Titel vd keuzeopdracht

In de ban van het griepvirus
Voorbereidingsopdracht
Een voorbereidende opdracht behorende bij de masterclass ‘In de ban van het
griepvirus’.
Besteed ongeveer 4 uur aan deze voorbereidende opdracht.
© 2016 Universiteit Utrecht: U-talent
Auteur: Andrea van Bruggen- van der Lugt MEd, onderwijsontwikkelaar U-talent
scheikunde
Voorkennis
Je bent net gestart in vwo 5 of 6. Er wordt dan verondersteld dat je al veel weet over de ruimtelijke
bouw van eiwitten. Je kent de primaire eiwitstructuur als ook de secundaire, tertiaire en quaternaire
structuur. Je weet globaal hoe eiwitten worden gevormd door transcriptie (vertalen van de DNA code
voor een bepaald eiwit naar een RNA code) en translatie (vertalen van een RNA code naar een
aminozuurvolgorde).
Overleg ook met je vakdocent als je in deze onderwerpen hiaten veronderstelt, en vraag dan welke
opdrachten je moet maken om deze kennis te verkrijgen. Je bent er dan dus meer dan 4 uur mee
bezig.
Oriëntatie op de masterclass
Tijdens de masterclass krijg je een college over virusziekten. Daarna doe je een praktisch onderzoek
aan patiëntmateriaal, waarbij je vaststelt of er sprake is van een besmetting met een griepvirus. Je
gebruikt hierbij de microscoop gecombineerd met moleculair biologische technieken. Je onderzoekt
welke medicijnen werken tegen het virus. Tenslotte gaan we aan de slag met een
computermodelleerprogramma, dat je inzicht geeft in de driedimensionale structuur van
viruseiwitten en mogelijke aangrijpingspunten om het virus onschadelijk te maken.
Oriëntatie op deze voorbereidingsopdracht
Deze voorbereidingsopdracht bestaat uit drie delen.
Je start met een basisdeel waarin je de voorkennis ophaalt over eiwitten en een eerste oriëntatie
over virussen.
Je verdiept de kennis over eiwitten door modellen van eiwitten te bestuderen. Zo leer je vast op een
driedimensionale manier naar eiwitten kijken.
Tenslotte bestudeer je in een keuzeopdracht alvast één van de technieken die je tijdens het
laboratoriumonderzoek toepast. Je kunt kiezen uit diverse moleculair biologische technieken nl.:
-
(Reverse Transcriptase) Polymerase Chain Reaction (RT- PCR)
Poly Acrylamide Gel Elektroforese (PAGE).
Het gebruik van fluorescerende eiwitten als marker voor het Golgi- systeem in de cel en
het virus.
Het gebruik van HeLa cellen voor celkweek.
2
Basisopdrachten
Ophalen voorkennis
Het onderwerp van de masterclass ligt op het raakvlak van scheikunde en biologie. Het kan zijn dat
je een aantal van onderstaande begrippen nog niet gehad hebt. Met onderstaande vragen zorg je
ervoor dat je de juiste voorkennis hebt voor de masterclass.
Opdracht 1. Aminozuren
a. Jouw lichaam bestaat voor een groot deel uit eiwitten. Aminozuren zijn de bouwstenen van
eiwitten. Teken de structuurformule van het aminozuur glycine.
b. Twee aminozuren kunnen aan elkaar binden met een peptidebinding. Zoek uit hoe deze binding
gevormd wordt en teken vervolgens twee glycinemoleculen na binding.
c. Welk molecuul komt er vrij bij de vorming van een peptidebinding.
Opdracht 2.
Eiwitten
a.
Zoek uit en beschrijf hoe een eiwit gemaakt wordt. Begin bij het gen dat codeert voor een eiwit.
In jouw uitleg moeten de begrippen transcriptie, translatie, aminozuur en ribosoom voorkomen.
b. Omschrijf de primaire, secundaire, tertiaire en quartaire structuur van een eiwit?
Tijdens de masterclass ga je zelf een medicijn ontwerpen tegen neuraminidase, een eiwit dat een rol
speelt bij het ontsnappen van het griepvirus uit de gastheercel. Om dit te kunnen doen, heb je kennis
nodig van interacties tussen eiwitten in een lichaam. Daarover gaan de volgende vragen.
Eiwitdefecten en medicijnen
In elke cel zijn eiwitten verantwoordelijk voor allerlei processen. Zo zijn eiwitten belangrijk bij de
synthese van DNA, ons erfelijk materiaal; ze zijn aanwezig in het cytoskelet, dat de cel vorm en
stevigheid geeft; ze kunnen zuurstof transporteren, maar ook hulp geven bij de omzetting van een
molecuul in een ander molecuul. Voor elke functie is steeds weer een ander eiwit aanwezig en zo zit
een cel vol met eiwitten in allerlei soorten en maten, met elk een eigen vorm.
Eiwitten zijn opgebouwd uit aminozuren die in een lange keten aan elkaar gekoppeld zijn (figuur 1).
Elk eiwit varieert in de volgorde waarin de aminozuren aan elkaar gekoppeld zijn en de lengte van
de keten.
afbeelding 1
3
Opdracht 3. Aminozuren en eiwitten
a. Wat betekenen de termen peptidebinding, N-terminus, C-terminus, polypeptide backbone?
b. Er bestaan 20 aminozuren met elk een andere zijgroep (BINAS tabel 67C; afbeelding 2). In deze
afbeelding staat per aminozuur het iso-elektrisch punt genoemd. Dit is de pH waarde waarbij de
zijgroep van het aminozuur neutraal geladen is. Zoek op wat er gebeurt met de zijgroep van
Asparaginezuur als de pH waarde gelijk is aan die van ons bloed.
afbeelding 2
Door de wisselende chemische samenstelling van elk aminozuur veranderen ook de chemische
eigenschappen van elk aminozuur en daarmee ook elk eiwit.
4
Opdracht 4.
Polaire zijgroepen
Bestudeer afbeelding 3. Sommige zijgroepen van aminozuren zijn in een cel negatief geladen, positief
geladen, ongeladen polair en niet polair.
a. Zoek eerst uit wat het begrip ‘polair’ betekent.
b. Beschrijf voor elk van deze 4 mogelijkheden hoe een zijgroep aan deze chemische eigenschap kan
komen.
Afbeelding 3
Hoe elk eiwit zich vouwt tot zijn driedimensionale structuur, wordt vooral bepaald door de volgorde
van de aminozuren. Door het ontstaan van verschillende bindingen tussen verschillende zijgroepen
vouwt het eiwit zich op een bepaalde manier op (afbeelding 4).
afbeelding 4
Opdracht 5.
Bindingen in eiwitten
a. Beschrijf de verschillende bindingen en rangschik de bindingen in sterkte.
5
b. In een cel zal elk eiwit zich zo opvouwen dat de hydrofobe groepen zich naar de binnenkant keren en
de hydrofiele groepen naar de buitenkant (zie afbeelding 5). Waarom?
afbeelding 5
Er zijn twee structuren die veel voorkomen in eiwitten:
In de α – helix is de N-H binding in elke peptidebinding gebonden via een waterstofbrug aan een C=O
groep van een naburige peptidebinding vier aminozuren verderop (afbeelding 6)
afbeelding 6
In de β-sheet is de keten in een plaatstructuur opgevouwen waarbij de verschillende delen in de
keten bij elkaar worden gehouden met waterstofbruggen tussen de peptidebindingen in de
verschillende delen. De keten kan zich parallel of antiparallel opvouwen (afbeelding 7).
6
afbeelding 7
Opdracht 6.
sheets
α-
helix
en
β
Bekijk onderstaand model van een klein
eiwit (afbeelding 8). Tijdens de
masterclass ga je met een computerprogramma een medicijn ontwerpen dat een interactie zal
aangaan met een eiwit dat een rol speelt bij een ziekte. De eiwitten zullen dan ook op deze manier
worden weergegeven.
Geef in onderstaand eiwit aan waar het eiwit zich heeft opgevouwen in een α- helix en in een β-sheet.
Afbeelding 8
De eerder genoemde niet-covalente bindingen spelen niet alleen een rol bij het vouwen van
eiwitten. Nog belangrijker voor het medicijn dat jullie gaan ontwerpen is het feit dat ze ook een
belangrijke rol spelen bij eiwit-substraat interacties.
Dit is bijvoorbeeld het geval bij veel enzymen. Het enzym zal een binding moeten aangaan met het
molecuul dat omgezet moet worden (het substraat). De binding van het substraat aan het enzym
vindt plaats in het actieve centrum (afbeelding 9 en 10).
7
afbeelding 9
Afbeelding 10
Na binding van het
substraat zal het enzym
helpen bij de omzetting van
het substraat, bijvoorbeeld
de splitsing van maltose in
twee glucose eenheden
(afbeelding 11)
Afbeelding 11
Bij veel ziekten spelen eiwitten een belangrijke rol. Soms wordt een bepaald eiwit teveel gemaakt of
spelen eiwitten een rol bij de groei (vermeerdering) van bepaalde ziekteverwekkers zoals bacteriën
of virussen. Wanneer we tijdens de masterclass een medicijn ontwerpen, doen we dat door in het
actieve centrum van het eiwit een molecuul te brengen dat stevig zal binden. Op die manier kan het
medicijn het eiwit blokkeren zodat de werking wordt geremd. Daarom gaan we op zoek naar positief
geladen aminozuren en negatief geladen aminozuren.
In opdracht 4 heb je beschreven hoe bijvoorbeeld glutaminezuur negatief geladen kan worden en
lysine positief geladen. Je kunt het ook goed zien in afbeelding 4.
8
Opdracht 7.
Het actieve centrum
a. Wanneer in het actieve centrum van het eiwit positief geladen aminozuren aanwezig zijn, welke
groepen moet het medicijn dan bevatten voor een sterke binding op die plaats
b. Wanneer in het actieve centrum van het eiwit negatief geladen aminozuren aanwezig zijn, welke
groepen moet het medicijn dan bevatten voor een sterke binding op die plaats?
Virussen
Opdracht 8. Virussen
a. Zoek uit en beschrijf wat virussen zijn. Maak daarbij onderscheid tussen DNA virussen, RNA
virussen, retrovirussen
b. Bestudeer in het bijzonder het griepvirus, bespreek de verschillende eiwitten die voorkomen in
het virus en waarom er jaarlijks nieuwe medicijnen tegen griep worden ontwikkeld.
c. Bekijk en beschrijf globaal de ruimtelijke bouw van de viruseiwitten die je hebt benoemd bij vraag
b.
9
Verdiepende opdrachten
De bouw van eiwitten weergegeven in een model
Veel informatie over de verschillende eiwitten kun je vinden in de Wikipedia (zowel de Engelse als
de Nederlandse versie) en in de proteopedia (http://www.proteopedia.org/), een soort wikipedia
voor eiwitstructuren. Kijk in de ‘structure index’ voor informatie per eiwit-type.
Zeer veel eiwit structuren (meer dan 100.000!) zijn opgeslagen in een vrij toegankelijke database,
de Protein Data Bank (PDB, http://www.rcsb.org/pdb). Voor de voorbereidingsopdracht zullen we
een aantal van deze 3D structuren bekijken met de Protein Workshop viewer die vanuit de PDB
pagina's toegankelijk is.
Tips voor het gebruik van Protopedia
-
Als je op de groene tekst in de beschrijvingen klikt, verandert het 3D plaatje ter illustratie.
Je kunt in het plaatje klikken en de structuur bewegen om iets beter te zien
Eventueel kun je op popup klikken om het plaatje in een groter venster te zien
Je kunt een plaatje bewaren door in het vlak van het plaatje te rechts-klikken en bestand –
export te selecteren
Tips voor gebruik van de Protein Workshop Viewer







Opstarten: Voor het runnen van de viewer moet Java op je computer geïnstalleerd zijn. Meestal
is dit het geval; zo niet installeer Java dan eerst.
In principe opent de viewer als je op de link in de PDB pagina klikt (door op ‘view in 3D’ te
klikken), maar soms gebeurt dit niet automatisch en moet je eerst een link downloaden.
Vervolgens dubbelklik je op deze link en de viewer opent met de structuur geladen.
In sommige versies van Internet Explorer 11 werkt de link niet.
In Chrome werkt de link. Wel kan het nodig zijn om linksonder in het browservenster te klikken
op RCSB-ProteinWorkshop.jnlp
In OSX kan het zijn dat de veiligheidsinstellingen het uitvoeren van bestanden die niet uit de
Applestore afkomstig zijn verbieden. Om Protein Workshop toch uit te voeren in Safari: Klik op
het “Toon downloads” icon rechtsboven. Rechts-klik op het bestand RCSB-ProteinWorkshop… en
selecteer “Toon in Finder”. In Finder CTRL+click op het bestand en selecteer open.
Als Protein workshop is opgestart
Laadt een andere structuur door te klikken op: File: Open PDB ID. De eerder getoonde structuur
verdwijnt. Als je twee structuren wilt vergelijken open je een tweede viewer vanaf de PDB-pagina
of dubbelklik je nog een keer op de link.
o Vaak moet je even je muis bewegen om de nieuw geladen structuur te zien.
Muis-acties:
o
Linkerknop = draaien
o
Rechterknop = verschuiven
o
Middelknop = zoomen (op een Apple Mac met een twee-knops muis: CTRL+ALT
plus muis is zoomen)
Plaatjes opslaan kun je onder: Options: Save Image of File: Save Image (je kunt
kiezen tussen TIFF - PNG - JPEG format).
o
Voor plaatjes is een witte achtergrond waarschijnlijk mooier: Shortcuts : Change the
Background Color.
10



De weergave aanpassen. Je kan dingen (on)zichtbaar maken, kleuren, labelen etc door de
stappen 1-2-3 (zie rechter menu) te volgen en vervolgens in het venster eronder (nr. 4) op het
juiste aminozuur, eiwit of molecule te klikken.
1. Selecteer welke eigenschap je wilt veranderen: bijv. Colors.
2. Selecteer waarop je het wilt toepassen: Atoms & Bonds (geldt ook als je hele aminozuren
wilt kleuren/zichtbaar maken) - Ribbons - Surfaces (dit heeft alleen effect als je het
moleculaire oppervlak van het eiwit laat zien)
3. Kies uit verschillende opties - hangt af wat je onder 1 hebt gekozen.
4. Selecteer het doelwit bijv. het ligand - een ion - het eiwit-een specifiek aminozuur in het
eiwit.
o Je kunt ook op de ribbon of op individuele atomen klikken om je selecties toe te passen.
BELANGRIJK!!!!! Voordat je in het plaatje klikt om het te bewegen etc., zorg dat je onder
tools - re-centering selecteert. Anders kunnen er ongewenste/onverwachte dingen
gebeuren, want je kunt de tools opties nl ook toepassen door op het eiwit te klikken.
Als je het huidige beeld wilt bewaren om later nog eens naar terug te keren, klik: OptionsCapture current viewer state (eerst een toepasselijke naam in het vakje invullen). De
bewaarde "state"' komt dan in het lijstje onder Import state - Je krijgt het weer terug door
op de naam te klikken.
o
Het is aan te raden dit regelmatig te doen.
o
Dit werkt alleen zolang de viewer draait en je geen nieuwe structuur laadt, als je
het permanent wilt bewaren moet je het saven onder options-save selected state.
Opdracht 9.
HIV-I protease
Intro:
11
Voor deze opdracht kijken we naar het enzym HIV-I protease. Human Immunodeficiency Virus (HIV)
is de veroorzaker van de ziekte AIDS. Het virus maakt zogenaamde poly-eiwitten. Deze bestaan uit
een aantal individuele eiwitten die samen worden gesynthetiseerd als 1 lange eiwitketen. Voordat
deze eiwitten hun werk kunnen doen moet die lange keten in de individuele eiwitten uiteen worden
geknipt. HIV-1 protease is het enzym dat deze functie uitvoert en HIV-1 protease is daarom cruciaal
voor de vermeerdering van HIV en dus een doelwit van veel AIDS remmers.



Afbeelding 12 Knippen van een poly-eiwit door HIV-1 protease
Gebruik Protopedia (zie tips hierboven) en Wikipedia en PDB (http://pdb101.rcsb.org/motm/6) om
de volgende vragen te beantwoorden:
1.
2.
3.
4.
Welke reactie kan een protease versnellen?
Beschrijf de bijzondere ruimtelijke bouw van dit viruseiwit.
Het substraat van HIV-1 protease is een polyeiwit (zie afbeelding 12). Waar denk je dat HIV1 protease zal gaan binden? Wat moet er gebeuren met HIV-I protease zodat het polyeiwit
in kleinere eiwitten geknipt kan worden?
Op welke manier kan HIV-I protease geremd worden (en hierdoor dan ook de ziekte AIDS)?
Er is een flink aantal 3D structuren bepaald van HIV-I protease met verschillende substraten/
remmers (kijk op Protopedia voor een complete lijst). We zullen een tweetal iets beter bekijken en
zien wat we er van kunnen leren:








Ga naar de Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb).
Typ in de zoekbalk bovenin: 1HXB (elke structuur heeft een unieke identifier = PDB ID).
Je ziet nu een pagina met veel informatie over 1HXB waar je waarschijnlijk niet zoveel
mee kunt; negeer dit. In het kort: 1HXB is HIV- I protease met het medicijn Saquinavar,
een AIDSremmer.
Aan de linkerkant van de pagina zie je een plaatje van de 3D structuur van HIV-I protease.
Kijk daaronder bij "Standalone Viewers" en open de Protein Workshop viewer (zie evt. ook
de hierboven beschreven Tips voor gebruik van de Protein Workshop Viewer)
Je ziet nu het eiwit HIV-I protease in ribbon (lint) weergave, waarbij de eiwitketen is gekleurd
van amino-terminus --> carboxy terminus = blauw --> rood
(als je niet meer weet wat het aminoterminus en carboxyterminus van een eiwit is kun je
dat opzoeken in opgave 3a)
In de witte box aan de rechterzijde zie je wat er in de structuur aanwezig is:
Chain A en B zijn twee eiwitketens;
Klik op chain A:hiv-1 protease en je ziet welke van de twee ketens chain a is doordat de
aminozuurzijketens zichtbaar worden.
Klik op + voor chain A:hiv-1 protease en je vouwt de lijst open om de aminozuren te zien.
Klik op één van de aminozuren in je ziet waar het betreffende aminozuur zich bevindt in de
keten.
Watermoleculen - die zullen we negeren
Vraag:
5.
Is het een monomeer of multimeer eiwit?
6.
Bestaat het uit voornamelijk α-helices of juist β-sheets?
Aminozuren die belangrijk zijn voor de enzymatische reactie van HIV-I protease zijn: Asparaginezuur
25, Threonine 26 en Glycine 27

Lokaliseer deze in de structuur (Tools – visibility – Atoms&bonds – klik Asp25,
12

THR26 en GLY27 in chain A en B
Maak het moleculaire oppervlak van HIV-1 protease zichtbaar door de schuifbalk ongeveer
tot halverwege transparant en opaque (ondoorzichtig) te verschuiven (je wilt de
onderliggende structuur blijven zien). Klik en beweeg het plaatje om het beeld te verversen.
Vraag:
7.
Welke van deze drie aminozuren zal de belangrijkste rol spelen bij het knippen van het
polyeiwit?
8.
Als je kijkt naar de vorm van het moleculaire oppervlak (beweeg het plaatje) en de positie
van de katalytische aminozuren, kun je dan voorspellen hoe het substraat (het polyeiwit)
bindt aan het eiwit?
Je kunt het oppervlak ook kleuren naar de mate waarin het oppervlak hydrofoob dan wel hydrofiel
of geladen is (knop onder de schuifbalk (hydrophobicity); geel = hydrofoob, wit = hydrofiel, blauw
= geladen aminozuren)
Vraag:
9.
Wat is de overheersende eigenschap van het oppervlak richting de substraat/ remmer
bindingsplaats?
Hiv-1 protease behoort tot de familie van de aspartyl proteases. Deze groep enzymen kenmerkt zich
door de aanwezigheid van de aminozuurvolgorde Asp-Thr-Gly. Vanwege het belang van HIV-1
protease voor de virulentie van HIV zijn er honderden 3D structuren van dit eiwit bekend, waarvan
vele met remmers. In oktober 2014 waren er al 471 structuren van HIV-1 protease beschikbaar in
de Protein Data Bank.
Vraag:
10.
Verklaar waarom het moeilijk is om HIV-I protease te kristalliseren (de techniek die nodig is
om deze 3D modellen te kunnen construeren) met het poly-eiwit.
(Tip: kristalliseren van eiwitten duurt enkele uren tot weken, afhankelijk van het eiwit en de
condities).
13
Keuzeopdrachten
Analyse technieken
Hieronder staat een viertal opdrachten (10 t/m 13) over diverse analysetechnieken die worden
toegepast tijdens de masterclass. Lees de opdrachten door en kies vervolgens welke opdracht je wilt
maken. Het is de bedoeling dat je er minstens één maakt. Verdiep je in de techniek waarvoor je de
meeste interesse voelt. Bereid je zo voor dat je, tijdens het experiment waarin je de betreffende
techniek toepast, het principe van de techniek kunt uitleggen aan je begeleider en medestudenten.
(Reverse Transcriptase) Polymerase Chain Reaction (PCR en RT-PCR)
Opdracht 10. PCR en RT- PCR
Beschrijf de techniek PCR.
Veel informatie kun je vinden
Op bioplek
http://www.bioplek.org/animaties/moleculaire_genetica/PCRx.html
in de nlt module forensisch onderzoek blz 110 t/m 113
http://betavak-nlt.nl/les/modules_v/gecertificeerd/00015/
Beschrijf in eigen woorden de verschillende stappen die plaatsvinden tijdens de PCR.
Wanneer je op school al eerder had kennis gemaakt met de techniek PCR, of wanneer je je verder
wilt verdiepen, kun je nog informatie verzamelen over RT-PCR. Beschrijf de rol van het enzym
Reverse Transcriptase en waarom soms RT-PCR moet worden toegepast in plaats van PCR.
https://en.wikipedia.org/wiki/Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction
Gelelektroforese
Opdracht 11. Gelelektroforese
Beschrijf de techniek gelelektroforese.
Veel informatie kun je vinden op de link
http://www.mlochemie.nl/index.php/21-elektroforese
waarbij je door kunt klikken naar andere websites waaronder bioplek.
Leg uit op basis waarvan de verschillende stukjes DNA worden gescheiden.
Fluorescerende markers
Opdracht 12. Red Fluorescent Protein (RFP) en Green Fluorescent Protein (GFP)
Bestudeer het filmpje over een nobelprijswinaar die het Green Fluorescent Protein ontdekte.
http://www.youtube.com/watch?v=90wpvSp4l_0&feature=related
Beschrijf over dit eiwit
waar het in de natuur wordt gevonden
de bijzondere eigenschappen
de bijzondere ruimtelijke bouw
de mogelijkheden die dit eiwit biedt in onderzoek. Beschrijf de manier waarop dit eiwit wordt
gebruikt in moleculair biologisch onderzoek.
Meer informatie kun je ook vinden op de Engelstalige website van Wikipedia over dit eiwit.
Celkweek
Opdracht 13. HeLa cellen
Lees het artikel Celkweek- het zwarte goud van de wetenschap
14
http://www.sciencepalooza.nl/2012/06/celkweek-het-zwarte-goud-van-de-medische-wetenschap/
Beschrijf hoe de cellen van Henrietta Lacks hebben geleid tot wetenschappelijke doorbraken
(sommigen zelfs bekroond met een Nobelprijs!) zoals een poliovaccin. Welke speciale eigenschap
maakt HeLa-cellen (maar ook veel andere cellijnen) zo geschikt voor het gebruik in onderzoek? Meer
informatie is te vinden op de wikipediapagina’s over
celcultuur
https://nl.wikipedia.org/wiki/Celcultuur
en HeLa-cellen
https://en.wikipedia.org/wiki/HeLa
De basisopdracht met opdracht 1 t/m 7 is overgenomen (en voor deze voorbereidingsopdracht bewerkt) uit de
U-talent vwo 4 module ‘Ontwikkeling van medicijnen’ .
De verdiepende opdracht met opdracht 9 is overgenomen (en voor deze voorbereidende opdracht bewerkt) uit
de U-talent vwo 6 module ‘Eiwitstructuur en enzymkinetiek’.
Colofon
Deze opdracht is gemaakt voor U-Talent (http://www.u-talent.nl/) met bijdragen van:
U-Talent:
o
o
A.W. van Bruggen- van der Lugt MEd (auteur)
Drs. C.C. Kleijer (curriculumcoördinator)
Universiteit Utrecht, Faculteit Bètawetenschappen, Departement scheikunde
o Ir. P.T. van Bentum
Voor deze voorbereidende opdracht geldt een
Creative Commons
Nederland Licentie
Naamsvermelding-Niet-commercieel-Gelijk
delen
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/nl
Het auteursrecht op de voorbereidende opdracht berust bij de Universiteit Utrecht en U-Talent
15
3.0
16