DOCBeheersing van bacterieziek in aardappelpootgoed (27/06/2016)

Beheersing van bacterieziek in aardappelpootgoed
Fonds voor Landbouw en Visserij
Fonds voor Landbouw en Visserij
Beheersing van bacterieziek in aardappelpootgoed
Projectverslag
1/4/2014 - 31/3/2015
Plant – Gewasbescherming
Het project is een draagvlak voor de keuring van pootgoed in Vlaanderen en een steunpunt voor een
duurzame pootgoedsector in Vlaanderen door wetenschappelijke en technische antwoorden te
formuleren op de bacterieziek problematiek. Het onderzoek is bij uitbreiding waardevol voor de hele
aardappelsector.
Het project impliceert diagnostisch onderzoek van bacterieziek voor de veldkeuring van pootgoed en
detectie van Dickeya en Pectobacterium in ingevoerde moederpartijen en kwekersmateriaal prebasispootgoed uit Vlaanderen met aanvullende ontwikkeling van moleculaire toetsen.
Het bestaat uit twee werkpakketten:

Diagnostisch onderzoek en detectie van pectinolytische enterobacteriën voor certificering van
pootgoed in Vlaanderen en uitvoer van pootgoed naar derde landen.
In dit projectonderdeel wordt de eerstelijnsdiagnostiek verder uitgevoerd. Verbreding van de
dienstverlening wordt voorzien door de uitbouw in Inagro van een diagnosedienst voor
bacteriële aantasting van aardappel(pootgoed). De labonderzoeken van pootgoedpartijen die
worden opgelegd door het keuringsreglement, die door de pootgoedsector worden
aangevraagd en die ten behoeve zijn van de uitvoer van pootgoed, zijn ook in dit pakket
opgenomen. Het is evident dat bestaande beproefde analysemethoden verder worden
toegepast en dat nieuwe ontwikkelingen in identificatie en detectie worden aangebracht,
i.h.b. voor de nieuw vastgestelde varianten van Pectobacterium. Genetische typering is het
draagvlak voor de ontwikkeling van nieuwe tools voor het opsporen van deze varianten in
pootgoed.

De impact van Pectobacterium in pootgoed.
In dit projectonderdeel wordt dieper ingegaan op de draagwijdte van de nieuwe
Pectobacterium varianten die in het pootgoed uit Vlaanderen werden vastgesteld. Door het
opstellen van virulentieprofielen wordt de schadelijkheid voor aardappel en andere gewassen
getaxeerd. Het is ook aangewezen om aan te tonen welke varianten ontegensprekelijk
zwartbenigheid veroorzaken vanuit de poter, m.a.w. welke variant te duchten is en welke
minder of niet. Aanvullend hierop wordt de expressie van aantasting nagegaan bij coexistentie van verschillende bacteriële rotters op de poter, al dan niet samen met
Colletotrichum coccodes.
2
Werkpakket 1. Diagnostisch onderzoek en detectie van pectinolytische enterobacteriën voor de
certificering van pootgoed in Vlaanderen en uitvoer van pootgoed naar derde landen.
1.1.
Diagnostisch onderzoek
De tijdige en correcte herkenning van bacteriezieke pootgoedplanten is een kritieke component van
de visuele inspectie van de vermeerderingspercelen door de keurmeester. Een pootgoedplant met
verwelkende en/of zwartbenige stengel(s) als bacterieziek afpunten heeft een aanzienlijke uitwerking
op de klasse. Toch is niet elke aardappelplant met zwarte benen bacterieziek en een verwelkende
plant zonder zwarte benen kan toch door bacterie aangestoken zijn. Daarom is voor de
perceelskeuring een ondersteunende diagnosedienst ingericht. Hierin wordt de oorzaak van
aangetaste pootgoedplanten vastgesteld. De monsters worden aangebracht door de keurmeesters of
door de pootgoedtelers. De analyse begint met uitkweek van de ziekmaker op voedingsmedium
waarna de bacterie of schimmel provisoir wordt geïdentificeerd. De resultaten worden aan de
keurmeesters bezorgd die er dan hun bevindingen kunnen aan aftoetsen.
Er werden 63 monsters van de vermeerderingspercelen 2014 geanalyseerd (bijlage 1). De resultaten
zijn samengevat in figuur 1.
Figuur 1. Diagnostisch onderzoek van pootgoed (2008-2014) voor de keuring van de
vermeerderingspercelen.
In nagenoeg 60% van de monsters van de vermeerderingspercelen 2014 werd bacterieziek bevestigd.
In de overige monsters werd de aantasting veroorzaakt door schimmels (Fusarium, Colletotrichum,
Rhizoctonia). De bacterieculturen werden tentatief geïdentificeerd als Pectobacterium en Dickeya met
een generieke PCR. Van de bacteriezieke monsters was ~20% door een variant van Dickeya aangetast
en ~80% door een variant van Pectobacterium.
Het diagnostisch onderzoek van pootgoed voor de keuring van de vermeerderingspercelen werd in
2008 structureel aangevat. Sinds dan zijn de aantastingen door Dickeya zowat gehalveerd, ondermeer
door de aangescherpte keuringsnorm voor pootgoed in Vlaanderen en minder besmetting in de
moederpartijen door de valorisatie van resultaten van labtoetsen in de keuring in Nederland. De
aantastingen door Pectobacterium zijn echter behoorlijk toegenomen. Er wordt in het diagnostisch
onderzoek nu meer op deze bacteriesoort getoetst dan in het verleden, vooral dan in associatie met
3
schimmelaantasting (Fusarium, Colletotrichum). De toename kan ook te verklaren zijn door
(ondermeer) bevorderende weerscondities, nieuwe varianten die beter overleven in en op de poter,
die meer versmeren of die zich beter in de plant prolifereren. De toename van Pectobacterium in
pootgoed heeft in Nederland een scherper toezicht op de nieuwe varianten veroorzaakt zodat een
verbetering van de gezondheid van de ingevoerde moederpartijen kan worden verwacht. Het is echter
duidelijk dat pootgoedteelt zonder bacterie de facto onwerkelijk is.
De bacterieculturen uit het diagnostisch onderzoek werden nader benoemd in taxon PCR. Er werden 4
Pectobacterium varianten en 2 Dickeya varianten geïdentificeerd in pootgoed van Vlaanderen: P.
atrosepticum, P. wasabiae, P. carotovorum ssp. carotovorum, P. carotovorum ssp. brasiliense , D.
dianthicola en D. solani (figuur 2).
Figuur 2. Identificatie van Dickeya en Pectobacterium varianten uit het diagnostisch onderzoek van
pootgoed.
Zowat 4/5 van de bacteriële aantastingen werden door Pectobacterium veroorzaakt. P.atrosepticum,
oorzaak van de klassieke zwartbenigheid, was ook in 2014 veruit de belangrijkste bacteriële ziekmaker
van pootgoed in Vlaanderen. Dat is opmerkelijk aangezien deze bacterie nog amper in Nederlands
pootgoed wordt vastgesteld. P.atrosepticum gedijt vooral in wat koeler weer. De eerste helft van het
teeltseizoen was echter warmer dan gemiddeld. Bijgevolg zou er nogal wat besmetting in de
moederpartijen aanwezig geweest zijn. De analyse toont ook aan dat P. carotovorum ssp. brasiliense
zich in het pootgoed heeft geïnstalleerd. Voor de toekomst lijkt deze bacterie wel het belangrijkste
knelpunt te worden. De afname van P.wasabiae en varianten van P.c. ssp. carotovorum wijst op weinig
bacterieziek in de tweede helft van het teeltseizoen. Zowat 1/5 van de bacteriële aantastingen werden
door Dickeya veroorzaakt. Dickeya solani is echter niet de belangrijkste bacteriële agressor in
pootgoed geworden. De strenge keuringsnormen hebben de bacterie sterk terug gedrongen. D.solani
en D.dianthicola werden nagenoeg in gelijke mate in de monsters vastgesteld en het
keuringsreglement blijft best opgaan voor beide Dickeya varianten. De analyse over de jaren toont aan
dat de diversiteit van enterobacteriële ziekmakers in pootgoed van Vlaanderen aanzienlijk is. Daarin
wordt weinig verandering verwacht. Aangezien elke variant nuances brengt in de
pootgoedvermeerdering is diagnostisch onderzoek het meest betrouwbare instrument om
bacterieziek te identificeren.
4
1.2.
Detectie.
Latente infectie van Dickeya en Pectobacterium werd opgespoord in pootgoed van de productie 2014:
- 7 monsters van partijen klasse E voor nacontrole Dickeya volgens het keuringsreglement Vlaanderen.
- 91 monsters vrijwillige controle van moederpartijen voor eigen vermeerdering, vnl. de partijen van
telersnummer 49030.
- 115 monsters van ingevoerde moederpartijen en 29 monsters van partijen prebasis pootgoed
(families) die voor vermeerdering als basispootgoed werden aangemeld.
De analyses werden uitgevoerd op de naveleinden van 100 of 200 poters. Er worden 10 testen
uitgevoerd op deelmonsters van 10 of 20 poters. Alleen levensvatbare bacteriecellen worden
aangetoond omdat de bacteriën eerst gedurende 72 uur micro-aërofiel worden aangekweekt in
pectaatmedium. Een generieke PCR voor Dickeya en een taxon-specifieke PCR voor de belangrijkste
Pectobacterium varianten, i.c. Pectobacterium carotovorum ssp. brasiliense en Pectobacterium
atrosepticum, werden uitgevoerd. In het diagnostisch onderzoek waren deze varianten oorzaak van ~
80% van de bacteriële aantastingen. De resultaten zijn opgenomen in bijlage 2A (verplichte en
vrijwillige partijkeuring) en in bijlage 2B (ingevoerde moederpartijen en aangemelde families).
Doorgaans werden meerdere varianten in een partij poters vastgesteld (figuur 3). In 20/48 (41.7%)
partijen werden zowel Dickeya, P.atrosepticum en P.c. ssp. brasiliense aangetoond. Opmerkelijk is ook
dat noch Dickeya, noch Pectobacterium atrosepticum als enige ziekmaker aanwezig was. P.c. ssp.
brasiliense werd daarentegen in 40/48 (83.3%) partijen gedetecteerd.
Figuur 3. Aanwezigheid van verschillende enterobacteriële rotters in monsters van 48 moederpartijen
pootgoed
De aanwezigheid van latent bacterieziek in moederpartijen voor eigen vermeerdering werd
geanalyseerd in december 2014 en in maart 2015. De gemiddelde scores van positieve resultaten op
10 testen zijn opgenomen in onderstaande tabel. De cijfers wijzen op een scherpe afname van
bacterieziek tijdens frigobewaring.
5
De resultaten van bepalingen van een monster van 100 (10x10) of van 200 (10x20) knollen van
eenzelfde partij poters zijn vermeld in volgende tabel. De cijfers voor de monsters van 200 knollen zijn
weliswaar hoger maar de verschillen zijn bescheiden. Een monster van 100 knollen geeft voldoende
betrouwbare analyseresultaten.
Het grootste risico voor insleep van enterobacteriële rotters (figuur 4) zijn moederpartijen uit
Luxemburg. In 6/11 (54.5%) moederpartijen werd latent bacterieziek vastgesteld. Maar ook in
Nederlandse moederpartijen werd behoorlijk wat latent bacterieziek vastgesteld (16/83 partijen of
19.3%), wat toch verwonderlijk is gelet op de strengere keuringsnormen en de NAK nacontrole. Het is
ook kwalijk dat in 8/29 (27.6%) partijen prebasispootgoed (families) ook latent bacterieziek werd
aangetoond. De occasionele aanwezigheid van deze organismen in pre-basis materiaal toont aan dat
elke generatie veldvermeerdering besmettingsrisico inhoudt.
.
Figuur 4. Vaststelling van latent bacterieziek (Dickeya/Pectobacterium) in 115 ingevoerde
moederpartijen en in 29 partijen prebasispootgoed (families) voor de vermeerdering in Vlaanderen in
2015.
Diepere analyse van de moederpartijen uit Nederland (figuur 5) toonde aan dat besmetting vooral
door P.c. ssp. brasiliense wordt veroorzaakt. Dezelfde vaststelling voor de besmetting in de families
(figuur 6).
6
Figuur 5. Ventilatie van latent Dickeya/Pectobacterium in moederpartijen pootgoed uit Nederland.
Figuur 6. Ventilatie van latent Dickeya/Pectobacterium in families.
Het onderzoek over de moleculaire identificatie en detectie van deze bacteriën heeft ook nieuwe
methodieken voort gebracht. Taxon-specifieke TaqMan real-time PCR werd ontwikkeld voor de
virulente variant P. carotovorum ssp. brasiliense op basis van sequentieverschillen in de
virulentiegenen pelY en dspE. De specificiteit is geen 100%, d.w.z. dat occasioneel ook P. carotovorum
kan worden opgepikt. Het is maar de vraag of voor deze genetische entiteit een absolute specificiteit
haalbaar is. De methodiek werd op 92 praktijkmonsters in samenwerking met NAK gevalideerd zoals in
onderstaande tabel samengevat.
NAK
1
0
1
47
4
0
5
36
ILVO
Er is overeenkomst in 83/92 (90.3%) van de analyseresultaten. De afwijkingen zijn zowel NAK+/ILVOals NAK-/ILVO+.
7
Werkpakket 2. De impact van Pectobacterium in pootgoed
In dit projectonderdeel wordt dieper ingegaan op de impact van de ‘nieuwe’ Pectobacterium varianten
in de pootgoedteelt. Isolaten van alle varianten van Pectobacterium uit pootgoed werden in een
veldproef .
1. Infectiviteit van Pectobacterium carotovorum varianten, i.h.b. van P.c. ssp. brasiliensis, vanuit besmet
pootgoed.
Uitvoering
15 varianten van Pectobacterium:
Besmetting van de poters
Telkens 25 poters van het ras Fontane werden in 2 liter celsuspensie van de Pectobacterium variant
ondergedompeld en door vacuüminfiltratie (20 minuten in positie low : ~100 mbar) besmet.
Van elke bacteriecultuur werd een celsuspensie in pelletbuffer aangemaakt met OD600 = 1. Deze
celsuspensie werd 1/5000 verdund in demiwater. Behandeling = 20 ml van de 1/5000 verdunning
toegevoegd aan 2 liter demiwater. De celconcentratie is dan ongeveer 2x106 per liter.
De proef werd aangelegd op P96. De 25 poters werden manueel in voorgetrokken ruggen geplant.
Plantafstand = 50 cm. Tussen elk object werd een rij met 10 negatieve controles geplant.
Poters geplant op 23/05.
Waarnemingen (figuur 7)
Registraties 8 en 14 weken na planten van :
- aantal planten
- aantal stengels
- aantal bacteriezieke stengels. Symptomen: verwelking, stengelnecrose, stengelnatrot.
Na de laatste registratie werd een chemische loofvernietiging uitgevoerd en werden 80 uiterlijk
gezonde knollen per object verzameld om latente infectie van bacteriële rotters in het naveleinde op
te sporen. Er werden 20 taxon PCR testen uitgevoerd per object (4 gepoolde knollen).
8
Figuur 7. Virulentie van Pectobacterium varianten in aardappelstengels na inoculatie van de poter.
Ventilatie van de waarnemingen (tabel hieronder) toont aan dat alle varianten van Pectobacterium in
meer of mindere mate bacterieziek veroorzaakten in aardappelstengels vanuit een besmette poter. P.
atrosepticum was de meest agressieve variant wat zich vertaalt in zowel het relatief aantal
bacteriezieke planten als het relatief aantal bacteriezieke stengels. Grote verschillen in virulentie
werden waargenomen in P.c. ssp. brasiliense. De isolaten uit paprika (Pcb428) en tomaat (Pcb1392)
veroorzaakten beduidend minder bacterieziek uit de poter dan hun soortgenoten uit aardappel.
Isolaat Pcb1390 uit Dieffenbachia is daarentegen even schadelijk als de isolaten uit aardappel. Isolaten
geïdentificeerd als P.carotovorum (Pc1757 Pc+ / Pcc-) en P.c. ssp. carotovorum (Pcc1816 Pc+ / Pcc+)
brachten ook sterk bacterieziek in de stengels, net zoals isolaat P390 uit Zantedeschia. Bacterieziek
door P.wasabiae werd niet zo doelmatig langs de poter overgezet. Na 14 weken werden bacteriezieke
stengels ook in de niet geïnoculeerde controleplanten waargenomen.
Latent bacterieziek werd gescoord in 80 uiterlijk gezonde knollen. De cijfers (+ resultaten op 20
testen voor Pectobacterium taxon PCR) zijn opgenomen in figuur 8.
9
Figuur 8. PCR analyse van uiterlijk gezonde knollen uit de 15 Pectobacterium objecten en de controle
objecten.
In elk object werden latente infecties van Pectobacterium vastgesteld in het stolooneind van nieuw
gevormde knollen. Voor alle varianten zijn er aanwijzingen dat ze ook in de nieuw gevormde knollen
aanwezig zijn maar zo nu en dan werden in de knollen ook andere Pectobacterium varianten
gedetecteerd dan degene waarmee de poters werden geïnoculeerd. De vermelding Pectobacterium
in het keuringsreglement is te verkiezen boven specifieke varianten, ook al zijn deze varianten
beduidend agressiever. Als de afgelopen jaren iets hebben geleerd over de enterobacteriële rotters
dan is het wel de onvoorspelbaarheid hoe ze zich gedragen. Een zwak virulente variant blijkt dan toch
sterke aantasting te veroorzaken en een sterk virulente variant blijkt afgezwakt.
10