van risico-inschattingen uitgewerkt.
Een voorbeeld van de bepaling van de inschaling in de praktijk
1. De klonering van een chymosine-gen in pUC18 met E. coli stam JM109 als gastheer,
waarbij alleen kleinschalige standaardlaboratoriumhandelingen zullen worden uitgevoerd
Stap 1: Is de combinatie van gastheer en vector geschikt voor risicoklasse 1? Daarvoor moet
eerst nagegaan worden of de gebruikte E.coli stam geschikt is voor risicoklasse 1. Alle E. coli
36
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
K12, B of C-stammen zijn geschikt voor risicoklasse 1 en dus is het voldoende om in catalogi,
bij de leveranciers, of in stammendatabases (bijv. ATCC of DSMZ) na te gaan of JM109 tot deze
stammen behoort. Het antwoord is in dit geval: ja, JM109 is een E.coli K12.
Daarna moet nagegaan worden of de vector geschikt is voor risicoklasse 1. PUC18 is een goed
gekarakteriseerde vector zonder schadelijke eigenschappen die bovendien niet-zelfoverdraagbaar is. De vector is geschikt voor risicoklasse 1. (Een gedetailleerde beschrijving van de eisen
aan vectoren is te vinden in bijlage 2 aan deze brochure, in hst A. Ook is daar te vinden wat
´goed gekarakteriseerd´ inhoudt).
De gastheer-vector combinatie zijn dus geschikt voor risicoklasse 1.
Stap 2: Nu kan in bijlage 2 het bijbehorende inschalingsartikel worden opgezocht. In dit geval
is uit hst A van bijlage 2, in de ‘eerste richting’ de categorie 1 van toepassing (gastheer-vectorsysteem voldoen immers aan de criteria voor indeling in risicoklasse 1). Maar voor de inschaling dient eerst nog het risico van het insert ingeschat te worden.
Stap 3: In dit geval wordt gewerkt met een stukje erfelijk materiaal uit rund dat verantwoordelijk is voor de productie van chymosine, een eiwit dat zorgt voor de stremming van kaas. Het is
in dit geval goed gekarakteriseerd, is geen toxine, heeft niets te maken met virussen of met
pathogeniteit, en is ook niet op een andere wijze schadelijk. Dus is uit hst A van bijlage 2, in de
‘tweede richting’, categorie j van toepassing, hetgeen een eerste identificatie van het inschalingsniveau oplevert: L1
Stap 4: Zijn er nog bijzonderheden in verband met: (1) het milieu dat zou kunnen worden
blootgesteld, (2) het type en de schaal van de activiteit, en (3) eventuele niet-standaard handelingen. In dit geval worden er bijvoorbeeld alleen kleinschalige, reguliere handelingen gedaan
zoals: transformatie, kleinschalige kweek in erlenmeyers, centrifugatie, eiwitisolatie, gelelectroforese. Een activiteit wordt pas als grootschalig gezien als het gaat om grote kweekvolumes in
een productiefaciliteit. Toch vereisen ook kleine fermentoren vaak bijzondere aandacht als het
gaat om afdichting en fysische inperking van de down-stream processing.
Er zijn in dit geval geen bijzondere handelingen die ofwel een extra risico met zich meebrengen ofwel een bijzondere vorm van additionele inperking vereisen. De finale inschaling komt
daarom neer op het hanteren van de standaard L1-voorschriften. Hierover kan het volgende
in dit boekje worden teruggevonden:
• L1-inperkingseisen: bijlage 1 van dit boekje
• Gedetailleerde VMT-basisvoorschriften: hst 5 van dit boekje
• Hoe te ontsmetten en te inactiveren: hst 6 van dit boekje
Een mogelijke variatie op dit voorbeeld:
1a. De klonering van het chymosine gen in een zelfoverdraagbaar plasmide in E. coli JM109
en het aanbrengen van de gemodificeerde bacteriën op een kunststof matrix waarbij niet
vermeden kan worden dat aërosolen ontstaan.
In dit geval verandert de inhoud van stap 2: de vector voldoet niet aan de eisen voor risicoklasse 1. Dit betekent dat van hst A, bijlage 2, in de ‘eerste richting’ nu categorie 2 van toepassing
wordt. Het genproduct is nog steeds goed gekend en niet schadelijk, dus blijft in de ‘tweede
richting’ j van toepassing, wat een L2 inschaling oplevert.
Er wordt bovendien een bijzondere aërosolproducerende handeling uitgevoerd. Hiervoor is een
additionele inperkende maatregel nodig, bovenop de standaard L2 voorschriften: er moet een
veiligheidskabinet van klasse II aanwezig zijn waarin de aërosolproducerende handeling wordt
uitgevoerd. Finaal wordt de inschaling dus L2 mét gebruik van veiligheidskabinet klasse II.
Hierover kan het volgende in dit boekje worden teruggevonden:
Werken met enkele veelgebruikte laboratoriumorganismen
37
• L2-inperkingseisen: bijlage 1 van dit boekje
• Beschrijving hoe te handelen in een veiligheidskabinet: hst 5 van dit boekje
• Hoe te ontsmetten en te inactiveren: hst 6 van dit boekje
Zijn er gevallen aan te wijzen waarin er bijzondere aandacht nodig is voor eventueel extra
te nemen maatregelen? Hieronder volgen enkele voorbeelden:
1. Het ontstaan en de verspreiding van aërosolen kan niet worden geminimaliseerd (dit is het
voorbeeld hierboven beschreven onder 1a). Het gebruik van een veiligheidskabinet van klasse
II is dan al gauw noodzakelijk.
2. GGO´s of pathogenen worden in een niet-destructieve meting gedurende langere tijd open
en bloot gehanteerd. Als de organismen gevaarlijk zijn, dient nagegaan te worden of ze zich
zouden kunnen verspreiden. Zo ja, dan dienen in veel gevallen de ruimte en de medewerker
extra beschermd te zijn (bijv. onderdruk en HEPA-filtering op afgevoerde lucht en/of handschoenen en gelaatsbescherming).
3. GGO´s of pathogenen worden in fermentoren gehanteerd en in een downstream-proces
opgezuiverd. Sommige fermentoren zijn dichter dan andere en dit geldt zeker ook voor
downstream-procesapparatuur. Bij organismen van klasse 2 en hoger dient er bijvoorbeeld
ook een hydrofoob absoluut filter of een HEPA-filter aanwezig te zijn op de fermentorgasafvoer.
4. GGO´s of pathogenen worden in of op een plant of proefdier gebracht. Er dient per geval zorgvuldig te worden nagegaan of verspreiding naar het milieu van het GGO of het pathogen moet
worden tegengegaan. De maatregelen hangen sterk af van plant tot plant en van dier tot dier.
Vaak bepaalt de toedieningswijze of en hoe een micro-organisme zich kan verspreiden.
Wat te doen bij twijfel over de inschaling of eventueel toe te passen maatregelen?
In achtereenvolgende stappen, indien de voorgaande stap geen uitsluitsel heeft gegeven:
1. Zoek eventueel ontbrekende informatie op om een betere inschatting te kunnen maken.
2. Raadpleeg uw hiërarchische overste.
3. Raadpleeg uw groepsleider.
4. Win eventueel advies in bij interne experts op het terrein van bioveiligheid (zie bijlage 5 van
dit boekje), of win anders eventueel extern advies in bij de sectie bioveiligheid en biotechnologie van het WIV (http://www.biosafety.be).
Werken met niet-pathogene genetisch gemodificeerde gisten
Inschaling
Niet-pathogene genetisch gemodificeerde gisten zoals Saccharomyces cerevisiae,
Schizo-saccharomyces pombe en Pichia pastoris kunnen allemaal onder L1 condities
gehanteerd worden op voorwaarde dat er geen genen in zijn gekloneerd die gevaarlijke
producten aanmaken. De in laboratoria gebruikte stammen van gist zijn allemaal op de
één of andere wijze deficiënt en hebben een speciaal voedingsmedium nodig waaraan een
bepaalde essentiële stof is toegevoegd. Vaak gaat het om aminozuurdeficiënties.
38
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
Laboratoriumvoorzieningen
Dezelfde standaard laboratoriumvoorzieningen als voor E.coli zijn voldoende. Het verdient
echter aanbeveling open handelingen met gisten uit te voeren in een veiligheidskabinet.
Gisten kunnen gedurende lange tijd in de lucht overleven en kunnen op deze wijze allerlei
kweken besmetten. Daarnaast is er bij gesensibiliseerde mensen kans op een allergische
reactie na blootstelling aan gist of zijn sporen. Daarom wordt gistwerk vaak in een apart
lokaal gedaan.
Afval
Op dezelfde manier als voor E. coli dient alle afval dat genetisch gemodificeerde gisten
bevat geïnactiveerd of ontsmet te worden.
Bijzonderheden
Ook hier geldt dat bij het kloneren van een gen dat codeert voor een schadelijk genproduct zoals een toxine, de risicoklasse omhoog gaat en dat alle bijbehorende maatregelen
moeten worden opgetrokken naar dat niveau.
Werken met genetisch gemodificeerde cellijnen
Inschaling
De inschaling van dierlijke of menselijke cellijnen is niet eenvoudig. De bepalende factor is
of de cellen schadelijke biologische agentia kunnen produceren, en dan met name virussen. Ten eerste dient een onderscheid te worden gemaakt tussen primaire cellen en ‘established cell lines’. De minimum inschaling van primaire cellen is L2. Bij established cell
lines moet vastgesteld worden of ze eventueel een virus zouden kunnen produceren.
Daarbij moet rekening gehouden worden met virale sequenties die in de vector aanwezig
zijn. Enkele voorbeelden:
Cellijn
Virale
sequenties
in cellijn
Vector (dient
slechts als
voorbeeld)
Inschaling*
Inschalingsregel**
Opmerking
Primaire
muizencellijn
onbekend
niet relevant
L2
-
NIH-3T3
geen
SV40ori vector
L1
4, e of j
HELA
E6E7 genen SV40ori vector
uit HPV
L1
4, e of j
Inschaling kan pas omlaag als aangetoond
is dat de cellen geen
schadelijke biologische
agentia produceren
kans op vorming
van virus is nul
combinatie virale
sequenties in cellijn
en vector kan geen
virus opleveren
Werken met enkele veelgebruikte laboratoriumorganismen
39
293
E1 en stuk
E4 uit
adenovirus
E1 gedeleteerde
adenovirale
vector
EBV geïm- cellen bevat- niet relevant
mortaliseerde ten compleet
lymfocyten EBV virus
L2
8, e of j
L2
-
recombinatie tussen
sequenties in cellijn
en vector kan replicatie competente
virusdeeltjes geven
de inschaling van de
cellen volgt de inschaling van het
virus dat erin aanwezig is
* uitgaande van onschadelijke inserts, schadelijke inserts verhogen de risicoklasse!
** het gaat hierbij om de uit de schema’s in bijlage 2 van toepassing zijnde inschalingsregel
Laboratoriumvoorzieningen
De benodigde laboratoriumvoorzieningen variëren naargelang de inschaling. Eenvoudige
L1 laboratoria voldoen voor cellen zoals NIH-3T3. In de praktijk is het zo dat voor het
enten en opgroeien van dergelijke cellen goed uitgeruste celkweeklaboratoria worden
gebruikt die qua inrichting veel meer zijn dan een L1 laboratorium. Er is meestal een veiligheidskabinet klasse II aanwezig om bij de open handelingen met de cellen de cellen te
beschermen tegen infecties van buitenaf. In plaats van een veiligheidskabinet klasse II
wordt vaak gebruik gemaakt van een horizontale laminaire flowkast. Een dergelijke kast is
geschikt voor L1 activiteiten met celkweken. Voor cellen die een L2 inschaling vereisen, is
een horizontale laminaire flowkast niet geschikt. In dat geval is alleen een veiligheidskabinet van klasse II geschikt om zowel de medewerker, het milieu en de celkweek te beschermen. De eisen van L2 in vergelijking met die van L1 zijn vooral strenger voor wat betreft
de toegang tot het laboratorium en de uitvoering van werkzaamheden waarbij aërosolen
gevormd kunnen worden.
Afval
Al het biologisch afval van genetisch gemodificeerde cellen dient te worden geïnactiveerd.
Er is echter een onderscheid tussen de celkweken van L1 niveau en die van L2 niveau.
Voor celculturen van L1 niveau is het voldoende om ze bloot te stellen aan een zeepoplossing en vervolgens door de gootsteen te spoelen. Ook besmette materialen kunnen op
deze manier behandeld worden. Voor celculturen op L2 niveau dienen meer rigoureuze
maatregelen te worden genomen om ervan verzekerd te zijn dat ook mogelijke schadelijke
biologische agentia gedood zijn. Autoclaveren is daarvoor de meest aangewezen methode.
Bijzonderheden
Werk nooit met autologe cellen. Zeker wanneer daar groeifactoren of oncogenen in gekloneerd zouden worden bestaat het gevaar dat een besmetting leidt tot ongewenste gevolgen.
De cellen worden immers niet door het immuunsysteem als vreemd herkend.
40
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
Werken met genetisch gemodificeerde virussen of virale vectoren
Inschaling
De indeling van genetisch gemodificeerde virussen in risicoklassen volgt in het algemeen
de biologische risicoklassen van de virussen (zie bijlage 5.51.8 aan Vlarem II, www.biosafety.be), tenzij het insert zorgt voor een verhoging van het risico. In dat geval dient de
inschaling hoger uit te vallen dan de biologische risicoklasse van het virus. Het gebruik van
virussen en virale vectoren kan niet los gezien worden van het gebruik van cellijnen. En dit
betekent dat ook hier gekeken moet worden naar de combinatie van virussequenties in de
vector en in de cellijn. Bij de productie van replicatiedefectieve viruspartikels wordt gebruik
gemaakt van cellijnen die de ontbrekende virale sequenties bezitten die nodig zijn om
viruspartikels gevormd te krijgen. Pas wanneer er in dergelijke systemen geen kans bestaat
op vorming van replicatiecompetente partikels kan de inschaling een trede omlaag.
Packaging Virale sequenties
cellijn
in cellijn
Vector (dient
als voorbeeld)
Inschaling*
Inschalingsregel**
Opmerking
L2
8 e of j
combinatie virale
sequenties in
cellijn en vector
kunnen resulteren i/d
formatie van een
replicatie-competent
virus
kans op vorming van
replicatie competente
virusdeeltjes is nul
293
E1 gen en stuk van E1 gedeleteerde
E4 gen uit
adenovirale
adenovirus
vector
PER.C6
E1 gen van
adenovirus
E1 gedeleteerde L1
adenovirale vector
zonder sequentieoverlap
9 e of j
PA317
gag-pol-env van retrovirale vector L2
amfotroop muizen- zonder gag-polretrovirus
env genen
8 e of j
Y-CRE
gag-pol en env
retrovirale
genen van ecotroop vector zonder
muizen-retrovirus als gag-pol-env
twee gescheiden
genen
constructen
L1
7 e of j
Phoenixampho
E1/E4 van adeno- retrovirale vector L2
virus, largeT van
zonder gag-polSV40, en episomaal env genen
gag-pol en env
genen van amfotroopmuizen
retrovirus
8 e of j
kans op vorming van
RCR’s is klein, maar
niet nul. Er is vaak
nog wat sequentieoverlap
kans op vorming van
RCR’s is kleiner dan
bij PA317 en bovendien is het virus ecotroop dus kan het de
mens niet infecteren
kans op vorming van
RCR’s kleiner dan bij
PA317, maar door
episomale aanwezigheid van gag-pol en
env in meerdere kopieën is de kans op vorming van RCR’s niet nul
* uitgaande van onschadelijke inserts, schadelijke inserts verhogen de risicoklasse!
** het gaat hierbij om de uit de schema’s in bijlage 2 van toepassing zijnde inschalingsregel
Werken met enkele veelgebruikte laboratoriumorganismen
41
Laboratoriumvoorzieningen
Voor het opgroeien van adenovirale of muizenretrovirale partikels, of ze nu replicatiedefectief zijn of niet, is een laboratorium met inperkingsniveau 2 aangewezen. Bovendien is een
veiligheidskabinet van klasse II nodig, een horizontale laminaire flowkast geeft onvoldoende bescherming aan de medewerker en het milieu. Strikte toegangsregels gelden voor de
toegang tot de ruimte.
Afval
Al het vast, vloeibaar en besmet materiaal dient geïnactiveerd of ontsmet te worden voordat het wordt weggegooid of hergebruikt. Autoclaveren is hiervoor de aangewezen
methode, of afvoeren van het materiaal in speciale biohazardafvalcontainers naar een vuilverbranding die geschikt is voor de verbranding van ziekenhuisafval.
Bijzonderheden
Werkzaamheden met de verschillende virale vectoren kunnen niet gelijktijdig in eenzelfde
ruimte, laat staan in eenzelfde veiligheidskabinet worden uitgevoerd. Na beëindiging van
werkzaamheden met een bepaald virus dienen de werkoppervlakken en het veiligheidskabinet te worden opgeruimd en ontsmet voordat het wordt vrijgegeven voor werkzaamheden met een ander virus.
In het bovenstaande wordt uitgegaan van onschadelijke inserts. Bij het gebruik van virale
vectoren, zeker wanneer het gaat om vectoren die hun erfelijk materiaal in het genoom
van de cel inbouwen, moet extra opgepast worden met bijvoorbeeld het gebruik van
dominant cellulaire oncogenen. De inschaling gaat dan een klasse omhoog. Ook genen
voor sommige immuunmodulerende eiwitten kunnen in virale vectoren als schadelijk worden aangemerkt. Een risicoklasse 3 inschaling is in sommige gevallen nodig en daarvoor
gelden strikte inperkingsvoorzieningen en werkvoorschriften die in de praktijk nogal wat
met zich meebrengen.
Er zijn steeds meer systemen voor de productie van virale vectoren waarbij het partikel dat
geproduceerd wordt bestaat uit componenten afkomstig van verschillende virussen. Het
meest bekende voorbeeld is de pseudotypering van retrovirale vectoren met het VSV-G
eiwit. Dergelijke combinaties van virale componenten verdienen bijzondere aandacht.
Gastheerspecificiteit kan veranderen, bijvoorbeeld van niet-infectieus voor de mens naar
wel-infectieus voor de mens. De risicoklasse dient aangepast te worden aan het actuele
risico.
42
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
Werken met genetisch gemodificeerde Agrobacterium
Inschaling
Over het algemeen wordt gewerkt met A. tumefaciens stammen die ‘disarmed’ zijn, dat wil
zeggen dat ze niet langer oncogeen zijn. Ze veroorzaken geen ‘crown galls’ meer. Deze stammen vallen in risicoklasse 1. Dit geldt niet voor wildtype stammen of voor A. rhizogenes.
Stam
vectoren
Inschaling*
Disarmed A.
tumefaciens
stammen
Not disarmed A.
tumefaciens
stammen
A. rhizogenes
Binaire en andere
plant transformatie
vectoren
Binaire en andere
plant transformatie
vectoren
Binaire en andere
plant transformatie
vectoren
L1
L2
L2
Inschalings- Opmerkingen
regel**
1 e of j
de stammen zijn biologisch
ingeperkt ten opzichte van
de wildtype stammen
3 e of j
deze stammen zijn
pathogeen
3 e of j
deze stammen zijn
pathogeen
* uitgaande van onschadelijke inserts
** het gaat hierbij om de uit bijlage 2 van toepassing zijnde inschalingsregel
Laboratoriumvoorzieningen
Standaard L1 laboratoriumvoorzieningen volstaan voor disarmed A. tumefaciens stammen.
Dezelfde regels kunnen gevolgd worden voor E. coli K12. Voor de niet-disarmed tumefaciens of A. rhizogenes stammen volstaat een standaard L2 laboratorium. In geval van L2
werkzaamheden waarbij de vorming van aërosolen niet kan worden vermeden, dient een
veiligheidskabinet klasse II aanwezig te zijn.
Afval
Al het materiaal, vast of vloeibaar, dient ontsmet te worden net als voor E. coli.
Autoclaveren is daarvoor de meest aangewezen methode.
Bijzonderheden
Vaak worden kleine, recent getransformeerde plantjes overgezet op verse media. Deze
plantjes zijn (nog) niet vrij van A. tumefaciens. Meestal wordt dit gedaan in horizontale
laminaire en crossflowkasten. Dit is toegestaan zolang er niet gewerkt wordt met echte
open bronnen van Agrobacterium.
Werken met enkele veelgebruikte laboratoriumorganismen
43
Werken met transgene planten
Bij het werken met transgene planten kunnen de volgende vuistregels gehanteerd worden:
1. Kweek in fytotrons of kweekcellen:
• Kweekcellen moeten dicht zijn en mogen niet direct op de buitenlucht openen.
• Plantenmateriaal moet geautoclaveerd worden voordat het als restafval wordt
afgevoerd (in het geval het nog niet vrij is van genetisch gemodificeerde
Agrobacterium tumefaciens).
• De verspreiding van zaden moet worden tegengegaan en reproductieve delen van
planten moeten geïnactiveerd worden voordat ze als afval worden afgevoerd.
2. Kweek in serres:
• Bij gebruik van bloeiende insectenbestuivers moeten openingen voorzien zijn van
insectengaas en mag de serre niet direct op de buitenlucht openen (er moet een sas
zijn); bij gebruik van bloeiende zelfbevruchters, apomicten of windbestuivers hoeft er
geen insectengaas op de openingen en is een sas niet echt nodig.
• Ook hier geldt dat de verspreiding van zaden tegengegaan moet worden. Zaden
moeten zorgvuldig worden verzameld. Grond die zaden kan bevatten mag pas na
inactivering worden afgevoerd als afval. Reproductieve delen van planten moeten
geïnactiveerd worden voordat ze als afval worden afgevoerd.
44
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
8. REFERENTIES
Begrip voor Veilige Microbiologische Techniek; theoretische inleiding voor de practische
cursus, Commissie ad hoc recombinant-DNA werkzaamheden, 1987
Veilig werken met micro-organismen en cellen in laboratoria en werkruimten; theorie en
praktijk; concept, oktober 1997; Nederlandse Vereniging voor Microbiologie.
Laboratory Biosafety Manual, second edition, WHO, Geneva, 1993
Leidraad voor een Handboek GGO ingeperkt gebruik, BVF-platform, 2001
Richtlijn 90/219/EEG, zoals gewijzigd door richtlijn 98/81/EEG
Vlarem I en II, rubriek 51
Biosafety cabinets, CDC, Atlanta, USA
http://www.biosafety.be
http://www.hc-sc.qc.ca/hpb/lcdc/biosafty/msds/index.html
http://www.ebsa.be
http://www.cdc.gov/od/ohs
Referenties
45
9. VERKLARENDE WOORDENLIJST
Aërosol: minuscule vloeistofdruppeltjes die zich door de lucht kunnen verplaatsen
Amfotroop: in staat om zowel muize- als humane cellen te infecteren
Biologisch agens: in zijn wettelijke definitie betekent dit ziekteverwekker (zie welzijnswetgeving)
Donorsequentie: het stukje erfelijk materiaal dat uit een bepaald organisme – de donor –
wordt overgebracht naar een ander organisme, ook wel insert genaamd. In veel gevallen is
echter geen sprake meer van het overbrengen van een sequentie uit een ‘donor’, maar
wordt een stuk erfelijk materiaal synthetisch aangemaakt
Ecotroop: enkel in staat om muizecellen te infecteren
Gastheer:
(1) in de context van natuurlijke pathogenen betekent gastheer het organisme dat van
nature door de ziekteverwekker wordt geïnfecteerd,
(2) in de context van genetische modificatie betekent gastheer het te modificeren organisme: het organisme waarin het nieuwe stukje erfelijk materiaal wordt ondergebracht.
HEPA: High Efficiency Particulate Air (filter)
Pathogeniteit: ziekteverwekkendheid
Reproductief: in staat uit te groeien tot een zelfstandig functionerend organisme
Toxiciteit: vergiftiging
Transductie: staat in feite gelijk aan virale infectie. Wordt in de praktijk vooral gebruikt
om de infectie van bacteriën door fagen en om de infectie van cellen door een virale vector aan te duiden
Transformatie:
(1) in de context van tumoren betekent transformatie de omvorming van een normale cel
naar een oneindig delende tumorcel,
(2) transformatie wordt in de genetische modificatie ook als algemene term gebruikt om
het proces van genetische modificatie aan te duiden (transformeren is dan gelijk aan
genetisch modificeren).
Vector: letterlijk betekent dit ‘drager’
(1) in het kader van genetische modificatie is dit het plasmide, cosmide, artificial chromosome of ander genetisch element dat de genetische modificatie – het insert – draagt
en binnenbrengt in het te modificeren organisme,
(2) in de context van virale infectie van planten duidt het begrip vector het organisme aan
dat zorgdraagt voor de overdracht van het virus van de ene naar de andere plant. In
sommige gevallen zijn dit bladluizen.
Virale vector: een van een wild-type virus afgeleide virale constructie dat een vreemd
DNA-fragment kan opnemen of in zich heeft en zich ofwel autonoom kan gedragen,
indien hij de sequenties bezit die nodig zijn voor zijn verspreiding van cel tot cel, ofwel
defectief, indien hij één of meer sequenties mist voor zijn verspreiding.
46
Verklarende woordenlijst
BIJLAGE 1: INPERKINGSVEREISTEN
In deze bijlage zijn de wettelijk vereiste Belgische inperkingseisen gegeven voor laboratoria, proefdierverblijven en serres. De vereisten voor ziekenhuiskamers en grootschalige procesapparatuur zijn niet weergegeven, maar kunnen teruggevonden worden op www.biosafety.be. Ook de vereisten voor zogenoemde
quarantaine-organismen zijn niet weergegeven. Wanneer je wilt werken met een pathogeen dat voorkomt op de lijsten van quarantaine-organismen van het FAVV, moet je bij hen navragen welke vereisten
gelden om met deze organismen te mogen werken.
Belgische inperkingseisen voor L1-L4 laboratoria
voor werk met pathogenen en/of genetisch gewijzigde organismen
1. Inrichting en technische vereisten
Maatregelen
Inperkingsniveau
L2
L3
niet vereist
vereist
2
het laboratorium is gescheiden van
andere werkzones in hetzelfde gebouw
of is in een afzonderlijk gebouw gelegen
toegang tot het laboratorium via sas
L1
niet vereist
niet vereist
niet vereist
3
4
5
Vergrendelbare toegangsdeur(en)
zelfsluitende toegangsdeur(en)
vaste ramen
niet vereist
niet vereist
niet vereist
6
luchtdicht lokaal dat decontaminatie
niet vereist
met een gas mogelijk maakt
meubelen zijn dusdanig ontworpen dat
niet vereist
een controleprogramma voor insecten
en knaagdieren vergemakkelijkt wordt
kijkvenster of gelijkwaardig systeem dat
niet vereist
toelaat te zien wie zich in het
lokaal bevindt
was- en decontaminatievoorzieningen vereist (wasbakken)
voor het personeel
1
7
8
9
10 wasbakken met niet-manuele bediening
niet vereist
11 kapstokken of kleedkamer voor
aanbevolen
beschermende kledij
12 toevoerbuizen voor vloeistoffen
niet vereist
voorzien van een terugvloeibeveiliging
13 oppervlakken bestand tegen zuren,
vereist (werktafel)
basen, organische oplosmiddelen,
waterondoordringbaar en gemakkelijk
schoon te maken
14 autonoom electrisch systeem bij panne
niet vereist
L4
vereist
vereist, of als alternatief
vereist
enkel toegang via L2
vereist
vereist
vereist
optioneel
vereist
vereist
niet vereist, maar aanvereist
vereist (en onbreekbaar)
bevolen om te sluiten
tijdens de proefneming
niet vereist
vereist
vereist
aanbevolen
vereist
vereist
optioneel
aanbevolen
vereist
vereist (wasbakken)
optioneel
vereist
vereist (wasbakken in vereist (wasbakken en
het sas of nabij de douche, deze laatste met
uitgang)
chemische besprenkeling
in geval van gebruik van
isolerend pak dat onder
positieve luchtdruk staat)
vereist
vereist
vereist
vereist
niet vereist
aanbevolen
vereist
vereist (werktafel)
vereist (werktafel,
vloer)
vereist (werktafel,
vloer, muren, zoldering)
niet vereist
aanbevolen
vereist
Inperkingsvereisten
47
Maatregelen
15 brandalarmsysteem (onder voorbehoud
van plaatselijke reglementering inzake brand)
16 interfoon, telefoon of elk ander systeem
waarmee communicatie buiten de
inperkingszone mogelijk is
VENTILATIE
17 luchttoevoersysteem gescheiden van de
aangrenzende lokalen
18 luchtafvoersysteem gescheiden van de
aangrenzende lokalen
19 luchttoevoer- en luchtafvoersysteem
onderling verbonden om accidentele
overdruk te vermijden
20 luchttoevoer- en luchtafvoersysteem
afsluitbaar door middel van kleppen
21 onderdruk in de gecontroleerde zone ten
opzichte van de druk in de omliggende
zones
22 HEPA-filtratie van de lucht1
23 systeem dat toelaat filters te vervangen
en daarbij besmetting te vermijden
24 HEPA-gefilterde lucht mag opnieuw in
omloop gebracht worden
25 specifieke maatregelen om dusdanig te
ventileren dat daardoor de luchtbesmetting tot een minimum herleid wordt
1
2
L1
niet vereist
Inperkingsniveau
L2
L3
niet vereist
vereist
niet vereist
niet vereist
vereist
vereist (niet manuele
bediening)
niet vereist
niet vereist
aanbevolen
vereist
niet vereist
niet vereist
aanbevolen
vereist
niet vereist
niet vereist
vereist
vereist
niet vereist
niet vereist
vereist
vereist
niet vereist
niet vereist
vereist (controle- en
alarmsystemen)
vereist (controle- en
alarmsystemen)
niet vereist
niet vereist
vereist (bij de afvoer)
-
-
vereist
vereist (bij de toevoer
en dubbele filtratie bij
de afvoer)
vereist
-
-
optioneel
niet toegelaten
optioneel
optioneel
vereist2
vereist
L4
vereist
Bij gebruik van virussen die niet tegengehouden worden door een HEPA-filter zijn speciale maatregelen vereist voor de uit het laboratorium
afgevoerde lucht.
De kennisgever moet deze maatregelen specificeren in het bioveiligheidsdossier, en de bevoegde instantie moet deze maatregelen in de
toelating bepalen.
2. Veiligheidsuitrusting
Maatregelen
26 microbiologische
veiligheidskast/isolatieruimte
27 autoclaaf
28 doorgeefautoclaaf
29 centrifuge in de ingeperkte zone
30 vacuümgenerator voorzien
van een HEPA-filter
3
48
L1
niet vereist
indien autoclaaf,
dan op de site
niet vereist
niet vereist
niet vereist
Inperkingsniveau
L2
L3
optioneel (klasse I of II)
vereist (klasse I of II)
in het gebouw
niet vereist
vereist; niet vereist
indien lekvrije buizen
worden gebruikt
niet vereist
L4
vereist (klasse III;
indien klasse II,
isolerend pak dat onder
positieve luchtdruk staat)
in het laboratorium of
in het laboratorium
aangrenzende lokalen3
optioneel
vereist
vereist
vereist
aanbevolen
vereist
In dit geval zijn gevalideerde procedures nodig, die een equivalent niveau van bescherming bieden, voor de veilige overbrenging van
materiaal naar een autoclaaf gesitueerd buiten het laboratorium.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
3. Werkvoorschriften en beheer van afval
Maatregelen
Inperkingsniveau
L1
31 beperkte toegang
32 vermelding op de deur:
a: biorisicoteken
b: coördinaten van de verantwoordelijke
c: inperkingsniveau
d: aard van het biologisch risico
e: lijst van de toegelaten personen
f: criteria voor toegang tot de inperkingszone
33 laboratorium met eigen specifieke uitrusting
34 beschermende kleding
35 ontsmetting van kleding vooraleer ze de
inperkingszone verlaat
36 handschoenen
37 ademhalingsmasker
38 gelaatsbescherming (ogen/slijmvliezen)
39 fysische inperking van levensvatbare microorganismen (gesloten systeem)
40 vorming van spatten of aërosolvorming
41 specifieke maatregelen (inclusief uitrusting)
om vorming van spatten of verspreiding
van aërosols tegen te gaan
42 mechanische pipettering
43 drinken, eten, roken, gebruik van cosmetica,
manipulatie van contactlenzen en opslag van
voedsel voor menselijke consumptie is verboden
44 beschikken over geschikte registers
45 toezicht op controlemaatregelen en
veiligheidsuitrusting
46 nota voor gebruiksaanwijzing van
doeltreffende ontsmettingsmiddelen
47 ontsmettingsmiddelen in de hevels
48 opleiding van het personeel
49 schriftelijke instructies inzake procedures met
betrekking tot bioveiligheid
50 doeltreffende controle van vectoren (bv. om de aanwezigheid van insecten of knaagdieren op te sporen)
51 rondlopen van dieren
52 in geval van manipulatie van zoöpathogenen,
periode waarbinnen elk contact van het personeel
met het(de) gastheerdier(en) moet worden vermeden
AFVAL EN/OF BIOLOGISCHE RESIDU’S
53 gevalideerde inactivering van biologisch afval
en/of biologische residu’s volgens een geschikte
methode vóór verwijdering
54 gevalideerde inactivering van besmet materiaal
(glaswerk, enz.) volgens een geschikte methode
vóór het schoonmaken, hergebruiken of vernietigen
55 gevalideerde inactivering van de effluenten van
de wasbakken en douches volgens een geschikte methode vóór eindafvoer
4
L2
L3
L4
aanbevolen
aanbevolen (b, c)
vereist
vereist(a, b, c)
vereist (en controle)
vereist (a, b, c, d, e, f)
vereist (en controle)
vereist (a, b, c, d, e, f)
niet vereist
vereist
niet vereist
vereist
niet vereist
niet vereist
niet vereist
niet vereist
niet vereist
aanbevolen
optioneel
niet vereist
optioneel
vereist
vereist
optioneel
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
minimaliseren
niet vereist
minimaliseren
aanbevolen
beletten
vereist
beletten
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
niet vereist
vereist
vereist
niet vereist
vereist
vereist
aanbevolen
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
niet vereist
aanbevolen
vereist
vereist
verboden
niet vereist
verboden
niet vereist
verboden
4
aanbevolen
verboden
4
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
niet vereist
niet vereist
optioneel
vereist
vereist
vereist
vereist (en specifiek voor vereist (en specifiek voor
de inperkingszone) +
de inperkingszone)
optioneel geschikt schoeisel volledige omkleding
inclusief schoeisel bij
binnen- en buiten gaan
aanbevolen
vereist
De bevoegde instantie bepaalt de periode in de toelating.
Inperkingsvereisten
49
Belgische inperkingseisen voor A1-A4 proefdierverblijven
1. Inrichting en technische vereisten
Maatregelen
1
Inperkingsniveau
A1
A2
A3
A4
niet vereist
vereist
vereist
vereist
niet vereist
aanbevolen
vereist
vereist
niet vereist
niet vereist
vereist
vereist
niet vereist, maar
aanbevolen om te sluiten
tijdens de proefneming
optioneel
vereist
vereist
vereist
vereist (met drie
compartimenten)
vereist
vereist
vereist (en onbreekbaar)
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
aanbevolen
vereist
vereist
2
het animalarium is gescheiden van de
andere werkzones in hetzelfde gebouw
of is in een afzonderlijk gebouw gelegen
toegang via sas
3
4
5
vergrendelbare toegangsdeur(en)
zelfsluitende toegangsdeur(en)
vaste ramen
6
luchtdicht lokaal dat decontaminatie met
niet vereist
een gas mogelijk maakt
gebouw dusdanig ontworpen dat
aanbevolen
accidentele ontsnapping van dieren
vermeden wordt
kijkvenster of gelijkwaardig systeem dat toeaanbevolen
laat te zien wie zich in het lokaal bevindt
was- en decontaminatie-voorzieningen vereist (wasbakken)
voor het personeel
7
8
9
vereist (wasbakken)
vereist (wasbakken
vereist (wasbakken en
nabij de uitgang of in
douche, deze laatste
het sas, een douche met chemische besproeiing
is aanbevolen)
in geval een isolerend
pak dat onder positieve
luchtdruk staat)
vereist
vereist
vereist
vereist
10 wasbakken met niet-manuele bediening
niet vereist
aanbevolen
11 kapstokken of kleedkamer voor
vereist
vereist
beschermende kleding
12 toevoerbuizen voor vloeistoffen voorzien
niet vereist
niet vereist
aanbevolen
vereist
van een terugvloeibeveiliging
13 afzonderlijke ruimte voor opslaan van
aanbevolen
vereist
vereist
vereist
propere kooien, voeder en strooisel
14 oppervlakken waterondoordringbaar,
vereist (kooien,
vereist (kooien,
vereist (kooien,
vereist (kooien,
gemakkelijk schoon te maken en bestand werkoppervlakken) werkoppervlakken en vloer) werkoppervlakken, vloer werkoppervlakken, vloer
tegen ontsmettingsmiddelen
muren, zoldering)
muren, zoldering)
15 wasplaats voor kooien
vereist
vereist
vereist
vereist
16 autonoom elektrisch systeem bij panne
niet vereist
niet vereist
aanbevolen
vereist
17 brandalarmsysteem (onder voorbehoud van
niet vereist
niet vereist
vereist
vereist
plaatselijke reglementering inzake brand)
18 interfoon, telefoon of elk ander systeem
niet vereist
niet vereist
vereist
vereist (niet-manuele
waarmee communicatie buiten de
bediening)
inperkingszone mogelijk is
VENTILATIE
19 luchttoevoersysteem gescheiden van
niet vereist
niet vereist
aanbevolen
vereist
de aangrenzende lokalen
20 luchtafvoersysteem gescheiden van de
niet vereist
optioneel
aanbevolen
vereist
aangrenzende lokalen
21 luchttoevoer- en luchtafvoersysteem
niet vereist
optioneel
vereist
vereist
onderling verbonden om accidentele
overdruk te vermijden
22 luchttoevoer- en luchtafvoersysteem
niet vereist
optioneel
vereist
vereist
afsluitbaar door middel van kleppen
23 onderdruk in de gecontroleerde zone
niet vereist
optioneel
vereist (controle en
vereist (controle en
alarmsystemen)
alarmsystemen)
ten opzichte van de druk in de
omliggende zones
50
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
Maatregelen
Inperkingsniveau
A1
5
24 HEPA-filtratie van de lucht
25 systeem dat toelaat filters te vervangen
en daarbij besmetting te vermijden
26 HEPA-gefilterde lucht mag opnieuw in
omloop gebracht worden
27 specifieke maatregelen om dusdanig te
ventileren dat daardoor de luchtbesmetting tot een minimum herleid wordt
5
6
A2
A3
A4
niet vereist
optioneel
vereist (bij de afvoer)
-
-
vereist
vereist (bij de toevoer
en dubbele filtratie bij
de afvoer)
vereist
-
-
optioneel
verboden
optioneel
optioneel
vereist6
vereist6
Bij gebruik van virussen die niet weerhouden worden door een HEPA-filter zijn speciale maatregelen vereist voor de uit het laboratorium
afgevoerde lucht
De kennisgever moet deze maatregelen speciferen in het bioveiligheidsdossier, en de overheid bepaalt deze maatregelen in de toelating.
2. Veiligheidsuitrusting
Maatregelen
Inperkingsniveau
A1
7
A2
A3
28 Microbiologische veiligheidskast
niet vereist
optioneel (klasse I of II) optioneel (klasse I of II)
29 dieren ondergebracht in kooien of in een
gelijkwaardige geschikte inperking
(omheinde ruimte, aquarium, enz)
30 isolatoren voorzien van HEPA-filtratie
31 autoclaaf
optioneel
optioneel
optioneel
niet vereist
op de site
optioneel
in het gebouw
32 doorgeefautoclaaf
33 fumigatiesysteem of ontsmettingsbad
niet vereist
niet vereist
niet vereist
aanbevolen
vereist
in het animalarium
of aangrenzende lokalen7
aanbevolen
vereist
A4
optioneel (klasse III of
klasse II met isolerend
pak dat onder positieve
luchtdruk staat)
optioneel
vereist
in het animalarium
vereist
vereist
In dit geval zijn gevalideerde procedures nodig, die een equivalent niveau van bescherming bieden, voor de veilige overbrenging van materiaal
naar een autoclaaf gesitueerd buiten het animalarium.
Inperkingsvereisten
51
3. Werkvoorschriften en afvalbeheer
Maatregelen
52
Inperkingsniveau
A1
A2
A3
A4
34 beperkte toegang
35 vermelding op de deur: biorisicoteken,
inperkingsniveau, aard van het biologisch
risico, coördinaten van de verantwoordelijke,
lijst van de toegelaten personen, criteria voor
toegang tot de inperkingszone
36 animalarium met eigen specifieke uitrusting
37 beschermende kleding, specifiek voor de
inperkingszone
vereist
vereist, behalve
biorisicoteken
vereist
vereist
vereist (en controle)
vereist
vereist (en controle)
vereist
niet vereist
vereist
aanbevolen
vereist
vereist
vereist + optioneel
geschikt schoeisel
38 ontsmetting van kleding vooraleer de
inperkingszone te verlaten
39 handschoenen
40 ademhalingsmasker
41 gelaatsbescherming (ogen/slijmvliezen)
42 vorming van spatten en aërosols
43 specifieke maatregelen (inclusief uitrusting)
om vorming van spatten en verspreiding van
aërosols te controleren
44 mechanische pipettering
45 verboden te drinken, te eten en te roken,
cosmetica te gebruiken, contactlenzen te
manipuleren, of etenswaren bestemd voor
menselijke consumptie op te slaan
46 register(s) waarop alle handelingen vermeld
worden (binnenbrengen en buitenbrengen
van proefdieren, inoculatie van GGM’s enz.)
47 nazicht van controlemaatregelen en
veiligheidsuitrusting
48 nota met gebruiksaanwijzing voor doeltreffende ontsmettingsmiddelen
49 ontsmettingsmiddelen in de hevels
50 opleiding van het personeel
51 schriftelijke instructies van procedures voor
bioveiligheid
52 doeltreffende controle van vectoren (bv.
voor detectie van de aanwezigheid van
insecten en knaagdieren)
53 isolatie van proefdieren gebruikt bij de
proefneming
54 in geval van manipulatie van zoöpathogenen, periode waarbinnen elk contact van
het personeel met het(de) gastheerdier(en)
vermeden moet worden
AFVAL EN/OF BIOLOGISCHE RESIDU’S
55 gevalideerde inactivering van biologisch
afval en/of biologische residu’s (besmette
kadavers, uitwerpselen*, strooisel*,...) volgens
een geschikte methode vóór verwijdering
56 gevalideerde inactivering van besmet materiaal* (glaswaren, kooien, enz...) volgens een
geschikte methode voor het schoonmaken,
hergebruiken of vernietigen
57 gevalideerde inactivering van effluenten van
wasbakken en douches volgens een
geschikte methode vóór eindafvoer
niet vereist
niet vereist
vereist
vereist
vereist volledige omkleding bij binnen- en buitengaan, inclusief schoeisel
vereist
optioneel
niet vereist
niet vereist
minimaliseren
niet vereist
aanbevolen
optioneel
optioneel
minimaliseren
aanbevolen
vereist
optioneel
optioneel
vermijden
vereist
vereist
vereist
vereist
vermijden
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
niet vereist
vereist
vereist
aanbevolen
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
aanbevolen
vereist
vereist
vereist
vereist
niet vereist
vereist
(afzonderlijk lokaal)
niet vereist
vereist
(afzonderlijk lokaal)
aanbevolen8
vereist
(afzonderlijk lokaal)
vereist8
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
niet vereist
niet vereist
aanbevolen
vereist
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
8
*
De bevoegde instantie bepaalt de periode in de toelating
faeces van transgene dieren hoeven niet te worden geinactiveerd.
Belgische vereisten voor G1-G3 kweekcellen en serres
G4-vereisten zijn in de Belgische wetgeving niet gedefinieerd.
1. Inrichting en technische vereisten
Maatregelen
1
2
3
4
de serre is een permanente constructie9
kanten van de serre: zone in beton of van
plantengroei gezuiverd over een breedte van 1,5m
rondom de kas
beveiligde omheining
gangpaden
5
toegang via een afzonderlijke ruimte waarvan de
twee deuren een gekoppelde vergrendeling hebben
6 vergrendelbare toegangsdeur(en)
7 constructie10 bestand tegen schokken
8 constructie9 waterbestendig en gemakkelijk schoon
te maken
9 vaste ramen
10 hermetische constructie9 die decontaminatie met
een gas mogelijk maakt
11 decontaminatie-voorzieningen voor het personeel
12 wasbakken met niet-manuele bediening
13 toevoerbuizen voor vloeistoffen voorzien van
een terugvloeibeveiliging
14 oppervlakken bestand tegen zuren of basen,
organische oplosmiddelen en ontsmettingsmiddelen
15 waterondoordringbare vloer
16 maatregelen met betrekking tot de afvloeiing van
verontreinigd water
17 autonoom elektrisch systeem bij panne
18 brandalarmsysteem (onder voorbehoud van
plaatselijke reglementering inzake brand)
19 interfoon, telefoon of elk ander systeem waarmee
communicatie buiten de inperkingszone mogelijk is
VENTILATIE
20 luchttoevoer- en luchtafvoersysteem onderling
verbonden om accidentele overdruk te vermijden
21 luchttoevoer- en luchtafvoersysteem afsluitbaar door
middel van kleppen
22 onderdruk in de gecontroleerde zone ten opzichte
van de druk in de omliggende zones
23 HEPA-filtratie van de lucht12
24 systeem dat toelaat filters te vervangen en daarbij
besmetting te vermijden
9
10
11
12
Inperkingsniveau
G1
niet vereist
niet vereist
G2
vereist
vereist
G3
vereist
vereist
niet vereist
gestabiliseerde
grond
niet vereist
niet vereist
hard materiaal
vereist
hard materiaal
optioneel
vereist
niet vereist
niet vereist
niet vereist
vereist
aanbevolen
aanbevolen
vereist
aanbevolen
vereist
niet vereist
niet vereist
niet vereist
niet vereist
vereist
vereist
vereist (wasbakken)
vereist (wasbakken)
niet vereist
niet vereist
niet vereist
niet vereist
vereist (wasbakken in de luchtsluis of nabij de uitgang),
douche in voorkomend geval)
vereist
aanbevolen
niet vereist
aanbevolen
vereist
niet vereist
optioneel
aanbevolen
afvloeiing beperken11
vereist
afvloeiing beletten
niet vereist
niet vereist
niet vereist
optioneel
vereist
vereist
niet vereist
optioneel
vereist
niet vereist
optioneel
vereist
niet vereist
optioneel
vereist
niet vereist
niet vereist
optioneel
niet vereist
-
niet vereist
-
vereist (bij de toe- en afvoer)
vereist
De serre moet een duurzame constructie zijn met een naadloze waterdichte bekleding, gelegen op een plek waarvan het talud van die aard is dat
de instroming van oppervlaktewater wordt voorkomen en voorzien van zelfsluitende, vergrendelbare deuren.
Onder constructie worden de wanden, het dak en de vloer verstaan.
Als transmissie via de grond mogelijk is.
In geval van gebruik van virussen die niet weerhouden worden door een HEPA-filter zijn speciale maatregelen van toepassing op de uit het
laboratorium afgevoerde lucht.
Inperkingsvereisten
53
2. Veiligheidsuitrusting
Maatregelen
25 autoclaaf
26 doorgeefautoclaaf
27 fumigatiekamer of immersietank voor
transfer van levend materiaal
Inperkingsniveau
G1
op de site
niet vereist
niet vereist
G2
in het gebouw
niet vereist
niet vereist
G3
in de serre
optioneel
optioneel
3. Werkvoorschriften en beheer van afval
Maatregelen
28
29
30
31
beperkte toegang
signalisatie van het biologisch risico
specifieke uitrusting
beschermende kleding
32 ontsmetting van de kleding vooraleer de
inperkingszone te verlaten
33 handschoenen
34 overschoenen of ontsmettingsbad voor schoenen
35 vorming van spatten en aërosols
36 specifieke maatregelen (inclusief uitrusting) om
vorming van spatten te beperken en verspreiding van
aërosols tegen te gaan
37 mechanische pipettering
38 verboden te drinken, te eten en te roken, cosmetica te
gebruiken, contactlenzen te manipuleren, of etenswaren
bestemd voor menselijke consumptie op te slaan
39 register(s) waarop alle handelingen vermeld worden
(binnenbrengen en buitenbrengen van planten,
inoculatie van GGM’s enz.)
40 nazicht van controlemaatregelen en veiligheidsuitrusting
41 nota met gebruiksaanwijzing voor doeltreffende
ontsmettingsmiddelen
42 opleiding van het personeel
43 schriftelijke instructies van procedures voor bioveiligheid
44 rondlopen van dieren
45 maatregelen ter bestrijding van ongewenste
organismen zoals insecten en andere arthropoden,
knaagdieren, …
46 zichzelf verspreidende organismen:
- transport binnen de inrichting tussen
de inperkingszones
- vermelding op het register
- decontaminatie van containers voor transport
47 maatregelen met betrekking tot afvloeiing van besmet water
AFVAL EN/OF BIOLOGISCHE RESIDU’S
48 gevalideerde inactivering van biologisch afval
en/of biologische residu’s (besmette planten,
besmette substraten, …) volgens een geschikte
methode vóór verwijdering
14
54
Als transmissie via de grond mogelijk is.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
Inperkingsniveau
G1
vereist
niet vereist
niet vereist
vereist
G2
vereist
vereist
niet vereist
vereist
niet vereist
niet vereist
G3
vereist (en controle)
vereist
vereist
vereist (en specifiek
voor de inperkingszone)
vereist
niet vereist
niet vereist
minimaliseren
niet vereist
optioneel
optioneel
minimaliseren
aanbevolen
optioneel
optioneel
beletten
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
vereist
verboden
vereist
vereist
vereist
verboden
vereist
vereist
vereist
verboden
vereist
container, optioneel
container
dubbele container
niet vereist
niet vereist
optioneel
aanbevolen
vereist
afvloeiing minimaliseren14
vereist
vereist
afvloeiing beletten
vereist
vereist
vereist
Maatregelen
49 gevalideerde inactivering van besmet materiaal
(glaswerk enz.) volgens een geschikte methode
vóór reiniging, hergebruik en/of vernietiging
50 inactivering van de effluenten van wasbakken en
douches volgens een geschikte methode vóór
eindafvoer
Inperkingsniveau
G1
vereist
G2
vereist
G3
vereist
niet vereist
niet vereist
optioneel
Inperkingsvereisten
55
BIJLAGE 2: VIB RICHTLIJNEN VOOR INSCHALING
VAN ACTIVITEITEN MET GGO’S
Situering
Deze richtlijnen hebben tot doel hulp te bieden bij de vaststelling van de benodigde inperkingsniveaus bij activiteiten met genetisch gemodificeerde organismen. In deze bijlage wordt onderscheid
gemaakt tussen activiteiten met micro-organismen en cellen (hst. A), activiteiten met planten (hst. B)
en activiteiten met dieren (hst. C). De transformatie van planten met behulp van Agrobacterium
stammen wordt ingeschaald als een activiteit met het micro-organisme.
Gebruik van deze richtlijnen
Deze richtlijnen bieden met name hulp bij de inschatting van de benodigde inperkingsmaatregelen
voor activiteiten met micro-organismen en cellen (hst A van deze richtlijnen). In dit hoofdstuk A staat
een beschrijving hoe de inschalingsschema’s te gebruiken. Daarnaast zijn de benodigde definities van
toxines en de eisen aan gastheren en vectoren voor risicoklasse 1 weergegeven. Indien het gaat om
activiteiten met transgene planten, dan geeft hst. B een leidraad. Activiteiten met transgene dieren en
vooral activiteiten waarin het gebruik van genetisch gemodificeerde micro-organismen of cellen
gecombineerd wordt met dieren zijn niet eenvoudig in te schalen. Hst C geeft hierin een leidraad.
Er zijn natuurlijk gevallen waarin deze richtlijnen niet voorzien. In een dergelijk geval is het voor
advies raadzaam contact op te nemen met de bioveiligheidsexperten intern en extern zoals weergegeven in bijlage 5 van dit boekje.
Bronnen
De richtlijnen zijn afgeleid van de Richtlijnen van de Nederlandse Commissie Genetische Modificatie
(COGEM) voor zover die toepasbaar zijn in België. Daarnaast is gebruik gemaakt van de inschalingsvoorschriften zoals deze zijn opgenomen in de bijlagen bij hoofdstuk 5.51 van Vlarem II.
HST A. RICHTLIJNEN VOOR INSCHALING VAN ACTIVITEITEN MET
GENETISCH GEMODIFICEERDE MICRO-ORGANISMEN EN CELLEN
Inschalingsregels
Op de volgende pagina’s zijn schema’s weergegeven waarin een eerste identificatie van het inperkingsniveau kan worden afgeleid. Zoals aangegeven in hoofdstuk 3 en in het voorbeeld in hoofdstuk
7, dient daarna nog gekomen te worden tot een finale vaststelling van de benodigde maatregelen
waarbij rekening gehouden wordt met (1) de eigenschappen van het milieu dat aan het GGO zou
kunnen worden blootgesteld, (2) het type en de schaal van de activiteit, en (3) eventuele niet-standaard handelingen.
Het inschalingsschema is in vier stukken verdeeld:
• Deel A1: Activiteiten met gastheer/vectorsystemen die al dan niet voldoen aan risicoklasse 1 en
activiteiten met niet virale pathogene gastheren.
56
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
• Deel A2: Activiteiten met animale cellen zonder virale vectoren en activiteiten met baculovirussen.
• Deel A3: Activiteiten met animale cellen in combinatie met virussen of virale vectoren.
• Deel A4: Activiteiten met plantencellen.
De schema’s werken als volgt: Eerst worden de vier deelschema’s in de ‘eerste richting’ langsgelopen
en wordt bepaald welk type van gastheer en vector van toepassing is. In tweede instantie wordt in
de ‘tweede richting’ bepaald of het gaat om activiteiten met ongekarakteriseerd of gekarakteriseerd
genetisch materiaal. In derde instantie wordt dan binnen de van toepassing zijnde categorie (gekarakteriseerd of ongekarakteriseerd) bepaald welk type van insertie van toepassing is. In het geval van
ongekarakteriseerd genetisch materiaal is het een keuze tussen een van de categorieën a t/m e, in
het geval van gekarakteriseerd genetisch materiaal is het een keuze tussen de categorieën f t/m j. Uit
de combinatie van de van toepassing zijnde categorie van gastheer/vector en van toepassing zijnde
categorie van insert kan dan de inschaling worden afgelezen.
Definitie van klassen van toxines
a. Een toxine van klasse T-3 is een toxine met een LD50 voor vertebraten van minder dan 100 nanogram per kg lichaamsgewicht;
b. Een toxine van klasse T-2 is een toxine met een LD50 voor vertebraten van 100 nanogram tot
1 microgram per kg lichaamsgewicht;
c. Een toxine van klasse T-1 is een toxine met een LD50 voor vertebraten van 1 tot 100 microgram
per kg lichaamsgewicht;
Eisen aan gastheer/vector systemen voor indeling in risicoklasse I
Eisen voor kleinschalige laboratoriumhandelingen
(kleinschalig is <100 liter effectief kweekvolume)
1. De gastheer is niet pathogeen.
2. De gastheer is vrij van gekende biologische agentia die potentieel schadelijk zijn.
3. De vector is goed gekarakteriseerd, dit wil zeggen: het type vector moet gedefinieerd zijn (plasmide, cosmide, minichromosoom, etc.), grootte moet gekend zijn, functie en herkomst van structurele genen en merkergenen moet gekend zijn, evenals restrictiesites, en replicon. Commercieel
verkrijgbare vectoren zijn in het algemeen goed gekarakteriseerd.
4. De vector mag geen schadelijke gevolgen hebben (geen virulentie- en toxinebepalende elementen
overbrengen).
5. De omvang van de vector is zoveel mogelijk beperkt tot die elementen die noodzakelijk zijn.
6. De vector mag de stabiliteit van het GGO in het milieu niet doen toenemen.
7. De vector moet moeilijk te mobiliseren zijn (Tra-).
8. De vector mag geen resistentiemerkers overdragen naar micro-organismen die deze niet van nature opnemen, indien dergelijke opname het gebruik van geneesmiddelen ter bestrijding van ziekteverwekkers in gevaar brengt.
Risicogroepen (biologische riscioklassen)
Met organismen van risicogroep 4, 3 en 2 wordt bedoeld organismen die respectievelijk ingedeeld
zijn in de pathogeniteitsklassen 4, 3 en 2 als weergegeven in bijlage 5.51 van Vlarem II.
VIB Richtlijnen voor inschaling van activiteiten met GGO’s
57
Activiteiten waarbij gekarakteriseerd genetisch
materiaal is toegevoegd
Activiteiten waarbij ongekarakteriseerd genetisch
materiaal is toegevoegd
a. De donor produceert een toxine van
respectievelijk klasse
1
58
T3
T2
T1
b. De donor is een voor eukaryote cellen Risicogroep 4
infectieus virus van respectievelijk
Risicogroep 3
Risicogroep 2
c. De donor is een defect voor eukaryote Risicogroep 4
cellen infectieus virus van
Risicogroep 3
respectievelijk:
Risicogroep 2
d. De donor is een niet-viraal pathogeen Risicogroep 4
van respectievelijk
Risicogroep 3
Risicogroep 2
e. De donor is een organisme van risicogroep 1,
of een plant of een dier
3. Activiteiten in pathogene gastheren, virale
pathogenen uitgezonderd. De gastheer is een
pathogeen van respectievelijk risicogroep 4, 3, 2
2. Activiteiten in een gastheer/vectorsysteem dat
niet voldoet aan de criteria voor indeling in
risicoklasse 1
eerste richting
1. Activiteiten in een gastheer/vectorsysteem die
voldoen aan de criteria voor indeling in
risicoklasse 1
tweede richting
A1: Activiteiten met gastheer/vectorsystemen die al dan niet voldoen aan risicoklasse 1
en activiteiten met niet-virale pathogene gastheren
L4
L3
L2
L3
L2
L1
L2
L1
L1
L3
L2
L1
L1
L4
L4
L3
L4
L3
L2
L2
L2
L2
L3
L2
L2
L2
Resp: L4, L4, L4:
Resp : L4, L4, L4
Resp: L4, L3, L3
Resp: L4, L4, L4
Resp: L4, L3, L3
Resp: L4, L3, L2
Resp: L4, L3, L3
Resp: L4, L3. L2
Resp: L4, L3, L2
Resp: L4, L4, L4
Resp: L4, L3, L3
Resp: L4, L3, L2
Resp: L4, L3, L2
L4
L4
L3
L4
L3
L2
Resp: L4, L4, L4
Resp: L4, L4, L4
Resp: L4, L3, L3
Resp: L4, L4, L4
Resp: L4, L3, L3
Resp: L4, L3, L2
L2
L2
L2
Resp: L4, L3, L3
Resp: L4, L3, L2
Resp: L4, L3, L2
L2 of L3
Resp: L4, L3, L2
L2
Resp: L4, L3, L2
f. De sequentie bevat genetische inforT3
L4
matie die codeert voor een toxine van
T2
L3
respectievelijk klasse
T1
L2
g. De sequentie bevat genetische infor- Risicogroep 4
L3
matie voor de vorming van een voor Risicogroep 3
L2
eukaryotische cellen infectieus virus, Risicogroep 2
L1
van respectievelijk:
h. De sequentie bevat genetische infor- Risicogroep 4
L2
matie voor de vorming van een defect, Risicogroep 3
L1
voor eukaryotische cellen infectieus
Risicogroep 2
L1
virus, van respectievelijk:
i. De sequentie bevat genetische informatie
L1 of L2
die codeert voor een schadelijk genproduct,
anders dan in f1.
j. De sequentie bevat geen genetische informatie
L1
die codeert voor een schadelijk genproduct.
De vraag wat een schadelijk genproduct is, is een van de moeilijkste vragen voor de inschaling. Virulentiegenen
kunnen een voorbeeld zijn van een schadelijk genproduct. De uiteindelijke indeling hangt af van het vermoede effect
van het genproduct in het gebruikte gastheerorganisme.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
Activiteiten waarbij gekarakteriseerd genetisch materiaal is toegevoegd
Activiteiten waarbij ongekarakteriseerd genetisch materiaal
is toegevoegd
a. De donor produceert een toxine van
respectievelijk klasse
6. De virale vector is, of
is afgeleid van, een
biologisch nietingeperkt baculovirus
dat door de
vervaardiging evenmin
wordt ingeperkt
5. De virale vector is, of
is afgeleid van, een
baculo-virus dat
biologisch ingeperkt
is of dat door de
vervaardiging
ingeperkt wordt
eerste richting
4. Activiteiten in
animale cellen waarbij
geen virale vector
wordt gebruikt
tweede richting
A2: Activiteiten met animale cellen zonder virale vectoren en met baculovirussen
T3
T2
T1
b. De donor is, of is afgeleid van, een voor Risicogroep 4
eukaryote cellen infectieus virus van
Risicogroep 3
respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, en Risicogroep 2
aanwezigheid van het genetisch materiaal
van de donor in de gastheer kan leiden
tot de vorming van autonoom
replicerende virusdeeltjes
c. De donor is, of is afgeleid van, een defect Risicogroep 4
voor eukaryote cellen infectieus virus van Risicogroep 3
respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, en Risicogroep 2
aanwezigheid van het genetisch materiaal
van de donor in de gastheer kan niet
leiden tot de vorming van autonoom
replicerende virusdeeltjes
d. De donor is een niet-viraal pathogeen
Risicogroep 4
van respectievelijk
Risicogroep 3
Risicogroep 2
e. De donor is een organisme van biologische
risicoklasse 1, of een plant of een dier
L1
L1
L1
L4
L3
L2
L2
L1
L1
L4
L3
L2
L3
L2
L2
L4
L3
L2
L3
L2
L1
L2
L2
L1
L3
L2
L2
L3
L2
L1
L1
L2
L2
L1
L1
L3
L2
L2
L2
f. De sequentie bevat genetische informatie
T3
die codeert voor een toxine van
T2
respectievelijk klasse
T1
g. De sequentie bevat genetische informatie Risicogroep 4
voor de vorming van een voor
Risicogroep 3
eukaryotische cellen infectieus virus, van Risicogroep 2
respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2 en
aanwezigheid van het genetisch materiaal
van de donor in de gastheer kan leiden
tot de vorming van autonoom
replicerende virusdeeltjes
h. De sequentie bevat genetische informatie Risicogroep 4
voor de vorming van een defect, voor
Risicogroep 3
eukaryotische cellen infectieus virus, van Risicogroep 2
respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, en
aanwezigheid van het genetisch materiaal
van de donor in de gastheer kan niet
leiden tot de vorming van autonoom
replicerende virusdeeltjes:
i. De sequentie bevat genetische informatie die codeert
voor een schadelijk genproduct, anders dan in f.
j. De sequentie bevat geen genetische
informatie die codeert voor een
schadelijk genproduct
L1
L1
L1
L4
L3
L2
L2
L1
L1
L4
L3
L2
L3
L2
L2
L4
L3
L2
L3
L2
L1
L2
L2
L1
L3
L2
L2
L1
L1
L2
L1
L1
L2
VIB Richtlijnen voor inschaling van activiteiten met GGO’s
59
8. De virale vector is een mensof dierpathogeen autonoom
replicerend infectieus virus van
respectievelijk risicogroep 4, 3
of 2 of een daarvan afgeleid
defect virus en de mogelijkheid
dat autonoom replicerende
virusdeeltjes gevormd worden
bestaat
9. De virale vector is, of is
afgeleid van, een satelliet-virus,
of is een defect virus afgeleid
van een mens- of dierpathogeen van respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2 ; de mogelijkheid dat autonoom replicerende
virusdeeltjes gevormd worden
bestaat niet
Activiteiten waarbij ongekarakteriseerd genetisch materiaal
is toegevoegd
Activiteiten waarbij gekarakteriseerd
genetisch materiaal is toegevoegd
L2
L2
L2
L4
L3
L2
Resp. L4, L4, L4
Resp. L4, L4, L3
Resp. L4, L4, L3
Resp. L4, L4, L4
Resp. L4, L3, L3
Resp. L4, L3, L2
Resp. L3, L3, L3
Resp. L3, L2, L2
Resp. L3, L2, L2
Resp. L4, L4, L4
Resp. L3, L3, L3
Resp. L3, L2, L2
Risicogroep 4
Risicogroep 3
Risicogroep 2
L3
L2
L1
Resp. L4, L3, L3
Resp. L4, L3, L2
Resp. L4, L3, L2
Resp. L3, L3, L3
Resp. L3, L2, L2
Resp. L3, L2, L1
Risicogroep 4
Risicogroep 3
Risicogroep 2
L3
L2
L1
L1
Resp. L4, L3, L3
Resp. L4, L3, L2
Resp. L4, L3, L2
Resp. L4, L3, L2
Resp. L3, L3, L3
Resp. L3, L2, L2
Resp. L3, L2, L1
Resp. L3, L2, L1
T3
T2
T1
Risicogroep 4
Risicogroep 3
Risicogroep 2
L2
L2
L2
L4
L3
L2
Resp. L4, L4, L4
Resp. L4, L4, L3
Resp. L4, L4, L3
Resp. L4, L4, L4
Resp. L4, L3, L3
Resp. L4, L3, L2
Resp. L3, L3, L3
Resp. L3, L2, L2
Resp. L3, L2, L2
Resp. L4, L4, L4
Resp. L3, L3, L3
Resp. L3, L2, L2
Risicogroep 4
Risicogroep 3
Risicogroep 2
L3
L2
L1
Resp. L4, L3, L3
Resp. L4, L3, L2
Resp. L4, L3, L2
Resp. L3, L3, L3
Resp. L3, L2, L2
Resp. L3, L2, L1
L2
Resp. L4, L3, L2
Resp. L3, L2, L2
L1
Resp. L4, L3, L2
Resp. L3, L2, L1
eerste richting
a. De donor produceert een toxine van
respectievelijk klasse
60
T3
T2
T1
Risicogroep 4
Risicogroep 3
Risicogroep 2
7. De virale vector is een
compleet of defect ecotroop
muizenretrovirus
tweede richting
A3: Activiteiten met animale cellen in combinatie met virussen of virale vectoren
b. De donor is, of is afgeleid van, een voor
eukaryote cellen infectieus virus van
respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, en
aanwezigheid van het genetisch materiaal
van de donor in de gastheer kan leiden
tot de vorming van autonoom
replicerende virusdeeltjes
c. De donor is, of is afgeleid van, een defect
voor eukaryote cellen infectieus virus van
respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, en
aanwezigheid van het genetisch materiaal
van de donor in de gastheer kan niet
leiden tot de vorming van autonoom
replicerende virusdeeltjes
d. De donor is een niet-viraal pathogeen
van respectievelijk
e. De donor is een organisme van biologische
risicoklasse 1, of een plant of een dier
f. De sequentie bevat genetische informatie
die codeert voor een toxine van
respectievelijk klasse
g. De sequentie bevat genetische informatie
voor de vorming van een voor
eukaryotische cellen infectieus virus, van
respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2 en
aanwezigheid van het genetisch materiaal
van de donor in de gastheer kan leiden
tot de vorming van autonoom
replicerende virusdeeltjes
h. De sequentie bevat genetische informatie
voor de vorming van een defect, voor
eukaryotische cellen infectieus virus, van
respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, en
aanwezigheid van het genetisch materiaal
van de donor in de gastheer kan niet
leiden tot de vorming van autonoom
replicerende virusdeeltjes:
i. De sequentie bevat genetische informatie
die codeert voor een schadelijk
genproduct, anders dan in f.
j. De sequentie bevat geen genetische
informatie die codeert voor een
schadelijk genproduct
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
Activiteiten waarbij ongekarakteriseerd genetisch materiaal is toegevoegd
11. De virale vector is, of is
afgeleid van, een
plantenvirus en is niet
biologisch ingeperkt
eerste richting
a. De donor produceert een toxine van
respectievelijk klasse
Activiteiten waarbij gekarakteriseerd genetisch
materiaal is toegevoegd
10. De virale vector is, of is
afgeleid van, een
plantenvirus en is
biologisch ingeperkt.
tweede richting
A4: Activiteiten in plantencellen
T3
T2
T1
Risicogroep 4
Risicogroep 3
Risicogroep 2
L2
L1
L1
L4
L3
L2
L3
L2
L2
L4
L3
L2
Risicogroep 4
Risicogroep 3
Risicogroep 2
L1
L1
L1
L2
L2
L2
Risicogroep 4
Risicogroep 3
Risicogroep 2
L1
L1
L1
L1
L2
L2
L2
L2
f. De sequentie bevat genetische informatie die
T3
codeert voor een toxine van respectievelijk
T2
klasse
T1
g. De sequentie bevat genetische informatie
Risicogroep 4
voor de vorming van een voor eukaryotische Risicogroep 3
cellen infectieus virus, van respectievelijk
Risicogroep 2
risicogroep 4, 3 of 2 en aanwezigheid van
het genetisch materiaal van de donor in de
gastheer kan leiden tot de vorming van
autonoom replicerende virusdeeltjes
L2
L1
L1
L4
L3
L2
L3
L2
L2
L4
L3
L2
h. De sequentie bevat genetische informatie
Risicogroep 4
voor de vorming van een defect, voor
Risicogroep 3
eukaryotische cellen infectieus virus, van
Risicogroep 2
respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, en
aanwezigheid van het genetisch materiaal
van de donor in de gastheer kan niet leiden
tot de vorming van autonoom replicerende
virusdeeltjes:
i. De sequentie bevat genetische informatie
die codeert voor een schadelijk genproduct,
anders dan in f.
j. De sequentie bevat geen genetische informatie
die codeert voor een schadelijk genproduct
L1
L1
L1
L2
L2
L2
L1
L2
L1
L2
b. De donor is, of is afgeleid van, een voor
eukaryote cellen infectieus virus van
respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, en
aanwezigheid van het genetisch materiaal
van de donor in de gastheer kan leiden tot
de vorming van autonoom replicerende
virusdeeltjes
c. De donor is, of is afgeleid van, een defect
voor eukaryote cellen infectieus virus van
respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, en
aanwezigheid van het genetisch materiaal
van de donor in de gastheer kan niet leiden
tot de vorming van autonoom replicerende
virusdeeltjes
d. De donor is een niet-viraal pathogeen van
respectievelijk
e. De donor is een organisme van risicogroep 1,
of een plant of een dier
VIB Richtlijnen voor inschaling van activiteiten met GGO’s
61
HST B.
RICHTLIJNEN VOOR INSCHALING VAN ACTIVITEITEN IN
SERRES MET PLANTEN DIE TRANSGEEN ZIJN OF GENETISCH
GEMODIFICEERDE MICRO-ORGANISMEN DRAGEN
Niveau G1:
• De steriele of gesteriliseerde planten.
• De strikt autogame planten (zelfbevruchters).
• De planten die niet in staat zijn om in het ecosysteem te overleven (zoals banaan).
• De planten die in het ecosysteem geen interfertiele soorten hebben (zoals banaan).
• De planten die door een virus van biologische risicoklasse 2, door een genetisch gemodificeerd virus
van biologische risicoklasse 1 of 2 of door een virale vector van biologische risicoklasse 1 of 2 zijn
geïnfecteerd, of die een viraal genoom van biologische risicoklasse 1 of 2 vertonen.
• De planten die drager zijn van een zichzelf niet verspreidend fytopathogeen van biologische risicoklasse 1 of 2.
Niveau G2:
• De allogame (kruisbevruchters) of autogame (zelfbevruchters), anemofiele (windbestuivers) of entomofiele (insectenbestuivers) planten.
• De planten waarvan de volledige ontwikkelingscyclus enkel kan plaatsvinden in het ecosysteem en
waarvan de zaden een lange overlevingsduur hebben (naargelang het geval en de verworven ervaring).
• De planten die door een virus van biologische risicoklasse 3, door een virale vector van biologische risicoklasse 3 zijn geïnfecteerd of die een viraal genoom van biologische risicoklasse 3 vertonen.
• De planten die drager zijn van een zichzelf verspreidend fytopathogeen of van een GGO van biologische risicoklasse 2 of van een fytopathogeen of van een GGO van biologische risicoklasse 3.
Niveau G3:
• De planten die gelijkaardige eigenschappen hebben als degene die beschreven zijn in niveau 2 en die,
hetzij een gevaarlijk vreemd gen (dat bijvoorbeeld voor een toxine codeert), hetzij een virus van biologische risicoklasse 4, hetzij een viraal genoom van biologische risicoklasse 4 hebben gekregen.
• De planten die onderworpen zijn aan eerste proeven van overdracht van genen, die afkomstig zijn van
een voor de mens of het milieu gevaarlijk pathogeen organisme en waarvan de risico’s niet bekend
zijn.
• De planten die drager zijn van een fytopathogeen of van een GGO van biologische risicoklasse 4.
Niveau G4:
• De planten die een virus van biologische risicoklasse 4 hebben gekregen, dat een bijzonder hoog
gevaar vertegenwoordigt voor het milieu (of waarvoor een nultolerantie vereist is) of een gen bevat
dat verantwoordelijk is voor de synthese van voor de mens of het dier bijzonder gevaarlijke stoffen.
• De planten die drager zijn van een fytopathogeen of een GGO van biologische risicoklasse 4, dat een
bijzonder groot gevaar vertegenwoordigt voor het milieu (of waarvoor een nultolerantie vereist is).
• De planten die vreemde genen bevatten, afkomstig van een voor de mens, het dier of het milieu bijzonder gevaarlijk pathogeen organisme en waarvan de risico’s niet bekend zijn.
62
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
HST C.
RICHTLIJNEN VOOR INSCHALING VAN ACTIVITEITEN IN
DIERVERBLIJVEN MET DIEREN DIE TRANSGEEN ZIJN OF GENETISCH
GEMODIFICEERDE MICRO-ORGANISMEN OF CELLEN DRAGEN
Niveau A1:
• de zichzelf niet verspreidende dieren (varkens, schapen, runderen) die een vreemd DNA-fragment in
hun genoom hebben opgenomen zonder de hulp van een virale vector;
• de zichzelf niet verspreidende dieren die drager zijn van GGO’s van risicoklasse 1.
Niveau A2:
• de zichzelf verspreidende dieren (kleine knaagdieren, konijnen, insecten, vissen) die een vreemd DNAfragment hebben opgenomen, zonder de hulp van een virale vector;
• de zichzelf verspreidende dieren die drager zijn van een GGO van risicoklasse 1 of 2.
Opmerkingen
De inschaling van activiteiten met dieren die genetisch gemodificeerde micro-organismen (GGM’s) of
cellen dragen is gecompliceerder dan de inschaling van genetisch gemodificeerde micro-organismen op
zich. Dit komt omdat bij activiteiten in dierverblijven niet alleen de risicoklasse van het GGM van belang
is, ook de specifieke combinatie proefdier/micro-organisme, de wijze van toediening en de mogelijke
verspreiding van het micro-organismen naar het milieu spelen een zeer belangrijke rol. Bij werkzaamheden met GGM’s in een laboratorium wordt het micro-organisme altijd gehanteerd in een gesloten houder, en wanneer deze houder geopend wordt en de kans daarbij bestaat dat micro-organismen zich verspreiden (bijv. via aërosolen), gebeurt dit veelal in een veiligheidskabinet (klasse 2 en hoger). Het proefdier kan niet gezien worden als een gesloten houder. Dit betekent dat voor elke combinatie
proefdier/micro-organisme zorgvuldig bepaald moet worden of eventueel bijzondere maatregelen nodig
zijn om verspreiding van het micro-organisme tegen te gaan. Deze bijzondere maatregelen zijn in de
beschrijving van de inperkingsniveaus A1 t/m A4 aangeduid met “aanbevolen” of “optioneel”.
Een voorbeeld: een genetisch gemodificeerd adenovirus van risicoklasse 2 moet in een laboratorium
onder standaard L2-condities worden gehanteerd. Wanneer dit virus in de longen van een muis wordt
toegediend in de vorm van een aërosol, zijn standaard A2 condities niet voldoende om verspreiding van
het virus tegen te gaan. Er zal een veiligheidskabinet aanwezig moeten zijn voor de toediening van het
virus, de muizen moeten gehuisvest worden in speciale filtertopkooien, en al het afval (faeces, urine,
bedding, etc.) moet geïnactiveerd worden. Wanneer het niet om een muis zou gaan, maar om een varken, zijn weer andere maatregelen nodig omdat een varken niet in een filtertopkooi gehuisvest kan worden. Het verblijf in zijn geheel moet dan de benodigde inperking geven. Dit betekent dat er een sas zal
moeten zijn, onderdruk, de ruimte zal moeten geschikt zijn om te kunnen worden gefumigeerd, medewerkers zullen speciale beschermende kleding moeten dragen die na de werkzaamheden in de sas achterblijft en er zullen speciale voorzieningen moeten getroffen worden voor de inactivatie van faeces en
urine (gesloten opvangsysteem gekoppeld aan een installatie voor inactivatie).
VIB Richtlijnen voor inschaling van activiteiten met GGO’s
63
BIJLAGE 3: DE BIOLOGISCHE
RISICOKLASSE VAN ENKELE
RELEVANTE PATHOGENEN
In deze bijlage zijn de biologische risicoklassen weergegeven van enkele relevante pathogenen. Deze lijst
is een verkorte versie van de bijlage 5.51.8 van Vlarem II. Enkel de meest relevant geachte pathogenen
zijn op deze lijst weergegeven. Wordt er gewerkt met een ander pathogeen dat niet op deze lijst voorkomt, dan kunnen de lijsten van Vlarem geraadpleegd worden. Komt het pathogeen ook daar niet op
voor, dan dient u contact op te nemen met de interne of externe deskundigen (zie bijlage 4), of met de
Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie van het WIV (http://www.biosafety.be).
M = biologische risicoklasse voor mensen
D = biologische risicoklasse voor dieren
P = biologische risicoklasse voor planten
OP = opportunistisch pathogeen
(*) = vertonen een beperkt infectierisico, omdat ze niet overdraagbaar zijn via de lucht
+ = virus waarvan het biologisch risico afhangt van het gastheer-dier
LET OP!: dit is een verkorte lijst. De volledige lijst is terug te vinden in Vlarem, rubriek 51, en op www.biosafety.be
Mens en dierpathogenen: bacteriën en aanverwanten
M
3
OP
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
64
D
3
OP
2
2
2
2
2
3
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
Bacillus anthracis
Bacillus cereus
Bacillus lentimorbus
Bacillus popiliae
Bacillus sphaericus
Bacillus thuringiensis
Bordetella avium
Bordetella bronchiseptica
Bordetella parapertussis
Bordetella pertussis
Campylobacter coli
Campylobacter fetus subsp. fetus
Campylobacter fetus subsp. venerealis
Campylobacter jejuni
Campylobacter spp.
Chlamydia pneumoniae
Clostridium botulinum
Clostridium tetani
Enterobacter spp.
Enterococcus faecalis
Escherichia coli (uitgezonderd niet pathogene stammen)
Helicobacter hepaticus
Helicobacter pylori
Klebsiella mobilis (Enterobacter aerogenes)
Klebsiella oxytoca
Klebsiella pneumoniae
Klebsiella spp.
Listeria ivanovii
Listeria monocytogenes
Mycobacterium avium
subsp.paratuberculosis
Mycobacterium bovis (behalve de stam BCG)
Mycobacterium leprae
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
M
3
2
2
2
2
2
2
2
D
3
2
2
2
2
2
3 (*)
2
2
3 (*)
2
2
2
3
2
3
2
2
2
2
2
2
2
3
2
3
3
2
3
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
3
Mycobacterium tuberculosis
Neisseira gonorrhoeae
Neisseira meningitidis
Neisseira spp.
Pseudomonas aeruginosa
Salmonella Abortusequi
Salmonella Abortusovis
Salmonella choleraesuis (enterica)
subsp. arizonae
Salmonella Dublin
Salmonella Enteritidis
Salmonella Gallinarum
Salmonella Paratyphi A,B,C
Salmonella Pullorum
Salmonella Typhi
Salmonella Typhimurium
Shigella boydii
Shigella dysenteriae (Type I)
Shigella flexneri
Shigella sonnei
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Streptobacillus moniliformis
Streptococcus agalactiae
Streptococcus dysgalactiae
Streptococcus equi
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Streptococcus spp.
Streptococcus suis
Streptococcus uberis
Vibrio cholerae (El Tor inbegrepen)
Yersinia pestis
Mens en dierpathogene virussen
M
D
2
2
4
3
4
4
4
2
+
+
+
3
3
2
2
2
3
3
3
2
4
4
4
4
3
3
3
3
+
+
3
3
4
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
3
2
2
3
2
2
2
2
2
2
Adenoviridae
Animal adenoviruses
Human adenoviruses
African swine fever virus
Arenaviridae
Flexal virus
Junin virus
Lassa virus
Machupo virus
Equine arteritis
Simian haemorrhagic fever virus
Astroviridae
Astroviruses
Baculoviridae
Invertebrate baculoviruses
Birnaviridae
Drosophila X virus
Infectious pancreatic necrosis virus
Bunyaviridae
California encephalitis virus
Hantaan virus (Korean haemorrhagic
fever)
Filoviridae
Ebola virus
Marburg virus
Flaviviridae
Dengue virus 1-4
Japanese encephalitis virus
Yellow fever virus
Hepatitis C virus
Border disease virus
Bovine diarrhoea virus
Hog cholera virus
Herpesviridae
Avian herpesvirus 1 (ILT)
Marek’s disease
Bovine herpesvirus 1
Bovine herpesvirus 2
Bovine herpesvirus 3
Bovine herpesvirus 4
Chimpanzee herpesvirus
(pongine herpesvirus 1)
Cytomegalovirus
(Human herpesvirus 5)
Cytomegaloviruses of mouse,
guinea pig and rat
Epstein-Bar virus
(EBV, Human herpesvirus 4)
Herpes virus B
Orthomyxoviridae
Avian influenza virus A-Fowl plague
Equine influenza virus 1 (H7N7)
and 2 (H3N8)
Influenza viruses (Types A, B & C)
Papovaviridae
Animal papillomaviruses
Human papillomaviruses (HPV)
Bovine polyomavirus (BPoV)
Monkey (SV40, SA-12, STMV, LPV)
Paramyxoviridae
Measles virus
Mumps virus
M
2
D
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
3
2
2
4
4
2
3
2
3
2
3
3
3
2
+
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
3
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
2
2
3
3
Parainfluenza viruses types 1-4
Parvoviridae
Adeno-associated viruses AAV
Canine parvovirus (CPV)
Human parvovirus (B 19)
Picornaviridae
Coxsackieviruses
Polioviruses
Swine vesicular disease virus
Bovine rhinoviruses (types 1-3)
Human rhinoviruses
Poxviridae
Entomopoxviruses
Fowlpox virus
Other avipoxviruses
Camelpox virus
Cowpox virus
Horsepox virus
Monkeypox virus
Rabbitpox virus-variant of vaccinia
Vaccinia virus
Variola (major & minor)virus
White pox (Variola virus)
Swinepox virus
Reoviridae
(ortho)reoviruses
Human rotaviruses
Mouse rotaviruses (EDIM,
epizootic diarrhoea of infant mice)
Rat rotavirus
Retroviridae
Avian leucosis viruses (ALV)
Avian sarcoma viruses (Rous
sarcoma virus, RSV)
Bovine foamy virus
Bovine immunodeficiency virus (BIV)
Equine infectious anemia virus
Feline immunodeficiency virus (FIV)
Feline sarcoma virus (FeSV)
Human immunodeficiency viruses
(HIV) types 1 & 2
Human T-cell lymphotropic viruses
(HTLV) types 1 & 2
Leukomogenic murine oncovirus
(Murine lymphosarcoma virus:MuLV)
Lymphosarcoma viruses of
nonhuman primates
Monkey mammary tumor viruses
(MPTV)
Murine mammary tumor viruses
(MMTV)
Murine sarcoma viruses (MuSV)
Porcine sarcoma virus
Rat lymphosarcoma virus
(Rat LSA)
Reticuloendotheliosis viruses
(REV)
Simian foamy virus
Simian immunodeficiency viruses
(SIV)
Simian sarcoma viruses (SSV)
De biologische risicoklasse van enkele relevante pathogenen
65
M
D
3
2
3
3
2
2
2
+
2
3
3
M
Rhabdoviridae
Rabies virus
Vesicular stomatitis virus (VSV)
Togaviridae
Semliki Forest virus
Sindbis virus
Rubella virus
Not classified
Blood-borne hepatitis viruses not
identified yet
Borna diseases virus
D
3
3
3
3
3
3
3
Unrelated agents connected
with
Bovine spongiform
encephalopathy (BSE)
Chronic wasting disease of deer
Creutzfeldt–Jakob disease
Gerstmann-Sträussler-Scheinker
syndrome
Kuru
Mink encephalopathy
Scrapie
Mens en dierpathogene schimmels
M
2
2
OP
OP
OP
2
D
2
2
OP
2
OP
OP
2
Aspergillus flavus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus nidulans
Aspergillus parasiticus
Aspergillus terreus
Aspergillus versicolor
Candida albicans
M
2
3
OP
OP
D
2
2
2
OP
2
2
2
Cryptococcus neoformans
Fusarium coccophilum
Penicillium marneffei
Pneumocystis carinii
Rhizomucor pusillus
Rhizopus cohnii
Rhizopus microspous
LET OP!: dit is een verkorte lijst. De volledige lijst is terug te vinden in Vlarem, rubriek 51, en op www.biosafety.be
Mens en dierpathogene parasieten
M
3
3
2
3
2
2
2
3
3
2
2
D
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
M
Eimeria acervulina
Eimeria burnetti
Eimeria maxima
Eimeria necratix
Eimeria spp.
Leishmania brasiliensis
Leishmania donovani
Leishmania ethiopica
Leishmania major
Leishmania mexicana
Leishmania peruviana
Leishmania spp.
Leishmania tropica
Plasmodium falciparum
Plasmodium spp. (bij mensen en apen)
Pneumocystis carinii
Theileria annulata
2
D
3
2
2
3
2
3
3
2
3
3
3
3
3
3
3
3
2
Theileria hirei
Theileria mutans
Theileria ovis
Theileria parva
Theileria taurotragi
Toxoplasma gondii
Trichomonas foetus
Trichomonas vaginalis
Trypanosoma brucei brucei
Trypanosoma brucei gambiense
Trypanosoma brucei rhodesiense
Trypanosoma congolense
Trypanosoma cruzi
Trypanosoma equiperdum
Trypanosoma evansi
Trypanosoma vivax
Fytopathogenen
N.B.: Hieronder is de pathogeniteit van enkele fytopathogenen aangeduid. Sommige fytopathogenen
zijn bovendien onderworpen aan bepalingen van de federale besluiten voor de bestrijding van voor planten of plantaardige producten schadelijke organismen (quarantaineregels).
66
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
Fytopathogene virussen
P
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
3
2
2
2
2
2
2
Alfalfa mosaic virus
Apple chlorotic leaf spot virus
Apple mosaic virus
Apple stem grooving virus
Barley yellow mosaic virus
Beet western yellows virus
Carnation ringspot virus
Cucumber mosaic virus
Hop american latent virus
Hop mosaic virus
Lettuce mosaic virus
Maize dwarf mosaic virus
Melon necrotic spot virus
Papaya ringspot virus
Pea early-browning virus
Potato leafroll virus
Potato virus A
P
2
2
2
2
2
2
2
3
2
3
2
3
2
2
2
3
3
Potato virus M
Potato virus S
Potato virus X
Potato virus Y
Tobacco mosaic virus
Tobacco necrosis virus
Tobacco rattle virus
Tobacco streak virus
Tobacco stunt virus
Tomato bushy stunt virus
Tomato mosaic virus
Tomato yellow leaf curf virus
Tulip breaking virus
Turnip crinkle virus
Turnip mosaic virus
Wheat dwarf virus
Wheat spindle steak mosaic virus
LET OP!: dit is een verkorte lijst. De volledige lijst is terug te vinden in Vlarem, rubriek 51, en op www.biosafety.be
Fytopathogene bacteriën en aanverwanten
P
2
2
2
2
2
3
3
2
2
Agrobacterium rhizogenes
Agrobacterium rubi
Agrobacterium tumefaciens
Erwinia carotovora subsp. betavasculorum
Erwinia chrysanthemi pv. chrysanthemi
Erwinia salicis
Erwinia tracheiphila
Pseudomonas cichorii
Pseudomonas fluorescens
P
3
3
2
2
3
2
3
Pseudomonas syringae pv. phaseolicola
Pseudomonas syringae pv. pisi
Pseudomonas syringae subsp. syringae
Rhodococcus fascians
Xanthomonas campestris pv. aberrans
Xanthomonas campestris pv. alfalfae
Xanthomonas populi
P
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
3
2
3
Mucor circinelloides
Mucor piriformis
Mucor racemosus
Mucor strictus
Penicillium corymbiferum
Penicillium cyclopium
Penicillium digitatum
Penicillium expansum
Penicillium italicum
Phytophthora infestans
Phytophthora megasperma
Rhizoctonia carotae
Rhizoctonia fragariae
Rhizoctonia tuliparum
Rhizopus arrhizus
Rhizopus stolonifer
Sclerophthora macrospora
Sclerospora graminicola
Sclerotinia minor
Sclerotinia trifoliorum
Septoria apiicola
Septoria azaleae
Septoria chrysanthemella
Septoria lactucae
Septoria lycopersici var. lycopersici
Fytopathogene schimmels
P
2
3
2
2
3
2
2
2
2
3
2
2
3
2
2
2
3
2
3
3
3
3
2
2
2
Alternaria dauci
Alternaria solani
Botrytis allii
Botrytis elliptica
Botrytis fabae
Botrytis hyacynthi
Botrytis tulipae
Cladosporium phlei
Cladosporium variabile
Claviceps gigantea
Claviceps purpurea
Fusarium arthrosporioides
Fusarium coeruleum
Fusarium culmorum
Fusarium graminum
Fusarium oxysporum f. sp. betae
Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici
Fusarium oxysporum f. sp. pisi
Fusarium oxysporum f. sp. trifolii
Fusarium solani f. sp. cucurbitae
Fusarium solani f. sp. phaseoli
Fusarium solani f. sp. pisi
Glomerella cingulata
(anamorph Colletotrichum gloeosporioides)
Glomerella graminicola
(anamorph Colletotrichum graminicola)
Glomerella tucamanensis
(anamorph Colletotrichum falcatum)
Fytopathogene parasieten
P
3
Heterodera glycines
De biologische risicoklasse van enkele relevante pathogenen
67
BIJLAGE 4: LEESCOMMISSIE
Hierbij betuigen wij onze dank aan onderstaande personen die bij de totstandkoming van eerdere
versies van dit boekje nuttige commentaren hebben geleverd.
Ann Van Gysel, communicatiemanager VIB
Bernadette Van Vaerenbergh, WIV, Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie
Greet Van Eetvelde, milieucoördinator, Universiteit Gent
Huub Schellekens, Klankbordcommissie VIB, Universiteit Utrecht
Kim De Rijck,
Mieke Van Lijsebettens, VIB departement Planten Systeembiologie, Universiteit Gent
Hilde Revets, VIB departement Moleculaire en Cellulaire Interacties
Peter Brouckaert, VIB departement voor Moleculair Biomedisch Onderzoek, Universiteit Gent
Thierry Vandendriessche, VIB departement Transgene Technologie en Gentherapie, KULeuven
Wim Van de Ven, VIB departement Menselijke Erfelijkheid, KULeuven
Hubert Backhovens, VIB departement Moleculaire Genetica, UA
68
Leescommissie
BIJLAGE 5: INFORMATIEBLAD
Namen en coördinaten van verantwoordelijken
Deze lijst dient als overzicht van de voor uw afdeling geldende contactpersonen inzake (bio)veiligheid.
Contactpersonen verschillen vaak per afdeling. Vul de onderstaande gegevens zelf in en zorg dat u ze in
het labo bij de hand heeft.
Naam
Telefoon
Overige
Noodnummer
Laboratoriumverantwoordelijke
EHBOverantwoordelijke
Locatie EHBO
verzorgingskast
Coördinator
bioveiligheid
Contactpersoon
Preventiedienst
Arbeidsgeneesheer
Contactpersoon
afval
Regulatory
Affairs Manager VIB
René Custers
09 244 66 11
[email protected]
Als u algemene vragen heeft over inschalingen of te nemen maatregelen, raadpleeg dan eerst uw hiërarchische overste, en indien dit geen uitsluitsel geeft achtereenvolgens uw groepsleider, interne bioveiligheidsexpert of externe bioveiligheidsexpert.
Informatieblad
69
BIJLAGE 6: ZELFTOETS
70
Vraag 1:
Wat is de definitie van een genetisch gemodificeerd organisme?
Vraag 2:
Hoeveel biologische risicoklassen bestaan er voor de indeling van
ziekteverwekkende organismen?
Vraag 3:
Noem drie gevaren die verbonden kunnen zijn met levende en/of gemodificeerde
organismen.
Vraag 4:
Tot welke risicogroep (of biologische risicoklasse) behoort wild type E.coli?
Vraag 5:
Tot welke risicogroep (of biologische risicoklasse) behoren E.coli K12 stammen?
Vraag 6:
Beschrijf de verschillende stappen van de risicoanalyse voor GGO’s
Vraag 7:
Wat is een aerosol?
Vraag 8:
Op welke wijze kan de combinatie van een geïmmortaliseerde cellijn met een virale
vector aanleiding geven tot de ongewenste verspreiding van genetisch
gemodificeerd materiaal?
Vraag 9:
Noem vier belangrijke fysieke inperkingsmaatregelen.
Vraag 10:
Juist of niet juist: risicoklasse 1 GGO’s mogen na het experiment gewoon via
de wasbak geloosd worden.
Vraag 11:
Welke van de volgende ontsmettingsmiddelen werkt niet tegen sporen?
(1) chloor, (2) formaldehyde, of (3) ethanol.
Vraag 12:
Juist of niet juist: besmette materialen die worden hergebruikt hoeven alleen
gewassen te worden. Ze hoeven niet te worden ontsmet.
Vraag 13:
Wat moet je doen als je genetisch gemodificeerde bacteria op een laboratoriumtafel
hebt gemorst?
Vraag 14:
Noem vijf belangrijke werkvoorschriften voor het werken in een veiligheidskabinet
van klasse II.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
Zelftoets
71
Belangrijke werkvoorschriften zijn:(1) Sluit de deur van het L2 laboratorium (2) laat het veiligheidskabinet 10 minuten draaien alvorens te beginnen (3) ontsmet het werkblad en de luchtafzuigroosters
van het kabinet alvorens te beginnen (4) zet alleen strikt noodzakelijke materialen in het kabinet, (5)
zet geen materialen op de luchtafzuigroosters, (6) werk diep genoeg in het kabinet, (7) beweeg rustig
om de luchtstroom zo min mogelijk te verstoren, (8) ontsmet het werkblad en de luchtroosters na het
experiment (9) laat het kabinet nog 5 minuten draaien na het experiment, (10) vul het logboek van
het kabinet in (naam, datum, gebruikt biologisch materiaal, teken af dat je het kabinet ontsmet hebt)
Vraag 14:
De gemorste bacteriën moeten met tissues worden verwijderd die vervolgens in het biologisch
besmet afval worden gegooid. De werktafel moet vervolgens grondig worden ontsmet met tissues
die gedrenkt zijn in een ontsmettingsmiddel, bijvoorbeeld ethanol.
Vraag 13:
Niet juist: Potentieel besmette materialen moeten eerst ontsmet worden (dmv sterilisatie of een
andere gevalideerde methode) voordat ze worden gewassen.
Vraag 12:
Ethanol werkt niet tegen bacteriële sporen. Dus als je bijv met Lactococcen werkt moet je een ander
ontsmettingsmiddel gebruiken.
Vraag 11:
Niet juist, ook risicoklasse I GGO’s moeten geïnactiveerd worden. Er zijn slechts enkele uitzonderingen mogelijk waarvoor je de expliciete toelating nodig hebt van de bevoegde overheid.
Vraag 10:
voorbeelden zijn: gesloten ramen en deuren, goed ontsmetbare werktafels, een veiligheidskabinet
van klasse II, onderdruk, een sas, HEPA gefilterde luchtafvoer, etc.
Vraag 9:
Een geïmmortaliseerde cellijn kan soms virussequenties bevatten (bv HELA cellen bevatten de E6E7
genen van HPV) die tesamen met de virussequenties aanwezig in de vector aanleiding kan geven
tot de vorming van infectieuze viruspartikels.
Vraag 8:
Een aerosol bestaat uit zeer fijne vloeistofdruppeltjes die zich via de lucht verspreiden. De druppeltjes kunnen levensvatbare micro-organismen bevatten en op die manier zorgdragen voor de verspreiding van deze organismen naar de omgeving.
Vraag 7:
(1) Lijst alle potentiele gevaren op verbonden aan de gastheer, insert en vector. (2) Hiermee bepaal
je een eerste idée van de risicoklasse (3) Identificeer vanuit deze risicoklasse de benodige inperkingsmaatregelen, rekening houdend met het omringende milieu, het type en de schaal van de activiteit, en eventuele niet-standaard handelingen. (4) Bepaal de definitieve risicoklasse.
Vraag 6:
E.coli K12 stammen zijn geattenueerd (kreupel gemaakt) en zijn niet langer in staat ziekte te veroorzaken. Daarom behoren ze tot risicogroep 1.
Vraag 5:
Wild type E.coli behoort tot risicogroep 2 en kan dus ziekte veroorzaken.
Vraag 4:
Onder andere: ziekteverwekkendheid, giftigheid, of verstoring van ecologische evenwichten.
Vraag 3:
Er zijn vier biologische risicoklassen (1 tot 4). Klasse 1 organismen kunnen geen ziekten veroorzaken, klasse 2, 3 en 4 organismen wel.
Vraag 2:
Een genetisch gewijzigd organisme is een organisme waarvan het genetisch materiaal is gewijzigd
op een wijze die niet mogelijk is door middel van voortplanting of natuurlijke recombinatie.
Vraag 1:
ANTWOORDEN