validatieproject kwalitatieve analyse

FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVT
SECTIE - SECTION: Toevoegingsmiddelen
VALIDATIEPLAN – PLAN DE VALIDATION
I-MET-FLVVT-143
Analysemethode
Bepaling van vetoplosbare vitaminen in specifieke levensmiddelen
Méthode d’analyse
Détermination de vitamines liposolubles dans denrées alimentaires spécifiques
Vitamines A, D, E
Techniek
Technique
Matrix / matrixgroep
Matrice / Groupe de
matrices
Type validatie
Type de validation
Verantwoordelijke
(Naam en functie)
Responsable
(Nom et fonction)
HPLC
Levensmiddelen (Voedingssupplementen)
Denrées alimentaires (Suppléments alimentaires)
Totaal – Totale
Secundair – Secondaire
Mini-validatie – validation minimale
Mieke Vanbrabant
Verantwoordelijke sectie toevoegingsmiddelen
Responsable section additifs
Naam – Nom: Mieke Vanbrabant
Opgesteld door
Functie - Fonction: Verantwoordelijke sectie Handtekeningen - Signatures:
Rédaction par
toevoegingsmiddelen
(get.)
Datum - Date: 2011-12-15
Goedgekeurd door
Approuvée par
Naam – Nom: Mandy Lekens
Functie - Fonction: Labomanager
Datum - Date: 2011-12-17
Handtekeningen - Signatures:
(get.)
LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan – Modèle plan de validation v.01 2012-03-15 1/12
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVT
SECTIE - SECTION: Toevoegingsmiddelen
Stap – Phase 1: Bepaling van het toepassingsgebied – Déterminer le
champs d’application
De methode moet geschikt zijn voor de kwantitatieve bepaling van de vetoplosbare vitamines A, D en E in
voedingssupplementen.
Het gehalte aan deze vitamines is relatief hoog voor voedingssupplementen en bedraagt gewoonlijk 1000 tot
3000 IE retinol (Vitamine A), 100 tot 300 IE calciferol (Vitamine D) en/of 8 tot 12 mg alfa-tocoferol
equivalenten (Vitamine E) per dagelijkse dosis.
Het werkgebied zal zo opgesteld worden dat de courante concentraties voor beide matrices probleemloos
kunnen gemeten worden en kritische concentraties niet helemaal aan de uitersten van het werkgebied
liggen.
Stap – Phase 2: Doel en statuut van de analysemethode – Le but et
status de la méthode d’analyse
Kwantitatieve
bevestigingsmethode,
afgeleide
methode
gebaseerd
op
Verordening
2009/152/EG
(Bemonsterings- en analysemethoden voor de officiële controle van diervoeders) en EN12821 (Foodstuffs Determination of vitamin D by high performance liquid chromatography).
Stap – Phase 3: Keuze validatieparameters – Choisir les paramètres à
valider
Voor deze methode worden de volgende prestatiekenmerken bepaald: lineariteit en werkgebied,
bepaalbaarheidsgrens en aantoonbaarheidsgrens, specificiteit en selectiviteit, juistheid en terugvinding,
precisie, herhaalbaarheid, reproduceerbaarheid (intra-) en robuustheid.
Stap – Phase 4: Externe eisen voor validatieparameters – Des exigences
externes pour les paramètres à valider
Nvt.
Stap – Phase 5: Keuze van de monsters – Le choix d’échantillons
Gecertificeerd referentiemateriaal dat een grote gelijkenis met praktijkmonsters vertoont:

Multivitamin/Multielement tablets: NIST Standard Reference Material (SRM) 328
LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan – Modèle plan de validation v.01 2012-03-15 2/12
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVT
SECTIE - SECTION: Toevoegingsmiddelen
VALIDATIERAPPORT – RAPPORT DE VALIDATION
I-MET-FLVVT-143
Analysemethode
Bepaling van vetoplosbare vitaminen in specifieke levensmiddelen
Méthode d’analyse
Détermination de vitamines liposolubles dans denrées alimentaires spécifiques
Vitamines A, D, E
Techniek
Technique
HPLC
Matrix / matrixgroep
Matrice / Groupe de
Levensmiddelen (Voedingssupplementen)
matrices
Datum laatste
aanpassing / Date de
2013/01/30
la dernière adaption
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 3/12
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVT

SECTIE - SECTION: Toevoegingsmiddelen
Overzicht van de prestatiekenmerken:
o
Zie paragraaf 3

De validatie voldoet aan procedure LAB 00 P180

De laboratoria die deze methode willen overnemen, moeten aantonen dat de criteria
hieronder aangegeven voldaan zijn:
o

Zie paragraaf 3.2 en 3.3 (zowel juistheid als precisie bepaald op minstens 1 niveau))
Historiek validatie
Versie
Herziening door/datum
Reden van herziening
Wijzigingen
01
12/2012, M. Vanbrabant
Opsteller initiële versie
Volledige tekst
01
01/2013, M. Vanbrabant
BELAC audit 12/2012 en
Toevoeging validatieplan en
voorbereiding publicatie (geen versie
overzicht validatierapport +
wijziging)
historiek
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 4/12
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVT
SECTIE - SECTION: Toevoegingsmiddelen
VALIDATIERAPPORT – RAPPORT DE VALIDATION
I-MET-FLVVT-143
Analysemethode
Bepaling van vetoplosbare vitaminen in specifieke levensmiddelen
Méthode d’analyse
Détermination de vitamines liposolubles dans denrées alimentaires spécifiques
Vitamines A, D, E
Techniek
Technique
HPLC
Matrix / matrixgroep
Matrice / Groupe de
Levensmiddelen (Voedingssupplementen)
matrices
Type validatie
Type de validation
Totaal – Totale
Secundair – Secondaire
Mini-validatie – validation minimale
Verantwoordelijke (Naam
en functie)
Mieke Vanbrabant
Responsable
Verantwoordelijke sectie toevoegingsmiddelen
(Nom et fonction)
Naam – Nom: Mieke Vanbrabant
Opgesteld door
Functie
Rédaction par
toevoegingsmiddelen
-
Fonction:
Verantwoordelijke
sectie Handtekeningen - Signatures:
(get.)
Datum - Date: 2012-12-10
Medewerkers
(Naam en functie)
Collaborateurs
(Nom et fonction)
Johan Vandenbempt : laborant
Jean-Pierre De Lannoy : laborant
Nele Maris : laborant
Martine Bral: laborant
Annemie Voets: laborant
Periode van validatie
Start - Début: 03-2012
Période de validation
Einde - Fin: 12-2012
Methode goedgekeurd en
geschikt bevonden door
Méthode approuvée et jugé
convenable pour la routine
Naam – Nom: Mandy Lekens
Handtekeningen - Signatures:
Functie - Fonction: Labomanager
(get.)
Datum - Date: 2012-12-07
par
Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals aangegeven in stap 8 van de procedure
LAB 00 P 180.
Ce qui suit est une description des résultats de l'étude de validation comme indiqué dans l'étape 8 de la procédure LAB
P 00 180.
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 5/12
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVT
SECTIE - SECTION: Toevoegingsmiddelen
SAMENVATTING VALIDATIEGEGEVENS – RÉSUMÉ DES DONNÉES DE VALIDATION ......................... 7
1
DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED........................................................................................................... 7
2
ANALYSEMETHODE EN ANALISTEN..................................................................................................... 7
3
PRESTATIEKENMERKEN ........................................................................................................................ 7
3.1
LINEARITEIT EN WERKGEBIED ................................................................................................................. 7
3.2
PRECISIE............................................................................................................................................... 8
3.2.1
Herhaalbaarheid (%RSDr ) en intralaboratoriumreproduceerbaarheid (%RSDRw) ...................... 8
3.2.1.1
3.3
JUISTHEID ........................................................................................................................................... 10
3.3.1
3.4
4
Voedingssupplementen (NIST SRM 3280) .......................................................................... 8
Voedingssupplementen (NIST SRM 3280) ................................................................................ 10
AANTOONBAARHEIDSGRENS (LOD) EN BEPAALBAARHEIDSGRENS (LOQ) ............................................... 10
3.4.1
Vitamine A .................................................................................................................................. 10
3.4.2
Vitamine D.................................................................................................................................. 10
3.4.3
Vitamine E .................................................................................................................................. 11
3.5
SPECIFICITEIT EN SELECTIVITEIT ........................................................................................................... 11
3.6
REPRODUCEERBAARHEID (INTER)......................................................................................................... 11
3.7
ROBUUSTHEID ..................................................................................................................................... 11
MEETONZEKERHEID ............................................................................................................................. 11
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 6/12
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVT
SECTIE - SECTION: Toevoegingsmiddelen
Samenvatting validatiegegevens – Résumé des données de validation
1
Doel en toepassingsgebied
Kwantitatieve bepaling van vitamines A, D en E met behulp van een afgeleide HPLC-methode.
Het gehalte aan deze vitamines is relatief hoog voor voedingssupplementen en bedraagt gewoonlijk 1000 tot
3000 IE retinol (Vitamine A), 100 tot 300 IE calciferol (Vitamine D) en/of 8 tot 12 mg alfa-tocoferol
equivalenten (Vitamine E) per dagelijkse dosis. Cholecalciferol (Vitamine D3) en ergocalciferol (Vitamine D2)
worden nooit samen toegevoegd aan een supplement en worden in de loop van het validatiedossier beide
bepaald om de geschiktheid van de methode voor beide componenten aan te tonen.
2
Analysemethode en analisten
I-MET-FLVVT-143, versie 01 en 02.
Het validatieonderzoek werd uitgevoerd onder toezicht van sectieverantwoordelijke Mieke Vanbrabant
(2012) door de volgende analisten:





Martine Bral
Annemie Voets
Nele Maris
Johan Vandenbempt
Jean-Pierre De Lannoy
Alle bepalingen gebeurden op HPLC keten 7.
3
Prestatiekenmerken
Ruwe gegevens: Zie bijlage.
3.1
Lineariteit en werkgebied
Een ijklijn in solvent en een ijklijn in matrix werden opgesteld op basis van 5 concentratieniveaus (3 maal).
De geschiktheid van het lineair model voor beide ijklijnen werd bewezen aan de hand van het statistisch
verwerkingsprogramma Statgraphics (Regressie-analyse, Lack-of-fit test). Een Statgraphics vergelijking
tussen de ijklijn in solvent en de ijklijn in matrix werd uitgevoerd om aan te tonen dat er geen significant
verschil bestaat tussen de ijklijn in solvent en de ijklijn in matrix (Comparison of regression lines). In dit geval
wordt er bijgevolg verder gewerkt met een ijklijn in solvent.
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 7/12
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVT
SECTIE - SECTION: Toevoegingsmiddelen
Het werkgebied wordt gekozen in functie van de meest voorkomende doseringsgehaltes en ligt tussen:
Vitamine A : 1,25 – 10 IE/ml
Vitamine D : 22 – 176 IE/ml
Vitamine E : 5 – 40 µg/ml
Aangezien voedingssupplementen gewoonlijk hoge gehaltes aan vitamines bevatten, worden de extracten
verdund tot de concentratie van het gewenste vitamine binnen de grenzen van het werkgebied valt.
3.2
Precisie
3.2.1
Herhaalbaarheid (%RSDr ) en intralaboratoriumreproduceerbaarheid (%RSDRw)
Voor deze bepaling werd er volgens de validatieprocedure gebruik gemaakt van Excel-template LAB 00 P
180 F 004.
3.2.1.1
Voedingssupplementen (NIST SRM 3280)
3.2.1.1.1
Vitamine A
FLVVT
Horwitz
%RSDr
7,79
%RSDr max =
4,26
%RSDRw
8,75
%RSDRw max =
6,39
Herhaalbaarheid r (IE/kg)
321000
Reproduceerbaarheid R (IE/kg)
361000
Evaluatie:
Het gecertificeerde gehalte aan vitamine A voor SRM 3280 bedraagt 444 +/- 46 mg/kg, dit komt overeen met
1480000 +/- 153000 IE/kg, wat een relatief hoog gehalte is.
Zowel herhaalbaarheid (%RSDr) als intralaboratorium-reproduceerbaarheid (%RSDRw) is niet kleiner dan of
gelijk aan de maximaal toegelaten waarde volgens de vergelijking van Horwitz.
Gezien de extreem hoge gevoeligheid van vitamine A voor afbraak door oxidatie, is het bijna niet mogelijk
om de strikte Horwitz maxima toe te passen. Daarom werden er meerdere bepalingen uitgevoerd, waarvan
er 31 van de 36 bepalingen binnen het interval vallen, bepaald door de gemiddelde waarde rekening
houdend met de meetonzekerheid. Bovendien is zowel %RSDr / %RSDr max als %RSDRw / %RSDRw max groter
dan 2, wat op een aanvaardbare variantie wijst.
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 8/12
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVT
3.2.1.1.2
SECTIE - SECTION: Toevoegingsmiddelen
Vitamine D2
FLVVT
Horwitz
%RSDr
4,29
%RSDr max =
7,64
%RSDRw
7,37
%RSDRw max =
11,46
Herhaalbaarheid r (IE/kg)
43100
Reproduceerbaarheid R (IE/kg)
74100
Evaluatie:
Voor vitamine D2 is zowel herhaalbaarheid (%RSDr ) als intralaboratorium-reproduceerbaarheid (%RSDRw) is
kleiner dan de maximaal toegelaten waarde volgens de vergelijking van Horwitz.
3.2.1.1.3
Vitamine D3
FLVVT
Horwitz
%RSDr
5,54
%RSDr max =
8,37
%RSDRw
5,54
%RSDRw max =
12,56
Herhaalbaarheid r (mg/kg)
32900
Reproduceerbaarheid R (mg/kg)
32900
Evaluatie:
Voor vitamine D3 is zowel herhaalbaarheid (%RSDr ) als intralaboratorium-reproduceerbaarheid (%RSDRw)
kleiner dan de maximaal toegelaten waarde volgens de vergelijking van Horwitz.
3.2.1.1.4
Vitamine E
FLVVT
Horwitz
%RSDr
2,31
%RSDr max =
2,38
%RSDRw
4,74
%RSDRw max =
3,57
Herhaalbaarheid r (mg/kg)
1300
Reproduceerbaarheid R (mg/kg)
2660
Evaluatie:
Voor vitamine E is enkel de herhaalbaarheid (%RSDr ) kleiner dan de maximaal toegelaten waarde volgens
de vergelijking van Horwitz, in tegenstelling tot de intralaboratorium-reproduceerbaarheid (%RSDRw).
%RSDRw / %RSDRw maxis echter groter dan 2, wat op een aanvaardbare variantie wijst
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 9/12
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVT
3.3
SECTIE - SECTION: Toevoegingsmiddelen
Juistheid
Bij herhaalde analyses van een monster moet het resultaat liggen tussen 75 en 125% van het belaste of
gecertificeerde gehalte.
3.3.1
Voedingssupplementen (NIST SRM 3280)
De juistheid voor de matrix voedingssupplementen werd bepaald aan de hand van een standaard
referentiemateriaal (SRM 3280). Alle waarden voldoen aan de vooropgestelde voorwaarde.
3.4
Vitamine
Juistheid (%)
A
96,76
D2
97,78
D3
105,83
E
96,68
Aantoonbaarheidsgrens (LOD) en bepaalbaarheidsgrens (LOQ)
De LOD en LOQ worden berekend op basis van de signaal-ruisverhouding (S/N). Voor de LOD dient S/N ≥ 3
te zijn; voor de LOQ is S/N ≥ 6. Indien S/N ≥ 30, dienen de aantoonbaarheidsgrens en
bepaalbaarheidsgrens niet bepaald te worden (De Ware(n) Chemicus).
3.4.1
Vitamine A
Voor de bepaling van de LOD en LOQ werden 6 deelmonsters belast op 1000 IE/kg en vervolgens
geanalyseerd. De signaal/ruis-verhouding (S/N) bedroeg gemiddeld meer dan 30 en de concentratie
bedroeg gemiddeld 1040 IE/kg.
Aangezien S/N groter is dan 30, dienen de aantoonbaarheidsgrens en bepaalbaarheidsgrens niet bepaald te
worden. Gezien de hoge concentraties aan vitamine A in voedingssupplementen, wordt 1000 IE/kg
aangenomen als rapporteringsgrens.
3.4.2
Vitamine D
Voor de bepaling van de LOD en LOQ werden 6 deelmonsters belast op 5000 IE/kg en vervolgens
geanalyseerd. De signaal/ruis-verhouding (S/N) bedroeg gemiddeld 28,3 en de concentratie bedroeg
gemiddeld 5210 IE/kg.
Gezien de hoge concentraties aan vitamine D in voedingssupplementen, wordt 5000 IE/kg aangenomen als
rapporteringsgrens.
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 10/12
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVT
3.4.3
SECTIE - SECTION: Toevoegingsmiddelen
Vitamine E
Voor de bepaling van de LOD en LOQ werden 6 deelmonsters belast op 1 mg/kg en vervolgens
geanalyseerd. De signaal/ruis-verhouding (S/N) bedroeg gemiddeld meer dan 30 en de concentratie
bedroeg gemiddeld 1,07 mg/kg.
Aangezien S/N groter is dan 30, dienen de aantoonbaarheidsgrens en bepaalbaarheidsgrens niet bepaald te
worden. Gezien de hoge concentraties aan vitamine E in voedingssupplementen, wordt 1 mg/kg
aangenomen als rapporteringsgrens.
3.5
Specificiteit en selectiviteit
De piekidentificatie gebeurt aan de hand van de retentietijd.
De piekkwantificatie gebeurt aan de hand van de piekoppervlakte.
3.6
Reproduceerbaarheid (Inter)
Deelname aan ringtesten indien mogelijk.
3.7
Robuustheid
Langetermijnsvalidatie zal uitgevoerd worden op basis van Shewart-controlekaarten (trendanalyse).
4
Meetonzekerheid
De meetonzekerheid van de methode wordt berekend, rekening houdend met de juistheid en precisie.
Vitamine
A
D
Uitgebreide
Niveau
Uitgebreide
Uitgebreide
Concentratie
relatieve
Concentratie
relatieve
Concentratie
relatieve
(IE/kg)
meetonzekerheid U
(IE/kg)
meetonzekerheid
(mg/kg)
meetonzekerheid
(%)
Midden
E
1500000
22,0
U (%)
200000
23,7
U (%)
21000
15,2
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 11/12
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVT
SECTIE - SECTION: Toevoegingsmiddelen
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 12/12