University of Groningen Modular assembly of functional DNA

advertisement
University of Groningen
Modular assembly of functional DNA-based systems
Sancho Oltra, Núria
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to
cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
2011
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Sancho Oltra, N. (2011). Modular assembly of functional DNA-based systems Groningen: s.n.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the
author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately
and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the
number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Download date: 19-07-2017
Samenvatting
DNA is het molecuul dat in levende organismen alle genetische informatie bevat. Het
komt doorgaans voor als een dimeer van twee complementaire nucleotide-polymeren,
waarbij de individuele nucleotiden in het polymeer gekoppeld zijn via fosfodiëster
verbindingen. Elke nucleotide bestaat uit een fosfaatgroep, een suikergroep en een base
(zie Figuur 1). Er zijn vier base-soorten die voorkomen in DNA; adenine (A), guanine (G),
cytosine (C) en thymine (T).
Figuur 1. Algemene structuur van een nucleotide (links) en de structuren van de verschillende basen
(rechts).
De specifieke interactie tussen de verschillende basen (adenine koppelt met thymine en
guanine met cytosine) door middel van waterstofbruggen zorgt ervoor dat de twee
complementaire nucleotide-strengen zich ordenen in een dubbele-helix structuur (Figuur
2).
T
A
G
C
G
C
H
H
H
N
N
O
H
G
A
T
T
N
N
N
N
H
C
N
O
N
N
O
N
N
N
N
A
N
H
O
N
G
G
H
C
C
A
T
H
A
T
T
Adenine
Thymine
Guanine
Cytosine
A
C
G
Figuur 2. Waterstofbruggen tussen de DNA-basen en een schematische weergave van de dubbele DNAhelix.
De genetische informatie is gecodeerd in de volgorde van de basen in het DNA. Gebruik
makend van de specificiteit van de structurele ordening van deze basen, zijn er buiten de
dubbele helix ook andere DNA-assemblages mogelijk. Deze unieke eigenschap, samen
met de mogelijkheid om vrijwel elke gewenste DNA-volgorde the synthetiseren, stelt men
in staat om voorspelbare DNA-assemblages van variërende complexiteit te bouwen,
uiteenlopend van twee-dimensionale tot drie-dimensionale structuren.
Vanwege haar speciale eigenschappen is het DNA-molecuul gebruikt in verschillende
wetenschappelijke onderzoeksvelden, zoals katalyse, synthese en nanotechnologie. Deze
veelzijdigheid van het DNA geeft het potentieel van het molecuul weer om in een
toenemend aantal onderzoeksvelden te worden gebruikt en om innovatieve, functionele
systemen te creëren. Zo is de toepassing van DNA in nanotechnologie nog slechts in het
beginstadium, waardoor mogelijkheden grenzeloos lijken.
Het onderzoek beschreven in dit proefschrift had als doel om nieuwe, functionele
systemen gebaseerd op DNA-structuren te ontwikkelen. Hiervoor werd een modulaireassemblage benadering gevolgd, gebruik makend van zowel gefunctionaliseerde als nietgefunctionaliseerde oligonucleotiden. De resulterende, op DNA-gebaseerde systemen
lieten zien toe te passen te zijn in de katalyse en synthese, alsmede in moleculaire sensoren licht-oogst-applicaties. Al deze systemen waren gebaseerd op het gebruik van
oligonucleotiden met covalent gebonden functionele moleculen. Deze laatste aanpak liet
de precieze plaatsing van functionele groepen in de DNA-structuur toe, wat zorgde voor
een beter begrip van de systemen en daardoor, voor een makkelijker optimalisatie.
In het eerste hoofdstuk van dit proefschrift wordt een overzicht van de toepassingen van
het DNA-molecuul in de wetenschap gegeven. Dit hoofdstuk geeft de diversiteit weer van
de onderzoeksvelden waarin DNA succesvol is toegepast. Hoewel er dus al tal van DNAapplicaties zijn, blijven er nog vele mogelijkheden over om te verkennen.
Hoofdstuk 2 beschrijft de constructie van twee op DNA gebaseerde katalysatoren met
een covalent gebonden metaal complex. De katalysatoren werden bestudeerd in de
asymmetrische koper(II)-gekatalyseerde Diels-Alder reactie tussen azachalcon en
cyclopentadieen (Figuur 3). Verschillende conversie- en enantioselectiviteitswaarden
werden verkregen bij gebruik van twee monodentaat-liganden, zoals bijvoorbeeld
pyridine, of een bidentaat ligand, zoals bipyridine. De modulaire aard van het systeem liet
een snelle optimalisatie toe door de eenvoudige omwisseling van welke gewenste
module dan ook. Deze aanpak maakt dus niet alleen gebruik van de makkelijke
assemblage door middel van DNA-hybridisatie, maar gebruikt ook de inherente chiraliteit
van het DNA om één van de twee mogelijke enantiomeren in overmaat te verkrijgen.
Enantiomere overmaten tot 93% werden verkregen met de op bipyridine gebaseerde
katalysator.
Figuur 3. Op DNA gebaseerde katalysatoren met covalent gebonden pyridine- (links) en bipyridinegroepen
(rechts).
142
Samenvatting
In hoofdstuk 3 werden twee verschillende benaderingen voor het creëren van een
kunstmatig ribosoom onderzocht. In dit hoofdstuk werd de sjabloon-functionaliteit van
DNA gebruikt om de koppeling tussen aminozuren te bevorderen. Hierbij waren de
aminozuren verbonden aan verschillende oligonucleotiden, welke complementair waren
aan het DNA-sjabloon (Figuur 4). Het gevolgde ribosoom-ontwerp impliceert het gebruik
van beschermde aminozuren, waardoor een ontschermingsstap nodig is voordat de
peptide-koppeling plaats kan vinden. De twee onderzochte benaderingen maken gebruik
van verschillende ontschermingsmethoden; palladium gekatalyseerde ontscherming van
Alloc-beschermde aminozuren en lichtgeïnduceerde ontscherming van onitrobenzylcarbamaat-derivaten. Pogingen om de ontscherming volgens de eerste
methode uit te voeren waren niet succesvol. Echter, ontscherming door middel van
bestraling met licht was niet alleen mogelijk in het geïsoleerde beschermde aminozuuroligonucleotide-conjugaat, maar ook wanneer deze was geïntegreerd in het kunstmatige
ribosoom. Ondanks het feit dat de koppeling tussen aminozuren na ontscherming nog
niet is waargenomen, zijn de resultaten aanmoedigend. Koppelingsreacties tussen
overeenkomstige groepen komen voor in de natuur, dus is het goed mogelijk dat een
optimalisatie van het systeemontwerp zal resulteren in de vorming van de gewenste
peptide verbinding.
Figuur 4. Schematische weergave van een kunstmatig ribosoom.
De sjaboon-functionaliteit van DNA vormt ook een essentieel onderdeel in het onderzoek
dat wordt beschreven in hoofdstuk 4. In dit onderzoek werden twee afzonderlijke
oligonucleotiden, beiden gebonden aan één helft van een enzym (murine
dihydrofolaatreductase (mDHFR)), gecombineerd met een complementair DNA-sjabloon.
De hybridisatie van de oligonucleotide-componenten met een sjabloon-streng maakte
een herassemblage van het gesplitste enzym mogelijk, waarmee haar katalytische
activiteit werd hersteld (Figuur 5). De katalytische activiteit van het enzym bleek
gemoduleerd te worden door het inbouwen van een variërend aantal verkeerde baseparingen in het DNA-sjabloon. Bovendien werd laten zien dat deze activiteit afhankelijk is
van de concentratie van het gebruikte DNA-sjaboon.
143
Figuur 5. Schematische weergave van de herassemblage van het gesplitste enzym door middel van DNA
hybridisatie.
Een directe toepassing van dit enzymatische systeem, het maken van een moleculaire
sensor, wordt besproken in hoofdstuk 5. Het ontwerp omvat een combinatie van het in
hoofdstuk 4 beschreven systeem en een moleculaire herkenningsgroep, zoals
bijvoorbeeld een adenosinetrifosfaat (ATP) aptameer (Figuur 6). De gekozen aanpak is
gebaseerd op het vrijkomen van een deel van de sjabloon-DNA streng in een DNAherstructurering ten gevolge van herkenning van het ATP molecuul. Het vrijkomen van dit
deel van het sjabloon is essentieel voor de correcte DNA hybridisatie en de
daaropvolgende herassemblage van het gesplitste enzym. Verschillen in de enzymatische
activiteit werden waargenomen bij de aan- of afwezigheid van het doel-molecuul (ATP),
wat betekent dat de DNA-herstructurering die nodig is voor de herassemblage van het
enzym daadwerkelijk plaatsvindt wanneer ATP wordt herkend. Een evenwicht tussen de
stabiliteit van het gevouwen aptameer en het gehybridiseerde enzymatische systeem is
nodig voor een optimale prestatie van het geheel. Het ontwerp van de aptameer-DNAsjabloon streng is dus cruciaal, waardoor de gevoeligheid van de sensor wellicht kan
worden verhoogd door de base-volgorde in het DNA.
Figuur 6. Schematische weergave van de door ATP-geïnitieerde herassemblage van een gesplitst enzym.
144
Samenvatting
Het laatste experimentele hoofdstuk van dit proefschrift beschrijft de constructie van een
licht-oogst systeem gebaseerd op een DNA G-quadruplex (Figuur 7).
N
NH
N
N
N
HN
N
N
Figuur 7. Schematische weergave van de op een G-quadruplex gebaseerde, kunstmatige licht-oogstantenne. E.O. = energieoverdracht.
In deze specifieke door DNA aangenomen structuur is het mogelijk om donor (coumarine)
en acceptor moleculen (porfyrine) te plaatsen in de onderlinge orientatie die nodig is om
energieoverdrachtsprocessen plaats te laten vinden. Bij gebruik van DNA strengen die
niet in staat waren om de quadruplex structuur te vormen, werd overeenkomstig ook
geen energieoverdracht waargenomen.
145
Download
Random flashcards
fff

2 Cards Rick Jimenez

Create flashcards