De wet van Lambert

MOLECULAIRE
SPECTROFOTOMETRIE

Principe: In de spectrofotometrie wordt de concentratie van een
gekleurde stof bepaald door de kleur dan de oplossing van die stof
te vergelijken met oplossingen waarin diezelfde gekleurde stof zit
maar dan in concentraties die bekend zijn. De kleur kan afkomstig
zijn van de stof zelf maar kan ook het reactieproduct zijn van de te
meten stof met een geschikt reagens.

Concentratie van een onbekende kan al met het blote oog geschat worden
Sneltesten: indicator strips (bijvoorbeeld voor aquaria: nitraat, nitriet, ...)
Nauwkeurige meting: met spectrofotometer

Oplossing heeft een kleur omdat het een gedeelte van het licht absorbeert


MOLECULAIRE SPECTROFOTOMETRIE
LICHT = elektromagnetische golven
Naargelang de energie-inhoud van deze
golven wordt het elektromagnetisch
spectrum opgesplitst in :
WAT IS LICHT ?
 Gammastraling
(behandeling van kanker)
 X-stralen
(geneeskunde)
veel energie
 Ultraviolet stralen
 Zichtbaar licht
 Infrarood stralen
 Microgolven
(microgolfovens)
 Radiogolven
(F.M. radio, radar, televisie)
weinig energie
MOLECULAIRE SPECTROFOTOMETRIE
Enkel een klein deel van het
elektromagnetisch spectrum is
voor de mens zichtbaar als kleur.
WAT IS LICHT ?
Dit is dan het zichtbare gedeelte.
In dit zichtbare deel van
het spectrum kunnen we 7
basiskleuren onderscheiden
(dit zijn de kleuren van de
regenboog):
Rood, Oranje, geel,
groen, blauw, indigo
en violet.
MOLECULAIRE SPECTROFOTOMETRIE

Ultra Violet (UV)
200 - 400 nm

Zichtbaar (Visible - Vis)
400 - 800 nm

Nabij Infra Rood (NIR)
800 - 2500 nm

Infra Rood (IR)
2500 - 12500 nm
Electromagnetische golven
Licht is een elektromagnetisch golfverschijnsel dat zich in vacuum met een
constante snelheid (c) van ca. 300 000 km/s voortplant.
Een golf kunnen we karakteriseren met:
De trillingstijd T: de tijdsduur van een trilling (eenheid: s)
De frequentie f: het aantal trillingen per seconde (eenheid: Hz) (f=1/T).
De golflengte l: de lengte van een trilling (eenheid: nm (10-9 m) of Å (10-10 m))
Het golfgetal s:1/ l (eenheid: cm-1) - wordt voornamelijk in de Infra Rood
spectroscopie gebruikt
de golfsnelheid: c = (afgelegde weg / tijd) = l / T = f . l (f=1/T).
als de golflengte toeneemt neemt de frequentie af en vice versa.
Electrisch
veld
Magnetisch veld
Kleurencirkel en kleurenspectrum
• als we uit wit licht de kleur groen verwijderen: geeft rode kleur
•. We zien steeds de complementaire kleur
• liggen tegenover elkaar in het kleurenspectrum
Licht als energie

De intensiteit van een bundel licht is een maat voor de hoeveelheid
energie. Deze bundel bestaat uit een stroom energiedeeltjes. Deze
deeltjes worden KWANTEN of FOTONEN genoemd.
De wet van Planck

De energie inhoud van elk deeltje is evenredig met de frequentie.
Dit wil zeggen dat een bundelstraling met een frequentie f bestaat
uit fotonen met een energie gelijk aan :
E = h . f = h.c/l
Hierin is h = de constante van Planck = 6,625 x 10-34 J.s
Interactie tussen materie en straling

Materie getroffen door electromagnetische
straling:



De straling wordt doorgelaten: fotonen passeren ongehinderd
De straling wordt verstrooid: fotonen veranderen van richting
De starling wordt geabsorbeerd: fotonen worden door het
medium opgenomen


Energie van het medium zal stijgen met de energieinhoud van de
fotonen
E2= E1 + hf
Moleculaire energieniveaus
Veel meer vrijheidsgraden dan een atoomkern+electronen
Buig, strek, rotatie-modes met eigen gequantizeerde energieniveaus
Kleine energieverschillen ! dichte `bosjes’ van lijnen, voornamelijk IR
De opgenomen energie kan gebruikt worden ter verhoging van:
•Rotatie energie:snelheid waarmee een molecule draait om zijn as
•Vibratieenergie: trillen van de atomen in een moleculen
•Electronen energie: energie die de electronen bezitten in hun banen
om de atoomkern
Etot= Eelc + Evib + E rot
Eelec >> Evib >> Erot
VIS
IR
micro
Energie
Aangeslagen toestand
E3=hf3=h.c/l3
E2=hf2=h.c./l2
E1=hf1=h.c./l1
Electronen
In grond toestand
Grond toestand
Vibrationele niveaus
Rotationele niveaus
Spectrofotometrie
I 0 = I a + It + Ir
Indien men er voor zorgt dat Ir = 0 door bv. een blanco te
gebruiken en te zorgen dat de reflectie geminimaliseerd
wordt dan is de bovenstaande vergelijking gelijk aan :
I0 = Ia + It
De wet van Lambert
invloed van de vloeistofdikte (cuvette lengte) ten opzicht van de intensiteit van
de lichtstraal.
de intensiteit van de uittredende lichtstraal t.o.v. de vloeistofdikte vertoont een
exponentieel dalende kurve.
 kb
I t  I 0 10
Waarin k een constante is en b de dikte van de vloeistoflaag
It
It
 10 kb
I0
b
Absorptie
It
T
I0
log
It
 log 10 kb  kb log 10  kb
I0
transmissie
It
A   log
  log T
I0
%T 
It
x100
I0
Dan wordt
Procentuele
transmissie
A  k.b
Wet van Beer






Naar analogie van de bovenstaande afleiding van de wet van
Lambert kan men de wet van Beer bepalen.
Hierin wordt de absorptie bestudeerd i.f.v. de concentratie van de
oplossing waardoor men licht gaat zenden.
Men bekomt eveneens een exponentieel dalende kurve met
volgende formule :
It = I0 . 10 – k2.C
Verdere analoge afleiding leert ons dat de absorptie in een oplossing
rechtevenredig toeneemt met stijging van de concentratie in de
oplossing of :
It
A = k2 . C
C
Wet van Lambert-Beer
Indien men de wet van Lambert en Beer samenvoegt kan men stellen
dat :
A=k.b
A = k2 . C
Of dat A =k. k2 .b. C
A = ε .b. C
ε = molaire absorptiecoefficient (L/(mol.cm))
b= dikte van de cuvette
c= concentratie in mol/L
De wet van Lambert-Beer geldt alleen als aan de volgende voorwaarden wordt voldaan:
•monochromatisch licht
•"optisch lege" vloeistoffen (geen lichtverstrooiende deeltjes aanwezig)
•constante temperatuur
•niet te geconcentreerde oplossing
Opnemen van absorptiespectrum


Manueel of automatisch (in nieuwere toestellen)
2 oplossingen:


blanco (bevat alles behalve de te meten stof)
Standaard met hoogste concentratie
Voorbeeld: Fe2+ + fenantroline geeft rood complex
dus absorbeert tussen 480 en 550nm
we nemen het spectrum op tussen 450 en 600nm
0,3
l
A
450
0,07
470
0,1
490
0,17
510
0,22
530
0,25
550
0,25
570
0,21
590
0,14
610
0,07
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
400
450
500
550
600
650
Doel = Concentratiemetingen
Calibratiemethode: ijklijn
Van de te bepalen verbinding wordt een serie (nauwkeurig
bekende!) verdunningen gemaakt, waarvan de absorpties worden
gemeten.
Door gebruik te maken van interpolatie kan de concentratie van
een onbekend monster na meting van de absorptie worden berekend
Ax
A4
y = ax + b
A3
A2
A1
C1
C2
C3
C4
Cx
Concentratiebepaling: praktisch
voorbeeld




Fe met fenantroline
Welk concentratiegebied: rekening houden met lineair gebied (uit
literatuur): tot 10 mg/L
Maak stockoplossing van 0.5g/L=500 mg/L
Hieruit maken we verdunningen :


0mg/L, 1mg/L, 2mg/L, 3mg/L, ....10mg/L en meten de absorbantie
Concentratiebepaling:



Meet Absorbantie van onbekende oplossing
Kunnen gemiddelde ε bepalen uit de standaarden en deze gebruiken in
de berekening
Kunnen ijkrechte opstellen en concentratie van onbekende berekenen
uit vergelijking
Instrumentatie
intreespleet
lichtbron
uittreespleet
detector
uitlezing
versterker
golflengteselectie
cuvet
stralingsbron



De Stralingsbron moet van constante stralingsintensiteit
zijn en straling uitzenden zo gelijkmatig mogelijk over
het gehele golflengtegebied verdeeld.
Meestal gebruikt men voor het zichtbare gebied een
wolfraam lamp die een continue spectrum heeft van 350
- 2500 nm.
Een Deuteriumlamp met een hoge intensiteit tussen 180
nm en 375 nm

Deze lamp wordt in het U.V. gebied gebruikt.
Golflengteselectie


Filters of monochromators worden gebruikt om de door de bron
uitgezonden straling te scheiden in zijn samengestelde golflengtes.
Monochromatisch licht nodig voor:




Grotere selectiviteit
Betere gevoeligheid
Zekerheid dat aan wet Lambert-Beer voldaan wordt
Voor de golflengteselectie kunnen:


Filters (absorptie of interferentiefilters)
Monochromators: prismas en roosters
Filters
Absorptiefilters
Dit zijn filters die een deel van het lichtspectrum doorlaten en een ander deel
tegenhouden door absorptie. Ze bestaan uit gekleurd glas of uit een organische kleurstof
gesuspendeerd in gelatine en vastgehouden tussen glazen plaatjes.
Ze hebben een effectieve bandbreedte van bv. 20 nm dwz dat bv. een filter van 500 nm
eigenlijk alle golven doorlaat tussen 490 nm en 510 nm
Interferentiefilters
Deze zijn gebaseerd op optische interferentie, reflectie en uitdoving.
Ze hebben een kleinere bandbreedte dan de absorptiefilters
MONOCHROMATORS: Prisma




Wet van Snellius
Lichtstralen worden gebroken bij
de overgang van lucht naar glas
(wet van Snellius)
(n=brekingsindex)
Breking is golflengteafhankelijk:
hierdoor krijgen we dispersie
van licht
Een lens focuseert het
uittredend licht naar de
uittreespleet
Door het prisma te draaien kan
men de gewenste golflengte
selecteren
Monochromator: rooster





Rooster of tralie op
regelmatige afstand van elkaar
(vb. krassen op een glazen
plaat (zo als een CD)
Parabolische spiegel richt wit
licht op het rooster
Licht van verschillende
golflengtes wordt weerkaatst
onder een andere hoek
2de spiegel richt het weerkaatst
licht op de uittreespleet
Door de tralie te draaien
selecteert men de golflengte
monochromator
Een monochromator zal de lichtstraling
scheiden volgens de golflengte en zal om
het even welk deel van de straling
doorlaten. Alle licht gaat dus door heen de
monochromator. Er zal dus niet
geselecteerd worden door absorptie zoals
bij filters.
cuvetten
Kuvetten zijn de recipiënten die gebrukt worden om de oplossingen te
meten in de spectrofotometer.
Er bestaan talrijke uitvoeringen naargelang het gebruik.
Kuvetten kunnen gemaakt zijn uit glas, kwarts of kunststof.
Kwartskuvetten worden gebruikt voor het werken in het UV-gebied,
hoewel heden ook kunststofkuvetten uit bv. metacrylaat kunnen
gebruikt worden
Naargelang het volume kan men kuvetten van verschillende inhoud en
weglengte gebruiken.
De meest gebruikte weglengte is één cm en het meest courante
volume is 3,5 ml en 1,5 ml.
Een kuvet heeft meestal twee gepolijste of heldere zijden en twee
matte zijden, doch voor bv. fluorimetrie moet men kuvetten gebruiken
met vier gepolijste zijden.
detector
De stralingsdetector (bv fotocel) zet de erop vallende straling om in een
elektrisch signaal dat na versterking wordt gemeten. Van de detector
wordt vereist:
- een hoge gevoeligheid voor een groot golflengtegebied
- een rechtlijnig verband tussen de intensiteit van de lichtstraling en het
daardoor opgewekte elektrische signaal.
De versterker moet een lineaire afhankelijkheid tussen invoer en
uitvoer bezitten.
De meter geeft het gemeten signaal aan op een transmissie schaal (%)
en/of extinctie schaal (log-schaal).
Fotocel: cylindrisch glazen omhulsel
met fotogevoelige kathode en
anode.Lichtinval rukt electronen los uit
kathode die worden aangetrokken door de
kathode waardoor een stroom ontstaat
Fotovermeningvuldigings
buis: een fotogevoelige kathode
en 10 anodes op verschillend
potentiaal: geeft een belangrijke
versterking van het signaal
uitlezing
•De meetresultaten van een spectrofotometrische bepaling
worden zowel analoog als digitaal geregistreerd
•kan ze zowel als een absorptie A of Procentuele Transmissie %
T aflezen.
•Ook kan men bij een aantal spectrofotometers rechtstreeks
concentraties aflezen mits men de richtingscoëfficiënt ( de
molaire absorptiecoëfficiënt ) kent en in het apparaat vastlegt.
Spectrofotometrische titratie
Automatische buret
spectrofotometer
recorder
Papier loopt met
constante snelheid
(cm/min)
In plaats van een cuvet
meetcel (1cm)
ondergedompeld in de
oplossing
Titreren met constante debiet
(ml/min)
Spectrofotometrische titratie van azijn
CH3COOH
NaOH
FFT
kleurloos
roos-paars
Eindpunt van de titratie
Bepaling absorptiespectrum FFT in zuur en basisch midden
A
A
Bepaling werkgolflengte
l
zuur
CH3COOH + NaOH
l
basisch
CH3COONa + H2O