No Slide Title
advertisement
LENGTE METEN VAN EEN GENOOM Gew. E.coli genoom is 2.6 x 107 of 4.6 x 106 baseparen of 4600 KBP of 4.6 mega-baseparen. Een helix bevat 10 baseparen en is 3.4 nm lang. Lengte van de DNA draad is 4.6 x 106 x 0.34 nm = 1564 mm. Grootte cel is ongeveer 1 mm Mol. UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie Annealing Probe Primer Enkelstrengig naar dubbelstrengig DNA Baseparing DENATURATIE-RENATURATIE- HYBRIDISATIE The result is a double stranded molecule organised in a double helix Note that the strands or oriented in the opposite direction The bases are connected via H-bridges: two H-bridges for the A=T pair and 3 for the G C pair UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie Native (Double helix) Denatured (random coil) UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie Melting curve: Tme UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie PARAMETERS VAN ZUIVER DNA 1 mg DNA per ml komt overeen met een OD260 van ongeveer 2 OD260/OD280 tussen 1.8 en 2.2 OD234/OD260 ongeveer 0.5 UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie Comparison of prokaryotic cells and eukaryotic organelles Prokaryotic cell DNA Histones circular histone-like proteins Ribosomes 70S ssu rRNA 16S Growth binary fission UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie Eukaryotic cell Eurakyotic organelles (mitochondria & chloroplasts) linear yes circular no 80S 18S mitosis 70S 16S binary fission UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie MOLECULAIR KLONEREN Uit een komplex genoom een klein deel halen en inbrengen in een eenvoudige vector die zich zeer vlug kan vermenigvuldigen DNA mRNA vector cDNA transformatie vector transformatie Genoom bib UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie cDNA bib UNIVERSITEIT GENT Faculteit Wetenschappen Laboratorium voor Microbiologie Restrictie en aantal fragmenten 4 x 10 6 BP (E. coli), kans op voorkomen van een restrictie site Is 1/ 4n, waarin n het aantal basen is in de site aantal fragmenten fragment grootte (Nf=S/4n) Tetracutter 4.6x106/256=~15 000 ~260 BP Hexacutter ~1000 ~ 4000 BP Octacutter ~ 60 ~66 000 BP DNA restrictie In vector fragmenten splicing cDNA In vector Transformatie of transductie Genoom bib:109 cellen waarin al dan niet de vector met al dan niet een vreemd restrictiefragment cDNA bib:109 cellen waarin al dan niet de vector met al dan niet een vreemd exon ln(1-p) N = ---------ln(1-f) N = aantal clones P = probabiliteit om een bepaalde sequentie op te sporen F = fractie van het genoom aanwezig in iedere clone Menselijk genoom wordt geschat op 3 x 106 KBP Indien men veronderstelt dat in er in Lambda een insert van 17 KBP ingebouwd is, wordt : 1.7 x 104 f = ------------3 x 109 en betekent dit dat 8.1 x 105 fagen nodig zijn om 99% kans te hebben dat om het even welk menselijk gen in op zijn minst één clone zal aanwezig zijn. Indien men pBR322 zou gebruikt hebben (insert van 5 KBP) dan zou de bibliotheek verschillende miljoenen klones moeten bevatten om het gehele genoom te bestrijken. SCREENEN VAN DE BIBLIOTHEKEN 1. Welke gastheercellen bevatten de vector? 2. Bevat de vector vreemd DNA? 3. Identificatie van het vreemd DNA Via het DNA Via het eiwit 1. WELKE GASTHEERCELLEN BEVATTEN DE VECTOR? Antibiotica resistentie Lac Z complementatie 2. WELKE VECTOREN BEVATTEN VREEMD DNA? Tweede antibiotica resistentie Lac Z complementatie IDENTIFICATIE VAN DE CLONES Via het DNA: Probe via reverse translation cDNA, PCR technieken, Subtractieve hybridisatie. Via het eiwit indien het tot expressie komt: Immunologie, Western blot, Gevoelige signalisatie gebruiken
