Restrictiefragment-lengtepolymorfisme

1
Restrictiefragment-lengtepolymorfisme
Een didactisch model voor een belangrijke DNA-techniek
Gebaseerd op het gelijknamige artikel Roels, P., Goethals V., Smets E., & F. De Meuter
(1996), Bulletin voor het Onderwijs in de Biologie 27, 165: 206-212.
ABSTRACT
Lessen waarin recente ontwikkelingen uit de moleculaire biologie aan bod komen, zijn voor
leerlingen vaak moeilijk te volgen. Het hier voorgestelde didactisch model stelt leerlingen van
het zesde jaar secundair onderwijs in staat spelenderwijs kennis te maken met verschillende
facetten van een belangrijke DNA-techniek, nl. de studie van het restrictiefragment-lengtepolymorfisme of kortweg RFLP (uitgesproken “rifflip”). Door toepassing van dit model in de
klas zullen leerlingen niet alleen de belangrijkste termen uit het DNA-onderzoek kunnen
leren, maar krijgen ze eveneens de kans een inzicht in deze techniek te verwerven. Bovendien
laat het model toe bepaalde facetten van de “wetenschappelijke methode” effectief in te
oefenen.
LITERATUUR
Backeljau, T. & B. Winnepenninckx (1995).
DNA als merker voor evolutie-onderzoek.
Jaarboek van de Vereniging voor het Onderwijs, in de Biologie, de Milieuleer en de
Gezondheidseducatie: 201-225.
Crabbé, C. (1995).
Genetica in het secundair en universitair onderwijs, een struikelblok voor velen.
Jaarboek van de Vereniging voor het Onderwijs, in de Biologie, de Milieuleer en de
Gezondheidseducatie: 87-102.
Logtenberg, H. & E. Bakker (1987).
DNA in de getuigenbank.
Natuur & Techniek 55, 10: 842-853.
Moore, P. (1995).
Goochelen met genen.
Natuur & Techniek 63, 4: 248-255.
Rasquin, V. (1995).
Enkele aspecten van de biotechnologie.
Jaarboek van de Vereniging voor het Onderwijs, in de Biologie, de Milieuleer en de
Gezondheidseducatie: 167-178.
Valerio, D. (1994).
Gentherapie. Belofte met haken en ogen.
Natuur & Techniek 62, 8: 602-613.
2
INLEIDING
De kennis van de biologie neemt explosief toe. Vooral het moleculair onderzoek in het
algemeen, en het DNA-onderzoek in het bijzonder, gaan met rasse schreden vooruit. Dit
wordt duidelijk als we bedenken dat tussen de ontdekking van het DNA als drager van de
erfelijke eigenschappen, door Oswald Avery in 1944 en de ontwikkeling van alle nu bekende
DNA-technieken een tijdspanne van amper vijftig jaar ligt. De resultaten van de moleculaire
biologie beïnvloeden bovendien meer en meer onze hedendaagse maatschappij in zeer
uiteenlopende domeinen, gaande van nieuwe ontwikkelingen in de misdaadbestrijding (bv.
genetische vingerafdruk, Logtenberg & Bakker 1987) tot grondige vernieuwingen in
landbouw en geneeskunde (bv. genmanipulatie bij planten, Botterman 1989; gentherapie bij
de mens, Valerio 1994). We verwijzen naar Rasquin (1995) voor een leertekst omtrent
elementaire biotechnologische begrippen. Daarnaast rijzen er ook steeds meer ethische vragen
over de grenzen van de uitvoering van datgene wat technisch haalbaar is (Moore 1995).
Terecht kunnen we ons daarom afvragen hoe het biologie-onderwijs hierop moet reageren.
Moet de leerinhoud van de lessen biologie uitgebreid worden ? Zo ja, hoe ver kan daarin
worden gegaan ? Bestaat het gevaar van overbelasting van het vak biologie ? Daarenboven is
het niet onwaarschijnlijk dat leerlingen uiteindelijk gedetailleerde informatie over bepaalde
biologische structuren, hun functies en bijkomende technieken zullen kennen, maar deze niet
(meer) met elkaar in verband kunnen brengen of situeren binnen een groter geheel. Zo kan het
gebeuren dat leerlingen de volledige fotosynthese-reacties kennen, maar niet op de hoogte
zijn van de plaats noch functie van dit proces (zie Crabbé 1995 voor gelijkaardige problemen
in de genetica).
In Vlaamse leerboeken biologie verschenen reeds allerlei uitweidingen over bepaalde DNAtechnieken (bv. “polymerase-kettingreactie (PCR)”, “RFLP”, “Southern-vlek-techniek”,
“genetische manipulatie”). Vaak echter betreft het, ons inziens, erg technische beschrijvingen
zonder veel uitleg over de uiteindelijke resultaten en hun interpretatie. Daarnaast moet men
ook rekening houden met het feit dat de leerkrachten zelf vaak onvoldoende op de hoogte zijn
van deze recente (r)evoluties in de biologie: het gebruik van de polymerase-kettingreactie bv.
is pas sinds 1988 definitief doorgebroken.
Omwille van de relevantie van de recente ontwikkelingen in de biologie en ons dagelijks
leven, achten we het nuttig dat de leerlingen een basiskennis bezitten over DNA-technieken.
Rekening houdend met hogergenoemde problemen, schetsen we een model dat in de klas kan
worden toegepast om leerlingen toe te laten de techniek voor de studie van restrictiefragmentlengtepolymorfisme (RFLP) spelenderwijs te exploreren gedurende één lestijd. Hierbij ligt de
nadruk niet zozeer op details, maar op het inzicht. Bovendien is het model zo opgesteld dat
het ook kan worden gebruikt om bepaalde facetten van de “wetenschappelijke methode” aan
te leren (nl. het opstellen van concrete hypothesen en de toetsing ervan). Het model werd aan
de K.U. Leuven (Laboratorium voor Systematiek) ontwikkeld voor, en uitgetest met
leerlingen van het 6de jaar secundair onderwijs in het kader van de wetenschapsweek, die in
oktober 1994 voor het eerst in Vlaanderen werd georganiseerd.
3
DE THEORIE
De genetische informatie van het leven is opgeslagen in de structuur van het
desoxyribonucleïne-zuur (DNA). De elementaire delen, de nucleotiden, vormen vier “letters”
die onderling verschillen in de ingebouwde organische base (adenine, A; cytosine, C;
guanine, G; thymine, T). Drie opeenvolgende nucleotiden (een codon) in het DNA coderen
voor een aminozuur in het uiteindelijk opgebouwde proteïne. Gedurende de evolutie ontstaan
er in het DNA op toevallige wijze veranderingen, zogenaamde mutaties, waardoor individuen
tot stand komen die genetisch verschillend zijn. Voorbeelden van mutaties zijn o.a. de
omzetting van een bepaalde base in een andere (base-substitutie) of het bijkomen (insertie)
of verdwijnen (deletie) van één of meerdere basen in het DNA. Het gevolg van een mutatie
kan een verandering van een aminozuur in een eiwit tot gevolg hebben, zoals bij
sikkelcelanaemie (tengevolge van base-substitutie). Mutaties kunnen echter ook fenotypisch
onopgemerkt blijven.
In het moderne moleculair onderzoek kunnen mutaties vrij gemakkelijk worden opgespoord.
Dit kan o.a. gebeuren door het restrictiefragment-lengtepolymorfisme1 tussen verschillende
monsters DNA te gaan bestuderen en te vergelijken. Hiervoor worden ze behandeld met een
restrictie-enzym of restrictie-endonuclease, waarvan er nu al meer dan honderd
verschillende bekend zijn. Elk restrictie-enzym herkent een welbepaalde, voor dat enzym
specifieke, opeenvolging van vier tot zes basen in het DNA (de herkenningssequentie) en
zal het DNA telkens ter hoogte van een dergelijke sequentie “doorknippen” (zie fig. 1).
Daarom worden ze ook wel knipenzymen genoemd. Zo ontstaat voor elke bestudeerde
monster DNA een verzameling van fragmenten met verschillende lengte. De zo bekomen
fragmenten kunnen nu uit elkaar worden gehaald en gevisualiseerd. De monsters DNA
worden daartoe op een gel gebracht, waarover vervolgens een elektrisch veld wordt
aangelegd. Aangezien DNA negatief geladen is, beweegt het naar de positieve pool, de
kleinste fragmenten het snelsts2. Voor het voorbeeld uit fig. 1 zou dit tot een resultaat leiden
als geschetst in fig. 2.
Fig 1. Voorstelling van twee dubbelstrengige DNA-moleculen met
aanduiding van de plaatsen waar het knipenzym met de
herkenningssequentie 5’ACGG 3’ aangrijpt.
3’TGCC 5’
1
Voor een gedetailleerde uitweiding over de werking van deze techniek wordt eveneens verwezen naar
Logtenberg & Bakker (1987).
2
Door Southern is een techniek ontwikkeld om uit een elektroforese-gel de DNA-fragmenten als het ware af te
vloeien en op een andere ondergrond over te brengen (“Southern blotting” of “Southern-vlektechniek”).
Hierdoor kunnen op de bekomen DNA-fragmenten weer andere technieken worden losgelaten.
4
Fig. 2. Voorstelling van de bekomen DNA-fragmenten uit
fig. 1 na scheiding d.m.v. gel-elektroforese.
Indien geen mutaties zouden zijn opgetreden tussen de bestudeerde monsters DNA zou elk
fragment bij de ene soort, een tegenhanger van gelijke grootte bezitten in de andere soort;
beide fragmenten zijn dan tevens genetisch identiek, d.i. bezitten eenzelfde opeenvolging van
basen.
Doordat mutaties echter vaak wel zijn opgetreden, zullen sommige van de gegenereerde
fragmenten van de verschillende monsters DNA er anders uitzien; er ontstaat een zogenaamd
polymorfisme (veelvormigheid).
- Door het optreden van inserties en deleties kunnen fragmenten respectievelijk langer of
korter zijn bij het ene monster in vergelijking met het andere.
- Door het optreden van puntmutaties kunnen herkenningssequenties verdwijnen of juist
ontstaan. Zo heeft DNA a uit fig. 1 tengevolge van een base-substitutie een extra
herkenningsplaats voor het beschouwde knipenzym in vergelijking met DNA b. Na
behandeling van het DNA met het knipenzym zullen daarom bij DNA a en b respectievelijk
twee korte en één lang fragment worden geproduceerd. De lengte van het lange fragment (uit
DNA b) komt daarbij overeen met de som van de lengtes van de twee korte fragmenten (uit
DNA a).
In fig. 3 wordt schematisch een samenvattend overzicht van de verschillende stappen uit een
studie naar het RFLP gegeven.
De hoger beschreven processen geven dus aanleiding tot een restrictiefragment-lengtepolymorfisme. Indien deze mutaties niet a priori gekend zijn, zoals in de praktijk nu vaak het
geval is, kunnen ze door een vergelijking van het fragmentenpatroon van verschillende
monsters DNA worden afgeleid. Deze informatie kan bijvoorbeeld worden gebruikt om een
idee te krijgen van de genetische diversiteit tussen de bestudeerde monsters, en in een verder
stadium zelfs om aan evolutiereconstructie te doen. De gegenereerde patronen zelf kunnen
echter ook zonder meer worden gebruikt, zoals bv. in de misdaadbestrijding. Hiervoor
bestudeert men met de bovenstaande techniek stukjes DNA die na behandeling met een
knipenzym een persoonsspecifiek patroon opleveren. Dit patroon kan dan ter identificatie
worden gebruikt. Met behulp van RFLPs tenslotte kunnen reeds tal van erfelijke ziekten
worden opgespoord.
5
Fig. 3. Schematische voorstelling van de verschillende stappen in een studie naar het restrictiefragment-lengtepolymorfisme. De lengte van de beschouwde fragmenten is proportioneel aan het aantal puntjes voor of na de
eigenlijke sequentie van deze fragmenten. De ‘λ‘ in 1.c en 1.d stelt referentie-DNA voor met fragmenten van
gekende lengte; dit laat in de praktijk toe van de fragmenten met onbekende lengte een benaderde lengte te schatten.
Voor meer uitleg wordt verwezen naar de tekst.
PRAKTISCHE UITWERKING
1. Voorbereiding
Voorafgaand aan de praktische uitvoering van het model, wordt door de leerkracht kort
ingegaan op de theoretische achtergrond van RFLPs. Naast de belangrijkste termen worden de
algemene werking en het nut van de bijbehorende techniek aangebracht. Voor de inhoud van
dit lesgdeelte verwijzen we naar het gedeelte “theorie” van deze tekst. Eventuele details
kunnen dan gedurende de uitvoering van het didactisch model worden ingevuld.
In het model, zoals hier uitgewerkt, werken de leerlingen in groepjes van vier, die samen
telkens de gehele procedure zullen doorlopen. De aantallen benodigdheden zijn hieronder dan
ook telkens weergegeven voor een dergelijk groepje.
6
Elke leerling moet beschikken over een lange papieren strook waarop in grote letters de
basenpaaropeenvolging van een kort dubbelstrengig DNA-molecule staat afgebeeld. Voor elk
groepje zijn er twee verschillende DNA-moleculen (verder DNA I en DNA II genoemd).
Alhoewel de leerkracht zelf een DNA-molecule met een bepaalde basenopeenvolging kan
ontwikkelen, wordt aangeraden de in fig. 4 voorgestelde DNA-moleculen te gebruiken: deze
zijn immers zo ontworpen dat men er achteraf de belangrijkste facetten van RFLP op een
didactische manier mee kan toelichten. In fig. 5 wordt een werkblad met deze DNAsequenties afgebeeld voor direct gebruik in de klas.
Fig. 4. Voorstelling van de nucleotidenopeenvolging van twee DNA-dubbelstrengen (DNA I en DNA II), met
aanduiding van de respectievelijke herkenningsplaatsen voor knipenzym A (vetjes) en B (onderlijnd). De cijfers
onder de strengen geven de lengtes van de te bekomen fragmenten weer. De herkenningssequenties voor de
beide knipenzymen worden in dit geval voor de eenvoud exact in het midden doorgeknipt.
Voor elke groep van vier leerlingen liggen verder vier scharen klaar, waarmee de papieren
strook in een aantal fragmenten zal worden geknipt. Elke leerling moet beschikken over
voldoende plaats zodat hij de te bekomen fragmenten mooi kan uitspreiden.
Op het schoolbord wordt voor de aanvang van de les een X-Y-assenkruis getekend. Op de Yas wordt een nummering van 1 to 26 (in stappen van 1) aangebracht, overeenkomend met de
lengte van de te bekomen fragmenten (zie lager, en fig. 6). Op de X-as worden de vier
condities (vier leerlingen, zie lager en fig. 6) voorgesteld. Elke conditie zal telkens door een
andere leerling van de groep op het bord worden gezet.
7
Fig. 5. Werkblad met de sequenties van DNA I en II voor rechtstreeks gebruik in de klas. Indien gewenst kan
het eerst worden vergroot.
2. Uitvoering
De leerlingen moeten zich in een eerste stadium gedragen als knipenzymen. Hiervoor
overlopen zij de DNA-streng van links naar rechts en knippen het dubbelstrengige DNAmolecule volledig door indien ze de respectievelijke herkenningssequentie tegenkomen. Dit
knippen gebeurt voor de eenvoud in het midden van de herkenningssequentie van het
beschouwde knipenzym. Twee van de vier leerlingen functioneren als knipenzym A met
3‘
herkenningssequentie 5’AGCT
op respectievelijk DNA I en DNA II; de overige twee
3’TCGA 5’
functioneren als knipenzym B met herkenningssequentie
5’CCGG 3’
3’GGCC 5’
eveneens op DNA I en
DNA II.
Nadat de DNA-strengen zijn doorgeknipt, wordt het aantal basenparen van elk bekomen
fragment geteld en erop genoteerd. Op basis daarvan worden dan de fragmenten ter plaatse
volgens grootte gescheiden, zoals in een echte gelelektroforese.
Na deze fase kunnen een paar leerlingen de bekomen DNA-fragmenten schematisch op het
bord brengen, rekening houdend met de grootte van de respectievelijke DNA-fragmenten.
Hiervoor kunnen leerlingen van verschillende groepjes worden gebruikt die reeds hun taak
beëindigden. Deze leerlingen moeten dan wel zodanig worden gekozen dat de fragmenten van
de twee DNA-strengen, elk afzonderlijk geknipt met knipenzym A en B, uiteindelijk naast
elkaar op het bord komen (zie ook fig. 6).
Tijdens dit gebeuren kunnen andere leerlingen nakijken of ze dezelfde fragmenten bekwamen
en zodoende een controlerende rol vervullen. Indien een leerling meerdere fragmenten bezit
8
met eenzelfde lengte, wordt op het bord op de respectievelijke plaats slechts één fragment
getekend, overeenkomend met het beeld van een echte gel.
Vervolgens kan de klassikale bespreking van het resultaat worden aangevat. We beschouwen
deze fase als de belangrijkste van het hele gebeuren.
3. Resultaat
Het is ons inziens wenselijk dat de leerkracht gedurende deze bespreking enkel optreedt als
moderator: hij leidt weliswaar de discussie door achtereenvolgens op een aantal dingen te
wijzen, maar laat vervolgens het redeneren over aan de leerlingen.
3.1) Bespreking van het fragmentenpatroon van DNA I en DNA II geknipt met knipenzym A
Best wordt hierbij de hieronder weergegeven strategie gevolgd. Eerst wordt een lijst
opgesteld met alle fragmenten die slechts in één van de twee monsters DNA voorkomen: voor
DNA I zijn dit de fragmenten 10, 7 en 5; voor DNA II de fragmenten 17 en 4 (zie fig. 6).
Vervolgens probeert men deze verschillen te verklaren vanuit hogergenoemde mutaties die
mogelijk zijn opgetreden tussen de twee monsters.
De meest plausibele verklaring (vergt het minste aantal deelhypothesen) voor het hier
geobserveerde bandenpatroon is dat fragment 5 van DNA I overeenkomt met fragment 4 van
DNA II. Beide fragmenten verschillen door een lengtemutatie (DNA I heeft een extra
basenpaar gekregen t.o.v. DNA II of alternatief, DNA II heeft een basenpaar verloren t.o.v.
van DNA I). Fragment 17 van DNA II vinden we terug onder de vorm van de fragmenten 10
en 7 in DNA I. Fragment 17 heeft een extra knipplaats voor het beschouwde knipenzym
gekregen (of alternatief: de knipplaats die fragmenten 7 en 10 scheidde, is verdwenen in DNA
II). Nadat deze hypothesen door de leerlingen (met de hulp van de leerkracht) zijn
geformuleerd, kunnen ze ook effectief worden nagekeken op de doorgeknipte papieren
fragmenten. Zo blijkt dat indien de fragmenten 10 en 7 van DNA I op de juiste manier achter
elkaar worden gelegd de basenpaar-opeenvolging overeenkomt met deze van fragment 17 van
DNA II, op één basemutatie na die juist aan de basis ligt van de bijkomende knipplaats.
Hetzelfde kan gebeuren met de andere fragmenten. Het dient te worden opgemerkt dat in
werkelijkheid de hier voorgestelde hypothesen in dit stadium niet nader (kunnen) worden
nagekeken, tenzij men bijvoorbeeld aan sequentiebepaling doet (zie Backeljau &
Winnepenninckx 1995 voor meer technische informatie hieromtrent).
3.2) Bespreking van fragmentenpatroon van DNA I en DNA II geknipt met knipenzym B
DNA I bezit de fragmenten 23 en 20 die niet voorkomen bij DNA II; DNA II daarentegen
bezit fragmenten 22 en 12 die niet voorkomen bij DNA I (zie fig. 6). De meest plausibele
verklaring voor dit patroon is dat fragment 23 van DNA I overeenkomt met fragment 22 van
DNA II, waarbij beiden verschillen door een lengtemutatie. Fragment 20 van DNA I heeft dan
slechts één partiële tegenhanger in DNA II, namelijk fragment 12. Dit kan worden verklaard
als men aanneemt dat fragment 8 tweemaal voorkomt in DNA II. Eén van de fragmenten 8
komt overeen met fragment 8 van DNA I; het andere vormt tegelijk met fragment 12 het
fragment 20 van DNA I.
9
Fig. 6. Schematische voorstelling van het te bekomen fragmentenpatroon na behandeling van DNA
I en II met knipenzymen A en B.
3.3) Randopmerkingen
Het is goed de leerlingen erop te wijzen dat fragmenten die geknipt zijn met een verschillend
knipenzym en eenzelfde lengte bezitten, niet dezelfde basenopeenvolging bezitten. Dit heeft
natuurlijk te maken met het feit dat twee verschillende knipenzymen op verschillende
plaatsen in het DNA gaan knippen (hebben een verschillende herkenningssequentie). Daarbij
kunnen toevallig wel fragmenten met eenzelfde lengte ontstaan. Bij twee DNA-stalen geknipt
met eenzelfde knipenzym mag verwacht worden dat fragmenten van gelijke grootte wel
eenzelfde informatie-inhoud zullen hebben. Toch dient hierbij te worden opgemerkt dat ook
deze fragmenten in beperkte mate kunnen verschillen in basenopeenvolging door het optreden
van eventuele basensubstituties die verder geen effect hadden in het bijkomen/verdwijnen van
een knipplaats. Een voorbeeld kan worden aangegeven tussen de fragmenten 10 van DNA I
en II geknipt met
GGATTGGTCC
GGATAGGTCC
versus CCTATCCAGG
.
knipenzym B: CCTAACCAGG
Voor elk verschil in bandenpatroon tussen soorten kunnen vaak meerdere hypothesen worden
geformuleerd, bv. het gecombineerd optreden van basesubstituties en lengtemutaties. Zo kan
bv. in het geval van DNA I en DNA II geknipt met knipenzym A de volgende hypothese
gemaakt worden: fragment 17 van DNA II heeft na een deletie van 2 baseparen een extra
knipplaats gekregen waardoor het bij DNA I voorkomt onder de vorm van twee fragmenten
met lengte 10 en 5; fragment 7 van DNA I is herleid tot fragment 4 van DNA II door een
10
deletie van 3 basenparen (zie fig. 6). Indien de leerlingen deze hypothesen stellen, is het ons
inziens belangrijk ze te stimuleren tot het formuleren van de meest waarschijnlijke
hypothesen.
CONCLUSIE
Het hoger voorgestelde model laat toe leerlingen vertrouwd te maken met een belangrijke
techniek en allerlei termen uit de moleculaire biologie. De nadruk werd hierbij gelegd op het
leren probleemstellend werken en op het leren formuleren van concrete hypothesen (die in het
model nadien op hun geldigheid kunnen worden getest). De gedetailleerde uitweidingen die
soms werden weergegeven, hebben enkel tot taak de leerkracht een zo volledig mogelijke
theoretische achtergrond te geven van de beschouwde techniek en hem bovendien voor te
bereiden op mogelijke vragen en suggesties van de leerlingen tijdens de les. Het is zeker niet
de bedoeling dat de leerkracht al deze problemen ook daadwerkelijk in de klas behandelt.
Onze (beperkte) ervaring met dit model gedurende de wetenschapsweek leert ons dat sterkere
klassen de beschouwde techniek gemakkelijk in één les kunnen aanleren en zelfs sommige
van de gedetailleerde uitweidingen gemakkelijk kunnen begrijpen. Veel succes!