ummary

Summary
Urinary tract infections (UTIs) are common in human beings. UTIs include cystitis,
pyelonephritis and asymptomatic bacteriuria. Although UTIs are frequently relatively
benign, these are often recurrent and cause major discomfort to the patient. Some
complications can be severe and even life-threatening. UTIs cause a huge cost to the
healthcare system and are a heavy burden for the hospital and the physician.
Most known Escherichia. coli are commensal or cause intestinal diseases. However,
some E. coli infect other organs, these are named extra-intestinal pathogenic E. coli
(ExPEC). ExPEC causing UTIs are known as uropathogenic E. coli (UPEC). Most
community-acquired UTIs are caused by UPEC. Although UPEC have been
intensively studied, so far there are no vaccines or effective treatments, other than
antibiotics, available to treat for UPEC infections. A detailed understanding of the
molecular genetic basis of the virulence of UPEC may contribute to the development
of more effective therapeutics and prophylactics.
Comparison of complete genome sequences and epidemiological investigations
demonstrated that UPEC share more than 50% of their genes with commensal E. coli
and other ExPEC and that the clinical isolates belong to various phylogenetic groups
and serotypes.
Virulence factors are the ammunition of the bacterial pathogens to attach to the
epithelial cells of the organs of the host, escape from the host defenses, invade the
host tissues, survive in the host and/or cause disease. The molecular mechanism of
pathogenesis and the regulation of the discovered virulence factors have been
intensively investigated. However, the interaction of UPEC with their host is rather
complex. UPEC with variety of virulence factors stimulate several responses of the
host, including apoptosis, immune and inflammatory responses, endocytosis of UPEC
and dispersal of the bacteria in intracellular bacterial communities (IBCs) in bladder
epithelial cells.
During the present study, we first deciphered the molecular mechanism of the NAD
dependence of UTI89, which is an acute cystitis isolate and of serotype O18:K1:H7. A
mutation in the nadB gene, encoding L-aspartate oxidase, was shown to be
responsible for the nicotinamide-requirement of UTI89. This was further confirmed
by the complementation assay. Construction of site-specific point mutations, selection
and analysis of spontaneous prototrophic revertants and sequencing of nadB of other
NAD-dependent and independent O18 isolates demonstrated that the Ala28Val
mutation in NadB completely impedes de novo synthesis of nicotinamide. However,
no significant differences were observed between the virulence of isogenic NADauxotrophic and prototrophic strains in the murine ascending urinary tract infection
model. We applied the nadB locus as a neutral site for DNA insertions in the bacterial
chromosome, that is, we stably inserted other genes into the middle region of nadB to
complement the genes inactivated on the chromosome. Such complementation is
required to confirm the identification of these genes as virulence factors and is often
difficult to perform using plasmids, as these are often lost at an excessive rate in vivo.
The use of the alkaline phosphatase gene phoA as a reporter in UTI89 is hampered by
the presence of an indigenous phoA gene, causing a high background activity.
Therefore, we decided to first construct a UTI89ΔphoA mutant. Since UTI89 is a
refractory strain for using the Red recombination system, we first constructed the
mutant in the E. coli K-12 strain BW25141. It turned out that the transducing phage
P1 did not produced high titer lysates on BW25141ΔphoA::cat. Therefore we first
transferred the ΔphoA::cat mutation to the wild type E. coli K-12 strain MG1655, and
then to UTI89 via P1vir transduction, to produce the UTI89ΔphoA::cat mutant
DV7728. At the same time, we observed that the phoA flanking sequences are almost
identical between UTI89 and E. coli K-12. Therefore, we used longer flanking
sequences to transfer the phoA deletion to UTI89, by Red-mediated recombination of
a linear fragment that was amplified from DV7728 by PCR. The resulting
UTI89ΔphoA mutant, DV7748, was used as a recipient strain for the construction of a
transposon mutant library by conjugation with the donor strain S17-1 (λpir) harboring
pGV4220, which contains a phoA reporter gene within the miniTn5phoA2 transposon.
We took advantage of the difference of nutrient requirements of DV7748 and S171(λpir) on minimal A medium to construct a transposon insertion mutant library. The
transposon insertion mutants were selected on minimal A medium containing
nicotinamide and kanamycin, and were then further tested on LB containing the PhoA
substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (X-P). A set of 103 miniTn5phoA2
insertion mutants were analyzed and the insertions of 96 mutants were localized. In
total, 91 discrete insertions were identified. The phenotype of these mutants was
tested in vitro and in vivo. We found that the survival ratio of Caenorhabditis elegans
feeding on mutant 26 with a disrupted wciP gene is statistically significantly higher
than that of C. elegans feeding on the wild type strain. Further, screening for mutants
defective in colonization in the bladder and kidneys of C3H/HeN mice, demonstrated
tatA and pstC, nhaA as well as degP, yohJ and plasmid-encoded genes p060 and p135
potentially are virulence determinants of UTI89. Comparison of the data obtained in
C. elegans and mice showed that several mutations affecting virulence in the mouse
do not increase the lifespan of infected C. elegans and would not be identified if the
screening is only performed in nematodes.
Using linear fragments amplified from the chromosome, the degP and yohJ
transposon insertion mutations were transferred to wild type UTI89. Such
construction of isogenic strains in a clean genetic background is required to prove the
linkage between a mutant phenotype and an inactivated gene. The results
demonstrated that the mucous colony morphology of the yohJ transposon insertion
mutant resulted from some unlinked mutation but not from inactivation of yohJ.
Comparison of the infection in the bladder and kidneys by degP mutants and the wild
type strains in the murine UTI model, confirmed that degP plays an important role
both in the cystitis isolate UTI89 and the pyelonephritis isolate CFT073. However, the
contribution of degP to the colonization in the pyelonephritis isolate CFT073 is earlier
than in the cystitis isolate UTI89.
Several mutations disrupted genes in the indigenous plasmid pUTI89. The plasmidencoded protein ParB was shown to contribute to the virulence of UTI89. It is one of
the proteins encoded by the parAB plasmid partitioning system. We isolated plasmidfree cells when only one of the genes, parB or parA, was replaced by a resistance
marker. However, we could not isolate plasmid-free cells from the parAB mutant
missing both genes. In addition, the plasmid pCP20, encoding the yeast FLP
recombinase, cannot be harbored stably in the parB mutant, which implies some
interaction between gene products in the UTI89 parB mutant and the plasmid pCP20.
In conclusion, the present study discovered the molecular mechanism of NAD
dependence of O18 UPEC strains, developed a generalized method to transfer
mutations between E. coli strains and disclosed a new neutral insertion site in the
chromosome for complementation assays. Plasmid-free UTI89 derivatives were
isolated by specific targeting of a plasmid partitioning gene, parB or parA. The
plasmid partitioning gene parB was first confirmed as a virulence determinant of
UPEC in the mouse model.
Samenvatting
Urineweginfecties zoals cystitis, pyelonefritis en asymptomatische bacteriurie, treden
frequent op bij de mens. Hoewel urineweginfecties vaak relatief goedaardig zijn,
kunnen deze herhaaldelijk optreden en groot ongemak veroorzaken voor de patiënt.
Sommige complicaties kunnen echter ernstig en zelfs levensbedreigend zijn.
Urineweginfecties veroorzaken ook grote kosten voor de gezondheidszorg en zijn een
zware last voor het ziekenhuis en de arts.
De meeste Escherichia coli zijn commensaal of veroorzaken darmziekten. Sommige
E. coli infecteren andere organen, deze worden extra-intestinale pathogene E. coli
(ExPEC) genoemd. ExPEC die urineweginfecties veroorzaken staan bekend als
uropathogene
E.
coli
(UPEC).
Buiten
ziekenhuizen
worden
de
meeste
urineweginfecties veroorzaakt door UPEC stammen. Hoewel UPEC intensief werden
onderzocht, zijn er tot nu toe geen vaccins of effectieve behandelingen, met
uitzondering van antibiotica, beschikbaar voor UPEC infecties. Een gedetailleerd
begrip van de moleculair-genetische basis van de virulentie van UPEC kan bijdragen
tot de ontwikkeling van meer effectieve profylactische maatregels en behandelingen.
Vergelijking van volledige genoomsequenties en epidemiologisch onderzoek hebben
aangetoond dat UPEC meer dan 50% van hun genen delen met met commensale E.
coli en met andere ExPEC en dat de klinische isolaten behoren tot verschillende
fylogenetische groepen en serotypen.
Virulentiefactoren zijn de munitie die de bacteriële pathogenen toelaat zich te hechten
aan de epitheelcellen van de organen van de gastheer, te ontsnappen aan de
afweermechanismen van de gastheer, binnen te dringen in de weefsels van de
gastheer, in de gastheer te overleven en / of ziekte te veroorzaken. Het moleculaire
mechanisme van de pathogenese en de regulatie van de uitdrukking van de
virulentiefactoren werden reeds intensief onderzocht. De interactie van UPEC met
hun gastheer is echter vrij complex. UPEC stimuleren aan de hand van verschillende
virulentiefactoren een aantal reacties van de gastheer, met inbegrip van de apoptose,
immune en inflammatoire reacties, endocytose van UPEC en de verspreiding van de
bacteriën in intracellular bacterial communities (IBC) in blaasepitheelcellen.
In deze studie hebben we eerst het moleculaire mechanisme ontcijferd van de NAD
afhankelijkheid van E. coli UTI89, een acute cystitis isolaat van het serotype
O18:K1:H7. Een mutatie in het nadB gen, coderend L-aspartaat oxidase, bleek
verantwoordelijk voor de nicotinamide auxotrofie van UTI89. Dit werd verder
bevestigd door de complementatietest. Constructie van plaatsspecifieke puntmutaties,
selectie en analyse van spontane prototrofe revertanten en sequencing van het nadB
gen van andere NAD-afhankelijke en onafhankelijke O18 isolaten heeft aangetoond
dat de Ala28Val mutatie in NadB volledig de de novo synthese van nicotinamide
belemmert. Er werden echter geen significante verschillen waargenomen tussen de
virulentie van isogene NAD-auxotrofe en prototrofe stammen in het muismodel voor
urineweginfecties. We gebruikten de nadB locus als neutrale site voor DNA inserties
in het bacteriële chromosoom, i.e. andere genen werden stabiel ingebracht in het
middengebied van het nadB gen om geïnactiveerde genen elders op het chromosoom
te complementeren. Dergelijke complementatie moet de identificatie van genen als
virulentiefactoren bevestigen en is vaak moeilijk uit te voeren met behulp van
plasmiden, aangezien deze vaak in vivo te frequent verloren gaan.
Het gebruik van het alkalisch fosfatase gen phoA als reporter in UTI89 wordt
gehinderd door de aanwezigheid van een endogeen phoA-gen, dat een hoge
achtergrondactiviteit veroorzaakt. Daarom hebben we besloten om eerst een
UTI89ΔphoA mutant de te construeren. Aangezien de toepassing van het Red
recombinatiesysteem in UTI89 niet efficiënt bleek, werd de mutatie eerst
geconstrueerd in de E. coli K-12 stam BW25141. Vermits bleek dat geen hoge titer
lysaten van de transducerende faag P1vir konden geproduceerd worden op
BW25141ΔphoA::cat, werd de ΔphoA::cat mutatie eerst door P1vir getransduceerd
naar de wildtype E. coli K-12 stam MG1655 en vervolgens nogmaals via P1vir
transductie naar UTI89 overgebracht om de UTI89ΔphoA::cat mutant DV7728 te
verkrijgen. Tegelijkertijd stelden we vast dat de phoA flankerende sequenties vrijwel
identiek zijn tussen UTI89 en E. coli K-12. Daarom werden langere flankerende
sequenties gebruikt om de phoA deletie over te dragen naar UTI89, door Redgemedieerde recombinatie van een lineair fragment dat uit DV7728 werd
geamplificeerd door PCR. De resulterende UTI89ΔphoA mutant DV7748 werd
gebruikt als een recipiëntstam voor de constructie van een transposonmutant
bibliotheek door conjugatie met de donor stam E. coli S17-1 (λpir)(pGV4220), die
een phoA reportergen in het miniTn5phoA2 transposon bevat.
Dan hebben we gebruik gemaakt van het verschil tussen de auxotrofe merkers van
DV7748 en S17-1(λpir) om een transposon insertiemutanten bibliotheek te verkrijgen.
De transposon insertiemutanten werden geselecteerd op minimaal A medium met
nicotinamide en kanamycine en vervolgens verder getest op LB medium met het
PhoA substraat 5-broom-4-chloor-3-indolylfosfaat (X-P). Een set van 103
miniTn5phoA2 insertiemutanten werd geanalyseerd en de inserties van 96 mutanten
werden gelokaliseerd. In totaal werden 91 discrete inserties geïdentificeerd. Het
fenotype van deze mutanten werd getest in vitro en in vivo. De overleving van
Caenorhabditis elegans gevoed met mutant 26, met een geïnactiveerd wciP gen, was
statistisch significant langer dan die van C. elegans gevoed met de wild type stam.
Verder screenen op mutanten met een verminderde kolonisatie in de blaas en nieren
van C3H/HeN-muizen, heeft aangetoond dat tatA, pstC, nhaA, degP, yohJ en de
plasmide-gecodeerde eiwitten P060 en P135 potentiële virulentiedeterminanten zijn
van UTI89. Vergelijking van de gegevens verkregen met C. elegans en met muizen
heeft aangetoond dat verscheidene mutaties die de virulentie bij de muis verminderen
niet de levensduur van geïnfecteerde C. elegans verlengen en dus niet zouden
geïdentificeerd worden indien de screening alleen wordt uitgevoerd in nematoden.
Met lineaire fragmenten, die door PCR waren geamplificeerd uit het chromosoom,
werden de degP en yohJ transposoninsertie mutaties uit de bibliotheek door
transformatie overgebracht naar wild type UTI89 en UPEC CFT073. Dergelijke
constructie van isogene stammen in een schone genetische achtergrond is
noodzakelijk om de koppeling tussen een mutant fenotype en een geïnactiveerd gen
aan te tonen. De resultaten toonden aan dat de mucoïde koloniemorfologie van de
yohJ transposon insertiemutant het gevolg is van een ongekoppelde mutatie maar niet
van de inactivering van yohJ. Vergelijking van de infectie in de blaas en nieren met
degP mutanten en wild type stammen in het muismodel, bevestigde dat degP een
belangrijke rol speelt bij de infectie, zowel bij het cystitis isolaat UTI89 als bij het
pyelonefritis isolaat CFT073. De functie van degP is echter in een vroeger stadium
nodig voor de kolonisatie door CFT073 bij UTI89.
Verschillende mutaties inactiveerden eveneens genen op het endogene plasmide
pUTI89. Het plasmide-gecodeerde eiwit ParB werd geïdentificeerd als noodzakelijk
voor de volledige virulentie van UTI89. Het is één van de eiwitten gecodeerd door het
parAB plasmideverdelingssysteem, dat verantwoordelijk is voor de verdeling van de
plasmiden tussen de dochtercellen bij de celdeling. We verkregen plasmide-vrije
cellen wanneer slechts één van de genen, parB of parA, werd vervangen door een
resistentiemerker. We konden echter geen plasmide-vrije cellen isoleren van de
parAB mutant waarbij beide genen ontbreken. Bovendien kan het plasmide pCP20,
dat codeert voor het gist FLP recombinase, niet stabiel repliceren in de parB mutant,
wat een interactie tussen een genproduct in de parB mutant en het plasmide pCP20
impliceert.
Concluderend, de huidige studie ontdekte het moleculaire mechanisme van de NAD
afhankelijkheid van O18 UPEC stammen, ontwikkelde een algemene methode om
mutaties tussen E. coli stammen over te dragen en beschrijft een nieuwe neutrale
insertieplaats in het chromosoom voor complementatie-assays. Plasmide-vrije UTI89
derivaten werden geïsoleerd door mutatie van het plasmide verdelingsgen p060. Dit
parB gen werd voor het eerst bevestigd als noodzakelijk voor de volledige virulentie
van UPEC in het muismodel.