Lees de taal van de tumor

Proteomics
Waarom DNA alleen niet genoeg is…
Van DNA naar organisme
Eiwitten zijn de belangrijkste schakels tussen DNA en het organisme.
DNA
30.000 genen
RNA
vertaald genen in eiwit
Eiwit
meer dan 1,000,000
Cel
eiwitnetwerk
Organisme
2 miljard jaar evolutie
Proteomics voor de massa
Een organisme bestaat uit cellen
Proteomics voor de massa
De kern van iedere cel bevat
chromosomen met de genetische code
membraan
Nucleolus
Porien
Chromatine
Set met 23 paar menselijke
chromosomen met alle
genetische informatie
Chromosomen
Proteomics voor de massa
Een chromosoom is een opgevouwen
streng DNA
Chromosoom
ATCCGTTATGCT DNA
TAGGCAATACGA
Proteomics voor de massa
Het genoom
• DNA is opgebouwd uit 4 bouwstoffen:
de basen of nucleotiden A C T G
• Het complete menselijke genoom
bestaat uit 3.000.000.000 nucleotiden
(basen).
• Al het menselijk DNA is in kaart
gebracht. De gegevens liggen
opgeslagen in een database
…TGAC…
…ACTG…
Proteomics voor de massa
Genen en het genotype
Alle erfelijke eigenschappen liggen vast in het DNA.
Het stukje DNA dat de code bevat voor een erfelijke eigenschap wordt een
gen genoemd.
..AGC TAT CAA ATG CCG TAG ATC CGT AGT GTA AAC AAG ATC GTT
TGG AAA TTG CAG ATC AGT AAG CGT AGA TCG TGT TGA CG......
Een set van alle genen van een organisme wordt het genotype genoemd.
De nucleotiden volgorde van alle genen is bekend.
Proteomics voor de massa
Fenotype
Het fenotype is het totaal van alle waarneembare eigenschappen (kenmerken)
van een organisme.
De rups en de vlinder hebben
hetzelfde genotype (DNA),
maar zijn toch verschillend.
Ze hebben een verschillend
fenotype.
Proteomics voor de massa
Van Genotype naar Fenotype
• Alle 200 celtypen hebben dezelfde set met genen, maar alleen die eiwitten
worden aangemaakt die de cel nodig heeft voor zijn taak: Expressie.
• Verschillen in expressie verklaren de verschillende fenotypen.
• Expressie kan beïnvloed
worden door omgevingsfactoren.
DNA
RNA
Eiwit-
Eiwit
Fenotype
Synthese
Proteomics voor de massa
Eiwitten bepalen hoe we er uit zien
• DNA bepaalt wie we zijn
(genetisch bepaald)
• Eiwitten bepalen hoe we er uit zien.
Proteomics voor de massa
Hoe bepalen eiwitten het fenotype ?
De genen (het DNA) geven slechts de totale catalogus van mogelijke eiwitten.
Maar welke eiwitten en hoeveel van elk
wordt bepaald door de expressie van eiwitten.
Hoe en wanneer een eiwit actief wordt, wordt
Bepaald door de veranderingen die het eiwit
nog ondergaat na de expressie:
de zogenaamd post-translationele eiwitveranderingen
De eiwitnetwerken bepalen tenslote het
functioneel geheel in de cellen, weefsels
en het organisme
Proteomics voor de massa
Wat is een eiwit ?
• Eiwitten zijn opgebouwd uit 20 verschillende bouwstenen: de aminozuren.
• Een eiwit kan bestaan uit een keten van 50 tot enkele duizenden aminozuren,
de primaire volgorde of sequentie genoemd.
• Een eiwit wordt gevouwen in een complexe 3-dimensionale structuur.
• De volgorde van de aminozuren en
ruimtelijke structuur bepalen de functie
van het eiwit.
Ser
Val
LeuLeu
Ala
Thr
Cys
Proteomics voor de massa
Hoe wordt een eiwit uit DNA vertaald?
Voor elk aminozuur bestaat een unieke combinatie van 3 nucleotiden. De
vertaling en aanmaak van eiwitten vindt plaats op de ribosomen van het
cytoplasma
Verschillende eiwitten met ruimtelijke structuur
Antilichaam
Hemoglobline Insuline Kinase
Synthetase
Proteomics voor de massa
Wat is Proteomics ?
Proteomics is de studie naar eiwitten.
Proteomics is ook het vergelijken van eiwitten
tussen verschillende organismen, weefsels of
cellen
Proteomics is ook het vergelijken van
eiwitpatronen tussen gezonde en zieke
mensen.
Protein Genomics
Proteomics
Proteomics voor de massa
Analyseren van eiwitten
Het analyseren van eiwitten wordt bemoeilijkt door:
• Het grote aantal verschillende eiwitten ( > 1,000,000).
• Het hoge moleculaire gewicht van vele eiwitten.
• De hoeveelheid materiaal vaak beperkt is. Het kan niet in het lab
vermenigvuldigd worden zoals dat wel met DNA kan (PCR).
• dat eiwitten snel kapot gaan.
• Dure en geavanceerde analyse apparaten, die nodig zijn.
Proteomics voor de massa
Analyseren van eiwitten
• Een veel gebruikte techniek om dat ene bepaalde eiwit te isoleren uit een
mengsel van duizenden eiwitten is 2D-gelelektroforese.
• Deze techniek maakt gebruik van de unieke eigenschappen van elk eiwit,
namelijk: het moleculaire gewicht (grootte) en de lading.
1e dimensie: lading
pH 10
pH 3
pH 10
200.000
Dalton
-
+
pH 10
-
In een elektrisch veld bewegen eiwitten
naar de pH waar ze neutraal zijn.
1000 Dalton
+
pH 3
+
-
pH 3
2e dimensie: grootte
In een elektrisch veld bewegen kleinere
eiwitten sneller dan grote eiwitten.
Proteomics voor de massa
Het resultaat: een eiwitkaart
Elk stipje (spotje) op de kaart is een ander eiwit, of een andere variant van
een eiwit!
pH
3
10
Molecuul gewicht (grootte)
200,000 Dalton
1000 Dalton
Proteomics voor de massa
Isoleren van een eiwit naar keuze
• Het eiwit van interesse wordt uit de gel gesneden en in een reageerbuis
gedaan.
• Het eiwit wordt in stukjes “geknipt” met een enzym, bijvoorbeeld trypsine,
omdat het intacte eiwit te groot is om te karakteriseren.
• De stukjes (fragmenten) worden gekarakteriseerd in een Massaspectrometer
“massaspectrometrie”
spot uitsnijden
2D-gel
Eiwitten in stukjes
knippen met enzym
Proteomics voor de massa
Wat is Massaspectrometrie (MS)
• MS is een krachtige analytische techniek die wordt gebruikt om (onbekende)
eiwitten te identificeren en/of te kwantificeren.
• Bovendien kunnen de structuur en chemische eigenschappen van het eiwit
worden achterhaald.
Er zijn verschillende methoden:
Electrical field
Time-Of-Flight
Magnetic field
Proteomics voor de massa
Wat doet Massaspectrometrie
Een apparaat om moleculen te ‘wegen’, een moleculaire weegschaal:
Voor:
• Mengsel van munten met
verschillend gewicht
• Verschillend aantal per munt
Na:
• Sorteer op gewicht
massaspectrum
Aantal
• Sorteer op aantal
Gewicht (massa)
Proteomics voor de massa
Massaspectrometrie met de
“Time-Of-Flight “ methode:
“flight tube”
Electrisch veld
Detector
De moleculen gaan “hardlopen” onder invloed van een hoog spanningsverschil
in de buis, de snelste (kleinste) komt als eerste aan:
start
finish
Proteomics voor de massa
Massaspectrometrie met de
“Time-Of-Flight “ methode:
Alle moleculen gaan tegelijkertijd de buis in
De snelheid kan worden
omgerekend naar een massa.
De hoogte van de piek geeft de
hoeveelheid aan.
Kleine moleculen vliegen sneller!
Massaspectrum
Proteomics voor de massa
Massaspectrometrie van een eiwit:
R
Eiwit:
R
K
K
R
K
knippen van het eiwit met het enzyme trypsine
1
K
2
K
3
R
4
R
5
K
6
R
Massaspectrometrie bepaalt de massa’s van de brokstukken
Het patroon is uniek voor het eiwit: identificatie van het eiwit!
relative
intensity
Trypsine knipt na elke
lysine (K) of arginine (R), en
maakt daarmee brokstukken
die eindigen op K of R:
1
2
3 4
5
6
m/z
Is te vergelijken met een
vingerafdruk van het
eiwit!
Proteomics voor de massa
Identificatie van een eiwit:
1
2
3 4
5
6
Het massaspectrum van een eiwitmengsel wordt
vergeleken met de gegevens in de database
De 30.000 genen van
het menselijk genoom
met de bijbehorende
eiwitten zijn opgeslagen
in een database
De computer geeft een lijst
met alle mogelijke eiwitten
die er in een monster zitten!
Proteomics voor de massa
Toepassingen van Proteomics:
• Kwantificering van de eiwitexpressie met biomarkers onder specifieke
omstandigheden, bijvoorbeeld bij medische behandeling.
• Toepassing in de ontwikkeling van nieuwe medicijnen
• Identificatie van eiwitten die een rol spelen bij specifieke ziekten
• Identificatie van eiwit biomarkers specifiek voor eiwit expressie
Proteomics voor de massa