Groei micro-organismen materiaalsoort afhankelijk

Nederland ontwikkelt nieuwe bepalingsmethode voor groeipotentie
Groei micro-organismen
materiaalsoort afhankelijk
Al langer is bekend dat bepaalde materialen in contact
met drinkwater de groei van micro-organismen kunnen
bevorderen. In sommige gevallen bleek deze groei te
leiden tot klachten van consumenten over smaak en
troebelheid van het leidingwater. Nederland heeft nu
een werkwijze ontwikkeld om de groeipotentie van
materialen te bepalen. Uit eerste onderzoeken blijkt
bijvoorbeeld dat materialen als
aangroei kennen en
PVC-P
Tekst: D. van der Kooij,
Kiwa Water Research, Nieuwegein
rinkwater komt tijdens transport en distributie in aanraking met het inwendige oppervlak van reinwaterkelders en een
uitgestrekt netwerk van leidingen.
64 juni 2004 intech K&S
en
PVC-C
een lage
juist hoog.
Techniek
D
RVS
Aanvankelijk pasten we in Nederland
gietijzer toe voor transport- en distributieleidingen en vanaf omstreeks
1930 ook asbestcement. In 1955 is
de sector leidingen van ongeplastificeerd polyvinylchloride (PVC-U) gaan
gebruiken en sinds 1995 is dit het
meest toegepaste materiaal (zie figuur 1). Andere kunststoffen, zoals
polyethyleen en glasvezelversterkte
polyester zijn veel minder in gebruik
(< 5 %).
Versterkte aangroei
Dat bepaalde materialen, als zij in
contact komen met drinkwater, de
groei van micro-organismen kunnen
bevorderen door afgifte van afbreekbare verbindingen, is al bekend. In sommige gevallen leidde
dit tot klachten van consumenten
over smaak en troebelheid van het
leidingwater. Andere problemen
zijn:
• vermeerdering van bacteriën van
de coligroep in reinwaterreservoirs van hardhout (VS), op glijmiddelen voor buiskoppelingen en
op rubberen afsluiters;
• een toename van koloniegetallen
na het aanbrengen van een coating in een reinwaterkelder;
• groei van micro-organismen met
ziekteverwekkende eigenschappen (Legionella pneumophila, Mycobacterium, Pseudomonas aeriginosa) op kraanleertjes, rubberen
sluitringen in afsluiters en leidingen van kunststof.
De groei van micro-organismen kan
ook gepaard gaan met de aantasting
van het materiaal, bijvoorbeeld ringen van natuurrubber in buiskoppelingen.
Biofilmvorming
Distributie van drinkwater gebeurt in
ons land in de meeste voorzieningsgebieden zonder een restgehalte van
een desinfectiemiddel. Om vermeerdering van micro-organismen in het
distributiesysteem (nagroei) te beperken, streven de waterbedrijven
naar de productie van biologisch stabiel drinkwater. Dit drinkwater bevat
een zodanig laag gehalte aan afbreekbare verbindingen dat vermeerdering van micro-organismen hierin
slechts in zeer beperkte mate mogelijk is. De mate van biologische stabiliteit van drinkwater kan men beoordelen op basis van het gehalte gemakkelijk assimileerbare organische
koolstof (AOC) en de biofilmvormingssnelheid. Dosering van een desinfectiemiddel ter beperking van nagroei
zien wij in Nederland als ongewenst,
omdat dit leidt tot smaakbezwaren
en omdat het gepaard gaat met de
vorming van organochloorverbindingen met giftige eigenschappen. Willen we de biologische stabiliteit van
het drinkwater handhaven dan moeten we materialen toepassen die vrijwel geen afbreekbare stoffen afgeven. Voor de beoordeling van materialen op dit aspect zijn in Europa diverse methoden beschikbaar.
Testmethoden
Het Verenigd Koninkrijk (UK) beoordeelt al tientallen jaren de materialen
die in contact komen met drinkwater
op groeibevordering. In de huidige
werkwijze hanteert men daar het
zuurstofverbruik als maat voor de
groeibevorderende werking van een
materiaal. Stukjes van het te testen
materiaal legt men gedurende een
periode van 7 weken in drinkwater.
Tweemaal per week wordt het water
blatt W270. Na 3 maanden en na 6
maanden verzamelen de onderzoekers het slijm dat op het materiaal
aanwezig is en meten zij het slijmvolume. Een groot aantal materialen is
op deze wijze getest. Slijmvolumes
variëren van minder dan 0,1 ml (detectiegrens) tot meer dan 10 ml per
800 cm2. Materialen die meer dan
0,1 ml slijm produceren vindt men in
Duitsland ongeschikt voor toepassing in contact met leidingwater.
Adenosinetrifosfaat (ATP) is een energierijke verbinding die in alle levende
organismen aanwezig is. Een nanogram (ng) ATP/l komt overeen met 104
à 105 cellen/ml, afhankelijk van celgrootte en activiteit. De analyse berust
op de vorming van licht uit luciferine
onder invloed van het enzym luciferase in aanwezigheid van ATP. Per molecuul ATP komt één foton licht vrij. Een
fotometer kan deze lichtproductie
nauwkeurig meten. De bepaling duurt
enkele minuten en de detectiegrens in
water zonder concentratiestap is ongeveer 0,5 ng/l.
Biomassaproductiepotentie (BPP)
Ook Nederland heeft voor het bepalen van de groeipotentie van materialen een werkwijze ontwikkeld die de
concentratie van de biomassa bepaalt
via een analyse van adenosinetrifosfaat (ATP – zie kader). De hoeveelheid
actieve biomassa (het ATP-gehalte)
hangt af van de beschikbaarheid van
afbreekbare verbindingen. In figuur
2A is het ATP-gehalte van drinkwater
weergegeven na éénmalige toevoeging van 1 mg acetaat-C/l, gevolgd
door een groeiperiode -incubatievan het water bij 25 ºC. Na een snelle toename treedt een sterke afname
op. Na ongeveer 50 dagen komt het
ATP-gehalte in het water met toegevoegd acetaat vrijwel overeen met de
concentratie in het water zonder toevoeging. In aanwezigheid van zacht
PVC (PVC-P) blijft het ATP-gehalte van
het water constant om het materiaal
voortdurend afbreekbare stoffen
blijft afgeven.
De uitvoering van de BPP-test vindt
plaats door de incubatie van een bepaalde hoeveelheid (‘batch’) materiaal in biologisch stabiel drinkwater
bij 25 ºC. Met ringen van glas (negatieve controle) bepaalt men de invloed van het water op de biofilmvorming. Het materiaal PVC-P heeft
ververst en na 5, 6 en 7 weken meten de onderzoekers het zuurstofgehalte van het water vóór het verversen. Het verschil tussen het zuurstofgehalte in water in aanwezigheid van
glasplaatjes (controle) en het zuurstofgehalte in aanwezigheid van het
te onderzoeken materiaal is een
maat voor het zuurstofverbruik (Mean Dissolved Oxygen Difference,
MDOD) van het betreffende materiaal.
Als positieve controle gebruikt men
paraffinewas. Materialen met een
MDOD-waarde groter dan 2,3 mg/l
worden niet toegelaten. Van die materialen is gebleken dat onder de
testcondities een zichtbare mate van
groei van micro-organismen optreedt. De werkwijze is vastgelegd in
British Standard 6920 en de toepassing is wettelijk geregeld.
Duitsland past een werkwijze toe
waarmee men de hoeveelheid slijm
(biomassa) op het oppervlak van een
materiaal (platen van 20 x 20 cm)
kan meten na een langdurig contact
met stromend leidingwater. De werkwijze is vastgelegd in DVGW-Arbeits-
1000
3000
AC
Andere
2500
GIJ
Biomassa (ng
km (x100)
ST
50
25
blanco
+ acetaat
2000
PVC-P
ATP/cm2)
PE
Biofilm (pg
75
B
A
PVC-U
ATP/l)
100
1500
1000
750
500
glas
PVC-U
250
500
0
0
0
1955
1965
1975
1985
1995
0
25 50 75 100 125
tijd (dagen)
Figuur 1. Materialen van distributieleidingen (uitwendige diameter PE en PVC-U > 63 mm ). AC, (asbestcement); GIJ (gietijzer); ST (staal); PVC-U (hard PVC); PE (polyethyleen) en andere
materialen, waaronder glasvezelversterkte materialen, nodulair gietijzer en beton.
0
100 200 300 400
dagen
Figuur 2A. Invloed van eenmalige acetaatdosering en aanwezigheid van PVC-P op de concentratie van actieve biomassa in
leidingwater in de BPP-test. B, biofilmconcentraties op hard
PVC en glas bij incubatie in leidingwater.
intech K&S juni 2004 65
kenmerk
MDOD
opzet
(Brits)
W270 (Duits)
BPP
(NL)
statisch (batch)
continue* doorstroming
statisch (batch)
verversen
2 x per week
1 x in 5 uur
niet
temperatuur (ºC)
30
variabel
25
volume (liter)
1
100
0,6
oppervlak (cm2)
150
800
100
biomassa
zuurstof
slijm
ATP
negatieve controle
glas
glas
glas
positieve controle
paraffine
paraffine
PVC-P
testduur (weken)
7
26
16
*, continue doorstroming (20 liter/uur)
Tabel 1. Kenmerken van de testen voor de bepaling van de groeibevorderende werking van materialen in contact met leidingwater.
een hoge biomassaproductie. Dit gebruikt men om aan te tonen dat het
water niet groeibeperkend is voor de
materialen die men onderzoekt.
Monsters van de materialen komen
na 56, 84 en 112 dagen incubatie
uit het water om ze daarna in steriel
ATP-arm water te leggen. De onderzoekers maken de biomassa op het
materiaal los met ultrasone behandelingen. Vervolgens bepalen zij het
ATP-gehalte van de verkregen suspensie en men berekent de concentratie van de biomassa per oppervlakte-eenheid van het betreffende
materiaal. Verder meet men het ATPgehalte van het water waarin het
materiaal is geïncubeerd om het te
kunnen toerekenen aan het blootgestelde oppervlak. De definitie van de
biomassaproductiepotentie (BPP) van
een materiaal is de gemiddelde
waarde van de ATP-concentratie (pg
ATP/cm2) op het betreffende materiaal en in het water op de hierboven
genoemde dagen.
In figuur 2B is een voorbeeld te zien
van het verloop van de biofilmconcentratie op PVC-U en glas. Op dag 0
is geen biomassa op het materiaal
aanwezig, maar door een exponentiële groei stijgt de biomassaconcentratie op PVC-U binnen enkele dagen
naar een relatief hoog niveau. Bij
voortzetting van de groei daalt het
gehalte sterk. Kennelijk was alleen in
het begin van de test afbreekbare
stof aanwezig (op het materiaal). Na
twee maanden is er een niveau van
ongeveer 50 pg ATP/cm2 bereikt. Dat
niveau blijft ook na een veel langere
tijd gehandhaafd. Typische BPPwaarden (pg ATP/cm2) voor materialen zijn bijvoorbeeld circa 50 voor
PVC-U, 500 tot 3000 voor PE en circa
30.000 voor PVC-P en natuurrubber.
De BPP-methode is vastgelegd in de
66 juni 2004 intech K&S
Nederlandse voornorm NVN 1225. De
basiskenmerken van de genoemde
testen zijn samengevat in tabel 1.
Internationale harmonisatie
In de Europese richtlijn voor de kwaliteit van drinkwater (1998) staat dat
het gebruik van chemicaliën en materialen in contact met leidingwater
alleen mag als er regelgeving is. Die
regelgeving moet schadelijke effecten op de gezondheid van de consument vermijden. De activiteiten om
de regelgeving binnen de EU op dit
gebied te harmoniseren, worden in
het project European Acceptance
Scheme (EAS) gecoördineerd. Gestandaardiseerde testmethoden vormen
een onderdeel van deze aanpak.
Sinds 1990 zijn de EU-landen bezig
met een Europese werkwijze voor
het bepalen van de groeibevorderende eigenschappen van materialen in
contact met drinkwater. In de periode maart 2001 tot maart 2003 vond
een internationaal onderzoek plaats,
het zogenoemde Construction Products in Contact with Drinking Water
(CPDW) project. Workpackage 1 (Microbial Growth) van dit project betrof
onderzoek gericht op de harmonisatie van de groeipotentietest. De volgende instituten waren betrokken bij
de uitvoering van WP1: Thames Water Utilities (Water Quality Laboratory), Centre de Recherche et de Con-
trole des Eaux de Paris (Crecep),
Österreichisches Forschungsinstitut
für Chemie und Technik (Ofi), Technologie Zentrum für Wasser (TZW),
Technische Universiteit van Denemarken (DTU) en Kiwa Water Research. Het onderzoek kreeg subsidie van de EU en in Nederland tevens
van het ministerie van Vrom, Vewin,
Uneto-VNI en FKS.
Opzet onderzoek
Voordat de uitvoering van het project
begon, besloten vertegenwoordigers
van de nationale overheden dat de
geharmoniseerde methode zou berusten op toepassing van de ATP-bepaling als biomassaparameter. Het
onderzoek omvatte de volgende
onderdelen:
• introductie en harmonisatie van
de ATP-bepaling;
• definiëring van kwaliteit van het
testwater en effect van enten met
micro-organismen;
• statische of dynamische testcondities;
• bepaling van de reproduceerbaarheid van het geharmoniseerde
testprotocol;
• vergelijking van het testprotocol
met bestaande testen en met experimentele opstellingen.
Om de ATP-bepaling bij de deelnemers te introduceren, organiseerde
Kiwa een workshop. Vervolgens ontvingen alle deelnemers aan het
onderzoek watermonsters met verschillende gehaltes biomassa. Bij deze testen bleek dat in het algemeen
een goede overeenstemming bestond tussen de meetresultaten. In
enkele gevallen rapporteerden de
deelnemers echter sterk afwijkende
resultaten. De oorzaak van deze afwijkingen ontstond door verschillen
in de procedure voor het maken van
ijklijnen, namelijk in buffer, in leidingwater of in demiwater. De aanwezigheid van zouten, in het bijzonder calcium, verlaagt de opbrengst
van de meting. Ook het werken met
onvoldoende geautomatiseerde apparatuur bleek een foutenbron. De
conclusie luidt dat men de ijking van
de ATP-bepaling moet uitvoeren in het
testwater en dat men aandacht moet
besteden aan verdere standaardisatie
van de ATP-bepaling.
Legionella pneumophila is de veroorzaker van de veteranenziekte, een ernstige vorm
van longontsteking, die een gevolg is van inademing van lucht met druppeltjes
besmet water (aërosol).
Mycobacterium avium is verwant aan de veroorzaker van tuberculose en veroorzaakt
eveneens longontsteking, met name bij Aids-patiënten.
Pseudomonas aeruginosa is een bacterie die wondinfecties kan veroorzaken en ook
longontsteking. Genoemde bacterietypen kunnen zich vermeerderen in slijmlaagjes
(‘biofilm’) op oppervlakken in contact met water.
1000
A
3000
B
SilR
glas
2500
Biofilm (pg
ATP/cm2)
750
2000
500
1500
Figuur 3.
Biofilmvorming
op glas, PVC-C en
siliconenrubber
(SilR) in de biofilmmonitor bij
continue doorstroming met
drinkwater.
1000
250
500
glas
PVC-C
0
0
50
100
150
0
0
dagen
100
150
dagen
Uitgangspunt en vereisten
Als uitgangspunt voor het testwater
moeten de onderzoekers drinkwater
gebruiken dat voldoet aan de wettelijke kwaliteitseisen. Andere, aanvullende eisen zijn de afwezigheid van
een desinfectiemiddel, voldoende
anorganische nutriënten (P, N), zonodig door toevoeging, en biologische
stabiliteit. Door middel van onderzoek selecteerden de deelnemers
een geschikt watertype. Toevoeging
van ent van rivierwater met micro-organismen bleek geen duidelijk aantoonbaar voordeel op te leveren,
maar men nam ook geen nadelige effecten waar. Daarom besloot men om
een dergelijke toevoeging te handhaven. Dit bevordert namelijk dat de afbreekbare componenten die in de
materialen aanwezig zijn onder de
testcondities voldoende snel afbreken.
Het bezwaar tegen de uitvoering van
de BPP-test zonder verversen van het
water is dat deze opzet niet overeenstemt met de praktijk. Het effect van
vier verversingscenario’s (geen; één
keer per twee weken; één keer per
week; twee keer per week) is getest.
Verversen van het water bleek bij
sommige materialen een duidelijke,
maar relatief geringe invloed te hebben op het testresultaat. Hoge BPPwaarden werden hoger en lagere BPPwaarden werden lager. Deze verschillen zijn toegeschreven aan gebrek
aan zuurstof, ophoping van groeiremmende stoffen of ophoping van
groeibevorderende stoffen. Uiteindelijk besloot men om een verversingsfrequentie van één keer per week te
hanteren.
Herhaalbaarheid van de
50
rectie van de invloed van het testwater. Uit tabel 2 blijkt dat de BPPwaarden van de geteste materialen
varieerden van laag (bij materialen
als RVS en PVC-C) tot hoog (bij PVC-P).
De variatiecoëfficiënt (VCR) van de
metingen is nog te hoog, maar als
eerste resultaat veelbelovend. Uitvoering van de test bij 30 ºC door
een drietal laboratoria gaf VCRwaarden van 20 tot 34 %.
Uiteindelijk is een vergelijking gemaakt van de resultaten van de aangepaste BPP-test (één keer per week
verversen) met de resultaten die uit
de Britse MDOD-test en de Duitse
W270-test komen. Dit leverde alleen
een verband op bij de MDOD-test. Uit
een vergelijking met de BPP-test zonder verversen, bleek dat de BPPwaarden van materialen zoals glas
en RVS met verversen hoger waren
dan zonder verversen. Ook bij materialen die een relatief sterke groeibevordering veroorzaken (nitrilrubber en PVC-P) waren de BPP-waarden
met verversen hoger dan zonder verversen. Vergelijkend onderzoek met
Tabel 2.
Gemiddelde
waarden van de
biomassaproductiepotentie (BPP)
van geselecteerde materialen in
een zestal laboratoria.
een experimentele leidinginstallatie,
uitgevoerd door één van de deelnemers aan het onderzoek, leverde
geen duidelijke resultaten op, vermoedelijk als gevolg van groeibeperking door onvoldoende doorstroming. Resultaten van onderzoek met
de Kiwa-biofilmmonitor, waarbij de
materialen zich bevinden in continue
stomend (0,2 m/s) water, bevestigen
de waarnemingen met de BPP-test.
(zie figuur 3). PVC-C had geen meetbare invloed op de biofilmvorming, terwijl siliconenrubber de biofilmvorming versterkte.
Op grond van de verkregen resultaten concluderen de uitvoerders van
het onderzoek (Workpackage 1) dat
de BPP-test geschikt is als basis voor
een te standaardiseren testmethode.
Standaardisatie van de methode
vergt echter nader onderzoek, onder
meer gericht op de ATP-analyse en de
samenstelling van het testwater. Ook
de opdrachtgevers (Regulators)
onderschrijven deze conclusie. Uit alle informatie in dit artikel blijkt dat
de groeibevordering (BPP-waarde) van
materialen in contact met leidingwater onderling sterk verschillen. Het
definiëren van goed onderbouwde
criteria waarop men materialen kan
goedkeuren of afkeuren (‘pass-fail’
criteria) op basis van de BPP-waarde is
de volgende stap bij de realisatie van
het European Acceptance Scheme.
materiaal
gemiddelde BPPwaarde
(pg ATP/cm2)
VCR (%)
glas
0*
nvt**
roestvast staal
64
107
PVC-C
47
54
Siliconenrubber
450
34
HD-PE
316
46
nitrilrubber
7170
107
PVC-P
21090
68
BPP-test
De aangepaste BPP-test was de basis
voor een onderzoek naar reproduceerbaarheid. Zes laboratoria testten
hiervoor zes verschillende materialen
en glas. De BPP-waarde in aanwezigheid van glas gebruikt men ter cor-
*
BPP-waarde
van glas en water is gebruikt voor de correctie
van de invloed van het testwater
** nvt, niet van toepassing
intech K&S juni 2004 67