2015 FREQUENTIEBEPALING VIA DNA-TESTEN VAN
advertisement
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar 2014 – 2015 FREQUENTIEBEPALING VIA DNA-TESTEN VAN ERFELIJKE AANDOENINGEN BIJ DE VLAAMSE KOEHOND, DE SINT-HUBERTUSHOND, HET VLINDERHONDJE EN HET KRULHARIG LEEUWTJE door Evy BECKERS Promotoren: Prof. Dr. Luc Peelman Onderzoek uitgevoerd in het kader Dr. Mario Van Poucke van de Masterproef © 2015 Evy Beckers Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef . UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar 2014 – 2015 FREQUENTIEBEPALING VIA DNA-TESTEN VAN ERFELIJKE AANDOENINGEN BIJ DE VLAAMSE KOEHOND, DE SINT-HUBERTUSHOND, HET VLINDERHONDJE EN HET KRULHARIG LEEUWTJE door Evy BECKERS Promotoren: Prof. Dr. Luc Peelman Onderzoek uitgevoerd in het kader Dr. Mario Van Poucke van de Masterproef © 2015 Evy Beckers VOORWOORD Ik wil graag iedereen bedanken die het mogelijk heeft gemaakt om dit onderzoek te realiseren. In het bijzonder wens ik mijn dank te betuigen aan mijn promotor Prof. Dr. Luc Peelman voor de begeleiding van het schrijven van deze masterproef en mijn copromotor Dr. Mario Van Poucke voor de begeleiding in het labo. Ook bedankt aan alle anderen die mij hebben geholpen met het praktische werk in het laboratorium en aan Lucy Vandeputte voor de vele uren die ze heeft gespendeerd om mij een handje te helpen. Tot slot wil ik mijn familie bedanken voor de morele steun. INHOUDSOPGAVE VOORWOORD INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING................................................................................................................................1 INLEIDING..........................................................................................................................................2 LITERATUURSTUDIE ........................................................................................................................3 1. X-LINKED HYPOHIDROTISCHE ECTODERMALE DYSPLASIE ................................................3 2. SHORT TAIL ...............................................................................................................................5 3. EXERCISE INDUCED COLLAPSE .............................................................................................7 4. PROGRESSIEVE RETINALE ATROFIE .....................................................................................7 5. DEGENERATIEVE MYELOPATHIE ............................................................................................8 6. VON WILLEBRAND ZIEKTE 1....................................................................................................9 ONDERZOEK ................................................................................................................................... 11 1. BLOEDSTALEN........................................................................................................................ 11 2. DNA-ISOLATIE UIT BLOED ..................................................................................................... 11 3. KWALITEIT EN CONCENTRATIE VAN HET DNA .................................................................... 12 4. MUTATIE DETECTIE ................................................................................................................ 13 4.1. BASISPRINCIPE VAN DE PCR .......................................................................................... 13 4.2. PCR-RFLP .......................................................................................................................... 14 4.3. REAL TIME PCR – TAQMAN ASSAY ................................................................................. 15 4.4. GEL-ELEKTROFORESE ..................................................................................................... 16 4.5. SEQUENTIE-ANALYSE ...................................................................................................... 17 4.6. TESTEN VOOR HET KRULHARIG LEEUWTJE .................................................................. 18 4.6.1. X-gebonden hypohidrotische ectodermale dysplasie ............................................... 18 4.6.2. Degeneratieve Myelopathie ........................................................................................ 22 4.7. TESTEN VOOR DE SINT-HUBERTUSHOND ..................................................................... 24 4.8. TESTEN VOOR DE VLAAMSE KOEHOND ......................................................................... 25 4.8.1. Short tail ...................................................................................................................... 25 4.8.2. Exercise induced collapse ......................................................................................... 26 4.9. TESTEN VOOR HET VLINDERHONDJE ............................................................................ 28 4.9.1. Progressieve retinale atrofie ...................................................................................... 28 4.8.2. von Willebrand ziekte 1............................................................................................... 30 5. RESULTATEN .......................................................................................................................... 33 5.1. KRULHARIG LEEUWTJE.................................................................................................... 34 5.2. SINT-HUBERTUSHOND ..................................................................................................... 35 5.3. VLAAMSE KOEHOND ........................................................................................................ 37 5.4. VLINDERHONDJE .............................................................................................................. 38 BESPREKING .................................................................................................................................. 39 REFERENTIELIJST .......................................................................................................................... 41 SAMENVATTING Genetische aandoeningen in hondenrassen krijgen steeds meer aandacht in de praktijk. Het is echter niet goed geweten op welke aandoeningen er best kan worden getest, door de weinige studies die hierover worden uitgevoerd. Om te weten te komen welke DNA-testen best kunnen worden uitgevoerd per ras, is een frequentiebepaling nodig. In deze studie werd een frequentiebepaling uitgevoerd van enkele genetische aandoeningen bij 4 Belgische hondenrassen, namelijk de Vlaamse koehond, de SintHubertushond, het krulharig leeuwtje en het vlinderhondje. Exercise induced collapse komt in een laag percentage voor bij de Vlaamse koehond (qmt = 3,5%). Het fenotype van een korte staart bij dit ras wordt veroorzaakt door een C189G mutatie in het T-gen, die eerder reeds werd aangetroffen in verschillende andere rassen. De mutatie is dominant en heterozygoten hebben een korte staart. Homozygoot mutanten zijn niet leefbaar. Het mutante allel dat degeneratieve myelopathie veroorzaakt komt aan een zeer hoge frequentie voor in de Sint-Hubertushond populatie in België (qmt = 24,1%). Dit ras kan best standaard worden getest voor deze aandoening. Dragers kunnen in de fok worden gehouden door ze enkel te kruisen met homozygoot normale individuen. X-gebonden hypohydrotische ectodermale dysplasie werd niet teruggevonden in het krulharig leeuwtje in deze steekproef. Wel werden er 2 dragers gevonden voor degeneratieve myelopathie tussen de 27 geteste honden. Bij het vlinderhondje komt zowel progressieve retinale atrofie als von Willebrandt ziekte type 1 voor aan een vrij lage frequentie (qmt = 3,8% en qmt = 2,6% resp.). Vanwege deze lage frequenties is een verplichte DNA-test niet nodig en wordt aangeraden om enkel te testen in lijnen met precedenten. INLEIDING Er is steeds meer bewustwording tot noodzaak en publieke druk om genetische aandoeningen in allerlei hondenrassen terug te dringen. Voor het terugdringen van genetische aandoeningen is een gericht fokadvies nodig. Tot op heden wordt het fokadvies grotendeels gebaseerd op buitenlandse en klinische studies omtrent frequenties van genetische aandoeningen. Deze gegevens worden dan naar de Belgische populatie geëxtrapoleerd. De situatie in België kan echter (sterk) verschillen van die in andere landen. Zo zullen de factoren tijd en geografische scheiding een invloed uitoefenen op allelenfrequenties. Een populair dier kan in een streek of foklijn veel worden ingezet, waardoor een eventueel in het fokdier aanwezig mutant allel zich sterk kan verspreiden in deze lokale populatie, terwijl het in andere lijnen en subpopulaties veel minder frequent aanwezig zal zijn. Om een goed idee te krijgen over de huidige situatie van genetische aandoeningen in verschillende hondenrassen in België, moet een frequentiestudie worden uitgevoerd. In deze studie werd een frequentiebepaling gedaan op basis van DNA-testen. Dit is een veel betrouwbaardere methode dan frequentieschatting via klinische parameters uit de dierenartsenpraktijken. In de praktijk worden vrijwel enkel klinisch aangetaste dieren gepresenteerd, waardoor de exacte frequentie moeilijk te achterhalen is. Lang niet alle gevallen worden geregistreerd, wat ook een bias geeft. In geval van recessieve aandoeningen, zullen dragers helemaal geen symptomen vertonen. Dit zorgt ervoor dat een percentage van de mutante allelen niet wordt opgespoord. Als laatste is er ook het probleem dat verschillende genetische aandoeningen klinisch sterk gelijkend zijn met andere aandoeningen of dat de klinische presentatie van een genetische aandoening zeer variërend kan zijn. Dit bemoeilijkt een juiste diagnosestelling en geeft aanleiding tot een foutieve frequentiebepaling. Anderzijds is het zo dat dezelfde aandoening kan worden veroorzaakt door verschillende mutaties (genetische heterogeniteit). Aangezien de meest gebruikte DNA-testen mutatie-specifiek zijn en de genetische heterogeniteit niet altijd onderkend is, kan een onderschatting van de frequentie gebeuren. Dit onderzoek maakt deel uit van een groter onderzoek naar erfelijke aandoeningen in de Belgische hondenpopulatie. Er werden voor dit onderzoek Belgische hondenrassen, namelijk de Vlaamse koehond, de Sint-Hubertushond, het vlinderhondje en het krulharig leeuwtje, onderzocht. Deze 4 rassen werden mede uitgekozen vanwege hun aangetoonde geringe genetische diversiteit, wat een gericht fokadvies des te relevanter maakt. Om zo representatief mogelijke resultaten te verkrijgen, werd ernaar gestreefd 50 honden per ras op te nemen in de studie. Dit is enkel gelukt voor de Vlaamse koehond, aangezien de 3 andere rassen veel minder populair zijn. Door gebruik te maken van verschillende bronnen (de dierenkliniek in Merelbeke, de bloedbank van het laboratorium, diagnostische staaltjes die binnenkwamen in het laboratorium), werd getracht zo weinig mogelijk verwante dieren op te nemen in de studie. Van sommige rassen zijn er echter weinig individuen, wat zorgt voor een lagere diversiteit in de Belgische populatie. Er kan niet met zekerheid worden bepaald wat de bias door verwantschap is. De gekozen aandoeningen per ras zijn aandoeningen waarvan de oorzakelijke mutatie reeds gekend is. Er werden enkel DNA-testen uitgevoerd die openbaar toegankelijk zijn en waarop geen patent rust. Verder werd er gekeken welke aandoeningen reeds in de literatuur werden beschreven per ras. De Vlaamse koehond werd getest op 2 genetische aandoeningen. De eerste betreft exercise induced 2 collapse (EIC). Deze aandoening werd beschreven bij de Vlaamse koehond en er bestaat een DNAtest voor (O.F.A., Currently available DNA tests). In het laboratorium van de vakgroep genetica, faculteit diergeneeskunde aan de UGent werd reeds een test ontwikkeld voor EIC. De tweede aandoening, short tail, werd gekozen omdat het fenotype van een korte staart voorkomt bij de Vlaamse koehond. De oorzakelijke mutatie voor een korte staart bij de Vlaamse koehond was eerder nog niet aangetoond. Wel was reeds een mutatie gekend voor hetzelfde fenotype bij enkele andere rassen. Aangezien de meest bekende mutatie voor een korte staart in homozygote vorm niet leefbaar is (Haworth et al., 2001), was het interessant om te testen of dit ook de oorzakelijke mutatie is bij de Vlaamse koehond. Verschillende studies tonen een allelenfrequentie van om en bij de 30% voor het mutante allel van degeneratieve myelopathie bij de Sint-Hubertushond (Zeng et al., 2014; O.F.A., Statistics and Data). Om deze reden werden de Sint-Hubertushonden hierop getest. Degeneratieve myelopathie komt ook voor bij het krulharig leeuwtje (O.F.A., Statistics and Data) en werd dus ook getest op dit ras. Volgens OMIA komt X-gebonden hypohydrotische ectodermale dysplasie ook voor bij het krulharig leeuwtje. Ook deze test is ter beschikking in het laboratorium en werd hier uitgevoerd. Progressieve retinale atrofie (Ahonen et al., 2013) en von Willebrandt ziekte type 1 (Boudreaux, 2012) blijkt voor te komen bij het vlinderhondje. Deze twee testen zijn beschikbaar in het laboratorium en werden uitgevoerd op het vlinderhondje. Op basis van dit onderzoek kan, voor deze 4 rassen en betreffende de uitgevoerde DNA-testen, een fokadvies worden opgesteld. LITERATUURSTUDIE 1. X-LINKED HYPOHIDROTISCHE ECTODERMALE DYSPLASIE X-gebonden ectodermale dysplasie is een congenitale, X-gebonden recessieve aandoening. Het wordt vooral gekarakteriseerd door een vermindering of afwezigheid van haarfollikels en huidklieren. Ook abnormaliteiten aan de tanden en andere ectodermale structuren komen voor. Bij de mens wordt deze aandoening anhidrotische/hypohidrotische ectodermale dysplasie genoemd en bij de muis is er het Tabby fenotype (Moura & Cirio, 2004). Beide aandoeningen uiten zich in hypoplasie van het haar en de exocriene zweetklieren, misvormde tanden en missende tanden. Gezien de gelijkenis tussen beide soorten, werd gedacht aan een homoloog gendefect (Casal et al., 1997). Ook bij runderen is de aandoening bekend. Hier wordt het hypotrichose met anodontie genoemd. Bij de hond zijn er enkele casussen gekend waar de symptomen veel leken op deze bij ectodermale dysplasie in de Tabby muis en anhidrotische/hypohidrotische ectodermale dysplasie bij de mens. Het gaat om 2 mannelijke honden (1970), 5 reuen en 3 teefjes (1977) en 3 mannetjes en 2 vrouwtjes (1997). Allemaal vertoonden ze dezelfde symptomen. Verschillende andere casussen vermelden symptomen van X-gebonden hypohidrotische ectodermale dysplasie (XHED), maar de ziekte wordt niet vernoemd. Een van deze gevallen was een krulharig leeuwtje (Moura & Cirio, 2004). 3 De aandoening werd vooral gezien bij reuen met klinisch normale ouderdieren. Via kruisingsstudie in 1977 werd nagegaan hoe de aandoening overerft. Later werd ook een stamboomanalyse uitgevoerd. Uit deze stamboomanalyse en de resultaten van vorige kruisingsstudies kwam dat het gaat om een Xgebonden recessieve aandoening. Bij heterozygote teefjes was er soms een mild mozaïekpatroon te zien (Casal et al., 1997). De symptomen van XHED bij de hond zijn goed beschreven (figuur 1). Het uit zich vooral in congenitale alopecie en hypotrichose over zo’n 2/3e van het lichaam. In jonge honden is de huid ter hoogte van de alopecieplekken dun en grijzig en is de vascularisatie zichtbaar. Met vorderende leeftijd neemt de pigmentatie meer toe. De honden behouden grotendeels hun primaire vacht, maar deze is dunner dan normaal. De secundaire haren zijn broos en onvolledig. Op histologie is er een vermindering of zelfs afwezigheid van haarfollikels, zweetklieren en musculi arrector pilli te zien. Hoe erger de alopecie is, hoe meer uitgesproken deze histologische veranderingen zijn. Onafhankelijk van de alopecie is er ook een orthokeratotische hyperkeratose te zien, net als focale spongiose en hyperpigmentatie in de epidermis. Afwijkingen aan de tanden worden iets minder frequent gezien dan huidafwijkingen. Oligodontie, tandhypoplasie, persisterende melktanden, vertraagde eruptie van permanente tanden en abnormale vormen kunnen allemaal voorkomen. Een derde afwijking die vrij vaak wordt gezien is conjunctivitis en fotofobie (Moura & Cirio, 2004). Er wordt vermoed dat XHED ook afwijkingen geeft in het immuunsysteem, gezien de frequente longinfecties en sterfte ten gevolge van pneumonie (Casal et al., 2005). In verschillende dieren en mensen zorgen mutaties in het EDA gen voor het ontstaan van ectodermale dysplasie. Linkage analyse toonde ook bij de hond een significante linkage aan tussen XHED en een marker dicht bij het EDA gen. Dit gen codeert voor ectodysplasine, een transmembraanproteïne. Ectodysplasine heeft een functie in de morfogenese van haarfollikels en tandknoppen tijdens de foetale ontwikkeling. Het TNF-like domein zit extracellulair en is de receptor-bindingsplaats. Na sequentieanalyse van het gen werd de oorzakelijke mutatie geïdentificeerd. Het betreft een substitutie van G naar A in de splice-acceptor plaats van intron 8. In aanwezigheid van de mutatie zal het intron pas eindigen in een cryptische acceptorplaats in exon 9. Hierdoor zal er een leesraamverschuiving ontstaan en een nieuw stopcodon, waardoor het TNFα domein van ectodysplasine afwezig zal zijn (Casal et al., 2005). 4 Figuur 1. Hond met XHED. a, c, d) 4 maand oud, met een karakteristieke distributie van alopecie. Op foto d is de vascularisatie goed te zien, alsook een umbilicale hernia. b) conjunctivitis. e) 17 maand oud. f) Tanden op 13 maand oud. Er is oligodontie, de tanden zijn kegelvormig en er zijn enkele persisterende melktanden aanwezig (uit Moura & Cirio, 2004). 2. SHORT TAIL Het fenotype van een korte staart is eerst bestudeerd in de muis. Mutaties in verschillende genen, waaronder een in het Pax1 gen, het Wnt-3a gen en het T-gen, kunnen aanleiding geven tot een korte staart. Het T-gen codeert voor een lid van de T-box transcriptiefactor familie. De transcriptiefactor is van belang voor een normale ontwikkeling van het caudale mesoderm. De mutatie betreft een nulmutatie (er wordt geen polypeptide gevormd). Heterozygote individuen ontwikkelen een korte staart. De lengte van de staart varieert van bijna afwezig tot 50% van de normale lengte. Het homozygoot fenotype is embryoletaal. 5 Een mutatie in het canine homoloog van het T-gen bij de muis bleek ook aan de oorsprong te liggen van een korte staart bij de Pembroke Welsh Corgi. De oorzaak is een missense mutatie in exon 1. Door de substitutie van C door G (C189G), zal het 63e aminozuur methionine zijn in plaats van isoleucine. Het T-proteïne bindt normaal aan DNA om zijn functie uit te voeren. De mutante molecule verliest echter zijn eigenschap om te binden, wat resulteert in een korte staart. Ook hier zijn homozygoot mutanten hoogstwaarschijnlijk embryolethaal, aangezien homozygote individuen voor de mutatie niet werden gezien. Het betreft een autosomaal dominante overerving (Haworth et al., 2001). Het fenotype korte staart komt voor in zeer veel hondenrassen. Om na te gaan of de mutatie, gevonden bij de Corgi, ook van toepassing is op andere rassen, werd een studie uitgevoerd met 23 andere rassen waar aangeboren kortstaarten voorkomen. Voor de studie werden 360 honden, waarvan 156 aangeboren kortstaarten, gebruikt. Een overzicht van de resultaten van deze studie is weergegeven in tabel 1. In 17 rassen werd dezelfde C189G mutatie gevonden. Hierbij werd een perfecte correlatie tussen de mutatie en het kortstaart fenotype gevonden. Net als bij de bevindingen bij de Corgi, werden geen homozygoot mutante individuen gevonden, wat weer een aanwijzing is dat de mutatie embryoletaal is. Bij de 6 andere rassen kwam de mutatie niet voor en werd er ook geen andere mutatie in het coderend gedeelte van het T-gen gevonden (Hytönen et al., 2009), wat aanwijst dat het ofwel een regulatorische mutatie in het T-gen is ofwel een ander gen betreft. Tabel 1. Resultaten van de genotypering van de T-gen mutatie C189G bij 23 hondenrassen. Voor elk ras wordt een vergelijking gemaakt tussen het genotype bij de korstaarten en de normale fenotypes. 6 3. EXERCISE INDUCED COLLAPSE Exercise induced collapse (EIC) werd eerst aangetroffen in Labrador retrievers en is later ook teruggevonden in andere Retrievers. De honden zijn meestal volledig normaal, maar na enkele minuten van intense inspanning zullen ze symptomen vertonen. Typisch is er eerst een incoördinatie van de achterpoten en ontwikkeling van paraparese, die niet pijnlijk is. Progressief zal dit ontwikkelen naar collaps van de achterhand. Er is typisch geen patellareflex meer aanwezig. Soms zullen ook de voorste ledematen betrokken zijn. Meestal herstellen de honden na 15-30 minuten volledige rust, maar er zijn enkele gevallen bekend van sterfte. De eerste tekenen van de aandoening treden gemiddeld op rond 17 maanden ouderdom en meestal in de leeftijdsgroep van 6 tot 11 maanden. Aangetaste dieren zijn meestal homozygoot mutant. Heterozygoten zouden geen verhoogde kans hebben op collaps. Dit wijst erop dat het gaat om een autosomaal recessieve overerving (Minor et al., 2011). Ondertussen is de aandoening ook in andere rassen teruggevonden en zijn er testen beschikbaar voor de American Cocker Spaniel, Vlaamse koehond, Boykin Spaniel, Chesapeake Bay Retriever, Curly Coated Retriever, German Wirehaired Pointer, Labrador Retriever, Old English Sheepdog en Pembroke Welsh Corgi (O.F.A., Currently available DNA tests). De aandoening wordt veroorzaakt door een mutatie in het dynamine 1 gen (DNM1). De dynamine genfamilie codeert voor enzymen met een belangrijke rol in de cellulaire endocytose. Dynamine 1 is vooral van belang in het recycleren van synaptische vesikels tijdens hoge frequenties van neurologische stimulatie. De oorzaak van de aandoening is een G767T mutatie. Het gaat hier om een missense mutatie, waarbij arginine op plaats 256 wordt vervangen door leucine (R256L). Het mutante dynamine 1 zou nog genoeg enzymatische activiteit bezitten om zijn functie uit te oefenen bij rust en gemiddelde inspanning. In homozygoot mutante honden is de enzymatische activiteit echter niet voldoende tijdens intense inspanning (Minor et al., 2011). 4. PROGRESSIEVE RETINALE ATROFIE Progressieve retinale atrofie (PRA) is een degeneratieve oogaandoening die kan leiden tot blindheid. Het wordt gekarakteriseerd door een progressieve daling van staafjes in de retina, gevolgd door een verminderde functie van de kegeltjes. De eerste symptomen betreffen verminderd zicht bij schemerlicht, wat evolueert naar blindheid. Er zijn zeer veel mutaties die aanleiding geven tot PRA en in verschillende hondenrassen is de oorzakelijke mutatie nog niet gevonden. Recent is deze voor het vlinderhondje en het nachtvlinderhondje geïdentificeerd. Het betreft een indel mutatie in het CNGB1 gen, meer bepaald een deletie van 1 basenpaar en een insertie van 6 basenparen (figuur 2). CNGB1 is belangrijk voor de fotoreceptor functie van de staafjes. De mutatie veroorzaakt een leesraamverschuiving, wat leidt tot een nieuw stopcodon en waarschijnlijk tot de afbraak van het mRNA. 7 Figuur 2. Chromatogram van een normaal (1) en aangetast (2) individu. De deletie van A en insertie (GCTACA) zijn omcirkeld in het rood (naar Ahonen et al., 2013). Uit stamboomanalyse blijkt dat PRA autosomaal recessief overerft. Aangetaste individuen kunnen voortkomen uit twee gezonde ouderdieren en beide geslachten worden evenveel aangetast (Ahonen et al., 2013). 5. DEGENERATIEVE MYELOPATHIE De term degeneratieve myelopathie (DM) wordt gebruikt om een progressieve neurodegeneratieve ziekte te beschrijven. Het is een autosomaal recessief overdraagbare aandoening. Symptomen treden pas op op een latere leeftijd, meestal pas na 8 jaar. Initieel ziet men vooral upper motor neuron symptomen. Dit omvat ataxie, verminderde spinale reflexen en spastische parese van de achterhand. De symptomen verergeren snel naar lower motor neuron symptomen, zoals slappe verlamming van de achterhand en later zelfs tetraplegie, algemene spieratrofie, moeilijkheden bij het slikken en niet kunnen blaffen. Uiteindelijk is er sterfte en vaak wordt er reeds vroeger geopteerd voor euthanasie. Op histologie van het ruggenmerg is een non-inflammatoire degeneratie te zien van axonen en de myeline, alsook astrogliose in de funiculi. Andere mogelijke letsels op histopathologie zijn een neurogene spieratrofie en secundaire demyelinisatie in de perifere zenuwen (Zeng et al., 2014). DM heeft veel gelijkenissen met amyotrophic lateral sclerosis bij de mens, wat kan veroorzaakt worden door een mutatie in het superoxide dismutase 1 (SOD1) gen. In een studie in 2009 werd het SOD1 gen van enkele normale en aangetaste honden gesequeneerd. Er werd een missense mutatie, een substitutie van G door A op plaats 118 (G118A), gevonden waardoor het aminozuur glutaminezuur op 8 plaats 40 wordt vervangen door lysine (E40K). Dit zou een conformatieverandering teweegbrengen van het SOD1, wat leidt tot aggregatie en intracytoplasmatische inclusies (Awano et al., 2009). Tabel 2. Genotypen op plaats 118 in het SOD1 gen voor de Sint-Hubertushond en 4 andere rassen. In de tabel ziet men achtereenvolgens het aantal geteste honden, G/G: homozygoot wildtypes, G/A: heterozygoten, A/A: homozygoot mutanten en de allelenfrequentie van het mutante allel A (naar Zeng et al., 2014). Later werd een Berner Sennenhond, die via histopathologie gediagnosticeerd was met DM, gevonden die homozygoot voor het wildtype allel bleek te zijn. Nadere analyse bracht een tweede missense mutatie aan het licht: een A52T substitutie, waardoor serine wordt vervangen door threonine op plaats 18. Na verder onderzoek is gebleken dat deze tweede mutatie minder frequent voorkomt. Een van de rassen waar DM in voorkomt, is de Sint-Hubertushond of Bloedhond (tabel 2). Er werd een allelenfrequentie gevonden van 30% voor het mutante allel (Zeng et al., 2014). Een frequentiestudie uit 2014 (tabel 3) leverde gelijkaardige resultaten voor de Sint-Hubertushond op en toonde ook homozygoten aan in het krulharig leeuwtje (O.F.A., Statistics and Data). Tabel 3. Frequentiebepaling DM bij de Sint-Hubertushond en het krulharig leeuwtje. Aantal getaste % normaal % aangetast % drager dieren Sint-Hubertushond 311 49,5 6,4 44,1 krulharig leeuwtje 6 83,3 16,7 0,0 6. VON WILLEBRAND ZIEKTE 1 Von Willebrand ziekte (VWD) is de meest voorkomende overerfbare, extrinsieke aandoening van de bloedplaatjes. Bloedplaatjes hebben een rol in de primaire bloedstolling en zorgen voor de vorming van een plaatjesprop bij beschadiging van een bloedvatwand. Extrinsiek wijst op het feit dat de bloedplaatjes zelf normaal zijn, maar dat een proteïne die nodig is om hun functie correct uit te voeren defect of afwezig is. Abnormale functie van de bloedplaatjes zal typisch leiden tot mucocutane bloedingen. Vooral 9 bloedingen aan het tandvlees, neusbloeden en hematurie komen voor. Spontane bloedingen blijven meestal vrij mild. Erge en levensbedreigende bloedingen kunnen ontstaan bij trauma of chirurgie. De oorzaak van deze aandoening is een defect in de von Willebrandt factor (VWF). Deze molecule is een proteïne multimeer dat wordt aangemaakt door het endotheel en is van belang voor de adhesie van bloedplaatjes aan het endotheel. Er bestaan verschillende soorten multimeren van verschillende groottes. VWD wordt ingedeeld in 3 types. Bij type 1, de meest voorkomende vorm bij honden, is er een gelijke afname van alle soorten multimeren. In type 2 patiënten is er enkel een daling te zien in de grote multimeren. Ook de kwaliteit van de multimeren is lager dan normaal. Type 2 is het tweede meest voorkomende type bij de mens, maar bij de hond komt dit slechts zelden voor. Het derde type is de ergste vorm. Hierbij is er geen meetbare waarde aan VWF. Dit type is zowel bij de mens als bij de hond zeer zeldzaam en is beschreven bij de Schotse Terrier, de Shetland Sheepsdog, Kooikerhondjes en de Chesapeake Bay Retriever. Type twee komt voor bij de Duitse Kortkaar Staande hond (draadhaar en korthaar). Bij alle andere rassen waar VWD voorkomt, waaronder het vlinderhondje, gaat het om VWD type 1. VWF vormt een complex met factor VIII-C. De factor VIII-C activiteit zal hierdoor dalen, maar deze daling is meestal mild wanneer het niet gaat om erge vormen van VWD. De meeste honden met VWD zullen dus normaal testen op stollingstesten. VWD1 wordt veroorzaakt door een substitutie van 3 basen in exon 43 van het VWF gen. G wordt vervangen door A op positie 7541, waardoor een cryptische splice site wordt gebruikt, met een verkorting van exon 43. Deze mutatie is teruggevonden in zeer veel hondenrassen, waaronder het vlinderhondje (Boudreaux, 2012). 10 ONDERZOEK In dit onderzoek werd een frequentiebepaling gedaan van genetische aandoeningen bij 4 Belgische rassen. De desbetreffende rassen zijn de Bouvier des Flandres of Vlaamse koehond, de Bichon Frisé of het krulharig leeuwtje, de Sint-Hubertushond of bloedhond en de continentale dwerghond, ook wel papillon of vlinderhondje genoemd. Het vlinderhondje heeft een Belgisch-Franse origine, net als het krulharig leeuwtje. De Vlaamse koehond en de Sint-Hubertushond komen uit België De aandoeningen die getest zijn, zijn deze besproken in de literatuurstudie. Voor deze frequentiebepaling werden Belgische honden gebruikt, om zo de frequentie van genetische aandoeningen in de Belgische hondenpopulatie te bepalen. 1. BLOEDSTALEN De stalen nodig voor het onderzoek zijn bloedstalen. Bloedstalen zijn het makkelijkst om mee te werken om DNA-testen op uit te voeren. De staaltjes werden hoofdzakelijk bekomen uit de bloedbank van het laboratorium en via de kliniek kleine huisdieren, waar dieren werden aangeboden voor andere zaken dan de genetische aandoeningen. Enkele stalen waren stalen aangeboden voor diagnostiek van deze aandoeningen. Door gebruik te maken van verschillende bronnen, wordt de bias door verwantschap zo klein mogelijk gehouden. De bias is echter niet exact gekend. Het bloed dat nodig is voor de DNA-testen moet niet gestold bloed zijn. Hiervoor moet het bloed zijn opgevangen in EDTA-buisjes. Dit is nodig om de witte bloedcellen uit het bloed te recupereren, waar het nodige DNA in zit. De bloedbuisjes worden optimaal gevuld tot het streepje op het buisje. Hiermee is er een perfecte verhouding tussen bloed en EDTA. Bij een grotere hoeveelheid bloed zal er toch bloedstolling kunnen optreden. Bloedstalen uit de kliniek werden bewaard in de koelkast. Deze uit de bloedbank worden bewaard in de diepvriezer. 2. DNA-ISOLATIE UIT BLOED Materiaal Molecular Biology Grade Water (MQ) Dit water is steriel en vrij van proteasen en nucleasen. Dit wordt aangekocht bij Thermofisher Scientific, Erembodegem. Tris-HCl-EDTA (TE) Tien ml 1 M Tris-HCl (pH 8) wordt samengevoegd met 2 ml 0,5 M EDTA (pH 8) en verder aangelengd tot 1l met MQ. Deze oplossing wordt gebruikt om het bloed te “wassen”. 11 Lysebuffer Een halve ml 1M Tris-HCl (pH 8,3) wordt samengevoegd met 2,5 ml 1 M KCl en 0,25 ml Tween® 20. Dit laatste is een commerciële naam voor Polyoxyethyleensorbitaan monolauraat en heeft een emulgerende werking. Alles wordt aangelengd tot 50 ml met MQ en bewaard bij 4°C. Proteïnase K Dit is een 20 mg/ml stockoplossing (Bioké, Leiden). Lysebuffer K Wordt gemaakt door 1 µl Proteïnase K toe te voegen aan 200 µl Lysebuffer. Methode 100 µl ongestold bloed wordt gepipetteerd uit een bloedbuisje en toegevoegd aan 500 µl TE in een proefbuisje (Eppendorftube 1,5 ml). Dit wordt goed gemengd met behulp van een vortex en dan 30 seconden bij 13.200 toeren per minuut (tpm) gecentrifugeerd. Onderaan het proefbuisje zit nu een pellet van witte bloedcellen. Het supernatans wordt afgezogen en er wordt weer 500 µl TE toegevoegd, gevortext en gecentrifugeerd. Deze stappen worden minimaal 3 maal herhaald, tot de celpellet niet meer rood ziet. Bij ouder bloed kan het zijn dat de pellet niet meer wit te krijgen is. De pellet wordt geresuspendeerd in 100 µl Lysebuffer K en de proefbuisjes worden gedurende 45 minuten in een warmwaterbad gezet van 56°C. Bij deze temperatuur kan proteïnase K zijn werking goed uitoefenen waardoor de eiwitten worden afgebroken. Hierna wordt proteïnase K geïnactiveerd door de proefbuisjes 10 minuten in een bad van 95°C te zetten. Er wordt nadien 1 minuut gecentrifugeerd bij 13.200 tpm. Dit is een snelle methode die relatief onzuiver DNA oplevert, maar is goed genoeg indien het DNA snel wordt gebruikt in DNA-testen. 3. KWALITEIT EN CONCENTRATIE VAN HET DNA Om een PCR te kunnen laten doorgaan, is een minimumhoeveelheid start DNA nodig. De DNAconcentratie kan worden gemeten met de NanoDrop 1000 Spectrofotometer (Thermo Sciantific, ). Er is een druppel nodig van 1 µl. Deze wordt gepipetteerd op het uiteinde van een optische vezel. Een tweede optische vezel (de bovenste arm van het toestel) wordt in contact gebracht met de druppel. Als lichtbron wordt een pulserende xenon lamp gebruikt. Het licht gaat door de druppel en wordt geanalyseerd door de spectrometer. Het toestel is verbonden aan een computer, die de metingen meteen uitvoert en de resultaten weergeeft. Een tweede belangrijke parameter is de 260/280 waarde. Dit is de ratio van lichtabsorptie door het staal bij een frequentie van 260 en 280 nm. Dit geeft een idee over de zuiverheid van het staal. Een staal met een ratio van ongeveer 1,8 wordt aanzien als een puur DNA-staal. Een significant lagere waarde kan wijzen op de aanwezigheid van proteïnen, fenol of andere contaminatie. Deze contaminanten 12 absorberen sterk bij 280 nm. De 260/280 waarde van de stalen zal hier lager zijn dan 1,8, aangezien het gaat om een zeer ruwe bereiding van DNA (tabel 4). Tabel 4. Kwaliteit DNA-stalen. De concentratie wordt weergegeven in ng/µl. A260 en A280 is de absorptie door het staal bij 260 en 280 nm resp. De laatste kolom geeft de 260/280 waarde weer. Sample ID ng/ul A260 A280 260/280 Cfam-2575 55.28 1.106 1.210 0.91 Cfam-2576 41.10 0.822 0.778 1.06 Cfam-2577 43.97 0.879 0.835 1.05 Cfam-2578 51.23 1.025 0.909 1.13 4. MUTATIE DETECTIE De DNA-testen worden besproken per ras. Er werden 3 methodes gebruikt: de PCR-restrictie fragment lengte polymorfisme (PCR-RFLP), de real-time PCR (Taqman assay) en sequentie-analyse. Er werden 4 testen uitgevoerd op basis van PCR-RFLP. Voor XHED en EIC zijn reeds foto’s beschikbaar van de gel van aangetaste dieren of dragers. Voor deze aandoeningen is enkel het uitvoeren van de PCR-RFLP voldoende bewijs voor dragers en aangetaste dieren. Voor ST en PRA werden in het laboratorium nog geen diagnostische testen uitgevoerd. Positieve resultaten voor ST en PRA in het onderzoek werden gecontroleerd door middel van een sequentie-analyse. 4.1. BASISPRINCIPE VAN DE PCR De polymerase-chain reaction (PCR) is een techniek die frequent wordt gebruikt om DNA te amplificeren. Er wordt hierbij gebruik gemaakt van een thermostabiel DNA-polymerase om de DNAstrengen logaritmisch te vermenigvuldigen. Het meest gebruikte DNA-polymerase (het Taq DNA polymerase) is afkomstig van Thermus aquaticus, een thermofiele bacterie, en is dus een hittebestendig enzym. Bij het reactiemengsel worden twee primers toegevoegd. Dit zijn synthetische oligonucleotiden, die zo worden gekozen dat ze de te amplificeren regio afbakenen. 13 Figuur 3. De polymerase chain reaction bestaat uit 3 stappen. Het DNA wordt ontdubbeld (dissociatie) en de primers binden aan beide strengen (primer associatie). Hierna is er een elongatie van het DNA (primer elongatie). Deze cyclus wordt zo’n 30 keer herhaald (uit Schuit, 2000) De eerste reactie van een PCR is de dissociatie van de DNA dubbelstreng. Dit gebeurt door verhitting. Hierna gebeurt er annealing. Hierbij zullen beide primers binden aan de 3’ kant van de complementaire sequenties van de matrijsstrengen. Tijdens de elongatie zal Taq DNA polymerase de primers verlengen van 5’ naar 3’ en zo het DNA repliceren (figuur 3). Na 30 cycli zijn er in theorie 230 kopieën. In praktijk ligt deze hoeveelheid wat lager. Dit wil zeggen dat er ook een zeer lage DNA-concentratie zal worden gedetecteerd via PCR. Het nadeel hiervan is dat vals positieve reacties zullen ontstaan bij geringe contaminatie van één van de gebruikte substanties van het mengsel. Daarom wordt er bij de stalen ook telkens een negatieve controle in het PCR toestel gezet (Schuit, 2000). 4.2. PCR-RFLP PCR-restrictie fragment lengte polymorfisme is een veel gebruikte techniek voor DNA-analyse. Het voordeel van deze methode in vergelijking met de meeste andere is dat er geen dure toestellen nodig zijn. De techniek maakt gebruik van genetische variatie, zoals single nucleotide polymorfismen, multinucleotide polymorfismen, deleties, duplicaties … Deze variaties liggen aan de basis van verschillende genetische aandoeningen en zijn vaak geassocieerd met het al dan niet voorkomen van een restrictieenzym herkenningsplaats. 14 Figuur 4. Genotypering via RFLP. Individu 3 heeft geen herkenningsplaats voor het restrictie-enzym, wat resulteert in 1 groot fragment. Individu 5 heeft 2 strengen met herkenningsplaats, wat resulteert in 2 kleinere fragmenten. Individuen 1, 2 en 4 zijn heterozygoot, wat resulteert in 3 fragmentlengtes (uit Rasmussen, 2012). Na amplificatie van het gewenste DNA-fragment via PCR, wordt het bijhorende restrictie-enzym toegevoegd. Het resultaat zal zijn, dat fragmenten met de juiste herkenningsplaats worden geknipt en deze zonder herkenningsplaats behouden hun oorspronkelijke lengte. Aldus worden restrictiefragmenten met verschillende lengtes bekomen. De scheiding en identificatie van deze fragmenten gebeurt via gel-elektroforese (Rasmussen, 2012). Een praktisch voorbeeld wordt weergegeven in figuur 4. 4.3. REAL TIME PCR – TAQMAN ASSAY Bij de real time PCR, wordt tijdens de PCR-reactie het DNA gemeten na elke cyclus. Via deze methode is niet enkel het aantonen van het DNA, maar ook de kwantificering ervan mogelijk. Deze kwantificering is mogelijk via de meting van een fluorescentie signaal. Dit signaal wordt omgezet naar een numerieke waarde (Dorak, 2006). Het signaal is afkomstig van een probe die wordt toegevoegd aan het PCR-mengsel. Deze probe kan niet worden verlengd aan zijn 3’-einde, en kan dus niet worden gebruikt als primer. De probe is een oligonucleotide die zo is gemaakt dat deze kan binden op de gewenste sequentie in het DNA. Bij een 15 TaqMan assay wordt er gebruik gemaakt van een TaqMan probe. Aan de 5’ kant van deze probe zit er een fluorofoor en aan de 3’ kant een quencher. De quencher inhibeert het signaal van de fluorofoor, zolang deze dicht bij de fluorofoor zit. Een intacte probe zal dus geen of weinig fluorescentie uitstralen. Figuur 5. De TaqMan probe bindt stroomafwaarts van de primer aan de DNA streng. Tijdens de elongatiefase wordt de probe gesplitst door de exonuclease-activiteit van het Taq polymerase, waardoor de fluorescentie wordt gedetecteerd (uit Arya et al., 2005). De fluorogene probe zal tijdens de reactie stroomafwaarts van de primer binden. Taq polymerase verlengt de primer en zal aankomen aan het 5’ uiteinde van de TaqMan probe. Het enzym heeft ook een exonuclease activiteit en zal de probe afbreken in kleine stukjes en vervolgens de synthese van de nieuwe streng verder zetten. Hierdoor worden de quencher en de fluorofoor van elkaar gescheiden en valt de inhibitie weg (figuur 5). De aanwezigheid van de doelsequentie van de probe, zal dus leiden tot een fluorescentiesignaal. Bij afwezigheid van de doelsequentie zal de probe niet binden en dus ook niet worden afgebroken, waardoor er geen of weinig fluorescentie wordt geproduceerd (Arya et al., 2005). 4.4. GEL-ELEKTROFORESE Gel-elektroforese wordt gebruikt om proteïnen, DNA of RNA te scheiden. Hier wordt enkel de scheiding van DNA-moleculen besproken. De scheiding van de moleculen gebeurt door het aanleggen van een elektrisch veld (Yılmaz et al., 2012). DNA draagt een negatieve lading door de fosfaat-suikerruggengraat en zal migreren naar de positieve pool (Lee & Bahaman, 2012). De gel die wordt gebruikt bij gel- 16 elektroforese is een agarosegel en vormt een medium waarin het DNA kan migreren. De snelheid van migratie van het DNA is afhankelijk van het moleculair gewicht van de molecule. Kleine moleculen zullen sneller door de gel migreren dan grote moleculen en de fragmenten worden zo van elkaar gescheiden. Door gebruik te maken van een DNA-ladder, kan men de grootte van fragmenten inschatten. Dit wordt vaak gedaan na vertering van het DNA met restrictie-enzymen, om zo mutaties op te sporen of aan genetische “fingerprinting” te doen. De migratiesnelheid wordt ook bepaald door de concentratie van de gel. Een hogere concentratie aan agarose zorgt voor kleinere poriën in de gel en een tragere migratie van DNA fragmenten. Dit is handig om kleine DNA-moleculen van elkaar te scheiden. Een 1% gel komt overeen met 1g/100ml. Ook het voltage heeft een invloed. Hoe hoger het voltage, hoe sneller de migratie. Om na de scheiding het DNA zichtbaar te maken, wordt voornamelijk gebruik gemaakt van ethidiumbromide (EtBr). EtBr wordt aan de gel toegevoegd en zal zich tussen de basen van het DNA voegen (Yılmaz et al., 2012). Wanneer de gel wordt blootgesteld aan UV, zullen de DNA-banden (met ethidiumbromide) te zien zijn als fluorescerende banden (Figuur 6 A). Van de gel kan ook een foto worden getrokken met behulp van een digitale camera (Figuur 6 B). Figuur 6. Gel-elektroforese met ethidiumbromide. A) Deze rood-oranje banden zijn te zien na belichting met UV. B) Beeld na fotograferen met een digitale camera. 4.5. SEQUENTIE-ANALYSE Via sequentiebepaling kan de volgorde van de basenparen worden bestudeerd. Zo kan men een gen volledig analyseren en op zoek gaan naar mutaties. Er bestaan veel methodes, maar hier wordt enkel ingegaan op de methode gebruikt bij het onderzoek, namelijk de methode ontworpen door Sanger. Hierbij wordt een primer gebonden aan een template streng. De primer wordt verlengd door middel van DNA-polymerase. De nieuw gevormde streng is complementair aan de template streng. Voor de opbouw van de DNA-streng zijn er deoxynucleotiden nodig. Aan het reactiemengsel worden echter ook 2’, 3’ dideoxynucleotiden (ddNTP) toegevoegd. Na deze ddNTP’s kunnen geen nieuwe nucleotiden worden ingevoegd, aangezien ze geen vrije 3’ OH groep bezitten. Hierdoor wordt de verdere opbouw van de streng verhinderd. In totaal worden er 4 verschillende reacties uitgevoerd, elk met 1 soort ddNTP. Als resultaat verkrijgt men een mengsel met een verzameling aan fragmenten met verschillende lengte. Na lengtebepaling van de fragmenten, weet men welke base op welke plaats zit. De lengtebepaling 17 wordt gedaan via scheiding op een polyacrylamidegel of in een capillair. Het scheidend vermogen van deze gel is groter dan een agrosegel (Trainor, 1990. Koster, 1996. Peelman, 2014). Bij directe sequencing, wordt er gebruik gemaakt van het Taq polymerase. Hierdoor kan de reactie simultaan gebeuren met een PCR (Peelman, 2014). 4.6. TESTEN VOOR HET KRULHARIG LEEUWTJE 4.6.1. X-gebonden hypohidrotische ectodermale dysplasie Materiaal MQ Steriel water, vrij van proteasen en nucleasen wordt gebruikt voor de PCR-mix (Thermofisher Scientific, Erembodegem). FastStart buffer (FSB) Dit is een standaard reactiebuffer voor een PCR-reactie en wordt geleverd bij het enzyme (Roche Diagnostics, Vilvoorde). CfamEDA+/-1 (5 µM elk) Dit zijn de twee primers, nodig voor de amplificatie van het beoogde fragment. Het zijn korte, enkelstrengige oligonucleotiden, die complementair zijn aan de uiteinden van de te amplificeren sequentie. De “forward primer” is CfamEDA+1 en heeft de volgende sequentie: TCCCTTCTTGTTGCCTCTCACC. De “reverse primer” is CfamEDA-1 en heeft deze sequentie: CCATCTTCACCGCAATCTTCTG. Na PCR-reactie zullen deze primers zorgen voor een fragment met lengte 194bp. Alle primers worden aangekocht bij Integrated DNA Technologies, Leuven. dNTP’s (10 mM elk) Dit is een oplossing van nucleotiden. Het bevat 2’-deoxyadenosine-5’-trifosfaat, 2’-deoxycytidine-5’trifosfaat, 2’-deoxyguanosine-5’-trifosfaat en 2’-deoxythymidine-5’-trifosfaat. De stockoplossing bevat 100mM en wordt aangekocht bij Gentaur, Kampenhout. Om een werkoplossing te bekomen met 10 mM van elke nucleotide, wordt er verdund met MQ naar een oplossing van 40 mM. FastStart polymerase (5U/µl) Dit is een thermostabiel Taq-polymerase, aangekocht bij Roche Diagnostics, Vilvoorde. DNA Dit is het DNA dat in een vorige stap is geïsoleerd uit de bloedstalen. 18 Ladingsbuffer Dit is een verzwarende stof met een blauwe kleur. Het wordt gebruikt bij gel-elektroforese. Door dit bij PCR-product te voegen, zal het DNA bij het laden van de gel naar beneden zakken in de gleufjes. TBE buffer TBE staat voor Tris, Boraat, EDTA. Deze buffer wordt gebruikt om de agarosegel te maken voor de gelelektroforese. Agarosepoeder Dit is een polysacharide dat, toegevoegd aan een buffer, oplost bij een hoge temperatuur en gelvormig wordt bij afkoeling. Ethidium bromide EtBr wordt gebruikt bij gelelektroforese om het DNA zichtbaar te maken na belichting door UV-licht. Ladders Ladders worden gebruikt bij gel-elektroforese als referentie. Hiermee kan een schatting worden gemaakt van de lengte van de fragmenten. De twee gebruikte ladders zijn + Kb Plus en Hyperladder V. Deze laatste wordt gebruikt voor kleinere fragmenten. ScrFI Dit is het restrictie-enzym. Het herkent en knipt CC’NGG. Het wildtype allel wordt in fragmenten met lengte 146 + 25 + 23 bp geknipt en het mutant allel in fragmenten van 169 + 25 bp. Alle restrictieenzymen worden bij Bioké, Leiden aangekocht. 10x NEBuffer 3.1 Dit is de buffer waar de restrictie-reactie in doorgaat. Het is een 10 maal verdunning. NEBuffer wordt bij de restrictie-enzymen geleverd. Methode PCR Per staaltje is 2 µl van het bereide DNA nodig. Dit wordt gemengd met 5,7 µl MQ, 1,0 µl FSB, 1,0 µl primers, 0,2 µl dNTP’s en 0,1 µl FastStart polymerase. Dit geeft een totaal van 10 µl PCR-oplossing. Naast de stalen wordt er ook nog een positieve en negatieve controle ingebouwd. De positieve controle is een staal dat reeds getest is. Voor de negatieve controle wordt MQ gebruikt. Er wordt best een mix gemaakt voor alle staaltjes in een proefbuisje. Hiervoor vermenigvuldigt men elke eenheid (behalve het DNA) met het aantal staaltjes (inclusief positieve en negatieve controle). Er wordt best ongeveer 1/10e extra mix gemaakt. Als voorbeeld wordt hier gewerkt met 7 stalen. 7 stalen + 2 controles + 1 extra = mix voor 10 19 57 µl MQ 10 µl FSB 10 µl Cfam+/-1 2 µl dNTP’s 1 µl FS polymerase 80 µl totaalvolume Alles wordt goed gemengd en even afgedraaid. Er kan nu 8 µl worden uitverdeeld in PCR-proefbuisjes. In elk proefbuisje wordt 2 µl DNA toegevoegd en goed gemengd met de pipet. De proefbuisjes worden nogmaals even afgedraaid en in de PCR-machine gezet. Het gebruikte PCR-programma is het volgende: 1) 3’45” aan 95 °C 2) 0’15” aan 95 °C 3) 0’15” aan 64 °C 4) 0’30” aan 72 °C 5) 2’00” aan 72 °C 6) HOLD aan 15 °C Stappen 2-4 worden 35 keer doorlopen. Gel-elektroforese voor knippen 2 µl PCR-product wordt gebruikt om op gel te zetten. Hiermee kan men nagaan of de PCR goed is doorgegaan. 2 µl PCR-product wordt toegevoegd aan 8 µl MQ en 5 µl ladingsbuffer. Dit kan weer gedaan worden door eerst een mix te maken en 13 µl uit te verdelen in PCR-proefbuisjes, waarna 2 µl PCR-product wordt toegevoegd. Alles wordt goed gemengd met de pipet en kort afgedraaid. Figuur 7. Gel-elektroforese 28 krulharig leeuwtje stalen. (A) Er wordt gebruik gemaakt van 1 Kb Plus ladder. (B) Mislukt staaltje. (+) Positieve controle. (-) Negatieve controle. De ongeknipte stukjes zijn zo’n 200bp lang. Er wordt gebruik gemaakt van een 2% gel. De gewenste hoeveelheid TBE buffer wordt in een erlenmeyer gegoten. De juiste hoeveelheid agarosepoeder wordt afgemeten en toegevoegd aan de TBE buffer, terwijl er wordt gemengd. Ondertussen wordt het gewenste formaat gelhouder gekozen en worden de kammen hier in gezet. Na 2 minuten mengen wordt de oplossing verwarmd in de microgolf 20 tot er schuimvorming ontstaat. De inhoud wordt voorzichtig gemengd en de erlenmeyer wordt weer in de microgolf geplaatst tot schuimvorming optreedt. Dit wordt herhaald tot een heldere oplossing wordt bekomen. De inhoud wordt even afgekoeld en de juiste hoeveelheid EtBr wordt toegevoegd via een pipet. De gel wordt voorzichtig in de gelhouder gegoten, zodat er geen luchtbellen ontstaan. Wanneer de gel is gestold wordt de gelhouder in de buffer gestoken en worden de kammen uitgehaald. Deze laten gleufjes achter in de gel, waarin we de mix MQ + ladingsbuffer + PCR-product laden. Er wordt een voltage en tijd ingesteld naargelang de grootte van de gel. Nadat de gel lang genoeg gelopen heeft, kan deze worden bekeken onder UV-licht. Hier kan een digitale foto van worden getrokken (figuur 7). De geschatte lengte van de fragmenten op basis van de 1 Kb Plus ladder is 200bp. Dit komt overeen met de werkelijke lengte van 194bp. Overnacht knippen De gelukte staaltjes worden overnacht geknipt door het restrictie-enzym ScrFI. De controles worden niet mee geknipt. Bij de resterende 8 µl PCR-product van elk staaltje wordt 1 µl 10x NEBuffer 3.1 en 0,5 µl ScrFI toegevoegd. Het knippen gebeurt overnacht aan een temperatuur van 37 °C Gel-elektroforese na knippen Bij geknipte staaltjes en beide controles wordt 5 µl ladingsbuffer toegevoegd. Alles wordt geladen op een 3% gel (figuur 8). Als ladder wordt Hyperladder V gebruikt. Figuur 8. Gel-elektroforese van 27 geknipte staaltjes. Het 6e staaltje is hetzelfde mislukte staaltje als deze te zien in figuur 6. (A) Hypeladder V. (+) en (-) Positieve en negatieve controle. De geknipte staaltjes hebben een grootte rond de 150bp. De ongeknipte controles hebben een lengte van ongeveer 200 bp. Alle staaltjes zijn homozygoot voor het wildtype-allel. 21 4.6.2. Degeneratieve Myelopathie Degeneratieve myelopathie wordt getest via een TaqMan Assay met de fluoroforen HEX en TexasRed. Materiaal 2x SYBRgreen Supermix Deze kleurstof bindt aan nucleotiden, sterkst aan dubbelstrengig DNA. Het absorbeert blauw licht en zendt groen licht uit. Cfam SOD1+-2 (5 µM elk) Dit zijn de primers die worden gebruikt (IDT, Leuven). De “forward” primer, CfamSOD1+2, heeft de sequentie CTTCCACTTTCTTGTGATTG en de “reverse” primer, CfamSOD1-2, heeft CACCTTGTGTATTATCTCCAA als sequentie. CfamSOD1Wt-1 (HEX; 10 µM) Dit is een van de probes voor de qPCR. Aan een kant zit het fluorofoor HEX en aan de andere kant een quencher: HEX-CGCCTTCAGTCAGCC-BHQ1. Deze probe gaat binden aan het wildtype allel van het SOD1-gen. CfamSOD1Mt-1 (TR; 10 µM) De tweede probe zit gebonden aan het fluorofoor TexasRed en een andere quencher: TexasRedCGCCTTTAGTCAGCCC-BHQ2. Het bindt aan het mutante allel van het SOD1-gen. De sequentie van deze probe lijkt zeer sterk op deze van de eerste probe. Het verschil zit hem in een nucleotide (onderlijnd). Deze probe is ook 1 nucleotide langer. MQ Steriel water dat vrij is van nucleasen en proteasen (Thermofisher Scientific, Erembodegem). Controlestalen Er zijn 4 controlestalen nodig, waarvan 3 positieve staaltjes en 1 negatief staal. De positieve stalen bestaan uit een homozygoot wildtype, een homozygoot mutant en een heterozygoot staal. Methode Per 2 µl DNA, wordt het volgende toegevoegd: 5 µl SYBRgreen Supermix, 1 µl CfamSOD1+/-2, 0,5 µl Cfam SOD1Wt-1 (HEX), 0,2 µl CfamSOD1Mt-1 (TR) en 1,3 µl MQ. 22 Er kan een mix worden gemaakt, die dan wordt uitverdeeld in PCR-proefbuisjes. Hierbij maakt men ongeveer 10% meer mix dan het aantal staaltjes. Voor 5 staaltjes + 4 controles kan er bijvoorbeeld een mix worden gemaakt voor 10: 50 µl SYBRgreen Supermix 10 µl CfamSOD1+/-2 5 µl CfamSOD1Wt-1 (HEX) 2 µl CfamSOD1Mt-1 (TR) 13 µl MQ 80 µl totaalvolume 8 µl wordt uitverdeeld in PCR-proefbuisjes. Hierbij wordt 2 µl DNA toegevoegd of, in het geval van de negatieve controle, 2 µl MQ. De proefbuisjes worden in de Bio-Rad real-time PCR geplaatst en Het PCR-programma wordt als volgt ingesteld: 1) 3’00” aan 95 °C 2) 0’20” aan 95 °C 3) 0’40” aan 56 °C 4) 0’05” smeltcurve van 75 °C tot 95 °C Na stap 3 wordt de plaat gelezen door de machine. Stappen 2-3 worden 40 keer doorlopen. De smeltcurve wordt aan het einde van de reactie gemaakt. Kleurstoffen binden het best aan dubbelstrengig DNA. Bij een verhoging van de temperatuur zullen de strengen van elkaar loskomen (smelttemperatuur) en zal er een duidelijke daling zijn van fluorescentie. De fluorescentiedaling wordt gemeten tijdens deze stijging in temperatuur en zal zorgen voor een piek. De piek representeert de smelttemperatuur (Tm). De resultaten worden afgelezen op de grafiek “amplification” (Figuur 9). Men kan kiezen om naar alle fluoroforen te kijken, of bijvoorbeeld enkel naar HEX. Voor elk fluorofoor wordt een drempel ingesteld. Wanneer bijvoorbeeld voor HEX de grafiek van een staal boven deze drempel uit komt, betekent dit de aanwezigheid van het wildtype allel. Komt de grafiek van dit staal voor TR ook boven de treshold uit, dan hebben we te maken met een drager 23 Figuur 9. Amplificatiecurve na q-PCR met HEX en Texas Red. De y-as toont de "relative fluorescence units" (RFU). HEX (bindt aan een normaal allel) geeft een groene kleur en Texas Red (bindt aan het mutante allel) een rode kleur. 1) Heterozygoot staal (A) en een negatieve controle (B). 2) Homozygoot normaal staal (A) en een negatieve controle (B). 4.7. TESTEN VOOR DE SINT-HUBERTUSHOND De Sint-Hubertushond werd, net zoals het krulharig leeuwtje, getest op degeneratieve myelopathie. Dit werd gedaan door een TaqMan Assay met de fluoroforen HEX en Texas Red. De methode en materialen zijn dezelfde ongeacht het hondenras. Hiervoor wordt verwezen naar de methode en materialen voor degeneratieve myelopathie bij het krulharig leeuwtje. 24 4.8. TESTEN VOOR DE VLAAMSE KOEHOND 4.8.1. Short tail Materiaal Er wordt gebruik gemaakt van hetzelfde materiaal als bij XHED. Enkel de primers en het restrictieenzym zijn anders. CfamT+/-1 (5 µM elk) De “forward primer” is CfamT+1 en heeft de volgende sequentie: TGAGCGCCGTGGAGAGCG. De “reverse primer” is CfamT-1 en heeft deze sequentie: CCCAGAAAACCCAGAGAGTGACGA. Na PCRreactie zullen deze primers zorgen voor een fragment met lengte 343bp. Dit wordt aangekocht bij IDT, Leuven. BSTEII (10U/ µl) Dit restrictie-enzym herkent en knipt G’GTNACC. Het wildtype allel wordt in fragmenten met lengte 184 + 159 bp geknipt en het mutant allel in fragmenten van 184 + 128 + 31 bp lang. Een heterozygoot staal geeft dus 4 fragmenten: 184 + 159 + 128 + 31 bp. Dit wordt aangekocht bij Bioké, Leiden. Methode PCR Dezelfde methode wordt gehanteerd om de PCR-mix te maken zoals bij XHED, alleen worden hier andere primers gebruikt (CfamT+/-1). Het PCR-programma is als volgt: 1) 3’30” aan 94 °C 2) 0’30” aan 94 °C 3) 0’30” aan 64 °C 4) 1’00” aan 72 °C 5) 4’00” aan 72 °C 6) HOLD aan 15 °C Stappen 2-4 worden 35 keer doorlopen. Gel-elektroforese voor knippen 2 µl PCR-product + 8 µl MQ en 5 µl ladingsbuffer wordt op een 2% gel gezet (figuur 10). Figuur 10. Gel-elektroforese van 17 ongeknipte short-tail fragmenten van Vlaamse koehond. 25 Overnacht knippen De gelukte staaltjes worden overnacht geknipt. 1 µl 10x NEBuffer 3.1 en 0,5 µl BstEII wordt toegevoegd aan de resterende 8 µl PCR-product. De positieve en negatieve controle worden niet geknipt. De stalen worden geïncubeerd bij 60 °C. Gel-elektroforese na knippen Bij geknipte staaltjes en beide controles wordt 5 µl ladingsbuffer toegevoegd. Alles wordt geladen op een 3% gel (figuur 11). Hyperladder V wordt gebruikt om de grootte van de fragmentjes in te schatten. Figuur 11. Foto van restrictiefragmenten van 19 Vlaamse koehond stalen, na digest met BstEII. (A) Hyperladder V. (B) Homozygoot wildtypen. De fragmentjes liggen tussen 200-175 bp en 175-150 bp. Dit komt overeen met de te verwachtte fragmenten van 184 bp en 159 bp. (Zwarte pijlen) Deze duiden 3 dragers aan. Naast de twee fragmentjes die men ook ziet bij de homozygoot wildtypen, is er een 3 e fragment te zien van ongeveer 125 bp. Dit komt overeen met de werkelijke lengte van 128 bp. Het kleinste fragmentje van 31 bp is niet te zien. 4.8.2. Exercise induced collapse Materiaal Ook hier wordt grotendeels gebruik gemaakt van hetzelfde materiaal als bij XHED en ST. Enkel de primers, de buffer voor het knippen en het restrictie-enzym verschillen. Ook wordt er een extra stof gebruikt bij het overnacht knippen. CfamDNM1+/-1 (5 µM elk) De primers worden aangekocht bij IDT, Leuven. De “forward primer” is CfamDNM1+1 en heeft de volgende sequentie: GGCTGGTTGCCCCTGACTT. De “reverse primer” is CfamDNM1-1 en heeft deze sequentie: ttttgttttcctTTTCCCCAGGCtTGAGTTCCTTACCTG. Na PCR-reactie zullen deze primers zorgen voor een fragment met lengte 232bp. 26 SmlI (10U/ µl) Dit restrictie-enzym (Bioké, Leiden) geeft fragmenten met lengte 205 + 27 bp bij homozygoot wildtypen. Bij een mutant allel zal het grootste fragment worden opgeknipt in 113 + 92. Een heterozygoot staal geeft dus 4 fragmenten: 205 + 113 + 91 + 27 bp. 10 x NEBuffer 4 Het knippen van de fragmenten door SmlI gebeurt in deze buffer. Het wordt samen besteld met het restrictie-enzyme. De buffer is 10 keer verdund. 10x Bsa Bovine serum albumine wordt gebruikt om de adhesie van het restrictie-enzym aan de PCR-proefbuisjes tegen te gaan. Het stabiliseert ook proteïnen tijdens de incubatie. Dit wordt aangekocht bij Bioké, Leiden). Methode PCR Dezelfde methode wordt gehanteerd om de PCR-mix te maken als bij XHED en ST, alleen worden hier andere primers gebruikt (CfamDNM1+/-1). Het PCR-programma is als volgt: 1) 3’30” aan 95 °C 2) 0’30” aan 95 °C 3) 0’30” aan 64 °C 4) 1’00” aan 72 °C 5) 4’00” aan 72 °C 6) HOLD aan 15 °C Stappen 2-4 worden 35 keer doorlopen. Gel-elektroforese voor knippen 2 µl PCR-product + 8 µl MQ en 5 µl ladingsbuffer wordt op een 2% gel gezet (figuur 12). Figuur 12. Foto van een agarosegel na elektroforese van 15 Vlaamse koehond stalen. De fragmenten liggen iets boven de streep van 200 bp van de ladder, wat een schatting geeft van ongeveer 220-240 bp. Dit komt overeen met de te verwachten 232 bp die men verkrijgt bij PCR-reactie met CfamDNM1+/1 primers. (A) 1 Kb Plus ladder. (+) en (-) Positieve en negatieve controle. 27 Overnacht knippen De gelukte staaltjes worden overnacht geknipt bij 64 °C. 1 µl NEBuffer 4, 0,5 µl SmlI en 1 µl Bsa worden toegevoegd aan de resterende 8 µl PCR-product. De positieve en negatieve controle worden niet geknipt. Voor homozygoot wildtype staaltjes geeft dot fragmenten van 205 + 27 bp lang en voor mutante allelen 113 + 92 + 27 bp. Gel-elektroforese na knippen Bij geknipte staaltjes en beide controles wordt 5 µl ladingsbuffer toegevoegd. Alles wordt geladen op een 3% gel (figuur 13). Als referentie wordt Hyperladder 5 gebruikt. Figuur 13. Foto na gel-elektroforese van geknipte staaltjes van Vlaamse koehond. De witte pijl duidt een heterozygote drager aan voor het mutante EIC allel. 4.9. TESTEN VOOR HET VLINDERHONDJE 4.9.1. Progressieve retinale atrofie Materiaal Er worden grotendeels dezelfde materialen gebruikt als bij XHED en ST. De primers verschillen, net als het restrictie-enzym. Net als bij EIC, wordt hier gebruik gemaakt van NEBuffer 4 in plaats van NEBuffer 3.1. CfamCNGB1+/-1 (5 µM elk) De “forward primer” is CfamCNGB1+1 en heeft de volgende sequentie: ACGCTCGGCAAACCGCAG. De “reverse primer”, CfamCNGB1-1,heeft deze sequentie: ACAGAGAAAGCAAAGACACCCGTGA. Na PCR-reactie zullen deze primers zorgen voor een fragment met lengte 287bp voor het wildtype allel. Aangezien het hier gaat om een indel mutatie, is het fragment van het mutante allel groter: 292 bp. De primers worden aangekocht bij IDT, Leuven. AluI (10U/ µl) Dit restrictie-enzym (Bioké, Leiden) herkent en knipt G’GTNACC. Het wildtype allel wordt in fragmenten met lengte 184 + 159 bp geknipt en het mutant allel in fragmenten van 184 + 128 + 31 bp. Een heterozygoot staal geeft dus 4 fragmenten: 184 + 159 + 128 + 31 bp. 28 Methode PCR Dezelfde methode wordt gehanteerd om de PCR-mix te maken als bij XHED, ST en EIC, alleen worden hier de CfamCNGB1+/-1 primers gebruikt. Het PCR-programma is dezelfde als deze bij ST: 1) 3’30” aan 94 °C 2) 0’30” aan 94 °C 3) 0’30” aan 64 °C 4) 1’00” aan 72 °C 5) 4’00” aan 72 °C 6) HOLD aan 15 °C Stappen 2-4 worden 35 keer doorlopen. Gel-elektroforese voor knippen 2 µl PCR-product + 8 µl MQ en 5 µl ladingsbuffer wordt op een 2% gel gezet (figuur 14). Figuur 14. Foto van een agarosegel na elektroforese van 11 vlinderhondje staaltjes. De fragmenten zijn verkregen via PCR met CfamCNGB1+/-1 en zijn iets kleiner dan 300 bp lang. (A) 1 Kb Plus ladder. (B) Mislukt staaltje. (+) en (-) Positieve en negatieve controle. Overnacht knippen 1 µl 10x NEBuffer 4 en 0,5 µl AluI wordt toegevoegd aan de resterende 8 µl PCR-product. De stalen worden geïncubeerd bij 37 °C en worden overnacht geknipt. De twee controles en mislukte staaltjes worden niet geknipt. De fragmenten die ontstaan na knippen bij een wildtype allel zijn 206 + 45 + 36 bp lang. Deze bij een mutant allel zijn 116 + 95 + 45 + 36 bp lang. Gel-elektroforese na knippen Bij de geknipte staaltjes en beide controles wordt 5 µl ladingsbuffer toegevoegd. Alles wordt geladen op een 3% gel (figuur 15). Als referentie wordt Hyperladder 5 gebruikt. 29 Figuur 15. Foto van gel na elektroforese van geknipte PRA-staaltjes. Er zijn 9 staaltjes te zien. (A) Hyperladder V. (B) Homozygoot wildtype staal. Er is een duidelijk fragment van ongeveer 200 bp, wat overeenkomt met de te verwachten 206 bp. Onderaan is er een fragment waar te nemen van zo’n 50 bp. Dit zijn de fragmentjes van 45 en 36 bp. (C) Heterozygoot staal. Men ziet dezelfde fragmenten als bij B en twee extra fragmenten. De extra fragmenten zijn ongeveer 125 en 100 bp lang. Dit komt overeen met de werkelijke lengte van 116 + 95 bp. 4.8.2. von Willebrand ziekte 1 Om na te gaan of er in vlinderhondjes von Willebrandt ziekte 1 voorkomt, werd sequentie-analyse uitgevoerd. Materiaal Voor de PCR wordt weer grotendeels gebruik gemaakt van hetzelfde materiaal als de testen op basis van de PCR-RFLP. De primers zullen hier verschillen en het DNA wordt niet geknipt, waardoor geen restrictie-enzym nodig is, noch een buffer om deze reactie in te laten doorgaan. Voor de stappen na de PCR zijn nieuwe producten nodig. CfamVWF+/-7 (5 µM elk) Deze primers (IDT, Leuven) geven aanleiding tot fragmenten van 287 bp lang na PCR. De “forward” primer, CfamVWF+7 heeft de sequentie CGAGGCACCATCTACCCTGTG. De “reverse” primer is CfamVWF-7 en heeft TCACCCAACCTCAGTCCTCTCC als sequentie. Exo-AP oplossing Dit is een mix van Exonuclease I en Antarctic phosphatase. Een stockoplossing van 30 µl bestaat uit 10 µl 20 U/ µl Exonuclease I + 20 µl 5 U/ µl Antartic Phosphatase en wordt bewaard aan -20°C. De ingrediënten worden afzonderlijk aangekocht bij Bioké, Leiden. RR-mix De Ready Reaction mix wordt aangekocht bij Life Technologies, Gent. 30 5x seq-buffer Dit wordt ook geleverd in dezelfde kit als de RR-mix. Het bestaat uit 200 mM Tris-HCl, pH8 + 5 mM MgCl2. CfamVWF+7 Enkel de “forward” primer wordt gebruikt in de sequentie-reactie (IDT, Leuven). GC-oplossing Deze wordt geleverd in de FastStart kit door Roche Diagnostics, Vilvoorde. Methode PCR Net als bij de PCR-RFLP, kan gebruik gemaakt worden van een mix, die wordt uitverdeeld over de PCRproefbuisjes. Hierbij wordt dan 2 µl DNA toegevoegd. De hoeveelheden van elke stof zijn dezelfde als reeds beschreven: 5,7 µl MQ 1 µl FSB 1 µl Cfam+/-1 0,2 µl dNTP’s 0,1 µl FS polymerase 2 µl DNA 10 µl totaalvolume per proefbuisje De proefbuisjes worden in de PCR gezet en het volgende programma wordt doorlopen: 1) 3’30” aan 94 °C 2) 0’30” aan 94 °C 3) 0’30” aan 64 °C 4) 1’00” aan 72 °C 5) 4’00” aan 72 °C 6) HOLD aan 15 °C Stappen 2-4 worden 30 keer doorlopen. Gel-elektroforese 2 µl PCR-product wordt gemengd met 5 µl ladingsbuffer en 8 µl MQ. Dit wordt geladen in een 2% agarosegel (figuur 16). 31 Figuur 16. Resultaat gel-elektroforese na PCR-reactie met CfamVWF+/-7 op 4 vlinderhondstaaltjes. De verkregen fragmenten zijn ongeveer 300 bp lang, wat overeenkomt met de werkelijke lengte van 287 bp. (A) 1 Kb Plus ladder. (+) en (-) Positieve en negatieve controle. Exo-AP Deze reactie zal de PCR-mix als het ware opkuisen. Alle resterende primers en dNTP’s worden door de enzymen verteerd, zodat enkel de dubbelstrengige DNA-fragmenten over blijven en de sequentiereactie kan worden gedaan. Per resterende PCR-mix (8µl) wordt 0,6 µl Exo-AP oplossing toegevoegd. De proefbuisjes worden in het PCR-toestel gezet en doorlopen de volgende reactie: 1) 30’ aan 37 °C 2) 15’ aan 80 °C 3) HOLD aan 4 °C Aan 80 °C worden de enzymen geïnactiveerd. Sequentie-reactie Er is maar 2 µl PCR-product nodig om de sequentie-reactie te doorlopen. Bij het PCR-product wordt 0,5 µl RR-mix, 2 µl 5x Seq-buffer, 2 µl CfamVWF+7 primer, 3 µl MQ en 1 µl GC-oplossing toegevoegd. Hiermee bekomt men een totaal volume van 10,5 µl. Weer kan men eerst een mix maken, die wordt uitverdeeld over de PCR-proefbuisjes en waarbij in elk proefbuisje het PCR-product wordt toegevoegd. De PCR-proefbuisjes worden in het PCR-toestel geplaatst en doorlopen het volgende programma: 1) 2’00” aan 95 °C 2) 0’20” aan 95 °C 3) 0’10” aan 60 °C 4) 4’00” aan 65 °C 5) HOLD aan 4 °C Stappen 2-4 worden 30 keer doorlopen. Sequeneren Het sequeneren wordt gedaan door een extern laboratorium. De 10,5 µl eindproduct wordt overgebracht in een 1,5 ml eppendorf en elk staaltje krijgt een nummer. De stalen worden opgestuurd naar Eurofins (Duitsland) en de resultaten zijn de volgende dag beschikbaar via internet (figuur 17). 32 Figuur 17. Voorbeeld van een homozygoot normaal individu en een drager van von Willebrandt ziekte type 1 bij het vlinderhondje. A) Normale sequentie in het VWF gen. B) Sequentie bij een drager. De pijl duidt de mutatie aan. Op deze plaats is er een zwarte piek (G) en een groene piek (A) te zien wat aantoont dat dit individu heterozygoot is. Het betreft een substitutiemutatie. 5. RESULTATEN De resultaten van de DNA-testen worden besproken per hondenras. Een overzicht wordt weergegeven in tabel 5. Tabel 5. Resultaten van de frequentiebepaling. XHED: X-gebonden hypohydrotische ectodermale dysplasie. DM: Degeneratieve myelopathie. ST: Short tail. EIC: Exercise induced collapse. PRA: Progressieve retinale atrofie. VWD1: von Willebrandt ziekte type 1. Ras DNA- Totaal Normaal Drager Aangetast test krulharig leeuwtje Allelenfrequentie mutant allel XHED 27 27 0 0 0% DM 27 25 2 0 3,7% Sint-Hubertushond DM 27 14 13 0 24,1% Vlaamse koehond ST 102 97 5 0 2,5% EIC 101 94 7 0 3,5% PRA 39 36 3 0 3,8% VWD1 39 37 2 0 2,6% vlinderhondje 33 5.1. KRULHARIG LEEUWTJE X-gebonden hypohidrotische ectodermale dysplasie De DNA-test voor XHED werd uitgevoerd op het krulharig leeuwtje. In totaal werden 28 staaltjes getest, waarvan 1 is mislukt. Alle honden testten negatief. Degeneratieve myelopathie Degeneratieve myelopathie werd getest op de Sint-Hubertushond en het krulharig leeuwtje. De resultaten worden afgelezen uit een amplificatiecurve (figuur 9). Een smeltpiek kan worden opgesteld voor elk staal (figuur 18). Hieruit kan de smelttemperatuur makkelijk worden afgeleid. Bij de smelttemperatuur zal 50% van het DNA in het staal gedissocieerd zijn. Hierdoor neemt de fluorescentie sterk af, wat leidt tot een smeltpiek. De allelische discriminatie grafiek is een puntgrafiek die een mooie overzicht geeft van alle stalen (figuur 19). Van de 28 Krulharige Leeuwtjes die werden getest, is 1 staal mislukt. Onder de 27 hondjes, werden 2 dragers gevonden (Grafiek 1). Volgens de wet van Hardy-Weinberg geldt in een ideale populatie: De frequentie Wt/Wt = p² = 0.92729 De frequentie van Wt/Mt = 2pq = 0,07133 De frequentie van Mt/Mt = q² = 0,00137 Dit komt overeen met de resultaten van de steekproef. Figuur 18. Smeltpiek van 3 stalen na q-PCR. Deze geeft de daling van fluorescentie weer (y-as) in functie van de temperatuur (x-as). De pieken geven de smelttemperatuur weer van elk staal. (1) en (2) zijn normale smeltpieken. (3) heeft een veel lagere smeltpiek, wat kan wijzen op niet-optimale amplificatie van het staal. Dit kan eventuele lage RFU-waarden verklaren op de amplificatiecurve. 34 Figuur 19. Allelische discriminatie. De fluorescentie voor HEX (wildtype allel) wordt weergegeven op de x-as, deze van Texas Red (mutant allel) op de y-as. (A) Homozygoot wildtype stalen. Deze zitten enkel boven de drempel voor HEX. (B) Heterozygote stalen. Deze zitten boven beide drempels (C) Het homozygoot wildtype controlestaal zit boven de drempel van Texas Red. (D) De negatieve controle bereikt geen van beide drempels. 5.2. SINT-HUBERTUSHOND De Sint-Hubertushond werd getest op degeneratieve myelopathie. Zevenentwintig honden werden hiervoor getest. 13 honden bleken drager en er werden geen homozygoot aangetaste individuen gevonden (grafiek 1). In deze steekproef zijn er 48% dragers en de allelenfrequentie van Mt is 24%. Het verwachtte percentage aangetaste dieren kan worden berekend met de wet van Hardy-Weinberg: p = 0,75926 q = 0,24074 De frequentie Wt/Wt = p² = 0.57647 De frequentie van Wt/Mt = 2pq = 0,36557 De frequentie van Mt/Mt = q² = 0,05796 Dit betekent dus dat homozygoot aangetaste dieren worden verwacht in deze populatie. Men verwacht namelijk in deze populatie van 27 honden 9,8 dragers, 15,6 normale en 1,6 aangetaste dieren te vinden. De reden dat hier geen aangetaste honden zijn gevonden, kan liggen aan het feit dat het slechts een kleine steekproef betreft. 35 Degeneratieve myelopathie 25 25 20 15 14 13 10 5 2 0 Krulharig leeuwtje Bloedhond Normaal Drager Aangetast Grafiek 1. Voorkomen van degeneratieve myelopathie bij het krulharig leeuwtje en de SintHubertushond. Bij het krulharig Leeuwtje zijn 2 van de 25 geteste honden dragers. Bij de SintHubertushond zijn er 48% dragers gevonden. Aangezien het een kleine steekproef betreft, kan de factor kans een grote invloed spelen. Om dit in rekening te brengen, dient gekeken te worden of de resultaten significant zijn via het toetsen van hypothesen. Kan men aannemen dat de allelenfrequentie van het mutante allel 20% of meer is? H0: π < π0 = 0,2 Ha: π > π0 = 0,2 Het kritieke gebied bij α = 0,05 is [1,65; + ]. t = 0,73. De teststatistiek valt niet in het kritieke gebied en H0 wordt niet verworpen. Kan men aannemen dat de allelenfrequentie 15% of meer is? In dit geval wordt t = 1,85. Dit valt wel in het kritieke gebied. Neemt men echter een α = 0,01 dan is het kritieke gebied [2,33; + ] en valt t hier niet in. Men kan dus met een betrouwbaarheid van 95% stellen dat de frequentie van het mutante allel minstens 15% bedraagt. Om een betrouwbaarheid van 99% te bekomen, dan moet een π0 van 0,13 worden genomen. In dit geval is t = 2,4 en valt dit wel in het betrouwbaarheidsinterval. Met een betrouwbaarheid van 99% kan worden gesteld dat de frequentie van het mutante allel gelijk is aan 13% of meer. In een ideale populatie met q = 13% verwacht men de volgende genotypenfrequenties: Wt/Wt: 75,69% Wt/Mt: 22,62% Mt/Mt: 1,69% 36 5.3. VLAAMSE KOEHOND Short tail Het fenotype “short tail” komt voor bij de Vlaamse koehond. Er werd eerder nog niet beschreven welke de oorzakelijke mutatie is in dit ras. Aangezien de C189G mutatie in het T-gen terugkomt in verschillende hondenrassen, werd de aanwezigheid ervan ook nagegaan bij de Vlaamse koehond. Van de 102 honden bleken 5 drager voor de mutatie en er werden geen homozygoot aangetaste individuen gevonden (Grafiek 2). Op 4 positieve stalen werd ook een sequentie-analyse uitgevoerd. Deze bevestigde de resultaten van de PCR-RFLP. Er kan besloten worden dat het fenotype “korte staart” bij de Vlaamse koehond wordt veroorzaakt door de C189G mutatie in het T-gen. Vlaamse koehond 97 94 100 80 60 40 5 20 7 0 0 0 ST EIC Normaal Drager Aangetast Grafiek 2. Voorkomen van Short tail en Exercise induced collapse bij de Vlaamse koehond. Resultaten van een steekproef bij 102 en 101 Belgische honden resp. Exercise induced collapse Alle 102 Vlaamse koehonden werden ook getest op EIC. Één test mislukte, wat een steekproef geeft van 101 individuen. Zeven honden bleken dragers en er waren geen homozygoot aangetaste dieren (Grafiek 1). Indien de wet van Hardy-Weinberg wordt toegepast, dan verwacht men in een ideale populatie volgende frequenties: p = allelenfrequentie van het wildtype allel (Wt) = 7/202 = 0,96534 q = allelenfrequentie van het mutante allel (Mt) = 1 – p = 0.03465 Wet van Hardy-Weinberg: p² + 2pq + q² = 1 De frequentie Wt/Wt = p² = 0.93189 De frequentie van Wt/Mt = 2pq = 0,06691 De frequentie van Mt/Mt = q² = 0,00120 37 In een populatie in evenwicht verwacht men dus 93,19% normale, 0,12% aangetaste individuen en 6,69% dragers. Toegepast op deze steekproef komt dit uit op de gevonden resultaten. Het is bijgevolg niet verbazend dat er geen aangetaste honden werden gevonden. 5.4. VLINDERHONDJE Progressieve retinale atrofie 39 vlinderhondjes werden getest op PRA. Hierbij werden 3 dragers gevonden en geen homozygoot aangetaste honden (grafiek 3). Ook deze resultaten komen overeen met het Hardy-Weinberg evenwicht. In een ideale populatie geldt: De frequentie Wt/Wt = p² = 0.92456 De frequentie van Wt/Mt = 2pq = 0,07396 De frequentie van Mt/Mt = q² = 0,00148 Vlinderhondje 40 35 30 25 20 15 10 5 0 37 36 3 2 0 PRA 0 VWD Normaal Drager Aangetast Grafiek 3. Voorkomen van progressieve retinale atrofie en von Willebrandt ziekte 1 bij het vlinderhondje. Resultaten van een steekproef bij 39 Belgische vlinderhondjes. von Willebrand ziekte 1 De 39 vlinderhondjes die werden getest op PRA, werden ook getest op VWD1. Er werden 2 dragers gevonden. De rest was homozygoot normaal (Grafiek 2). Na het toepassen van de wet van HardyWeinberg krijgt men volgende genotypenfrequenties: Wt/Wt: q² = 0,94938 Wt/Mt: 2pq = 0,04997 Mt/Mt: q² = 0,00066 Deze frequenties komen goed overeen met de resultaten van de steekproef. 38 BESPREKING In de literatuur werd een hoge allelenfrequentie beschreven voor het mutante allel van degeneratieve myelopathie bij de Sint-Hubertushond (Zeng et al., 2014). Deze hoge frequentie komt goed overeen met de gevonden frequentie (24,1%) in de Belgische populatie. Gezien deze mutatie zo veel voorkomt in de Sint-Hubertushond is het een goed idee om degeneratieve myelopathie standaard te laten testen bij fokhonden. Optimaal zouden zowel dragers als aangetaste individuen worden geweerd uit de fok. Het nadeel hiervan is dat men, gezien deze hoge frequentie van dragers, een zeer groot deel van de populatie zou moeten weren uit de fok. Wanneer men ook in rekening brengt dat de huidige populatie al vrij klein is, zou het weren van dragers en aangetaste dieren een te sterke daling in de genetische variatie teweegbrengen. Om deze reden is het een goed idee om dragers in de fok te houden. Aangezien het hier gaat om een recessieve aandoening, komen symptomen enkel voor bij homozygoot mutanten. Deze kunnen ontstaan door kruising van een aangetast individu met een drager (50% kans op een aangetaste nakomeling) of door kruising van twee dragers (25% kans op een aangetaste nakomeling). Dragers kunnen gepaard worden met een homozygoot normaal individu. Uit deze kruising komen 50% dragers en 50% normale dieren. Dit zou een daling teweegbrengen van de allelenfrequentie van het mutante allel en zal het ontstaan van aangetaste individuen tegengaan. In uitzonderlijke gevallen, bijvoorbeeld wanneer het een waardevol fokdier betreft, zou (gezien de geringe diversiteit in het ras en het relatief laattijdig optreden van de aandoening) kunnen overwogen worden om met dit dier verder te fokken. Dit kan enkel op voorwaarde dat het dier wordt gekruist met een niet verwante partner, die via de DNA test als homozygoot normaal werd getypeerd en met opvolging via de DNA test van alle nakomelingen. Uit deze studie blijkt dat het fenotype van een korte staart bij de Vlaamse koehond wordt veroorzaakt door een in vele rassen voorkomende mutatie in het T-gen. Dragers van het mutante allel hebben een korte staart en homozygoot aangetaste individuen zijn niet leefbaar. Aangezien dragers gemakkelijk met behulp van het fenotype kunnen worden geïdentificeerd, is een DNA-test niet nodig. Er kan worden gesteld dat twee kortstaarten best niet worden gekruist, aangezien dit 25% kans geeft op een niet leefbaar homozygoot mutant individu. Dit geeft aanleiding tot kleinere nesten. Kortstaarten kunnen wel nog worden gebruikt in de fok, door ze te kruisen met homozygoot normale honden (honden met een lange staart). Gemiddeld zal de helft van de nakomelingen uit deze kruising een korte staart hebben, de helft een lange staart en zal dit geen kleine nesten veroorzaken. Wat betreft degeneratieve myelopathie (DM) en X-gebonden hypohydrotische ectodermale dysplasie (XHED) bij het krulharig leeuwtje, exercise induced collapse (EIC) bij de Vlaamse koehond en progressieve retinale atrofie (PRA) en von Willebrandt ziekte type1 (VWD1) bij het vlinderhondje kan eenzelfde fokadvies worden meegegeven. Bij het krulharig leeuwtje werden, in een studie met 36 honden, 16,7% aangetaste honden gevonden voor DM (O.F.A., Statistics and Data). Een frequentiestudie voor XHED bij dit ras werd nog niet uitgevoerd. Hetzelfde geldt voor EIC bij de Vlaamse koehond en VWD1 bij het vlinderhondje. PRA werd bij het vlinderhondje gevonden aan een vrij hoge frequentie, namelijk 2,8% aangetaste honden en 17,2% dragers, na een cohortstudie (Ahonen et al., 2013). De frequentie die in deze studie werd gevonden ligt lager (8,3% dragers en geen aangetaste 39 individuen), maar dit kan ook liggen aan het feit dat het om een veel kleinere steekproef gaat. Deze aandoeningen zijn allemaal recessieve aandoeningen, waardoor dragers geen symptomen zullen vertonen, met uitzondering van VWD1, waarbij zeer uitzonderlijk een drager milde symptomen kan ontwikkelen. Algemeen kan worden gesteld dat aangetaste individuen moeten worden geweerd uit de fok, net als dragers. Dragers weren is hier zeker mogelijk, gezien het percentage in de populatie vrij klein is en dit de genetische variatie niet in gedrang brengt. Echter, door dit lage percentage, zou het in de praktijk niet lonen om een DNA-test verplicht te maken. Wel wordt aangeraden om de DNA test te gebruiken in families en lijnen waar de aandoening werd vastgesteld. De kans op het doorgeven van mutante allelen en het ontstaan van aangetaste individuen is namelijk zeer laag. Praktisch gezien is het dus aangeraden om aangetaste dieren uit de fok te weren. X-gebonden hypohydrotische ectodermale dysplasie is een x-chromosoom gebonden recessieve aandoening. Dit heeft als gevolg dat mannelijke dieren geen dragers kunnen zijn en er meer aangetaste mannelijke dan vrouwelijke dieren worden verwacht. Mannelijke dieren zijn normaal of aangetast en er zijn dus geen mannelijke dragers die de aandoening kunnen verspreiden. De gevonden lage frequentie in dit onderzoek (0%) kan hier mogelijks mee worden verklaard. Een algemeen fokadvies kan hier niet worden gegeven. Er moet nog uitgebreid onderzoek worden gedaan naar genetische aandoeningen bij verschillende rassen. Hier zijn slechts 4 rassen onderzocht en slechts enkele testen uitgevoerd. Binnen deze rassen kunnen er nog andere aandoeningen worden getest en mutaties voor veel voorkomende aandoeningen worden ontdekt. De studie kan ook worden uitgebreid naar een heleboel andere hondenrassen. Na verloop van tijd kan er worden vastgesteld welke DNA-testen nuttig zijn voor elk ras en hoe dit foktechnisch kan worden aangepakt om de mutante allelen terug te dringen. 40 REFERENTIELIJST Ahonen S.J., Arumilli M., Lohi H. (2013). A CNGB1 Frameshift Mutation in Papillon and Phalène Dogs with Progressive Retinal Atrophy. PLoS One 8(8), e72122. Arya M., Shergill I.S., Williamson M., Gommersall L., Arya N, Patel H.R.H. (2005). Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics 5(2), 209-219. Boudreaux M.K. (2012). Inherited platelet disorders. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care 22(1), 30-41. Casal M.L., Jezyk P.F., Greek J.M., Goldschmidt M.H., Patterson D.F. (1997). X-linked Ectodermal Dysplasia in the Dog. Journal of Heredity 1997 88, 513-517. Casal M.L., Scheidt J.L., Rhodes J.L., Henthorn P.S., Werner P. (2005). Mutation identification in a canine model of X-linked ectodermal dysplasia. Mammalian Genome 16, 524-531. Dorak M.T. (2006). Real-Time PCR: Advanced methods. Verenigd Koninkrijk: Taylor & Francis Group http://www.gene-quantification.de/dorak-book-real-time-pcr-2006.pdf Haworth K., Putt W., Cattanach B., Breen M., Binns M., Lingaas F., Edwards Y.H. (2001). Canine homolog of the T-box transcription factor T; failure of the protein to bind to its DNA target leads to a short-tail phenotype. Mammalian Genome 12, 212-218 Koster Hubert (inventor). (1996, 20 Augustus). Sequenom, Inc., assignee. Using the sanger sequencing strategy and assembling the sequence information by analysis of the nested fragments obtained by base-specific chain termination via their different molecular masses. Patentnummer 5,547,835 Lee S.V., Bahaman A.R. (2012). Discriminatory Power of Agarose Gel Electrophoresis in DNA Fragments Analysis, Gel Electrophoresis: Principles and Basics, Dr. Sameh Magdeldin (Ed.), ISBN: 978-953-51-0458-2, InTech, DOI: 10.5772/36891. Moura E., Cirio M. (2004). Clinical and genetic aspect of X-linked ectodermal dysplasia in the dog – a review including three new spontaneous cases. Veretinary Dermatology 15, 269-277. Orthopedic Foundation for Animals (s.d.). Currently available DNA tests. Internetreferentie: http://www.offa.org/dna_alltest.html?test=Exercise+Induced+Collapse&breed&btnShow=Show (Laatst geraadpleegd op 26 maart 2015) 41 Orthopedic Foundation for Animals (s.d.). Statistics and data. Internetreferentie: http://www.offa.org/stats.html#breed (Laatst geraadpleegd op 26 maart 2015). Peelman L. (2014). Algemene en Moleculaire Genetica van de Huisdieren. Cursus Faculteit Diergeneeskunde, Gent, hs. 5, p. 44-50 Rasmussen H.B. (2012). Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of PCR-Amplified Fragments (PCR-RFLP) and Gel Electrophoresis - Valuable Tool for Genotyping and Genetic Fingerprinting, Gel Electrophoresis: Principles and Basics. Dr. Sameh Magdeldin (Ed.), ISBN: 978953-51-0458-2, InTech, DOI: 10.5772/37724. Ronaghi M., Uhlén M., Nyrén P. (1998). DNA Sequencing : A Sequencing Method Based on RealTime Pyrophosphate. Science 5375, 363-365. Schuit F.C. (2000). Medische biochemie: moleculaire benadering van de geneeskunde. Houten: Bohn Stafleu Van Longhum. Awano T., Johnson G.S., Wade C.M., Katz M.L., Johnson G.C., Taylor J.F., Perloski M., Biagi T., Baranowska I., Long S., March P.A., Olby N.J., Shelton G.D., Khan S., O’Brien D.P., Lindblad-Toh K., Coates J.R. (2009). Genome-wide association analysis reveals a SOD1 mutation in canine degenerative myelopathy that resembles amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences 106(8), 2794-2799. Trainor G.L. (1990). DNA sequencing, automation, and the human genome. Analytical Chemistry 62(5), 418-426. Yılmaz M., Ozic C., Gok I. (2012). Principles of Nucleic Acid Separation by Agarose Gel Electrophoresis, Gel Electrophoresis: Principles and Basics, Dr. Sameh Magdeldin (Ed.), ISBN: 978-953-51-0458-2, InTech, DOI: 10.5772/38654. Zeng R., Coates J.R., Johnson G.C., Hansen L., Awano T., Kolicheski A., Ivansson E., Perloski M., Lindblad-Toh K., O’Brien D.P., Guo J., Katz M.L., Johnson G.S. (2014). Breed Distribution of SOD1 Alleles Previously Associated with Canine Degenerative Myelopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine 28, 515-521. 42
