Dried matrix spot in TDM en Toxicologie : nieuwe

Dried matrix spot in TDM en
Toxicologie : nieuwe
ontwikkelingen
Dr L Stolk, ziekenhuisapotheker/klinisch
farmacoloog/toxicoloog
Klinische Farmacie en Toxicologie, Maastricht
Universitair Medisch Centrum.
[email protected]
KKGTDAG2013
1
Academisch Ziekenhuis
Maastricht
aZ M
NVZA24-11KKGTDAG2013
2008
2
Inhoud
•
•
•
•
•
•
Korte inleiding bloed spot methode in TDM
Nieuwe ontwikkelingen:
Nieuwe bepalingen TDM en Toxicologie
Stabiliteit en Flash Heating
DBS en de farmaceutische industrie
Bloedmonsters ipv plasmamonsters
Het hematocriet probleem
Alternatieven voor hematocriet gevoelige
methoden
KKGTDAG2013
3
Historie Dried Blood spot
• 1961: Dr Robert Guthrie ontwikkelde
een screening test voor
phenylketonuria (PKU) bij neonaten:
een bepaling voor fenylalanine in
bloed gedroogd op filtreer papier.
• Vanaf dat moment is bloed spot
methode gebruikelijk geworden voor
screening van metabole ziekten bij
neonaten. Vooral kwalitatieve analyse
09/06/2015
researchtoxicologyUM
4
Bloed spot methode in TDM
• Het gebruik van de bloed spot
methode in TDM is later
ontwikkeld na de neonatale
methode.
• Sinds de tachtiger jaren, maar
vooral de laatste 10 jaar zijn veel
TDM bepalingen gebaseerd op de
bloed spot gepubliceerd.
09/06/2015
researchtoxicologyUM
5
Andere toepassingen van de
bloed spot methode in de
literatuur:
• Genotyperen
Wijnen P, Op den Buijsch R, Cheung S, van der Heijden J, Hoogtanders K, Stolk L, van
Dieijen-Visser M, Neef C, Drent M, Bekers O. Genotyping with a dried blood spot
method: A useful technique for application in pharmacogenetics. Epub 10 oct 2007. Clin
Chim Acta 2008;388:189-191
• Identificatie of virussen: eg HIV
• Klinisch chemische bepalingen
• Toxicologie: drugs of abuse
09/06/2015
researchtoxicologyUM
6
09/06/2015
researchtoxicologyUM
7
Techniek
• Hoe werkt de dried
blood spot methode?
KKGTDAG2013
8
Bloed spot methode (A)
• Patient prikt zijn vinger met een
automatisch lancet.
• De patient vult een voorgedrukte cirkel
(8 mm ø) op monster papier volledig
met één bloeddruppel.
• De bloed spot moet tenminste 3 uur
drogen aan de lucht.
• Het monster wordt per post verzonden
naar het laboratorium
KKGTDAG2013
9
Bloed spot methode (A)
In het laboratorium:
-Controle van het monster.
- Een ponsje (7.5 mm ø) wordt
uitgeponst.
-Extractie van het ponsje vindt
plaats.
-Het extract wordt geanalyseerd
KKGTDAG2013
10
Bloed spot alternatieve methode (B)
• Een vinger prik vindt plaats
• Patient of trained technician brengt
nauwkeurig een bepaald volume
bloed op het monster papier met
een pipet.
• In het laboratorium wordt de totale
spot in zijn geheel geextraheerd
KKGTDAG2013
11
Bloed spot methoden
• De eerste methode is eenvoudiger,
omdat er niet wordt gepipetteerd.
• Echter op correcte manier bloed
bemonsteren en uitponsen van de
spot zijn van kritisch belang om
het juiste monstervolume te
verkrijgen. Met de tweede methode
is dit minder kritisch.
KKGTDAG2013
12
Bloed spot in beeld
KKGTDAG2013
13
Voordelen bloed spot methode
-De patient is kan thuis bemonsteren (na
geschikte training)
-(Verkorte ) AUC gemakkelijker:
meerdere monsters gedurende de tijd.
-Verzenden per post is mogelijk
(biohazard risk verwaarloosbaar)
-In droge vorm zijn de meeste
geneesmiddelen zeer stabiel.
-Klein monster volume: + 30 μl per spot.
09/06/2015
researchtoxicologyUM
14
Nadelen bloed spot methode
• Bemonsteren is niet onder controle (A)
• Ondanks training blijkt de kwaliteit van de
monsters soms toch onvoldoende te zijn.
• Patienten zijn soms bang voor vingerprik
• Klein monstervolume betekent dat
gevoelige en dus dure analytische
technieken nodig zijn.
• Meestal zijn de methoden beperkt tot één
geneesmiddel.
• Na analyse is er meestal geen monster over.
09/06/2015
researchtoxicologyUM
15
Dried blood spot
Wat is er nieuw ?
KKGTDAG2013
16
Alle TDM bepalingen
Bijna alle bepalingen die routinematig
in TDM worden gedaan met veneus
bloed, zijn nu ook beschikbaar als
dried blood spot methode.
KKGTDAG2013
17
Bloed spot TDM bepalingen
Antipsychotics
Antiepileptics
Antimalarials
Antibiotics
Antifungals
Tuberculostatics
Antiretrovirals
Immunosuppressives
Tyrosinekinase-inhibitors
09/06/2015
researchtoxicologyUM
18
Review artikelen
- Li W, Tse FL. Dried blood spot sampling in combination
with LC-MS/MS for quantitative analysis of small
molecules. Biomed Chromatogr. 2010;24(1):49-65
- Peter M. Edelbroek, Jacques van der Heijden, and Leo M.
L. Stolk. Dried Blood Spot Methods in Therapeutic Drug
Monitoring: Methods, Assays, and Pitfalls. Ther Drug
Monit Volume 2009;31(3):327-36
review of 30 papers about TDM based on
DBS
09/06/2015
researchtoxicologyUM
19
Updates
• In 2010 and 2012 zijn updates van
ons review article:
40 nieuwe artikelen
• gepubliceerd op de IATDMCT
website: www.iatdmct.org
scientific committees: new
sampling strategies committee
09/06/2015
researchtoxicologyUM
20
Toxicologie
Also on IATDMCT website
Review of assays of toxicological
assays based on DBS.
30 references
Dried blood spots in toxicology: from the cradle to the grave?
Critical Reviews in Toxicology, 2012; 42(3): 230–243
Christophe P. Stove, Ann-Sofie M.E. Ingels, Pieter M.M. De Kesel, and Willy
E. Lambert
KKGTDAG2013
21
Toxicologische bepalingen
• Drugs of abuse
(XTC, cocaine, opiates, cotinine, fentanyl, tramadol,
zolpidem, ethylgucuronide etc)
• Environmental contaminants
(pesticides, polychlorinated biphenyls, cholinesterase
inhibitors etc)
• Biotoxins
( Brevetoxins = giftige algen, ciguatoxin etc)
• Trace elements
(As, Hg, Pb, Tl etc)
KKGTDAG2013
22
Pharmaceutische industrie en DBS
Voor registratie nieuwe geneesmiddelen is
onderzoek met dieren verplicht
DBS kan veel geld besparen :
-Kleine hoeveelheid monster (bijv voor
maken conc tijd curve is maar één dier
nodig.)
-DBS monsters zijn stabiel (geen dure
koeling tijdens transport nodig).
KKGTDAG2013
23
Daarom had de farmaceutische
behoefte aan ontwikkeling van
nieuwe technieken om veel
monsters te kunnen afhandelen in
korte tijd: Dus automatisering
KKGTDAG2013
24
KKGTDAG2013
25
a system for the automated extraction of DBS cards that can be
coupled directly to LC-MS systems: Fully automated handling of up to 500 DBS
cards.Optical DBS card positioning and identification including barcode reading module (OCR)
Wash station eliminates carryover.Internal standard (IS) application module.Easy Integration LCMS systems
KKGTDAG2013
26
Technieken voor directe analyse
zijn ontwikkeld
Directe Elutie
Directe Desorptie
KKGTDAG2013
27
KKGTDAG2013
28
Desorption electrospray
ionisation
DESI is een combinatie van
Electrospray and Desorption
Ionisation. Ionisatie vindt plaats met
een electrisch geladen ‘’mist’’een paar
mm bij het monster oppervlakte te
brengen en daartussen een
spanningsverschil aan te brengen.
KKGTDAG2013
29
DESI
KKGTDAG2013
30
Stabiliteit en flash heating
monsters
Gewoonlijk zijn DBS monsters stabiel in
droge vorm. Echter vlak na bemonstering,
wanneer het monster nog nat is, kan
(enzymatische) afbraak plaatsvinden.
KKGTDAG2013
31
KKGTDAG2013
32
Hitte stabilisatie
Een nieuwe techniek : Kort verhiten op
hoge temperatuur: 30 sec 95 ºC.
Bij enkele model geneesmiddelen is
stabiliteit van deze methode onderzocht.
Oseltamivir, cefotaxime and ribavirin
konden met succes worden gestabiliseerd.
Arthemeter en Dihydroartemisin waren
instabiel zelfs bij kort verhitten bij 60 ºC.
Oseltamivir verhit bij 95°C gedurende 30 sec
Bloed of plasma?
KKGTDAG2013
35
Dried blood spot monsters zijn
in essentie volbloed monsters.
Klassieke TDM wordt over het
algemeen in plasma of serum
gedaan. Referentie waarden
worden altijd aangegeven als
concentraties in plasma of
serum
De niet eiwit gebonden fractie van
geneesmiddelen in plasma is de
werkzame fractie.
Deze is over het algemeen lastig te
bepalen. Daarom wordt meestal alleen
de totale concentratie in plasma
bepaald.
De fundamentele vraag is:
Is de totale
geneesmiddelconcentratie in
DBS ( = volbloed), een
geschikte vervanger voor de
totale concentratie en de vrije
ongebonden concentratie in
plasma? Rowland M et al .Use of dried blood spots in drug
development:pharmacokinetic considerations. Bioanalysis
2010;2:1791-6
Parameters
-Eiwitbinding
-Binding aan bloedcellen
-Hematocriet =
Verhouding volume rode
bloedcellen/totaal volume van het
bloed. (gemiddeld 0,45)
KKGTDAG2013
41
Conclusies Rowland et al
Voor geneesmiddelen die
weinig variabiliteit vertonen in
eiwitbinding en in affiniteit
voor de bloedcellen zijn er geen
problemen voor gebruik van
DBS (volboed) als alternatief
voor plasma.
Het probleem van
variatie van de
Hematocriet
KKGTDAG2013
43
Twee Hematocriet problemen
1) Analytisch probleem: De bias in
de nauwkeurigheid van de
bepaling die wordt veroorzaakt
door spreiding van het op papier
opgebrachte bloedmonster.
2) Fysiologisch probleem : Invloed
op de Bloed plasma ratio.
KKGTDAG2013
44
Volume wordt beinvloed door Ht
Het uitgangspunt in DBS is dat bij
gebruik van een standaard maat pons,
alle spots hetzelfde volume opleveren.
Echter wanneer het bloed zich
radiaal over het papier verspreid,
bepaalt de viscositeit van het bloed
hoe ver het bloed zich verspreid.
De viscositeit wordt bepaald door
de hematocriet van het bloedmonster.
KKGTDAG2013
45
Oplossingen voor het analytische
hematocriet probleem :
-In de validatiefase het effect over een
range van hematocriet waarden
onderzoeken.
-Niet uitponsen maar de gehele bloed
spot analyseren. Dit betekent wel dat
bij monstername nauwkeurig met een
pipet moet worden gepipetteerd.
-Gebruik van ‘’Dried plasma spots’’
KKGTDAG2013
46
2) Fysiologisch probleem
Indien Hematocriet bekend is, kan
er gecorrigeerd worden met een
formule:
Cb/Cp = (1-Ht) + Ht x ρ x fu
KKGTDAG2013
47
Hoe weten we wat de hematocrit
is met alleen een bloed spot?
Antwoord:
Voorspelling van de hematocriet van
dried bloed spots door het meten van
kalium in de spot met een routine
clinical analyzer.
Capiau S , Stove W, Lambert W, Stove C. Analytical
Chemistry 2012; 85(1):404-10
KKGTDAG2013
48
Kalium wordt geanalyzeerd in kleine 3 mm
ponsjes.
Kalium concentraties zijn:
Zeer hoog intracellular in rode bloedcellen
140 mmol .
In plasma 3.5-5 mmol en deze staat onder
sterke fysiologische controle.
Dus bij kleine verandering hematocriet:
grote verandering kalium concentratie.
Alternatieven voor
hematocriet gevoelig
monster papier
KKGTDAG2013
51
Cellulose vrij monster papier
KKGTDAG2013
52
KKGTDAG2013
53
KKGTDAG2013
54
KKGTDAG2013
55
New Hematocrit Independent Dried
Blood Spot Card
John Mommers1, Ellen Gorissen1, Nik de Bont2, Jun Qui2,3, and Ynze
Mengerink1*
1DSM Resolve, 2DSM Biomedical, 3DSM Ahead,
*corr adres: PO Box 18, 6160 MD Geleen, The Netherlands
([email protected])
KKGTDAG2013
56
Alternatieve matrices
KKGTDAG2013
58
In dit artikel wordt ipv bloed spot een plasma
spot onderzocht. De plasma spot wordt
verkregen na centrifugeren en opbrengen
plasma. De resultaten in vergelijking met
klassiek plasma zijn goed.
KKGTDAG2013
59
Praktischer oplossing….
KKGTDAG2013
60
Yorktest membrane filtration device
• Het device (ontwikkled voor bepaling
homocysteine ) bestaat uit twee
membranen.
• Het bovenste membraan is in staat om
bloedcellen af te filtreren, maar het
plasma door te laten tot het onderste
membraan.
• Het bovenste membraan kan worden
verwijderd, zodat het membraan met
de plasma spot overblijft.
Dried Plasma Spot
KKGTDAG2013
62
KKGTDAG2013
63
Behalve bloed meer matrices
mogelijk….
•
•
•
•
Plasma
Urine
Saliva
etcetera
The Dried Blood Spot lijkt te
veranderen in The Dried Matrix Spot
KKGTDAG2013
64
vragen?
KKGTDAG2013
65
KKGTDAG2013
67
Dried plasma spots
KKGTDAG2013
68
09/06/2015
researchtoxicologyUM
69
DESI
The electrospray mist wordt naar het
oppervlakte getrokken door een
spanningsverschil aan te brengen met het
monster. Na ionisatie, verplaatsen de ionen
zich naar de atmospheric pressure interface
die verbonden is aan de massa spectrometer.
KKGTDAG2013
70
Pharmacokinetic considerations
about use of dried blood spot
sampling
Rowland M et al
Use of dried blood spots in drug
development: pharmacokinetic
considerations
Bioanalysis 2010;2:1791-6.
Ratio concentratie Bloed/Plasma
Ratio van de concentratie
bloed/plasma van een
geneesmiddel is een middel om af
te leiden of plasma eiwit binding
of bloed cel affiniteit een
belangrijke rol speelt bij DBS.
Wateroplosbare geneesmiddelen
Bij wateroplosbare geneesmiddelen,
die zich niet verdelen in bloedcellen
ligt de Ratio in de buurt van 0.55.
Bloed cellen gedragen zich louter als
verdunningsmiddel en alleen de
Hematocrit en de eiwitbinding zijn van
belang.
Voorbeeld: tobramycine
Geneesmiddelen met hoge affiniteit
voor bloed cellen: R > 2
Sterke binding aan bloedcellen
De Hematocriet en binding aan
bloedcellen zijn dan van belang
Voorbeeld tacrolimus R =10-20