Evaluatie van cytologisch onderzoek bij de bronchoalveolaire lavage

Originele artikelen
Evaluatie van cytologisch onderzoek bij de
bronchoalveolaire lavage
dr. P.H.M. Kuijper, klinisch chemicus, L.H.M. Verhoef, arts-microbioloog,
D.R.A.J. De Munck en J.D.J. Janssen, longartsen
Samenvatting
De diagnostische waarde van cytologie in bronchoalveolaire lavage (BAL)-vloeistof bij interstitiële
longziekten zoals sarcoïdose, is geëvalueerd. Hierbij
is ook de samenhang met ander diagnostisch onderzoek (radiologisch, microbiologisch en histologisch
onderzoek) onderzocht. Alle patiënten (n=55) die in
2002 en 2003 BAL-onderzoek ondergingen werden
retrospectief geanalyseerd. Bij 35% van deze patiënten kwam de conclusie van de BAL overeen met de
uiteindelijke diagnose. Bij 50% leverde het resultaat
slechts een zeer geringe bijdrage in de diagnostiek en
in 8 van de 55 patiënten was er een discrepantie tussen de conclusie van de lavage en de einddiagnose.
Verder werden o.a. rookgedrag, de detectie van microorganismen en de lymfocyten subtypering geëvalueerd.
Met betrekking tot sarcoïdose was de opbrengst van
de cytologie van de BAL iets lager dan de literatuur
aangeeft. Met behulp van nieuwe richtlijnen van de
landelijke BAL-werkgroep zal worden gekeken of
de resultaten kunnen verbeteren. Overige resultaten
kwamen over het algemeen overeen met de literatuur.
Zo wordt bevestigd dat het BAL-onderzoek vooral
richtinggevend kan werken in de keuze voor verder
diagnostisch onderzoek, waarbij mogelijk invasief
onderzoek kan worden voorkomen.
Inleiding
Diverse interstitiële longaandoeningen gaan gepaard
met een inadequaat gereguleerde immuunrespons.
Hierdoor verandert de samenstelling van de leukocytenpopulatie in het longparenchym en de alveoli1.
Cytologisch onderzoek van de bronchoalveolaire lavage (BAL) vloeistof kan inzicht geven in deze veranderingen en is daarom geïndiceerd bij o.a. diffuus
interstitiële longziekten. Gedacht moet worden aan
sarcoïdose, extrinsieke allergische alveolitis (E.A.A.,
bijvoorbeeld de duivenmelkerslong), drug-induced
pneumonitis (DP, bijvoorbeeld methotrexaatlong) en
idiopathische pulmonale fibrose (IPF). Andere aandoeningen waarbij een BAL-vloeistof afwijkingen
vertoont, zijn maligniteit en infectie (bijvoorbeeld
community acquired pneumonia). De toegevoegde
waarde van cytologisch onderzoek in vergelijking tot
bijvoorbeeld longfunctieonderzoek, radiologisch, microbiologisch en histologisch onderzoek is al jaren
een punt van discussie2. Sarcoïdose vervult bij deze
discussie een prominente rol.
64
Sarcoïdose is een multisystemische aandoening die
zich manifesteert met een scala van symptomen; 50%
van de patiënten presenteert zich met onder andere
respiratoire klachten, terwijl 20% een subklinische
beloopt kent. De oorzaak van sarcoïdose is onbekend,
over de immunopathogenese wordt langzaam meer
duidelijk3. Röntgenologische (bijv. intrathoracale lymfeklier vergroting) en histopathologische afwijkingen
(bijv. niet-verkazende granulomateuze ontstekingshaarden) vervullen bij de diagnostiek en stadiering
een belangrijke rol. BAL-lymfocytose treedt vaak op
bij sarcoïdose maar komt ook voor bij virale infectie,
alveolitis en interstitiële syndromen. Door subtypering van de lymfocyten neemt de specificiteit van een
dergelijke bevinding toe; een toegenomen ratio van
de T-helper cel (CD4+): T-suppressor cel (CD8+)
wordt gebruikt als een diagnostische test voor pulmonaire sarcoïdose met een sensitiviteit van 40 - 55% en
een specificiteit van ongeveer 90% 4.
In deze studie worden de resultaten van ongeveer 55
patiënten retrospectief geanalyseerd. Dit zijn alle patiënten die een bronchoalveolaire lavage ondergingen
in de periode 2002-2003. Met behulp van deze evaluatie kan een beeld worden gevormd van de bijdrage
van de BAL-cytologie uitgevoerd in het Klinisch
Laboratorium van Maxima Medisch Centrum bij de
vaak complexe diagnostiek van verschillende longaandoeningen. Een extra accent wordt hierbij gelegd
op sarcoïdose. Doel van de deze evaluatie is vooral
om te onderzoeken in hoeverre de praktijksituatie van
alledag overeenkomt met de studies in de wetenschappelijke literatuur. Mogelijk komen hieruit suggesties
voor verbeteringen voort en zal de verzamelde kennis
kunnen bijdragen aan een verbeterde interpretatie van
de onderzoeksresultaten.
Werkwijze
Lavage
Via bronchoscopie en spoeling met 4 x 50 ml verwarmde isotone zoutoplossing worden cellen en micro-organismen uit de diepere luchtwegen, vooral de
bronchus en alveoli verzameld5. De eerste fractie bevat (cel)materiaal uit de bronchus en wordt gekweekt
ten behoeve van microbiologisch onderzoek. De overige fracties zijn de alveolaire spoelingen voor cytologisch onderzoek. Tevens werd een centraal longbiopt genomen ten behoeve histologisch onderzoek
door het pathologisch laboratorium.
Medisch Journaal, jaargang 34, no. 2
Laboratoriumprocedure
Bij ontvangst van de BAL-vloeistof wordt het aspect
en het totaal volume van de vloeistof beoordeeld. De
concentratie cellen wordt gemeten en na een korte
voorbewerking wordt een cytospinpreparaat gemaakt.
Dit wordt vervolgens gekleurd met een May Grünwald Giemsa (MGG) kleurstof. Behalve de differentiatie van de kernhoudende cellen, gerapporteerd in
percentages, worden ook de morfologie en de leefbaarheid bepaald. Met de cytospin kan een groot aantal cellen en afwijkingen worden waargenomen. Deze
worden genoemd in tabel 1. Bij een toegenomen aantal lymfocyten (>15%) zal ook een immuuncytologische bepaling van de lymfocytensubsets worden uitgevoerd. Hierbij worden onder andere de CD4 en CD8
positieve T-lymfocyten gemeten.
Alle bevindingen worden ter interpretatie voorgelegd
aan de klinisch chemicus met aandachtsgebied hematologie/cytologie. Deze formuleert, eventueel na overleg met de aanvrager, zijn conclusie. De klinische gegevens die zijn ingevuld op het aanvraagformulier
spelen daarbij een belangrijke rol. Overige factoren
die bij de interpretatie een rol spelen worden samengevat in tabel 2.
Interpretatie-ondersteunend computerprogramma
Eind 2003 deed een elektronisch interpretatieprogramma (Interpretation of bronchoalveolar lavage
fluid cytology)6 haar intrede in het klinisch laboratorium. Hierbij wordt op basis van enkele patiëntenge-
gevens en laboratoriumuitslagen een kansberekening
gedaan. Door het algoritme worden vier verschillende kansberekeningen gedaan: de kans dat de resultaten veroorzaakt worden door 1) een infectie, 2) sarcoïdose, 3) EAA en/of DP en 4) IPF. De resultaten
van deze software waren in de evaluatieperiode niet
bekend bij de klinisch chemicus op het moment van
het formuleren van zijn / haar conclusie; de twee conclusies zijn dus onafhankelijk van elkaar.
Voor deze evaluatie is door middel van retrospectief
statusonderzoek een database gevuld met patiëntengegevens. Diverse gegevens, zoals klinische vraagstelling, resultaten van diagnostisch onderzoek en de
klinische diagnose, zijn in overleg met de behandelaar
en/of op basis van patiëntenbrieven gecategoriseerd.
Vervolgens zijn de resultaten aan elkaar gecorreleerd
m.b.v. het programma Excel.
Resultaten en discussie
Patiëntenpopulatie
Alle patiënten die in de periode 2002-2003 zijn ingezonden voor cytologisch onderzoek zijn opgenomen
in deze evaluatie. De 55 patiënten waren afkomstig
uit twee klinieken: Máxima Medisch Centrum locatie
Veldhoven (35) en het St. Annaziekenhuis, Geldrop
(20). De gemiddelde leeftijd was 56 jaar, met een
range van 26 en 87 jaar.
De meeste aanvragen werden gedaan in het kader van
onderzoek naar sarcoïdose (30%), EAA (20%), longfibrose (15%), diffuus longbeeld e.c.i. (10%) en DP
Tabel 1. Voorbeelden van cellen en vormafwijkingen die kunnen worden gezien in de cytospin met May Grünwald Giemsa kleuring. Bij de
afwijkingen worden voorbeelden genoemd van aandoeningen waarbij ze kunnen worden waargenomen.
Cel
Bjzondere eigenschap
Aandoening
Opmerking
Figuur
Alveolaire macrofagen
Intracellulaire partikels
Rokers, alveolaire bloeding,
ontsteking
Verhoogde turn-over
van cellen.
Specificiteit laag.
1a
Neutrofiele granulocyten
Eosinofiele granulocyten
Lymfocyten
Intracellulair hemosiderine
Alveolaire bloeding.
Door kristallijne
hemoglobinemetabolieten
Intracellulaire asbestvezels
Asbestose
Aspiratie van afbraak
resistente silicaten
Schuimmacrofagen
Aspiratie pneumonie, DP
en EAA
Toegenomen vacuolisatie
Specificiteit laag
Toegenomen aantal
Aspiratie pneumonie, IPF
Specificiteit laag
1b
Pycnotische kern
Gevorderde infectie
Uiting van degeneratie
en apoptose
1b
Toegenomen
Toegenomen
Plasmacellen
Bacteriën en Schimmels
Pneumocystis Carinii
DP, IPF en eosinofiele
pneumonie
Sarcoïdose, EAA en DP
1c
Specificiteit laag
1d
Diagnostiek door
microbiologisch
laboratorium
1e
EAA en DP
Intracellulair en extracellulair
Immuungecompromiteerde
patiënten, bijv. HIV
Diagnostiek door
microbiologisch
laboratorium
Bronchiaal trilhaarepitheel
bronchiale contaminatie
Vaak als artefact
Plaveiselcel epitheel.
bronchiale contaminatie
Vaak als artefact
ARDS en Pneumonie
Ernstige longschade
Pneumocyten
Omgeven door 'foamy casts'
Infectie, contaminatie,
fysiologisch
Vaak in groepjes
Medisch Journaal, jaargang 34, no. 2
1f
65
(10%). Sporadische was er sprake van een verdenking
op infectie, Histiocytose X en tumormetastasering.
Om een indruk te krijgen van de toegevoegde waarde
van het cytologisch onderzoek werden de resultaten
(samengevat in de conclusie van de klinisch chemicus) vergeleken met de klinische diagnose (tabel 3).
Een positieve bijdrage wordt gescoord wanneer de
conclusie overeenkomt met de diagnose of in ruime
mate past bij de diagnose. In ongeveer 35% van de
patiënten was dit het geval (19/55). Een negatieve
bijdrage (8/55, 15%) betekent dat de conclusie in tegenspraak was met de uiteindelijke diagnose. Een geringe bijdrage wordt gescoord wanneer de conclusie
niet direct kon bijdragen aan de diagnose. Een laboratoriumresultaat samengevat als ’geen afwijkingen’
(18/55, 35%) of ‘niet conclusief’ (9/55, 15%) behoort
tot deze categorie. Ook patiënten waarbij geen definitieve klinische diagnose kon worden vastgesteld
(9/55, 15%) vallen in de categorie ‘geringe bijdrage’.
Bij 3 van deze 9 patiënten luidde de laboratoriumconclusie ‘geen afwijkingen’. Het moge duidelijk zijn
dat de criteria voor de 3 categorieën (tabel 3) en voor
de klinische diagnose in deze vergelijking niet nauwkeurig zijn gedefinieerd. Toch maakt de indeling het
mogelijk om een grove indruk te krijgen van de invloed van diverse factoren op de onderzoeksresultaten.
Differentiatie en storende factoren
Bij de interpretatie van de resultaten dient men er rekening mee te houden dat deze worden beïnvloed
D
E
F
Figuur 1. Cellen in BAL-vloeistof. Cytospinpreparaten zijn gekleurd met May Grünwald Giemsa. De cellen zijn gefotografeerd met een 500
→) bij een roker (b) Neutrofiele granulocyten (→
→) bij aspiratie pneumonie. De
tot 1000 x vergroting. (a) Puinbeladen alveolaire macrofagen (→
vacuolen en picnotische kern (groene pijl) zijn een uiting van degeneratie en apoptose (c) Eosinofiele granulocyten bij een eosinofiele pneumonie. Opvallend zijn de vacuolen, bilobulaire kern en prominente granulatie (d) Lymfocytose bij actieve sarcoïdose (e) Extracellulaire bac→), een monocyt/macrofaag (groene pijl) en een lymfocyt (rode pijl) bij bronchiale contaminatie.
teriën bij een infectie (f) Trilhaarepitheel (→
66
Medisch Journaal, jaargang 34, no. 2
door een aantal (pre-)analytische factoren.
Roken: (Ex-)rokers zonder longaandoening hebben
een toename in het absolute aantal cellen en het percentage neutrofiele granulocyten in de BAL (tabel 2).
Het onderscheid tussen een gezonde roker en een
(IPF-)patiënt is daarom moeilijk te maken. In deze
studie is een dergelijk verschil tussen rokers (totaal
aantal cellen; 30 +/- 21 *106 percentage neutro’s 8%;
n=10) en niet-rokers (totaal aantal cellen; 12 +/- 15
*106 percentage neutro’s 15%; n=37) niet waarneembaar. Het gaat hier dan ook niet om gezonde vrijwilligers, maar om een heterogene populatie patiënten.
Toch lijkt het wel belangrijk om het rookgedrag van
de patiënt mee te nemen bij de interpretatie van de resultaten.
Opbrengst lavage: Wanneer weinig spoelvloeistof kan
worden teruggezogen, kan dit wijzen op een meer
bronchiale spoeling in plaats van een alveolaire spoeling. Bij een lage opbrengst (<20% van het ingebrachte volume of <0,06 * 106 cellen/ml) is volgens
de literatuur een betrouwbare interpretatie van de
resultaten niet mogelijk5. Dit blijkt niet uit onze
resultaten. Het materiaal in de onderzochte periode
bevatte 13 keer (= ongeveer 20%) een slechte opbrengst (tabel 3). In deze subpopulatie was de correlatie met de definitieve diagnose niet opvallend slechter (40% positieve bijdrage geleverd aan de diagnose)
dan bij lavages met een goede opbrengst. Toch is naar
aanleiding van de resultaten een uniform protocol
geïntroduceerd waardoor de recovery is verbeterd.
Genoemde factoren kunnen een verklaring vormen
voor het ontbreken van strikte referentiewaarden die
geschikt zijn voor iedere analyse. Ook in de literatuur
is een grote diversiteit aan referentiewaarden te vinden, die vaak zijn gebaseerd op kleine aantallen
(max. 50) vrijwilligers. Conclusie moet dan ook zijn
dat de interpretatie van de resultaten steeds met de
nodige voorzichtigheid moet worden gedaan.
Micro-organismen
De kleuring volgens MGG van het cytospinpreparaat
wordt primair gebruikt voor de beoordeling van
leukocyten. Net als met een Grampreparaat, is het
met MGG ook mogelijk om micro-organismen zoals
bacteriën te detecteren7. In deze evaluatie is gekeken
naar de waarde van de detectie van bacteriën met
cytologisch onderzoek.
Bij 20% procent van de patiënten werden bacteriën
gezien, hierbij ging het vaak om fysiologische mondflora. De specificiteit van het cytospinpreparaatonderzoek voor de klinische diagnose ‘infectie’ is daarmee
zeer laag. De sensitiviteit voor bacteriën in het algemeen was slechts 50%, waarbij het microbiologische
kweekresultaat als gouden standaard wordt gezien.
De verschillen in voorbewerking en detectietechniek
zijn hier debet aan.
Sarcoïdose en CD4/CD8 ratio
Bij een actieve sarcoïdose wordt vaak een lymfocytose en een verhoogde CD4/CD8 ratio waargenomen.
Tabel 2. Referentiewaarden en samenstelling van bronchoalveolaire vloeistof bij verschillende longaandoeningen.
Aandoening
Alveolaire
macrofagen
%
Referentiewaarden
niet rokers
Rokers
Niet-infectieuze aandoening
Sarcoïdose
EAA
IPF
DP
BOOP
Chronische eosinofiele
pneumonie
Asbestose
80 - 90
80 - 90
Lymfocyten
%
%
%
Plasma
cellen
%
<15
<7
<2
2-6
<1
<1
0
0
1,0 - 2,0
1,0 - 2,0
+
=
=/+
–
+ (= / –)
++
+
++
+
=+
+++
=/+
+
=+
=
=/+
++
+/–
–
+/–
– (= / +)
=
– (= / +)
–
+
=
+++
+/–
–
=
++
(>40%)
+
–
+
=
+
+
+
++
+
=
+
++
+
=/+
+/=
–
–
–
–
=
–/=
=
–
Monomorph
Polymorph
schuimig aspect
Schuimig aspect
Schuimig aspect
Asbestdeeltjes
Infectieuze aandoening
Bacteriële infectie
Virale infectie
Tuberculose
HIV-infectie
Intracellulaire
bacteriën
Insluitlichaampjes
Neutrofielen
Eosinofielen
CD4/CD8
ratio
++: sterk verhoogd; +: verhoogd; =: normaal; –: verlaagd of afwezig. Voor verdere toelichting zie tekst.
Tabel 3. Toegevoegde waarde van diagnostisch onderzoek bij de klinische diagnose.
Resultaat
Populatie
n
Positief
Bijdrage %
Gering
Negatief
Cytologie Klinisch lab.
Algorithme Drent
alle
Alle
55
55
30
40
60
30
10
30
Cytologie
Cytologie
slechte opbrengst
goede opbrengst
13
42
40
20
50
70
10
10
Cytologie
Cytologie
vraagstelling sarcoïdose
diagnose sarcoïdose
17
12
40
60
45
25
15
15
67
Medisch Journaal, jaargang 34, no. 2
67
Figuur 2. CD4/CD8 ratio in relatie tot de diagnose. De patiënten
werden gecategoriseerd op basis van de klinische diagnose in 3
groepen; Sarcoidose, E.A.A en overige. Binnen deze groepen is
weergegeven welk deel van de patiënten een CD4/CD8 ratio >2,5
쐽) heeft en welk deel een ratio <2,5 (쐽
쐽).
(쐽
Bij een behandelde sarcoïdose wordt vaak een verlaagde CD4/CD8 ratio waargenomen1. Bij een extrinsieke allergische alveolitis wordt vaak een verlaagde
CD4/CD8 ratio waargenomen. Als beslisgrens wordt
in de literatuur meestal een ratio van 2,5 genomen.
Ook de landelijke BAL-werkgroep propageert deze
waarde. Van de 55 monsters werd er 22 keer een
lymfocytose van >15% gevonden, met als vervolgonderzoek een lymfocyten subtypering. In figuur 2
staan drie diagnostische categorieën uitgezet tegen
het aantal keren dat een verhoogde of verlaagde
CD4/CD8 ratio werd gevonden. Er lijkt een verschil
te bestaan tussen de sarcoïdosegroep (60% verhoogde ratio) en de EAA-groep (25% verhoogde ratio).
Echter de besliskundige waarde van de ratio, onafhankelijk van andere gegevens, lijkt gering. De sensitiviteit in deze setting voor sarcoïdose is ongeveer
70 - 80%, dit is iets lager dan de 90% die wordt beschreven in de literatuur1. Dit is mogelijk deels te
verklaren door het verschil in studie-opzet. Deze bevinding is aanleiding om hier in de toekomst nader
onderzoek naar te verrichten.
Inspanning en risico
In de discussie over het nut van BAL-onderzoek
moet ook de extra inspanning en het risico worden
betrokken. Het afnemen van een BAL tijdens een
bronchoscopie levert weinig extra werk op voor de
scopist. Het meeste werk wordt verricht op het laboratorium: gemiddeld 2 uur werk voor een gespecialiseerde analist.
Voor de diagnose van diverse institiële longaandoeningen (waaronder sarcoïdose) is de aanwezigheid
van specifieke afwijkingen in een groot perifeer biopt
68
de gouden standaard (bijvoorbeeld niet verkazende
granulomateuze ontstekingshaarden). Het nemen van
perifere longbiopten kent een aanzienlijk risico op
complicaties, zoals bloedingen of een pneumothorax.
De BAL-procedure is een minimaal invasieve ingreep met een geringe morbiditeit (<3%) en mortaliteit (0%); nauwelijks hoger dan de bronchoscopie
zelf4. Complicaties die kunnen optreden is het beschadigen van het slijmvlies waardoor een kleine
bloeding en dus bloedbijmenging plaatsvindt. Tevens
worden als complicaties genoemd: Hoesten, tijdelijke
hypoxie en kortdurende koorts. Samenvattend zijn de
kosten en risico’s relatief gering.
Bij pathologisch en microbiologisch BAL-onderzoek
kunnen de bevindingen pathognomisch zijn door de
detectie van tumorcellen en pathogene micro-organismen, met een sensitiviteit van 60 - 95%4. Bij het cytologisch onderzoek ligt dat anders. Onze resultaten
laten zien dat de interpretatie van de BAL-resultaten
altijd in context van radiologische bevindingen, longfunctie, overig laboratorium- en P.A.-onderzoek moet
worden gedaan. Het stellen van een specifieke diagnose op basis van alleen cytologisch onderzoek is
vrijwel onmogelijk. De BAL-analyse wordt gewaardeerd door longartsen in de diagnostiek van longziekten omdat het snel resultaten oplevert die vooral
richtinggevend zijn. Een groot voordeel is verder dat
het invasief en potentieel risicovol onderzoek als een
mediastinoscopie of open longbiopt overbodig kan
maken.
Literatuur
1. Agostini C, Chilosi M, Zambello R, Trentin L, Semenzato G.
Pulmonary immune cells in health and disease: lymphocytes. Eur
Respir J 1993; 6: 1378-1401.
2. Rottoli P, Bargagli E. Is bronchoalveolar lavage obsolete in the
diagnosis of interstitial lung disease? Curr Opin Pulm Med 2003; 9:
418-425.
3. Gras M, van Kemenade FJ, van Maarsseveen AC, Alberts C. [Sarcoidosis: immunopathogenesis and the potential of immunotherapy]. Ned Tijdschr Geneeskd 2003; 147: 150-155.
4. Costabel U. CD4/CD8 ratios in bronchoalveolar lavage fluid: of
value for diagnosing sarcoidosis? Eur Respir J 1997; 10: 26992700.
5. Haslam PL, Baughman RP. Report of ERS Task Force: guidelines
for measurement of acellular components and standardization of
BAL. Eur Respir J 1999; 14: 245-248.
6. Drent M, Jacobs JA, Cobben NA et al. Computer program supporting the diagnostic accuracy of cellular BALF analysis: a new release. Respir Med 2001; 95: 781-786.
7. De Brauwer E, Jacobs J, Nieman F, Bruggeman C, Drent M. Test
characteristics of acridine orange, Gram, and May-GrunwaldGiemsa stains for enumeration of intracellular organisms in bronchoalveolar lavage fluid. J Clin Microbiol 1999; 37: 427-429.
Medisch Journaal, jaargang 34, no. 2