tiespectrometrie in UV en zichtbaar licht - chem

Moleculaire Absorptiespectrometrie in UV
en zichtbaar licht
D.Bax
Universiteit Utrecht (2002)
MOLECULAIRE ABSORPTIESPECTROMETRIE
IN UV EN ZICHTBAAR LICHT
COLOFON
Dit dictaat is bestemd voor het praktische en theoretische onderwijs in het
kernprogramma voor het doctoraal examen scheikunde. Dit dictaat heeft niet de
pretentie dat het de stof uitputtend behandelt. Het gaat voldoende diep op de stof in
om na bestudering, praktische spectrofotometrie met inzicht in de gang van zaken te
kunnen bedrijven.
Het wordt aan de Universiteit Utrecht gebruikt op het tweedejaars practicum van de
faculteit scheikunde, onderdeel "Analytisch Chemisch Meten".
Utrecht, oktober 1997, mei 2002
INHOUDSOPGAVE
1
1.1
1.2
1.3
2
3
4
4.1
4.2
4.2.1
4.2.2
5.
5.1
6
6.1
6.2
6.3
7
8
8.1
8.2
8.3
8.4
9
10
11
11.1
11.2
11.3
11.4
12
13
Inleiding
Waarom is een rode oplossing rood gekleurd?
Wat zijn complementaire kleuren?
Wat doet een gekleurde oplossing met het geabsorbeerde licht?
Wet van Planck
Interactie tussen straling en materie
Wet van Lambert en Beer
Afleiding
Afwijkingen van de wet van Lambert en Beer
'Echte' afwijkingen van de wet van Lambert en Beer
'Schijnbare' afwijkingen van de wet van Lambert en Beer
Lichtbron
Waterstof- en Deuteriumlamp
Monochromator
Interferentiefilter monochromator
Prismamonochromator
Roostermonochromator
Detector
Spectrometers voor UV- en zichtbaar licht
Enkelstraals spectrometer
Dubbelstraals spectrometer
'Diode array' spectrometer
UV-detectie bij High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Optimale extinctiewaarden
Optische doorlaatbaarheid
Absorptie-spectrometrie in UV- en zichtbaar licht
Organische verbindingen
Anorganische verbindingen
'Charge transfer' complexen
Gewenste eigenschappen van de lichtabsorberende verbinding
Nomenclatuur
Literatuur
1
1
1
1
2
2
3
3
5
5
5
6
6
7
7
8
8
9
10
10
10
11
11
11
13
15
15
15
16
16
17
17
Moleculaire absorptiespectrometrie in UV en zichtbaar licht
1. Inleiding
1.1 Waarom is een rode oplossing rood gekleurd?
Een oplossing van Fe(SCN)2+-ionen in water is rood gekleurd omdat de ionen vooral
groen licht uit het ingestraalde witte licht absorberen. Het overblijvende licht zien wij
als rood. De verandering van de doorgelaten lichtintensiteit bij veranderende concentratie van de ionen is in dat geval het grootst bij meting van de intensiteit van het
groene licht.
In het algemeen geldt dat de meting van de hoeveelheid geabsorbeerd licht het
gevoeligst kan indien de kleur van het gemeten licht complementair is aan de kleur
van de oplossing waaraan gemeten wordt.
TABEL 1
Zichtbare deel van het elektromagnetische spectrum (400-800 nm)
Golflengte
[nm]
400-435
435-480
480-490
490-500
500-560
560-580
580-595
595-650
650-750
Kleur
Violet
Blauw
Blauw-groen
Groen-blauw
Groen
Geel-groen
Geel
Oranje
Rood
Complementaire
kleur
Geel-groen
Geel
Oranje
Rood
Purper
Violet
Blauw
Blauw-groen
Groen-blauw
1.2 Wat zijn complementaire kleuren?
Indien twee kleuren licht in de juiste verhouding worden gemengd, door de twee
lichtbundels op één wit vlak te laten vallen en het resultaat is voor de waarnemer wit
licht, dan spreekt men van complementaire kleuren.
1.3 Wat doet een gekleurde oplossing met het geabsorbeerde licht?
Volgens de kwantumtheorie heeft elk atoom, ion of molecuul een discreet aantal
energieniveaus. Het laagste energieniveau noemt men de grondtoestand, bij een
hoger energieniveau spreekt men van een aangeslagen toestand. Bij
kamertemperatuur zijn vrijwel alle genoemde deeltjes in de grondtoestand. Indien
een lichtkwant of foton met een energie die precies gelijk is aan het energieverschil
tussen een aangeslagen toestand en de grondtoestand het deeltje treft dan kan dat
deeltje het foton absorberen. Daarbij raakt het deeltje in de aangeslagen toestand
volgens reactie (1):
M + “passend foton:” → M*
-1-
(1)
Na korte tijd, de relaxatietijd: 10-6 tot 10-9 s, valt het deeltje terug naar de
grondtoestand. De energie die daarbij vrijkomt draagt het deeltje over aan andere
deeltjes in zijn omgeving. Dit proces veroorzaakt een kleine stijging van de
temperatuur in de omgeving van het deeltje:
M* → M + warmte
(2)
De relaxatietijd is zó gering, dat op elk moment de concentratie aan aangeslagen
deeltjes zeer klein is. De vrijkomende hoeveelheid warmte is zo gering dat een
temperatuurstijging niet meetbaar is.
2. Wet van Planck
Indien een atoom, ion of molecuul, door het absorberen van een passend foton,
overgaat van de ene energietoestand (bijv. de grondtoestand) in een andere (de
aangeslagen toestand) dan geldt daarvoor de wet van Planck:
(3)
waarin ΔE het energie verschil [J] tussen de beide energietoestanden, h de
constante van Planck [J s], c de snelheid van het licht [m s-1], λ de golflengte [m] en
ν de frequentie van de straling [s-1]. Omdat de energieniveaus E1 en E2 discrete
waarden hebben, wordt ook straling met discrete golflengten (of frequenties) geabsorbeerd.
3. Interactie tussen straling en materie
UV- en zichtbaar licht zijn beide vormen van elektromagnetische straling. Straling uit
een groot deel van het elektromagnetische spectrum kan interactie aangaan met
materie. De energie-inhoud van de straling, die afhankelijk is van de golflengte
ervan, bepaalt welke soort interactie plaats vindt. Een overzicht van de soort
interacties die straling met materie kan aangaan is gegeven in Tabel 2.
TABEL 2
Spectrum van elektromagnetische straling
straling:
golflengte:
interactie met:
Gamma
Röntgen
<0.1 nm
0.1-5 nm
UV
50-400 nm
Zichtbaar licht
IR + Microgolven
400-800 nm
1-500 mm
Radar
ca. 1 cm
TV, FM-radio
Korte golf radio
Midden golf radio
Lange golf radio
1-10 m
10-100 m
100-500 m
500-1500 m
kern
binnenste
elektronen
bindings- en
π-elektronen
bindingselektronen
rotatie en vibratie
in moleculen
elektronenspin
(ESR ± 3 cm)
kernspin (NMR)
geen
geen
geen
-2-
Zowel spectrofotometrie d.w.z. een vorm van moleculaire absorptie spectrometrie als
atomaire absorptie- en atomaire emissie spectrometrie maken gebruik van
interacties in het ultraviolette en het zichtbare deel van het elektromagnetische
spectrum. Het verschil is dat bij spectrofotometrie sprake is van interacties met
bindingselektronen en π-systemen in moleculen terwijl bij atomaire absorptie- en
atomaire emissiespectrometrie sprake is van interacties met elektronen in de
buitenste schil van afzonderlijke atomen.
Bij AAS vindt de (atomaire) absorptie plaats binnen een zeer nauwe spectrale band.
Bij spectrofotometrie daarentegen vindt de moleculaire absorptie plaats in een brede
spectrale band. Dit komt omdat bij moleculaire absorptie naast (veel) elektronenovergangen ook vibratie- en rotatie-energieën een rol spelen. Hoewel ook dan in
principe slechts discrete golflengten kunnen voorkomen, is het aantal overgangen zó
groot dat het spectrum bij waarneming toch continu lijkt te zijn (Fig.1). Daardoor vindt
moleculaire absorptie en emissie plaats in (soms brede) banden.
Fig.1. Energieniveaus in een molecuul.
E = elektronenniveaus, V = vibratieniveaus, r = rotatieniveaus.
Zeer veel overgangen ΔEi zijn mogelijk.
Bij de overgang van Eo naar E1 hangt het
sterk af van V en r wat de exacte waarde
van ΔEi is.
4. Wet van Lambert en Beer
4.1. Afleiding
We beschouwen de afname van de invallende lichtintensiteit Io ten gevolge van
lichtabsorptie na doorgang door een medium waarin een concentratie aan absorberende deeltjes c en met dikte b. Daartoe denken we de absorberende laag
opgedeeld in zeer dunne laagjes met dikte db. De afname in de lichtintensiteit dI ten
gevolge van de doorgang door het laagje is evenredig met de dikte db, met de
daarop invallende lichtintensiteit I en met de concentratie aan absorberende deeltjes
c. In formule geldt voor een laagje met dikte db:
dI = -a⋅I⋅c⋅db
waarin a een evenredigheidsconstante is. Deze vergelijking kan omgewerkt en
geïntegreerd worden:
-3-
(4)
(5)
of:
ln I -ln Io = -a⋅c⋅b
(6)
en:
(7)
per definitie geldt:
(8)
dus:
A = ε⋅b⋅c
(9)
Vergelijking (9) heet de Wet van Lambert en Beer. Hierin is A de extinctie, ε de
molaire extinctiecoëfficiënt [l mol-1 cm-1], een andere evenredigheidsconstante
vanwege de omzetting van ln naar log, b de dikte van de lichtabsorberende laag [cm]
en c de concentratie van de absorberende stof [mol l-1]. I/Io ≡ T wordt de transmissie
genoemd.
Uit vergelijking (9) volgt dat er een lineair verband bestaat tussen A en c mits ε een
constante is. Het blijkt dat ε afhankelijk is van de aard van de stof en van de
golflengte. Het genoemde lineaire verband bestaat dus alleen bij gebruik van
monochromatisch licht. Als A wordt uitgezet tegen c, dan is de helling van de ijklijn,
dat is dus de gevoeligheid gelijk aan ε⋅b. Een grote waarde van ε maakt dus een
gevoelige bepaling mogelijk. De molaire extinctiecoëfficiënt ε is een maat voor de
kans dat een energie-overgang plaats vindt en dat licht dientengevolge wordt
geabsorbeerd.
De wet van Lambert en Beer is ook toepasbaar op mengsels van absorberende
stoffen, mits deze stoffen onderling geen interactie aangaan. Extincties zijn dan
additief, d.w.z. dat extincties van verschillende stoffen gewoon bij elkaar kunnen
worden opgeteld. Als Ai de extinctie is van verbinding "i", dan geldt bij één golflengte
de formule:
Atotaal = A1+A2+A3+... = ε 1 b c1 + ε 2 b c2 + ε 3 b c3 +...
⋅
⋅
⋅
⋅
⋅
⋅
(10)
Door bij meerdere golflengten de extinctie te bepalen is het soms mogelijk mengsels
van meerdere lichtabsorberende stoffen te analyseren. Als er n stoffen in het
mengsel aanwezig zijn met een bekende ε i, dan kunnen in principe de concentraties
bepaald worden uit n vergelijkingen (= metingen bij verschillende golflengten) met n
onbekenden. In de praktijk kan dit lastig of onmogelijk zijn, ook omdat de
extinctiecoëfficiënten veelal onbekend zijn.
-4-
4.2. Afwijkingen van de wet van Lambert en Beer
Afwijkingen van de wet van Lambert en Beer kunnen onderverdeeld worden in
'echte' afwijkingen en 'schijnbare' afwijkingen. Echte afwijkingen komen weinig voor.
Schijnbare afwijkingen kunnen veroorzaakt worden door instrumentele of door
chemische effecten. Deze afwijkingen leiden in het algemeen tot gekromde ijklijnen.
4.2.1. 'Echte' afwijkingen van de wet van Lambert en Beer
Echte afwijkingen kunnen ondermeer voorkomen bij sterk geconcentreerde
oplossingen waar de opgeloste lichtabsorberende deeltjes elkaar gaan beïnvloeden.
Door deze interactie kan het vermogen om licht te absorberen veranderen.
Moleculaire absorptie blijkt ook afhankelijk te zijn van de brekingsindex voor het
geabsorbeerde licht. Als verandering van de concentratie leidt tot een verandering
van de brekingsindex dan zal dit afwijkingen van de wet van Lambert en Beer tot
gevolg hebben. Dit laatste effect treedt zelden op bij concentraties < 10-2 mol l-1.
Om voorgaande redenen wordt het gebruik van de wet van Lambert en Beer beperkt
tot oplossingen met concentraties <10-2 mol l-1.
4.2.2. 'Schijnbare' afwijkingen van de wet van Lambert en Beer
Schijnbare afwijkingen van de wet van Lambert en Beer kunnen voorkomen als
gevolg van instrumentele imperfecties of als gevolg van chemische processen.
Strooilicht, dat is een teveel aan licht dat ten gevolge van reflecties van ongewenst
licht binnen het apparaat en/of door onvolkomenheden van de monochromator de
detector bereikt, leidt tot schijnbare afwijkingen. Ook verlies aan (gewenst) licht door
reflecties, met name in de meetkuvet kan leiden tot schijnbare afwijkingen.
Een andere bron van instrumentele afwijkingen is een niet constante waarde van ε.
De extinctiecoëfficiënt ε is een functie van de golflengte λ. Aangezien
monochromatisch licht altijd een zekere bandbreedte heeft, neemt men bij voorkeur
ε -waarden waarvoor geldt dat dε /dλ = 0, dat zijn dus maxima in de ε vs. λ grafiek,
zodat ε binnen de gebruikte bandbreedte zo constant mogelijk is (Fig. 2).
Fig.2. Het effect van de bandbreedte op de gemeten extinctie: Binnen band A is de
extinctie (eigenlijk ε) constant, terwijl binnen band B de extinctie varieert waardoor
het lineaire verband tussen A en c verloren gaat.
-5-
Afwijkingen van de wet van Lambert en Beer door chemische processen kunnen
optreden als de lichtabsorberende stof deelneemt aan een concentratie-afhankelijk
evenwicht zoals een dissociatie of een associatie. Voorbeelden daarvan zijn
gekleurde pH-indicator oplossingen waarbij zowel de gedissocieerde als de ongedissocieerde vorm van de indicator licht van de meetgolflengte absorberen. Uitgewerkte
voorbeelden zijn te vinden in de literatuur [1,2].
5. Lichtbron
Om de lichtabsorptie als functie van de golflengte te kunnen bepalen, d.w.z. om een
absorptiespectrum van een stof te kunnen maken moet men beschikken over een
lichtbron met voldoende intensiteit en die in het gewenste spectraalgebied een
continuüm uitzendt. Voor spectrofotometrie in zichtbaar licht wordt daarvoor gebruik
gemaakt van een (halogeen) gloeilamp met wolfraam gloeispiraal, bruikbaar in het
gebied 240-2500 nm. Voor het UV- gebied wordt gebruik gemaakt van een H2- of
een D2-lamp. De laatste zendt een continuüm uit in het gebied 180-300 nm. Voor
elke lichtbron geldt dat de intensiteit Io van het uitgezonden licht afhankelijk is van de
golflengte λ.
5.1. Waterstof- en Deuteriumlamp
Deuterium is een isotoop van waterstof waarvan de kern één proton en één neutron
bevat. Een gasontladingsbuis gevuld met deuteriumgas of waterstofgas bij lage druk
zendt in het UV-gebied, tussen ca. 180 en 300 nm een continu spectrum uit (Fig.3).
Dit continuüm wordt verkregen doordat een geëxciteerd molecuul wordt gevormd dat
uiteen valt in twee atomen en een UV-foton. Voor waterstof:
H2 + Eel. → H2* → H' + H" + foton
(11)
Hierin is Eel. de elektrische energie die door het waterstofmolecuul geabsorbeerd
werd. De energie van het geëxciteerde waterstofmolecuul, H2*, is weliswaar
gekwantiseerd, en kan dus slechts discrete waarden aannemen, maar EH' en EH"
niet.
Energetisch geldt dat de som van de kinetische energieën van H' en H" plus de
energie van het foton gelijk moet zijn aan de energie van het geëxciteerde
waterstofmolecuul.
EH2* = EH' + EH" + h⋅νfoton
(12)
De som van de beide kinetische energieën kan variëren van 0 tot de energie van het
geëxciteerde waterstofmolecuul. Als deze som klein is, is h⋅ν groot en omgekeerd.
Als consequentie zendt een waterstoflamp een "echt" continu spectrum uit. Voor een
deuteriumlamp geldt hetzelfde, het bruikbare werkgebied van de deuteriumlamp is
iets groter dan dat van de waterstoflamp. Ook bij dit type lampen geldt dat de
intensiteit Io niet bij elke golflengte dezelfde is.
-6-
Fig.3. Emissiespectrum (continuüm) van
een deuteriumlamp.
6. Monochromator
De monochromator dient bij moleculaire absorptie metingen om het gewenste
monochromatische licht te verkrijgen. De bandbreedte van absorptiebanden bij
moleculaire absorptie is, zoals we eerder zagen groot. Het benodigde oplossend
vermogen van de monochromator is dus niet erg groot, nl. ca 10 nm. Dit wil zeggen
dat twee spectraallijnen die 10 nm van elkaar liggen moeten nog net als
afzonderlijke lijnen herkenbaar zijn.
Bij alle monochromatoren is een voorziening (bijv. een lens of een paar spleten)
waarmee de intredende lichtbundel evenwijdig gemaakt wordt. Meestal aanwezig
zijn een lens om het licht te focusseren en een spleet waarmee een deel van het
spectrum kan worden geselecteerd. De breedte van de laatste spleet is mede
bepalend voor de resolutie van de monochromator. Gangbare monochromatoren
zijn:
6.1. interferentiefilter
6.2. prisma
6.3. rooster
6.1 Interferentiefilter monochromator
Een interferentiefilter bestaat uit een plaat van glasachtig materiaal (vaak CaF2 of
MgF2) die aan voor- en achterzijde verspiegeld is. De dikte van de plaat is
nauwkeurig constant gemaakt. Wanneer licht op de plaat valt wordt het merendeel
aan de voorzijde gereflecteerd, een klein deel van het licht wordt doorgelaten. Een
zelfde verschijnsel vindt aan de achterzijde plaats. Het aan de achterzijde
gereflecteerde licht wordt voor een deel weer aan de voorzijde gereflecteerd. Indien
het twee maal gereflecteerde licht en het niet gereflecteerde licht precies in fase zijn
treedt geen uitdoving op. Bij een klein faseverschil zal na vaker herhaalde reflecties
een faseverschil van ½⋅λ ontstaan. In dat geval zal het licht door interferentie
gedoofd worden. Naarmate het reflecterende vermogen van voor- en achterzijde
groter is zal het licht vaker worden gereflecteerd en zal de spectrale bandbreedte
van de filter kleiner zijn, maar de doorgelaten lichtintensiteit ook. Ga zelf na hoeveel
licht ongehinderd de interferentiefilter kan passeren bij resp. 90 en 99% reflectie van
licht aan voor- en achterzijde van de filter.
(Antwoord: resp. 1% en
0.01%)
Bij loodrechte inval is de voorwaarde voor niet-uitdoving:
2⋅n⋅d = k⋅λ
-7-
(13)
waarin n de brekingsindex van het glasachtige materiaal, d de dikte van de plaat en
k het orde getal. Omdat k ieder geheel getal kan zijn is het noodzakelijk een
interferentiefilter te combineren met een absorptiefilter (een gekleurd stuk glas). Er
bestaan interferentiefilters voor het ultraviolette en het zichtbare deel van het
spectrum. De gangbare bandbreedte is ca. 1.5% van de golflengte in het transmissie
maximum. Bij spectrofotometrie, d.w.z. moleculaire absorptie in UV- en zichtbaar
licht wordt dit type veel gebruikt. De vraag zou kunnen rijzen waarom bij deze
techniek bijna geen absorptiefilters gebruikt worden. De reden daarvoor is dat de
bandbreedte van dat soort filters te groot is nl. minimaal ca 50 nm. Daardoor is ε
binnen de gemeten spectrale band niet meer constant en is de ijklijn sterk gekromd.
Alleen voor sommige eenvoudige routine bepalingen kunnen dergelijke, zeer goedkope filters wel worden gebruikt.
Een nadeel van interferentiefilters is dat voor elke gewenste golflengte een
afzonderlijke filter nodig is.
6.2. Prismamonochromator
Een prismamonochromator werkt volgens het principe dat de brekingsindex van glas
een functie is van de golflengte van het licht. Blauw licht wordt meer gebroken dan
rood licht. De genoemde functie is een zeer grillige, waardoor sommige delen van
het spectrum meer opgerekt worden dan andere, m.a.w. de dispersie, dθ/dλ (θ =
afbuigingshoek) van een prisma is niet lineair. De dispersie wordt groter bij kleinere
golflengten. Glas laat golflengten beneden 400 nm niet voldoende door, kwarts is
bruikbaar voor het gebied 200-1000 nm. Prisma's worden soms nog gebruikt bij
hoge temperatuur emissie (boog en vonk) waar een grote resolutie vereist is. In de
spectrofotometrie worden ze niet gebruikt.
6.3. Roostermonochromator
Een roostermonochromator werkt volgens het principe van interferentie (Fig.4). Het
roostermateriaal (niet gepolijst, microkristallijn materiaal), waarin 1200-1400 groeven
per mm zijn aangebracht reflecteert het licht in alle richtingen. Door middel van een
spleet wordt een teruggekaatste bundel geselecteerd. Het weglengteverschil tussen
straal 1 en 2 is gelijk aan BC + BD. De invallende bundel en de gereflecteerde
bundel maken hoeken van i resp. r [graden] met de normaal (N.B. hoeken i en r
-8-
hoeven dus niet aan elkaar gelijk te zijn!). Indien de roosterafstand d bedraagt, dan
is BC+BD gelijk aan: d⋅sin i + d⋅sin r. Indien geldt:
d⋅sin i + d⋅sin r = k⋅λ
(14)
treedt geen uitdoving door interferentie op. Het ordegetal k kan ieder geheel getal
zijn. Indien λ niet exact aan Verg. (14) voldoet treedt uitdoving op. Roosters hebben
de prettige eigenschap dat de dispersie lineair is en dat ze bruikbaar zijn in een groot
golflengtegebied. Een lineaire dispersie brengt mee dat de stand van het rooster
(hoek θ) via tandwielen gekoppeld kan worden aan een telwerk dat de golflengte λ
aangeeft.
In spectrofotometers waarbij de lichtabsorptie als functie van λ kan worden bepaald
(d.w.z. indien een absorptiespectrum kan worden opgenomen) wordt altijd gebruik
gemaakt van een interferentierooster.
7. Detector.
Bij eenvoudige spectrofotometers wordt vaak een fotocel als detector gebruikt. Er
bestaan fotocellen die alleen gevoelig zijn voor langgolvig zichtbaar licht en die
alleen gevoelig zijn voor kortgolvig UV- en zichtbaar licht. Sommige
spectrofotometers zijn uitgerust met twee fotocellen. In dat geval wordt, afhankelijk
van het spectrale gebied de meest gevoelige fotocel gebruikt.
In de wat meer geavanceerde spectrofotometers wordt de fotomultiplicator- of
lawinebuis (FMT) als detector gebruikt. Dit is een lichtdetector die over een groot
golflengtegebied gevoelig is, zij het niet in gelijke mate. Het licht dat de geëvacueerde FMT binnenkomt valt op een fotokathode, die gemaakt is van een materiaal
dat elektronen afgeeft onder invloed van licht. Het aantal afgegeven elektronen per
tijdseenheid is evenredig met de intensiteit van het invallende licht. De vrijgekomen
elektronen worden aangetrokken door een elektrode (dynode) waarop een positieve
spanning staat. Elk inslaand elektron maakt uit de eerste dynode een aantal
secundaire elektronen los. Deze elektronen worden weer aangetrokken door een
volgende dynode die op een hogere positieve spanning staat. De meeste FMT's
hebben tien dynodes (Fig.5). Daarmee kan een stroomversterking gehaald worden
van zo'n 108 x. De gevoeligheid (stroomversterking) kan worden gevarieerd door de
spanning op de dynodes te variëren. Door het instellen van de "nul" van een
spectrofotometer met een blanco oplossing wordt de spanning op de FMT zo
ingesteld dat de transmissiemeter 100% (extinctie A = 0) aangeeft. Door de
aanwezigheid van lichtabsorberende stof wordt de gemeten hoeveelheid licht minder
en neemt de transmissie af (de extinctie neemt dan toe).
Fig.5: Elektrodeconfiguratie in een fotomultiplicatorbuis
-9-
8. Spectrofotometers voor UV- en zichtbaar licht
8.1. Enkelstraals spectrometer
Enkelstraals spectrofotometers bestaan uit:
1. een stralingsbron, die een continuüm uitzendt in het gebruikte werkgebied (UV:
160-380 nm, zichtbaar: 380-800 nm),
2. een monochromator voor de golflengte selectie, dit kan een filter- of een
roostermonochromator zijn.
3. een sluiter die in de lichtweg geplaatst kan worden en waarmee het mogelijk is
de transmissie op 0% in te stellen,
4. twee identieke cellen één voor de analytoplossing en één voor de referentieoplossing met hetzelfde oplosmiddel, die om en om in de lichtweg geplaatst
kunnen worden,
5. een detector die gevoelig is in het gebruikte spectrale werkgebied, dat kan een
fotocel zijn of een fotomultiplicatorbuis (FMT),
6. een versterker om het signaal te versterken.
Een meting van de transmissie verloopt als volgt: 0% T wordt ingesteld door de
sluiter in de lichtweg te plaatsen, 100% T wordt ingesteld door de referentiecel in de
lichtweg te plaatsen en de transmissie van de analyt kan dan gemeten worden. De
extinctie kan uit de verkregen transmissie berekend worden. Bij de meeste
apparaten gebeurt dit automatisch.
Voor meting van de extinctie bij één golflengte voldoet een enkelstraals
spectrometer uitstekend.
8.2. Dubbelstraals spectrometer
Indien een absorptiespectrum wordt opgenomen dient bij elke golflengte afzonderlijk
zowel I als Io bepaald te worden. Dit is uiteraard veel werk, daarom wordt in dat
geval een dubbelstraals spectrometer gebruikt.
Moderne spectrofotometers worden vaak uitgevoerd als dubbelstraals instrument.
Dit houdt in dat de invallende bundel vóór het absorptiekuvet wordt gesplitst in twee
delen. Dit kan op twee manieren: bij de ene manier wordt de lichtstraal door middel
van een 'beam splitter' in twee helften gesplitst, bij de andere manier wordt de
lichtbundel, door middel van een roterende spiegel alternerend twee verschillende
kanten opgestuurd. De ene bundel wordt door de monsterkuvet gestuurd (dit levert
I), de andere door een referentiekuvet (dit levert Io). Beide signalen worden, na
versterking gemeten en de extinctie (A = log Io - log I) wordt geregistreerd.
Een voordeel van een dubbelstraals instrument is ook dat op deze wijze gecompenseerd wordt voor drift in de stralingsbron en in de signaalversterkers. Een nadeel
van een dubbelstraals spectrometer kan zijn dat het niet opvalt als de optische
doorlaatbaarheid van de gebruikte optische materialen en/of oplosmiddelen bij de
gebruikte golflengte onvoldoende is. Dit onderwerp wordt uitvoeriger in Hoofdstuk 10
behandeld.
-10-
8.3. 'Diode array' spectrometers.
Bij een 'diode array' spectrometer wordt het licht na doorgang door het
absorptiekuvet niet bij één golflengte gemeten maar praktisch gelijktijdig bij een
groot aantal golflengten. Het polychromatische (witte) licht dat door de kuvet is
gegaan wordt door de monochromator, een 'echellette'-rooster in zijn bestanddelen
gesplitst. De detectoren zijn in dit geval een groot aantal dioden die op een rij
gemonteerd zijn, zo dat elke diode de lichtabsorptie bij een andere golflengte meet.
Op deze wijze kan de lichtabsorptie vlak na elkaar bij enige honderden golflengten
worden gemeten. Het hele spectrum wordt zo in minder dan 1 s gemeten. Het
oplossend vermogen van dit type van spectrometer is 1 tot 2 nm. Een meer
gedetailleerde beschrijving is te vinden in de literatuur [1].
8.4. UV-detectie bij High Performance Liquid Chromatography
(HPLC)
UV-spectrometrie is een van de meest gebruikte detectiemethoden bij HPLC. Bij het
meest eenvoudige type wordt een kwiklamp gebruikt die sterke emissielijnen heeft
bij 254 en 280 nm. Met behulp van een interferentiefilter wordt de gewenste lijn
geselecteerd uit het emissiespectrum van de lichtbron. Veel organische functionele
groepen absorberen licht bij deze golflengten. De weglengte door de meetkuvet of
meetcel is bij deze detectoren vrijwel altijd 1.0 cm. Het volume van de UV-meetcel
wordt zo klein mogelijk gemaakt (10-20 µl) om het oplossend vermogen van de
HPLC niet nodeloos te verkleinen. De diameter van de cel is dus 1.1 - 1.6 mm. Een
tweede meetcel in de aanvoerleiding van het eluens dient als referentiecel. Bij meer
geavanceerde HPLC-apparaten, uitgerust met een roostermonochromator, is een
vrijere keuze van de detectiegolflengte mogelijk. De lichtbron voor het UV-gebied is
dan een waterstof- of een deuteriumlamp.
9. Optimale extinctiewaarden
De nauwkeurigheid van metingen met een spectrofotometer zijn ondermeer
afhankelijk van de gemeten extinctie. Dit valt als volgt in te zien:
De wet van Lambert en Beer (Vgl. 9) is te herschrijven als:
(15)
T=10-A
(16)
(17)
-11-
Fig.6. De relatieve fout in de concentratie
c bij een absolute fout dT in het
percentage transmissie T (dat is het linker
lid van vergelijking (17)) als functie van de
extinctie A. De gebruikte "eenheid" voor
de fout is de minimale relatieve fout in c.
Indien de maximaal aanvaardbare
relatieve fout in c, 2 keer de minimale fout
is, dan moet voor de extinctie gelden:
0.1<A<1.2. In de grafiek zijn alleen
extincties weergegeven waarbij T>1%.
De linker term van vergelijking (17) is te interpreteren als de relatieve fout in c bij
een gegeven (absolute) fout dT in het percentage transmissie. In eerste benadering
is dT onafhankelijk van T. Bij moderne instrumenten is dT = 0.1-0.2% . Tabel 3 geeft
dc/c vs. T, waarbij de absolute fout in T, dT = 0.2% is gesteld. Het blijkt dat de
relatieve fout in c het kleinst is (< 1.0%) in het gebied A = 0.1 tot 1.2. Het optimum
ligt bij A = 0.43 (T = 37%).
TABEL 3
Relatieve fout in c (dc/c, volgens de wet van Lambert en Beer gelijk aan dA/A) bij
verschillende extinctiewaarden indien dT = 0.2%. Hiertoe zijn telkens twee Twaarden 0.2% van elkaar verschillend, de bijbehorende A-waarden en het
procentuele verschil tussen beide A-waarden opgenomen.
T [%]
A
05.0
1.3010
05.2
1.2840
10.0
1.0000
10.2
0.9914
15.8
0.8013
16.0
0.7959
30.0
0.5229
30.2
0.5200
dA/A =dc/c
1.3%
0.86%
0.67%
0.56%
-12-
T [%]
A
63.1
0.2000
63.3
0.1986
79.4
0.1000
79.6
0.0990
90.0
0.04576
90.2
0.04479
95.0
0.02228
95.2
0.02136
dA/A =dc/c
0.70%
1.0%
2.2%
4.1%
Het linker lid van vergelijking (17) kan ook grafisch worden uitgezet tegen T of tegen
A (Fig.6). Indien aan de fout in de transmissie dT een waarde wordt toegekend kan
verticaal worden volstaan met de term dc/c. Men dient zich te realiseren dat de
grafiek daarmee apparaatspecifiek is gemaakt en dat eenheden dus vereist zijn.
In verband met de optredende fout dT is het meetbereik van een spectrofotometer
dus beperkt tot ruim één dekade. (Eén concentratiedekade is een concentratiegebied waarbij de hoogste concentratie gelijk is aan tien maal de laagste
concentratie.) Uiteraard kan men wel bij lagere extincties dan ca 0.05 meten, maar
dan dient men rekening te houden met een grotere fout in de gemeten concentratie.
Voor veel doeleinden is een dergelijke meting, ondanks de grotere fout, toch
bruikbaar.
10. Optische doorlaatbaarheid
Het is uiteraard belangrijk dat de kuvet waarin de analyt gemeten wordt en de
materialen van de monochromator en van de detector het gemeten licht in
voldoende mate doorlaten. In Tabel 4 zijn de bruikbare golflengtegebieden voor een
aantal optische materialen weergegeven.
Voor normale spectrofotometrische bepalingen in het zichtbaar licht wordt 'gewoon'
glas gebruikt. Bij golflengten in het UV- gebied worden kwarts kuvetten gebruikt.
Kwarts kuvetten zijn op het oog niet te onderscheiden van glazen kuvetten. De prijs
van kwarts kuvetten is echter minstens 5x zo hoog als die van glazen kuvetten.
TABEL 4
Bruikbare golflengtegebieden [nm] voor optische materialen.
Materiaal
glas (afhankelijk van type)
kwarts en "fused silica”
NaCl
LiF
CaF2
AgCl
KBr
CsBr
CsI
golflengten
[nm]
400 - 2000
200 - 3300
300 - 15000
200 - 5000
200 - 12000
400 - 25000
300 - 30000
300 - 50000
300.-.70000
Kuvetten voor spectrofotometrie zijn gemerkt met de letters OG (optisch glas),
S (Suprasil-glas) of Q (kwarts).
-13-
TABEL 5
Ondergrens van het bruikbare golflengtegebied [nm] voor
spectrofotometrie in UV- en zichtbaar licht.
oplosmiddel
aceton
acetonitril
benzeen
butylacetaat
chloroform
cyclohexaan
dichloormethaan
1,2-dichloorethaan
N,N-dimethylformamide
dioxaan
ethanol
diethylether
ethylacetaat
glycerol
n-hexaan
iso-octaan
iso-propanol
methanol
methyleenchloride
pyridine
tetrachloormethaan
tetrachlooretheen
tolueen
water
m-xyleen
zwavelkoolstof
golflengte
[nm]
330
210
285
260
245
215
235
235
270
225
205
205
260
230
200
215
210
215
230
305
265
290
285
190
295
375
Van de gebruikte oplosmiddelen wordt vereist dat de analyt er in voldoende mate in
oplost en dat het licht van de gebruikte golflengten in voldoende mate doorlaat.
Voor spectrofotometrie in het UV- en zichtbaar licht zijn een groot aantal
oplosmiddelen bruikbaar. In Tabel 5 zijn de ondergrenzen van het bruikbare gebied
voor veel gebruikte oplosmiddelen gegeven.
Bij meting met een dubbelstraals spectrometer merkt men in het algemeen niet dat
de optische doorlaatbaarheid van de gebruikte optische materialen en/of
oplosmiddelen bij de gebruikte golflengte onvoldoende is. Dit blijkt alleen uit een
toename van het ruisniveau. Het is dus zeer zinvol Tabel 4 en 5 te raadplegen, of in
geval van twijfel een controlemeting te doen met een enkelstraals spectrometer.
11. Absorptie-spectrometrie in UV- en zichtbaar licht
-14-
11.1. Organische verbindingen
Moleculen die voldoende zichtbaar licht (400-800 nm) of licht in het nabije UV (190400 nm) absorberen kunnen in principe door middel van spectrofotometrie bepaald
worden. In organische moleculen zijn twee typen elektronen verantwoordelijk voor
absorptie van zichtbaar- en/of UV-licht: gepaarde bindingselektronen en ongepaarde
elektronen van atomen als zuurstof, halogenen, zwavel en stikstof. De golflengte
waarbij een organisch molecuul absorbeert is afhankelijk van het energieverschil ΔE
tussen de aangeslagen toestand en de grondtoestand van het desbetreffende
elektron. Dit energieverschil is bij de gepaarde elektronen van de C-C en C-H
bindingen zo groot dat alleen straling in het verre UV, met golflengten λ « 180 nm
wordt geabsorbeerd. Straling met deze golflengten is niet bruikbaar voor normale
spectrofotometrie omdat die door lucht en veel materialen (waaronder glas en kwarts
van kuvetten) wordt geabsorbeerd.
n-Alkanen kunnen dus niet spectrofotometrisch worden bepaald, omdat ε in het
bruikbare UV-gebied voor dit type verbindingen veel te klein is. Organische
verbindingen met dubbele en drievoudige bindingen vertonen absorptiebanden in het
bruikbare UV- gebied, omdat ΔE geschikte waarden heeft. Dit geldt met name voor
geconjugeerde systemen als bijv. CH2=CHCH=CH2.
Onverzadigde groepen in organische verbindingen die zichtbaar- en/of UV-licht
absorberen worden chromoforen genoemd. Organische moleculen die zwavel,
broom of jodium bevatten absorberen UV- straling uit het nabije UV doordat de
ongepaarde elektronen van deze atomen relatief gemakkelijk aangeslagen kunnen
worden.
11.2. Anorganische verbindingen
De spectra van de meeste lichtabsorberende anorganische verbindingen lijken sterk
op die van organische verbindingen in de zin dat de spectra ook uit brede banden
bestaan, waar weinig fijnstruktuur in zit. Een uitzondering vormen de spectra van de
ionen van de lanthaniden en actiniden (de zeldzame aardmetalen). De elektronen
die verantwoordelijk zijn voor de lichtabsorptie, hier de 4f en de 5f elektronen,
worden van uitwendige invloeden afgeschermd door elektronen uit hoger gelegen
'orbitals'. Dientengevolge zijn de absorptiebanden relatief smal en onafhankelijk van
de aard van de binding met liganden die door elektronen uit hoger gelegen 'orbitals'
wordt verzorgd.
Vrijwel zonder uitzondering zijn ionen en complexen van de overgangsmetalen
gekleurd in ten minste één van de oxydatietoestanden. De absorptie van zichtbaar
licht wordt hier veroorzaakt door de overgang van een d-elektron van de
grondtoestand naar een aangeslagen toestand. Het energieverschil ΔE tussen de
grondtoestand en de aangeslagen toestand en dus de golflengte λ van het
absorptiemaximum is in dit geval afhankelijk van de oxydatietoestand, van de plaats
in het periodiek systeem en van de aard van het ligand dat aan het overgangsmetaal
gebonden is. De waarde van ε is lang niet bij al deze gekleurde verbindingen groot
genoeg om een spectrofotometrische bepaling 'zonder meer', d.w.z. zonder er een
chromofore groep aan te hangen mogelijk te maken. Zie ook hoofdstuk 11.4.
-15-
11.3. Charge transfer complexen
Voor het doen van kwantitatieve bepalingen zijn 'charge transfer' complexen van
groot belang omdat ze een grote molaire extinctiecoëfficiënt (ε > 10000 [l mol-1 cm-1])
hebben, waardoor bepaling van zeer lage concentraties van dit soort complexen
mogelijk is.
Een charge transfer complex bestaat uit een elektron-donor die gebonden is aan een
elektron-acceptor. Bij de absorptie van straling met de juiste energie wordt een
elektron van de elektron-donor afgestaan aan de elektron-acceptor. De aangeslagen
toestand ontstaat dus door een intramoleculaire redoxreactie. Dit gedrag wijkt
duidelijk af van dat van bijv. organische chromofore groepen waar de aangeslagen
toestand zich bevindt in een 'molecular orbital' die door twee of meer atomen wordt
gedeeld. Voorbeelden van dergelijke charge transfer complexen zijn: Fe(III)thiocyanaat complex (rood), 1,10-fenanthroline complex met Fe2+ (oranje-rood), het
I3--complex met zetmeel (blauw) en het Fe2+/Fe(III)cyanide complex (Pruisisch
blauw). Bij de meeste charge transfer complexen van metalen vormt het metaal de
elektron-acceptor. Een van de weinige uitzonderingen hierop vormt het 1,10fenanthroline complex met Fe2+.
Een meer exacte uitleg van het mechanisme van de absorptie van UV- en zichtbaar
licht is mogelijk met behulp van de 'Molecular Orbital' theorie. Een beschrijving
daarvan is in de literatuur [2] te vinden.
11.4. Gewenste eigenschappen van de lichtabsorberende
verbinding
Eigenschappen van de lichtabsorberende verbinding die gewenst zijn voor het doen
van een spectrofotometrische bepaling zijn:
a) De lichtabsorberende verbinding moet voldoende tijd stabiel zijn om een bepaling
aan te kunnen doen. Veel gekleurde verbindingen zijn in de tijd niet geheel
stabiel.
b) Voor een gevoelige bepaling moet ε een grote waarde hebben, d.w.z. de
lichtabsorptie bij tenminste één golflengte moet groot zijn.
c) De lichtabsorptie mag niet al te gevoelig zijn voor omstandigheden als
temperatuur, pH en de overmaat van een eventueel kleurreagens.
d) De gekleurde verbinding moet bij voorkeur voldoen aan de wet van Lambert en
Beer. Ook wanneer deze wet niet geheel opgaat kan een bepaling nog goed
mogelijk zijn.
Metaalionen die van zichzelf een te kleine waarde van ε vertonen kunnen vaak toch
spectrofotometrisch worden bepaald door ze te laten reageren met een (vaak
organisch) reagens waardoor de resulterende verbinding wel een voldoende grote
waarde van ε vertoont. Dergelijke kleurreagentia moeten aan enige eisen voldoen:
e) Het reagens moet voldoende stabiel zijn zodat het niet te vaak opnieuw hoeft te
worden gemaakt.
f) De kleurreactie moet liefst snel zijn.
-16-
g) Het te bepalen metaal moet volledig en volgens een éénduidige
(stoichiometrische) reactie met het kleurreagens reageren. Aan deze eis hoeft
niet altijd geheel voldaan te zijn.
h) Het reagens moet liefst selectief met het te bepalen metaal reageren. De reactie
moet zo weinig mogelijk door andere metalen gestoord worden.
i) Het reagens zelf mag bij de golflengte van de bepaling geen licht absorberen.
12. Nomenclatuur
We kennen de term transmissie, afgekort met T (≡ I/Io, Engels "transmission"). De
transmissie kan worden gegeven in % of als fractie. De extinctie (= -log T) wordt in
het Engels "absorbance" genoemd, daarom is het internationaal afgesproken
symbool "A". Daarnaast kennen we de (weinig gebruikte) term absorptie
(= 100 - T [%], Engels "absorption"). Ten onrechte wordt in plaats van de term
"extinctie" soms de term "absorptie" gebruikt.
13. Literatuur:
1. D.A.Skoog, D.M.West en F.J.Holler, "Fundamentals of Analytical Chemistry", 6th
Edn. Saunders College Publishing, Fort Worth (1992), Hoofdstuk 20 t/m 22 (blz 508
t/m 603). (Theorie)
2. R.L.Pecsok, L.D.Shields, T.Cairns en I.G.McWilliam, "Modern Methods of
Chemical Analysis", 2nd Edn. John Wiley & Sons, New York (1976), Hoofdstuk 8 t/m
10 en 12 (blz 115 t/m 164 en 226 t/m 242). (Theorie)
3. M.G.Mellon, Edt., "Analytical Absorption Spectroscopy, Absorptiometry and
Colorimetry", John Wiley & Sons, London (1950).
4. J.Fries en H.Getrost, "Organische Reagenzien für die Spurenanalyse", E.Merk,
Darmstadt (1975).
5. O.G.Koch en G.A.Koch-Dedic, "Handbuch der Spurenanalyse, Die Anreicherung
und Bestimmung von Spurenelementen unter Anwendung extraktiver,
photometischer, spektochemischer mikrobiologischer und anderer Verfahren",
Springer Verlag, Berlin, (1964).
-17-