TENTAMEN BIOCHEMIE

TENTAMEN BIOCHEMIE (8S135) Prof. Dr. Ir. L. Brunsveld
31-10-2012 14:00 – 17:00 (totaal 100 punten + 5 bonuspunten)
6 opgaven in totaal + 1 bonusvraag! (aangegeven tijd is indicatie)
Gebruik geen rode pen!
1
(~30 minuten; 26 punten)
In rood zijn de antwoorden aangegeven. N.B. voor sommige vragen zijn ook
andere antwoorden mogelijk / goed.
De onderstaande aminozuursequentie maakt deel uit van een eiwit dat een rol
speelt bij bezuinigingen op onderwijs en onderzoek.
a.
Geef de 1-lettercode van deze 9 aminozuren in de corresponderende
volgorde. (4P)
VVDENPVDA
b.
Bovenstaande aminozuursequentie is onder deel van een loop/ beta-turn
in het eiwit. Welk aminozuur uit bovenstaand peptide speelt een cruciale
rol in de vorming van de beta-turn en welk aminozuur (die er nu niet in zit)
had u eigenlijk ook nog verwacht te vinden in de sequentie. Legt u uw
antwoord uit. (4P)
De ringstructuur van proline maakt het aminozuur conformationeel minder
flexibel en verhindert waterstofbrugvorming zoals noodzakelijk voor alfahelices en beta-sheets. De specifieke conformatie van proline faciliteert de
draaiing van de hoofdketen in de loop. Glycine is het kleinste en meest
flexibele aminozuur, deze eigenschap faciliteert in grote mate het maken
van de compacte turn en voorkomt afstoting van de zijstaarten van
aminozuren.
c.
Teken de moleculaire structuur van een beta-turn bestaande uit minimaal
4 aminozuren en geeft u daarbij het verloop van de waterstofbruggen aan.
(4P)
d.
U wilt onderzoeken of bovenstaand eiwit voorkomt in een bepaald celtype.
Hiervoor past u de techniek van Western-Blotting toe. Legt u uit, hoe deze
techniek werkt (waarbij u ervan uit mag gaan dat u de eiwitten al met
SDS-PAGE gescheiden hebt). Hoe zorgt u ervoor dat u specifiek alleen
uw eiwit aankleurt (maw, hoe detecteert u specifiek bovenstaand eiwit en
hoe komt u aan het reagens hiervoor)? (4P)
Na het scheiden van de eiwitten op grootte dmv SDS-PAGE worden de
eiwitten eerst uit de gel overgedragen op een blotpapier (zodat de eiwitten
beschikbaar geraken voor het blotten). Vervolgens wordt dit papier met
eiwitten erop geïncubeerd met een antilichaam dat specifiek is / selectief
bindt aan het eiwit van interesse. Na incubatie en wassen wordt het
specifiek gebonden bandje / eiwit gevisualiseerd, bijv. doordat het
antilichaam gemerkt / gelabeld was een fluorescente groep of
radioactiviteit, of middels een sandwich assay met een gelabeld
antilichaam.
e.
U bent nog steeds gefascineerd door bovenstaand eiwit en u wilt dit eiwit
zuiver in handen krijgen. Het blijkt dat het eiwit veel repeterende
eenheden van bovenstaande aminozuursequentie bevat. Beschrijf hoe u
middels kolomchromatografie uw eiwit zou zuiveren. Gaat u hierbij in op
het type kolomchromatografie dat u hiervoor selecteert, verklaart u kort
hoe de techniek functioneert en verklaar waarom u de door u gekozen
type kolomchromatografie zou gebruiken. (4P)
De reperterende eeheid bevat als geladen aminozuur 3 keer een zuur
aminozuur en geen basisch aminozuur. Als dit motief vaak in het eiwit
terugkomt, betekent dit dat het eiwit dus sterk negatief geladen zal zijn bij
physiologische pH. Hiervan kan door middel van ion-exchange
chromatografie gebruikt worden gemaakt, meer specifiek anion exchange
chromatografie. Hierbij wordt het eiwitmengsel over een positief geladen
kolommateriaal geelueerd. Het negatief geladen doeleiwit zal aan het
kolommateriaal binden en langzamer elueren als de andere eiwitten.
(eventueel vervolgens het eiwit van de kolom af elueren met sterk
ionische buffer).
Beschouw nogmaals de bovenstaande aminozuursequentie:
1f.
U wilt dit peptide enzymatisch knippen/hydrolyseren bij de covalente
amide binding aangegeven door de pijl. U heeft hiervoor het DNA van het
enzym trypsine tot uw beschikking, welke u genetisch kan veranderen.
Welke verandering (aminozuur puntmutatie) voert u door en waar bevindt
zich deze verandering in het enzym, zodat het enzym de
aminozuursequentie van opgave 1 knipt op de aangeven plek. Legt u uw
antwoord uit (4P).
Trypsine knipt normaal gesproken na een positief geladen aminozuur
(lysine of arginine), omdat trypsine in zijn S1 selectiviteitspocket een
negatief geladen aminozuur heeft welke coördineert met de positief
geladen zijstaart van K of R. We willen nu knippen na een negatief
geladen aminozuur, dus moeten we de S1 pocket zo aanpassen dat
daarin een positief geladen aminozuur (bijv. K) voorkomt welke kan
coördineren aan de E en daardoor het enzym laten knippen na de E.
1g.
Verwacht dat uw nieuwe enzym volledige selectiviteit vertoont voor
knippen in de aminozuursequentie alleen op de plek van de pijl? Legt u
uw antwoord uit. (2P)
Waarschijnlijk zal het enzym ook een bepaalde reactiviteit vertonen na
aspartaat (D), omdat deze ook een carboxylaat als zijstaart functionaliteit
heeft. Deze is echter korter en zal dus iets minder of beter een ionische
interactie aan kunnen gaan met de S1 pocket, afhankelijk daarvan hoe
diep deze is.
2
(~10 minuten; 14 punten)
Nu beschouwen we het enzym trypsine in zijn algemeenheid (dus zonder
verdere betrekking op de aminozuursequentie van opgave 1).
a.
De actieve site van het enzym trypsine bestaat uit een zogenaamde
katalytische triade. Beschouw een punt-mutatie in de katalytische triade
van trypsine waarbij de aspartaat van de katalytische triade is gemuteerd
tot een alanine. Hoe verwacht u dat deze mutatie de maximale
omzettingssnelheid (Vmax) van trypsine zal beïnvloeden? Verklaar uw
antwoord met behulp van een of meerdere tekeningen van de
peptidehydrolyse gekatalyseerd door de (gemuteerde) triade. (8P)
De katalytische triade bestaat uit een aspartaat, histidine en serine,
waarbij de alcohol groep van de serine de uiteindelijke nucleofiel is in de
reactie. Deze wordt geactiveerd door polarisatie van de hydroxyl groep
middels de histidine. De aspartaat helpt bij het correct positioneren van de
histidine en (meest belangrijk) maakt de histidine een betere proton
acceptor door waterstofbrug vorming en elektrostatische effecten.
Mutatie van de aspartaat tot een alanine, zal dus de activatie /
nucleophiliciteit van de serine verlagen. Hierdoor is de serine minder
reactief en wordt de kcat verlaagd en daarmee de Vmax (bij gelijk
blijvende enzymconcentratie).
b.
c.
Dezelfde effecten op de kinetiek van het enzym als van bovenstaande
puntmutatie kunnen ook verkregen worden met behulp van een trypsine
inhibitor. Wat voor type inhibitor leidt tot dezelfde effecten op Vmax als
bovenstaande punt mutatie. Legt u kort uit. (3P)
Mutatie verandert niet de affiniteit voor substraat (KM blijft gelijk), maar
verlaagd de Vmax. Hetzelfde effect kan veroorzaakt worden door een nietcompetitieve inhibitor.
Teken een conceptuele dubbel-reciprocale
plot (Lineweaver-Burk plot) voor het enzym
trypsine in af- en aanwezigheid van deze
inhibitor? Geef duidelijk aan wat de assen
representeren en welke veranderingen er
op treden door de inhibitor. (3P)
3
(~20 minuten; 15 punten + 5 punten bonus)
Membranen spelen een belangrijke rol in cellen en zijn opgebouwd uit specifieke
lipiden en eiwitten.
a.
De lipiden in membranen ondergaan snelle laterale diffusie, maar
langzame transverse diffusie (flip-flop). Lipiden die aan een eiwit
vastzitten, zogenaamde GPI (glycosylphosphatidylinositol) ankers,
ondergaan echter helemaal geen transverse diffusie. Legt u dit uit. (4P)
Om transverse diffusie te ondergaan moet het gehele lipide door het
membraan heen, inclusief polaire kopgroep. Dit is energetisch ongunstig,
omdat de polaire kopgroep, welke coördineert aan watermoleculen, de
watermoleculen “los moet laten” moet desolvateren. Dit leidt tot een hoge
energiebarrière. De additie van een zeer grote polaire kopgroep, zoals in
het geval van de GPI, introduceert een additionele nog veel grotere
energie barriere, die het onmogelijk maakt om transverse diffusie te
ondergaan.
b.
Een ionkanaaleiwit vergemakkelijkt het transport van ionen over een
membraan, maar doet dit alleen voor specifieke ionen. Leg uit hoe een
ionkanaal er schematisch uitziet (maak eventueel gebruik van een
tekening) en verklaar (op moleculair niveau) hoe deze het transport van
ionen over een membraan vergemakkelijkt, terwijl er toch geen water mee
door het membraan gaat. Verklaar tevens hoe een ionkanaal selectiviteit
voor een specifiek ion, bijvoorbeeld K+, bewerkstelligd. (6P)
Een ionkanaal zit volledig door een
membraan heen en maakt daarbij contact met
zowel de binnen- als de buitenkant van het
compartiment. Het ionkanaal heeft 1. een
watertunnel waarmee de dikte van het
membraan wordt verkleind en 2.een dunner
kanaal waarin coördinerende functionele
groepen (hetero-atomen) de solvaterende rol
van het water overnemen en de ionen op
kunnen nemen en transporteren over het
membraan. De selectiviteit wordt daarbij bewerkstelligd door de exacte
positionering van deze hetero-atomen in relatie tot de ionische radius van
het cation (in dit geval K+) welke wordt doorgelaten en het verschaffen
van het juiste aantal noodzakelijke coördinerende groepen.
c.
De biosynthese van ATP (adenosine trifosfaat) gebeurt met behulp van
het transmembraaneiwit ATP synthetase. Dit enzym synthetiseert ATP
vanuit ADP en Pi en heeft in het enzym verschillende
bindingstoestanden/affiniteiten voor substraat en product. Welk eiwit dat
geïnvolveerd is in DNA replicatie kent u dat ATP als energiebron gebruikt,
maar ook gebruik maakt van verschillende bindingstoestanden/affiniteiten
voor ATP en zijn hydrolyse producten? (2P)
(DNA) Helicase
d.
Legt u uit wat de overeenkomsten zijn tussen beide enzymen van vraag
3c met betrekking tot de resulterende veranderingen in de enzymen in de
verschillende bindingstoestanden. (3P)
Beide enzymen zijn hexameren met drie verschillende bindingstoestanden
voor ATP/ADP. Omzetting van ATP in ADP en Pi (voor de helicase) of van
ADP + Pi in ATP (voor de ATP synthetase) leidt tot conformatie
veranderingen in het eiwit, waarbij dus ook de subunits in drie
verschillende conformaties voorkomen.
Bonusvraag:
De Nobelprijs voor de chemie is dit jaar toegekend aan de opheldering
van de werking van GPCRs. Waarvoor staat de afkorting GPCR? (2P) Leg
kort uit hoe GPCRs hun signalen doorgeven de cel in (ga daarbij ook kort
in op de activatie van de eiwitten waaraan GPCRs in de cel binden). (3P)
G-Protein Coupled Receptor / G-eiwit gekoppelde receptoren
G-eiwitten zitten in het celmembraan en binden een signaalmolecuul aan
de buitenkant van de cel. Hierdoor ondergaan ze een conformatie
verandering waardoor de aan de binnenkant van de cel voorkomende, en
aan de GPCR gebonden, G-eiwitten geactiveerd worden: ze wisselen
GDP uit voor GTP. De G-eiwitten activeren vervolgens andere eiwitten
totdat ze gedeactiveerd worden door GTP hydrolse.
4
(~30 minuten; 20 punten)
a.
Teken een Watson en Crick basepaar naar
keuze. Teken daarbij in ieder geval beide
basen en het waterstofbrugpatroon tussen
de basen (de suiker mag u dus weglaten).
(4P)
\
b.
Noem tenminste drie enzymen die betrokken zijn bij de replicatie van DNA
in de cel en leg uit welke rol deze enzymen hebben / wat ze doen. (6P)
bijvoorbeeld (maar meer antwoorden mogelijk):
DNA polymerase: adderen de monomeren (dNTPs) aan de nieuwe DNA
keten
DNA helicase: trekt de dubbel helix uit elkaar, zodat de enkele strands
beschikbaar geraken als templaat
Topoisomerase: ontvouwt de supercoiling die ontstaat door de separatie
van de DNA dubbel helix
c.
U wilt het DNA tussen de twee hieronder getoonde sequenties
amplificeren met behulp van PCR. Kies uit de lijst van acht primers, welk
paar u hiervoor nodig heeft. (4P)
3’-GACCTGTGGAAGC-----------------------CATACGGGATTGA-5’
5’-CTGGACACCTTCG------------------------GTATGCCCTAACT-3’
1)
2)
3)
4)
5’-GACCTGTGGAAGC-3’
5’-GTATGCCCTAACT-3’
5’-AGTTAGGGCATAC-3’
5’-GCTTCCACAGGTC-3’
3, 6
5)
6)
7)
8)
5’-CATACGGGATTGA-3’
5’-CTGGACACCTTCG-3’
5’-CGAAGGTGTCCAG-3’
5’-TCAATCCCGTATG-3’
d.
Beschrijf het principe van de PCR aan de hand van de amplificatie van
een specifiek stukje dubbelstrengs DNA uit een chromosoom tijdens de
eerste en tweede cyclus. Geef hierbij de karakteristieken van iedere stap
aan (wat gebeurt er, wat reageert er, en waarom wordt een bepaalde
temperatuur gekozen), en laat duidelijk zien welke producten er in iedere
stap worden gevormd. (6P)
Verwarm tot 95 graden om het dubbelstrengs DNA te smelten
Bij 55 graden equilibreren om de primers te laten binden
Bij de optimale temperatuur voor de DNA polymerase, ca 72 graden, de
templaatreactie starten, primers worden verlengd. Proces nog een keer
herhalen leidt tot onderstaande produchten.
T~ 55°C
T~ 95°C
T~ 75°C
a.
b.
5
(~15 minuten; 10 punten)
Uw collega-student(e) amplificeert een stuk eukaryotisch DNA coderend
voor een bepaald eiwit met de Polymerase Chain Reaction (PCR) en
gebruikt daarvoor direct eukaryotische DNA als templaat. Hij/zij brengt dit
geamplificeerde DNA in een plasmide en gebruikt deze voor
eiwitexpressie in bacteriën. Tot zijn/haar verbazing leidt deze aanpak
echter niet tot een correcte expressie/synthese van het betreffende eiwit in
de bacteriën. U bent niet verbaasd. Legt u uit waarom deze aanpak niet
heeft gefunctioneerd. (5P)
Eukaryotische genen zijn opgebouwd uit intronen en exonen. Deze
intronen worden normaal gesproken verwijderd uit het mRNA en alleen de
exonen coderen voor het uiteindelijke eiwit. Dit proces heet mRNA
splicing. Prokaryoten kennen geen intronen en hebben het DNA voor de
eiwitten continu gecodeerd. Dientengevolge bezitten prokaryoten ook niet
de moleculaire componenten voor het splicing proces. Het inbrengen van
eukaryotisch DNA leidt daarom tot een mRNA waarin zich ook intron
genetische informatie bevindt die bij translatie leidt tot een onzin eiwit /
terminatie dmv stopcodons.
Wat is volgens u dan de beste manier om een eukaryotisch gen tot
expressie te brengen in een bacterie? Met andere woorden, beschrijf de
verschillende stappen die nodig zijn om vanuit eukaryotisch DNA een
recombinant plasmide te maken welke tot functionele eiwitexpressie in
bacteriën leidt. (5P)
Beschrijf onderstaand proces:
6
(~20 minuten;15 punten)
a.
Veronderstel dat u een stuk DNA
behandeld met een chemisch
mutageen (een stof die leidt tot
mutaties in het DNA). U vindt dat
in het uiteindelijke eiwit dan een
proline op een specifieke positie
gemuteerd wordt tot een leucine
of een serine. Verder
behandelen met het mutageen
leidt tot een phenylalanine op
deze positie in het eiwit (zie
schema hieronder).
Pro  Ser/Leu  Phe
Verklaart u de gevonden mutaties aan de hand van een voorstel voor
mogelijke codons die coderen voor deze vier aminozuren. (3P)
Als Pro door CCC wordt gecodeerd leidt een mutatie tot CUC (Leu) of
UCC (Ser), een volgende mutatie in beiden leidt tot UUC (Phe) of,
Als Pro door CCU wordt gecodeerd leidt een mutatie tot CUU (Leu) of
UCU (Ser), een volgende mutatie in beiden leidt tot UUU (Phe)
b.
Transfer RNAs (tRNAs) zijn noodzakelijk voor de eiwitsynthese. Noem
drie verschillende biomoleculen welke in de cel kunnen binden /een
interactie aan gaan met tRNA moleculen en geef van ieder van deze
componenten kort aan hoe ze aan tRNA binden en wat hun rol is. (6P)
Bijvoorbeeld:
tRNA synthetase: herkent de specifieke tRNA en belaadt deze met een
aminozuur
EF-Tu: bindt aan beladen tRNA, voorkomt vroegtijdige hydrolyse van de
amino acyl binding en transporteert de tRNA naar het ribosoom (alwaar
deze het tRNA loslaat onder hydrolyse van GTP).
Ribosoom: bindt aan tRNA in drie verschillende toestanden en zorgt voor
de overdracht van de groeiende peptideketen op een tRNA.
c.
Een tRNA welke met een verkeerd aminozuur beladen is wordt toch
zonder problemen geprocesseerd door het ribosoom en het verkeerde
aminozuur wordt probleemloos ingebouwd in de groeiende peptideketen.
Legt u uit waardoor dit komt. (2P)
Het ribosoom heeft geen controle mechanisme om te kijken of het anticodon overeenkomt met het aminozuur. Het uitlezen van de codons en de
eiwitsynthese zijn in het ribosoom ontkoppeld. Deze koppeling wordt
alleen gemaakt door het tRNA waar zowel het anti-codon als het
aminozuur aan vast zitten. Maw, na beladen van het tRNA met het
aminozuur, is er geen controlemechanisme meer.
d.
Maak de link. Geef aan welke moleculaire componenten in de linker kolom
horen bij welk proces in de rechter kolom. (4P)
1. RNA polymerase
2. DNA polymerase
3. Ribosome
4. dNTP
5. NTP
6. tRNA
7. mRNA
8. rRNA
9. RNA primer
10. promoter
a) 2, 4, 9
b) 1, 5, 10
c) 3, 6, 7, 8
a) Replicatie
b) Transcriptie
c) Translatie