Biotechnologie: theorie Stijn Vandelanotte

advertisement
Biotechnologie: theorie
Hoofdstuk 1: Algemene inleiding
Definitie
Bio → leven
Technologie → menselijke kunde en vaardigheid
Biotechnologie → het gebruik van organismen of onderdelen van organismen voor de productie van stoffen
Ontstaan na de ontdekking vd structuur vh DNA
Toepassingsgebieden
Gezondheidszorg
Landbouw
Voeding
Fijne chemicaliën
Papierproductie
Types
Witte biotechnologie → industriële toepassingen
Groene biotechnologie → genetische modificatie van planten
Rode biotechnologie → toepassingen in de medische sector, forensisch onderzoek
Dankzij de moderne biotechnologie hebben we de mogelijkheid om genetisch materiaal binnen te brengen in
microben, planten en dieren ⇒ Gevolgen
We kunnen deze organismen op een nieuwe manier waardevolle moleculen en eiwitten laten maken
Geneesmiddelen, vaccins, bioplastics
We kunnen planten en dieren produceren die ziekte resistent zijn of tolerant voor moeilijke omgevingssituaties
en/of hogere productieniveaus hebben van nuttige producten
We kunnen methoden ontwikkelen om menselijke ziektes op te sporen, voorkomen of te bestrijden
Veel methoden ontwikkeld om genetisch te transformeren, maar de grote lijnen blijven dezelfde:
Isoleren en kloneren van genen en de constructie van vectoren die alle gewenste signalen bevatten die de
expressie vh gen en de biochemische selectie van transformatie mogelijk maken
De ontwikkeling van biologische of fysische methoden voor gen transfer
Regeneratie, selectie en karakterisering van transformanten
Stijn Vandelanotte
-1-
Biotechnologie: theorie
Hoofdstuk 2: Het isoleren van genen
Algemeen
Genen komen meestal tot expressie via eiwitten → meestal als enzymen die specifiek
Belangrijkste methode om de functies van genen en eiwitten te achterhalen is via de analyse van spontane of
geïnduceerde mutanten bij modelorganismen
De ontwikkeling van de Sanger methode voor de bepaling van de volgorde vd basen in een DNA sequentie
Basisbegrippen bij de genstructuur van eukaryoten
Sense en antisense:
De antisense streng = de DNA streng die als mal dient voor de transcriptie → afleesbaar
De sense streng = het resulterende RNA is een replica van de sense DNA streng (T → U)
Intron en exon
Exons = expressed regions → deze komen tot expressie, introns niet
Na de transcriptie worden de introns tijdens de ‘processing’-stap geëlimineerd → de exons worden
samengevoegd tot een mRNA
De transcriptie loopt van het 5’ naar het 3’ uiteinde van de antisense DNA streng
Stroomopwaarts en stroomafwaarts
Start op positie +1: stroomopwaarts lig het promotor gebied → reguleert de transcriptie
25-30 bp stroomopwaarts van +1 ligt de TATA box → zorgt voor de correcte start vd RNA-polymerase
Verder stroomopwaarts ligt de CCAAT-box → betrokken bij fixatie van RNA-polymerase
De promotor bevat minstens 1 sequentie waarop een transcriptie factor kan binden
Dit zijn proteïnen die het polymerase ertoe aanzetten aan de transcriptie te beginnen
De transcriptie begint bij positie 1 en gaat dan stroomafwaarts verder
Stroomafwaarts bevinden zich signaal sequenties die het einde vd transcriptie aanduiden
Bv TAA, TAG, TGA
De transcriptie wordt afgesloten als een terminatorsequentie herkend wordt
Deze mag niet verward worden met een stopcodon dat in de translatie doet stoppen
♦ Bij een translatie wordt het mRNA afgelezen door een ribosoom, deze vertaalt de boodschap in
een zichzelf opvouwende keten van AZ → een EW
Chimeer gen
Gen? Complex van promotor en de voor een eiwit coderende sequentie
De promotor beslist onder welke voorwaarden het gen tot expressie zal komen
Een promotor van bij prokaryoten kan ook werken als promotor voor eukaryoten en omgekeerd, maar voor
een optimale expressie is het best een eukaryotenpromotor te gebruiken bij eukaryoten.
Wanneer men het promotor gebied van het ene gen met het coderend gebied v/e gen v/e ander soort organisme
combineert, spreekt men van een chimeer gen
Soorten promotors
2 types: constitutieve promotors en specifieke promotors
Constitutieve promotors: werken in alle weefsels en moeten dus niet geïnduceerd worden.
Bv 1: pNOS = promotor vh nopalinesynthase gen
Bv 2: p35S = deze sterker werkende 35S-promotor is afkomstig uit het Cauliflower Mosaic Virus.
In een verbeterde versie (P35x2) werd de activatorsequentie verdubbeld ⇒ activiteit = 5 – 10x sterker
Bv 3: pUBI = promotor vh ubiquitinegen → nog hogere expressieniveaus
Specifieke promotors:
zorgen er voor dat genen slechts tot expressie komen in bepaalde weefsels (wortel, pollen, delende cellen)
zorgen er voor dat genen slechts induceerbaar tot expressie komt (warmte, verwonding, pathogenen)
Stijn Vandelanotte
-2-
Biotechnologie: theorie
Genisolatie vertrekkende van mutantenanalyse
Modelorganismen
vooraf: belang van specifieke genen in de ontwikkeling v/e organisme komen tot uiting als een spontane mutatie
optreedt. essentieel in het gebruik van genen die aan de basis liggen van interessante eigenschappen is het isoleren
van die genen.
Probleem: spontane mutaties komen slechts zelden voor
doel: de frequentie van nuttige mutaties verhogen door deze modelorganismen te onderwerpen aan chemische of
genetische mutagenisatie systemen
Reversed genetics: zoeken naar de functie v/e gen vertrekkende v/e niet-gekarakteriseerde mutant met een
interessant fenotype
Wanneer is een organisme een modelorganisme:
eenvoudig op te groeien en in stand te houden met een korte levenscyclus
als ze geschikt zijn voor moleculaire analyse → inductie van mutatie is mogelijk, eenvoudig
ze zijn transformeerbaar
in de planten genetica heeft het onkruidplantje Arabidopsis thaliana (zandraket) alle andere modelplanten
verdrongen. Hoe is dit te verklaren?
Het zit genetisch makkelijk in elkaar
In 1 set v. 5 Chromosomen zitten 125 Mb→ deze bevatten alle instructies om een bloeiende plant te maken
Levenscyclus van 5 – 6 weken: van 1 zaadje naar 10.000 andere zaadjes
Zelfbestuiving → homozygoot kan in stand gehouden worden
Kleine afmetingen en vereist dus bijgevolg weinig plaats
Gemakkelijk mutanten induceerbaar en in stand gehouden worden
Kan gemakkelijk getransformeerd worden
In de dieren genetica is de vrijlevende nematode Caenorhabditis elegans een vergelijkbaar modelorganisme en wordt
vooral in de genetica aangewend om wille vd volgende eigenschappen
Zeer klein wormpje → behandelbaar als een mo
Meestal hermafrodieten XX → zelfbevruchting → homozygoot
Soms ontstaan er XO mannetjes die de eitjes vd hermafrodieten kunnen bevruchten
Diploïd met 5 autosomale chromosomen en 1 paar seks-chromosomen
Alle cellen zijn transparant en zichtbaar met microscoop
Bij 20° is de levenscyclus slechts 3 dagen, bij gemiddelde temperaturen 2-3 weken
In deze tijd legt de hermafrodiet ongeveer 300 eitjes
Klassieke of chemische mutagenisatie en isolatie vh gen
Ioniserend en niet-ioniserende bestraling → Radioactieve straling en UV straling
Ioniserende straling: X stralen … mechanisme
Veroorzaakt direct schade aan het DNA in de celkern zoals ss en ds breuken die leiden tot reorganisatie
deleties en zelfs chromosoomverlies of wijzigingen in de basen waardoor mutaties ontstaan
Door de hoge energie vd stralen ontstaan veel reactie vrije radicalen in het cytoplasma vd cel die kunnen
interageren met DNA, eiwitten en lipiden in het celmembraan
Niet ioniserende straling: UV straling … mechanisme
De energie wordt geabsorbeerd door DNA basen en aromatische AZ waardoor er toch sterke biologische
effecten optreden
Veroorzaakt voornamelijk de vorming van thymine dimeren waardoor er een blokkering van replicatie of
transcriptie optreedt die mutaties of reorganisaties vh chromosoom tot gevolg hebben
Behandeling met chemicaliën die wijzigingen in het DNA veroorzaken → bv EMS
De plaats vd mutatie is niet eenvoudig te bepalen
EMS = ethylmethanosulfonaat = veel gebruikt chemisch mutagen dat een zeer hoge frequentie van puntmutaties
kan opleveren
Veroorzaakt methylatie van guanine residuen in het DNA
Veroorzaakt GC/AT transities
Het modelorganisme wordt aan zo’n mutagen blootgesteld en na zelfbevruchting worden nakomelingen gewonnen
Pas in deze generatie kunnen recessieve mutaties tot uiting komen en geselecteerd worden
Is er een interessante mutant? Dan moeten we deze trachten te isoleren
Positional cloning:
Wat? manier om gegevens over het op voorgaande manier gemuteerd gen te bekomen
Hoe? Het gen wordt geisoleerd obv zijn chromosomale positie
Werking?
Men voert een testkruising uit met een niet verwante lijn en in de F2 vergelijkt men het overervingspatroon
vd mutatie met dat van gekende genen
Als de 2 loci bijna steeds samen overerven dan liggen ze dicht bij elkaar
Zo maakt men een ruwe plaatsbepaling vh gen en bakent men een gebied af van gemiddeld 10 Mb, waarin
10tallen of 100en genen kunnen inliggen
Stijn Vandelanotte
-3-
Biotechnologie: theorie
Genetische mutagenisatie: mutaties met een vlaggetje (tag)
Getagde mutaties zijn gemakkelijker op te sporen en worden veroorzaakt door mobiele genetische elementen en
gekenmerkt worden door een tag.
Tag? Stuk DNA dat zich nestelt op een willekeurige plaats in het genoom en dat zo een gen kan inactiveren
Gebruikte tags? Vooral transposons (springende genen) en bij planten het T-DNA van A. Tumefaciens
Transposons = springende genen,
Voorkomen: in bacteriën, planten en dieren
Functie: dragen bij tot de genetische variabiliteit van een
organisme
Mechanisme → een eenvoudige Tn bestaat uit
♦ 2 omgekeerde herhaalde sequenties (inverted repeat, IRs)
♦ Een gen dat codeert voor het transposase
♦ Het transposage herkent de IRs maakt een ds knip en
doet het Tn integreren op een andere plaats in het
genoom (cut and paste)
T-DNA
Mechanisme
♦ De bacterie herkend verwonde plantencellen
♦ In respons daarop wordt een ss T-streng aangemaakt
♦ Deze wordt getransfereerd naar de plantencel
♦ De T-streng wordt geïntegreerd in het genoom
Vooral bij planten
T – DNA transfer is onder laboconditites ook aangetoond voor schimmels en zelfs dierlijke cellen
Werking?
De mutant kan worden opgespoord door DNA-gelelektroforese en hybridisatie met de radioactief gemerkte
tag-sequentie als probe
Het stukje DNA waarop de probe bindt wordt uit de gel gesneden en met een “sequencer” wordt de base
volgorde ervan achterhaald
Deze gegevens kan men mbv bioinformatica het gedigitaliseerde genoom vd modelplant afscannen om de
volledige sequentie vh gen op te sporen
Opsporen van promotors: promotor trapping
Wat? een meer gesofisticeerde manier van ‘tagging’ ⇒ promotor trapping
Werking?
Een promotorloos reportergen wordt via een transposon of T-DNA binnengebracht in een plant of dier
Voorbeelden van reportergen: GUS of GFP gen
Als deze reporter nu achter een actieve promotor komt, zal de promotor intact blijven maar zal het gen inactief
worden → het reporter gen komt tot uiting in een bepaald orgaan
Voorbeeld: promotor, die normaal in de bladsteel de transcript v/e gen voor een bepaald enzym start, zal nu
het reportergen tot uiting brengen in de bladsteel
OPM: het reportergen kan hier ook als ‘tag’ gebruikt worden om de promotor sequentie op te sporen
Homologe of allelische mutaties
Hoe kan men controleren of 2 gelijkaardige mutaties homoloog zijn?
Stel 2 dwergmutanten → is deze mutatie vh zelfde gen?
Oplossing: kruising van de 2 mutanten
→ F1 opnieuw dwerggroei → mutaties van hetzelfde gen
→ F1 normaal → mutaties van verschillende genen
Het intacte alles vd ene ouder compenseert het defecte allel vh andere
Small interfering RNA (siRNA) en RNA interferentie (RNAi)
Vooraf:
RNA wordt nooit vertaald tot eiwit, wel interageert het met RNA, DNA en eiwitten
RNAi is een Post transcriptionele gene silencing? Bedoelt om cellen te beschermen tegen viraal RNA
dsRNA is een teken van infectie en activeert een anti-virale respons
RNAi is een mechanisme van gene silencing dat geïnduceerd wordt door dsRNA
RNAi is sequentie-specifiek en leidt tot de degradatie van zowel ssRNA en dsRNA (meestal mRNA)
RNAi is een zeer krachtig mechanisme: minder dan 50 moleculen siRNA kunnen een doelwit RNA
uitschakelen dat in duizenden copijen per cel aanwezig is
in planten en C. elegans kan het RNAi effect zich ook verspreiden doorheen het organisme
Stijn Vandelanotte
-4-
Biotechnologie: theorie
Werking
een lange molecule wordt door het ribonuclease Dicer verknipt tot stukjes
van 21-23bp (short interfering RNA)
de siRNAs worden gebonden door proteïnen die samen het RNA-induced
silencing complex (RISC) vormen
in het geactiveerde RISC worden de strengen van het siRNA ontwonden
zodat baseparing met het target RNA kan optreden
in het geactiveerde RISC worden de strengen van het siRNA ontwonden
zodat baseparing met het target RNA kan optreden
het RNA-afhankelijk RNA polymerase gebruikt het afgebroken mRNA als
template om dsRNA te maken
dit dsRNA wordt opnieuw door Dicer verknipt tot siRNA, wat leidt tot een
versterking van het RNAi effect
dit kunnen we nu ook gebruiken om op een gerichte manier specifieke genen uit
te schakelen → forward genetics
forward genetics: vertrekken van een gen en een gerichte mutatie maken
Genisolatie mbv informatica
Wat?
wetenschappelijke discipline die op de grens ligt tussen informatica en biologie
Werking?
Bioinformatici gebruiken de informatie die bekomen wordt uit “echte” experimenten uitgevoerd door
(moleculair) biologen, biochemici, pathologen… om in silico of “droge” experimenten te doen
Gebruik?
In hedendaags onderzoek van zo goed als elke discipline komt bioinformatica van pas
Belang?
De bioinformatica is heel belangrijk geworden om te kunnen omgaan met de enorme hoeveelheid informatie die
afkomstig is van genoomwijde studies (genomische sequenties, microarray- en andere expressiedata, ESTs,
metabolische informatie, interactomen,…), om die te stockeren in databanken, om die ten volle te benutten, en
om die te gebruiken om hypothesen voorop te stellen
Hoe kan bioinformatica helpen bij genisolatie?
Functionele genen liggen in een zee van junk-DNA, maar kunnen gelokaliseerd worden door de aanwezigheid
van korte typische basenvolgorden. Door de sequentie van nieuwe genen te vergelijken met gekende genen
kunnen ze in families in gedeeld worden en kan men een idee krijgen van hun functie.
Stel bij een muis vindt men een gen voor een aandoening dan is er ook veel kans opdat het bij de mens ook
voorkomt, afgezien het feit er veel variatie ontstaan is kan de pc gemakkelijk analoge delen eruit halen. De pc
doorloopt de sequentie vh menselijk genoom en vindt heel snel vergelijkbare sequenties bij de mens. Deze
informatica is een goed aanknopingspunt voor het ontwikkelen van geneesmiddelen
Stijn Vandelanotte
-5-
Biotechnologie: theorie
Hoofdstuk 3: Kloneren van genen
Definities
De basisstappen in een kloneringsexperiment zijn de volgende
het te kloneren DNA wordt binnengebracht in een vector; dit resulteert in een recombinante DNA molecule
de vector wordt binnengebracht in een gastheer, meestal E. coli
in E. coli vermeerdert de vector waardoor talrijke copijen van het gekloneerde DNA ontstaan
bij celdeling van de gastheercel krijgt elke dochtercel een aantal copijen van de vector
na één nacht incuberen ontstaat een kolonie van identieke cellen die elk talrijke copijen van het recombinante
DNA bevatten
het gen is gekloneerd: het is vanuit zijn complexe genomische achtergrond geïsoleerd en kan eenvoudig
vermeerderd worden in een technisch toegankelijk systeem
Voorwaarden om kloneren mogelijk te maken
Aanmaken van vectoren
Transformatiesystemen ontwikkelen
Technieken op punt te stellen om DNA te isoleren, visualiseren en te manipuleren
Kloneren eenvoudig? Ja, maar! Er moeten talrijke stappen gerealiseerd kunnen worden om dit mogelijk te maken:
het vector DNA moet gezuiverd en geopend kunnen worden
het te kloneren DNA moet geïsoleerd kunnen worden
het te kloneren DNA moet in de vector kunnen geïnsereerd worden
het verloop van dit knippen en plakken moet kunnen gevolgd worden
het resulterende recombinante DNA moet kunnen binnengebracht worden in een gastheercel
E. Coli?
Gram-negatieve bacterie die deel uitmaakt van de normale dikke darm flora en ons voorziet van vitamine K
reeds sinds zeer lang gebruikt als modelsysteem
relatief gemakkelijk te manipuleren
Voordelen: gemakkelijk te groeien, zeer korte verdubbelingstijd (20 minuten onder optimale condities)
Enzymen om DNA te manipuleren
Een biotechnoloog heeft heel wat enzymen ter beschikking om DNA te manipuleren. Ze worden in 5 klassen onder
verdeeld
Nucleasen verknippen, verkorten of degraderen DNA; zoals exo- en endonucleasen en restrictie-enzymen
Ligasen voegen DNA-strengen samen
Polymerasen kopiëren DNA
Modificerende enzymen verwijderen of voegen chemische groepen toe; zoals kinasen, fosfatasen en
methyltransferasen
Topo-isomerasen verwijderen draailussen in het DNA
Restricitie-enzymen
Wat? bacteriële endonuleasen die een bepaalde sequentie in het DNA herkennen en slechts DNA verknippen waarin
deze sequent voorkomt
Functie? ‘vreemd’ binnenkomend DNA af breken
Types
Type I: knippen op een onbepaalde willekeurige plaats buiten de herkende sequentie
Type II: knippen binnen de sequentie die herkend worden
in de moleculaire biologie worden enkel deze gebruikt
Type III: knippen op een welbepaalde plaats op een korte afstand buiten de herkende sequentie
Er moet gezorgd worden dat een organisme dat een specifiek restrictie-enzym aanmaakt natuurlijk zijn eigen DNA
ter hoogt van die sequentie tegen afbraak beschermen
Hoe? Door bij nieuw gesynthetiseerde dubbelstrengen één vd strengen te methyleren
Methylasen → herkennen sequentie → methyleren op die plaats een andere streng → beschermd tegen
activiteit vh restrictie-enzym
In het DNA van alle zoogdieren, hogere planten en talrijke prokaryoten zijn bepaalde gebieden gemethyleerd
wat problemen kan opleveren bij het gebruikt van restrictie-enzymen
Benaming
Letterwoord afgeleid vd geslacht- en voornaam en de stam vd bacterie waaruit ze zijn geisoleerd
Bv: BamHI = bacillus amyloliquefaciens H
Stijn Vandelanotte
-6-
Biotechnologie: theorie
Werking
Herkenningsequentie is vaak een palindroom. Bij het knippen kunnen even eindjes gevormd worden (blunt end)
De herkende palindromen worden dan precies doormidden geknipt, als er oneven of overhangende uiteindjes
gevormd spreekt men van sticky ends
Optimale werking bij
een bepaalde temperatuur
een bepaalde ionensterkte
zuurtegraad
in aanwezigheid van specifieke co-factoren (divalente ionen en stabiliserende moleculen)
Andere
de specifieke activiteit: 1 U = de hoeveelheid enzyme nodig om 1 µg DNA af te breken in 1 uur
een enzym kan meestal geïnactiveerd worden door een korte incubatie (10-tal minuten) bij 70°C
Ligasen
Normaal celmetabolisme → functie: tijdens DNA replicatie
Recombinante DNA methoden → functie: 2 DNA fragmenten covalent met elkaar te verbinden door de vorming
van 5’-3’ fosfodiester binding tussen het 5‘-fosfaat uiteinde van de ene DNA streng met het 3‘-OH uiteinde van de
andere
ATP wordt gebruikt als co-factor
Voorbeeld ligase → T4 DNA ligase wordt het meest gebruikt voor kloneringen en is afkomstig van bacteriofaag T4
Polymerasen
Types
Klenow Fragment van DNA polymerase
Heeft een 5’ → 3’ polymerase activiteit en een 3’ → 5’
exonuclease activiteit en beide kunnen gebruikt worden om
overhangende eindjes om te zetten in blunt eindjes
Taq DNA polymerase
Gebruikt voor de exponentiele vermeerdering v/e DNA fragment
in PCR Reactie
Reverse transcriptase
Probleem? Soms is het wenselijk om DNA sequenties te
vermeerderen die in een bepaald weefsel tot expressie komen.
⇒mRNA’s van dat weefsel zijn de aangewezen startmodules
Oplossing? Het mRNA moet worden omgezet in het
complementaire DNA (cDNA) mbv reverse transcriptase
Oorsprong: dit enzym is een RNA-afhankelijk DNA polymerase
en is afkomstig van retrovirussen
Werking?
Topo-isomerasen
DNA topo-isomerase I speelt een rol bij DNA replicatie en transcriptie: door een ss knip te maken kunnen supercoils
ontwinden → daarna worden de 2 uiteinden terug aan elkaar geligeerd
Scheiding en visualisatie van DNA-fragmenten
De fragmenten worden gescheiden door gelelektroforese.
Principe: Het DNA draagt een negatieve lading →beweegt hierdoor in een elektrisch veld naar de positieve pool
Waar: De elektroforese wordt uitgevoerd in een gel. Dit kan een poly-acrylamidegel of een agarose-gel zijn, dat
gevormd is uit een netwerk van polymeren.
De kleine DNA-fragmenten bewegen er snel doorheen, de grote traag ⇒ DNA volgens grootte gescheiden.
De fragmenten worden zichtbaar gemaakt door
Toevoegen vh DNA-mengsel ethidiumbromide of sybergeen en achteraf met UV belichten
Voordeel = zeer scherpe bandjes ↔ nadeel = zeer toxisch geheel
Toevoegen van kleurstoffen zoals methylblauw
Voordeel = minder toxisch en geen UV belichting nodig achteraf ↔minder scherpe bandjes
OPM: Als referentie wordt in een aparte baan een DNA-ladder meegelopen.
Dit is een mengsel van DNA-fragmenten met een exact gekende lengte.
Dankzij deze moleculaire meetlat kan de grootte van elk experimenteel DNA-fragment geschat worden.
Stijn Vandelanotte
-7-
Biotechnologie: theorie
Recombinantie van genen
Traditionele klonering via knippen en plakken
De belangrijkste kloneringsvectoren zijn omgebouwde plasmiden
Bv plasmide pBR322 uit E. Coli
Het draagt genen voor antibioticum resistenties (bv ampicilline en
tetracylineresistentie) → Enkel bacteriën die deze vector dragen zijn in staat te
groeien op een medium die AB bevat
Het heeft herkenningsplaatsen voor een reeks restrictie-enzymen
Het heeft een specifiek replicatiepunt voor E. Coli, waarin het plasmide na
transformatie autonoom kan repliceren. ⇒ vector wordt een replicatievector
Werking
Vector (bv pBR322) kan geknipt worden (bv met EcoRI)
Een vreemd gen dat op dezelfde manier verknipt is kan dankzij sticky ends in het
opgeknipte plasmide ingepast worden
Een ligase katalyseert de binding wat resulteert in een gerecombineerd plasmide
pBR322 is nu de vector vh vreemde gen
OPM:
door het inbouwen van multikloneringsplaatsen, oligonucleotiden met knipplaatsen
voor meerdere restrictie-enzymen worden de toepassingsmogelijkheden vergroot
multikloneringsplaatsen zijn echter wel slechts zinvol als hun restrictieplaatsen niet elders
op het plasmide voorkomen en als ze ingebouwd worden in niet vitale gebieden vh plasmide
TOPO-Kloneringen
Probleem? Alhoewel ligasen bij het plakken van restricitieenzymen zeker hun
nut bewezen hebben was er door het gebruik vd PCR reactie om te kloneren
aan een meer efficiente ligeringsmethode → oplossing: TOPO vectoren
TOPO-vectoren
topo-isomerase I van vaccinia virus herkent de sequentie CCCTTAAGGG
→ topo-isomeraseknipt het tussen de 2 T-residues wat een overhangend
eindje van één T-residue oplevert
→ het Taq polymerase dat gebruikt wordt bij PCR reacties hangt een extra
A-residue aan het fragment
→ samenvoegen van de TOPO-vector en het PCR product
⇒ A en T vormen met elkaar baseparen en het topo-isomerase ligeert
beide DNA fragmenten aan elkaar
Deze reactie is zeer efficiënt
Gateway technologie → meest moderne vorm van klonering
Wat? technologie gebaseerd op
toxine/antitoxine genen voor de stabiliteit van plasmiden met een laag kopij aantal (ccd B gen)
mechanisme van plaatsspecifieke recombinatie van faag λ in en uit het genoom van E. coli
Voordelen
Overbrenging van DNA fragmenten vd ene vector naar de andere wordt sterk vereenvoudig, flexibel en efficiënt
Verschillen met voorgaande methodes
Werking van restrictieenzymen en ligase wordt vervangen door plaatsspecifieke recombinantie thvd attL, attR
en attP recombinantiesites die gebruikt worden door bacteriofaag λ voor de uitwisseling vd DNA-fragmenten
Werking → er zijn 2 verschillende reacties in dit kloneringssysteem (BP en de LR-reactie)
BP – reactie
spontane uitwisseling vd DNA sequentie tussen de attB1 en de attB2 sites op ene DNA molecule (bevat het
te kloneren fragment, dit kan een vector of een PCR fragment zijn) en de sequentie tussen de attP1 en de
attP2 sites op de Gateway donor vector (bevat het ccdB gen)
door recombinantie thv deze sites ontstaat
enerzijds een entry clone waarin het te kloneren fragment geflankeerd is door attL1 en attL2 sites
anderzijds een bijproduct waarin het ccdB gen geflankeerd is door attR1 en attR2 sites
OPM: essentieel is wel het toedienen van een BP Clonage mix van recombinante proteinen
Stijn Vandelanotte
-8-
Biotechnologie: theorie
LR – reactie (= zelfde principe)
Nu zullen de attL1- en de attL2-sites vd entry clone en de attR1 en de attR2 sites vd Gateway destination
clone vector met elkaar recombineren waardoor een expression clone gevormd wordt met het gewenste gen
tussen attB sites en een bijproduct met attP sites
OPM: essentieel is hier het toedienen van LR Clonage mix
Zowel de donor vector uit de BP-reactie als de destination vector uit de LR-reactie dragen tussen hun
recombinante sites het ccdB gen, dat lethaal is voor de meeste E.Coli stammen omdat het DNA gyrase inhibeert
De bijproducten vd beide reacties en de niet-gerecombineerde donor en destination vectoren die aanwezig zijn
in de reactiemix zullen dus niet vermeerderd worden doordat de E. coli bacteriën waarin ze getransformeerd
worden zullen afsterven
Wegselecteren van niet-gerecombineerde expressien en entry clone gebeurt dmv AB in het medium waarop de
transformatiemengsels worden uitgeplaat:
E. Coli cellen met niet-gerecombineerde expression clone uit de BP-reactie kunnen niet groeien op
kanamycine en niet-gerecombineerde entry clone uit de LR-reactie kunnen niet groeien op ampiciline
Gevolg is dat een heel groot percentage vd kolonies die zich na trransformatie ontwikkelen, het gewenste
plasmide bezitten. Bovendien zal de orientatie vh gekloneerd gen steeds zoals gewenst zijn door de
specifieke recombinatie tussen de att sites
Transformatie, selectie en screening
Transformatie?
De opname door een levende cel van exogeen DNA en het stabiel overerven van dit DNA
Onder geschikte voorwaarden wordt 1 enkele DNA-molecule in de gastheercel gevestigd en daar vermeerderd
Bacteriën die exogeen DNA kunnen opnemen en vestigen worden competent genoemd
E. coli vereist een speciale behandeling om competent te worden voor hitteschok transformatie
Werking behandeling
Inductie van competentie
Voorgroeien tot een densiteit 2.108 /ml en koelen tot 0°C
Cellen wassen met 0,1 M MgCl2 en daarna heropnemen in 0,1 M CaCl2
10min op ijs bewaren en concentreren via centrifugatie
vanaf nu zijn ze competent voor transformatie
♦ → direct aanwenden of stockeren (in aanwezigheid van 30% glycerol bij -70°C)
Eigenlijke transformatie
Samenvoegen competente cellen met het te transforrmeren DNA en 10min op ijs houden
Hitteschok van 50sec bij 42°C → belangrijk voor penetratie vh DNA in de cel
Bacteriën terug 2 minuten op ijs houden
Cellen 10-voudig verdunnen met groeimedium en 10min incuberen bij de geschikte groeitemperatuur
Selectie
De cellen uitplaten op selectieve media en overnacht geincubeerd bij 37°C
Bij deze voorwaarden kunnen enkel de cellen groeien die het transformerend DNA hebben opgenomen
en aanleiding geven tot stabiele overerving vd selectiekenmerken die erop vervat liggen
Meer recente techniek om E. coli te transformeren is elektroporatie
Principe: competente cellen mengen met het te transformeren DNA en oiv/e hoogelektrische puls wordt het
DNA in de bacteriën gebracht
Detectietechnieken en selectietechnieken om de gewenste recombinanten op te sporen.
doel
de bacteriën die een plasmide hebben opgenomen moeten kunnen worden onderscheiden vd
oorspronkelijke
De bacteriën met een recombinant plasmide moeten kunnen worden onderscheiden van deze die enkel de
vector hebben opgenomen.
Hoe
Detectie
Veel gebruikt zijn vectoren die een multikloneringsplaats (MCS) hebben in het LacZ gen.
Lac Z codeert voor het enzym β-galactosidase en staat onder controle vd lac promotor
De aanwezigheid van het intacte gen resulteert in blauwe kolonies op het medium met de inducer IPTG
en het substraat X-gal
Bij recombinante klonen heeft de insertie vh vreemde DNA-fragmen plaatsgevonden in de MCS
♦ Deze bevindt zich tussen de lac Z gen en de lac promotor
⇒ het gen wordt inactief ⇒ X-gal kan niet meer in blauwe kleurstof worden omgezet ⇒witte kolonies
Selectie
Door het creeren van voorwaarden waarbij uitsluitend cellen die een recombinante vector bezitten
kunnen vermenigvuldigen. Veel gebruikt zijn antibioticumresistenties (bv ampicilineresistentie)
Stijn Vandelanotte
-9-
Biotechnologie: theorie
Hoofdstuk 4: Transformatie van planten
Dit betekent hier de overdracht v/e specifiek en meestal goed gedefinieerde DNA streng naar een plantencel
Het succes vd verschillende technieken is sterk afhankelijk van:
Plantensoort, Leeftijd vh weefsel, het explanaat
Methoden voor directe gentransfer
polyethyleenglycol (PEG)-gemedieerde transformatie
biolistics
electroporatie
T-DNA transformatie
via weefselkweek
in planta transformatie van zaden, bloemen
Andere methodes
directe opname via de pollenbuis
‘whiskers’
plantenvirussen
Strategieën voor direct gentransfer
omhelst de inbreng van grote hoeveelheden naakt DNA in plantencellen die tijdelijk permeabel zijn gemaakt
veel gebruikt voor de transformatie van graangewassen, maar ook toepasbaar in vele andere planten
in de meeste gevallen moet een in vitro regeneratiesyteem beschikbaar zijn om uit het getransformeerde
plantenmateriaal volledige planten te bekomen
Vectoren voor directe gentransfer
Aangezien grote hoeveelheden DNA nodig zijn om een directe gentransfer nodig te maken gebruikt men vaak
vectoren zoals pUC of pBluescript die in grote aantallen gekopieerd kunnen worden door E.coli
Deze vectoren moeten volgende sequenties bevatten
Voor E. Coli
Restrictieplaatsen voor de insertie van het te transfereren DNA
Een functioneel replicatiestartpunt voor E. coli
Een antibioticaresistentie voor de selectie van gerecombineerde bacteriën
Eventueel een detectiesysteem dat werkt in E. Coli
Voor de plant
Het te transfereren gen onder controle van plant-regulatorische sequenties
Een merkergen dat de selectie mogelijk maakt van getransformeerde plantencellen
Een eventueel detectiesysteem dat werkt in de plantencellen (reporter)
PEG-gemedieerde transformatie van protoplasten
Protoplasten
Wat? plantencellen zonder de cellulose celwand, maar met een intacte celmembraan
OPM : Voor sommige planten, zoals tabak, rijst en mais, kunnen de protoplasten in vitro regenereren tot nieuwe
planten
Polyethyleenglycol (PEG)
Werking
PEG = Is een niet toxische molecule die plaatselijk het plasmamembraan kan destabiliseren,
Hierdoor kan het DNA in aanwezigheid van divalente kationen bv Ca2+ binnenglippen in de cel
Het DNA migreert vervolgens naar de kern → DNA integreert in de chromosomen
Wanneer de geïntegreerde genconstruct tot expressie komt, kan de recombinante protoplast geselecteerd
worden door zijn nieuw verworven antibioticum- of herbicidenresistentie
De protoplasten laten een nieuwe celwand aangroeien en kunnen geregenereerd worden tot een nieuw plant
Voordelen vd PEG-gemedieerde transformatiemethode
Het is eenvoudige, efficiënte en goedkope methode
De methode is toegankelijk voor talrijke plantensoorten en weefsels aangezien het mogelijk is om grote
hoeveelheden protoplasten te bereiden
De getransformeerde cellen overleven en delen goed
Nadelen vd PEG-gemedieerde transformatieperiode
Protoplasten zijn vrij fragiel (→ geen celwand) en dus is er enige vaardigheid vereist om ermee te werken
Gebruikte DNA is naakt⇒ het tijdens de procedure kan het afgebroken worden of reorganisaties ondergaan
De regeneratie van vruchtbare planten vanuit protoplasten is moeilijk voor sommige plantensoorten
Een alternatieve methode voor de transformatie van protoplasten maakt gebruik van liposomen
Wat? kunstmatige blaasjes die ontstaan door spontane schikking van fosfolipiden
Werking?
Het te transfereren DNA wordt ingekapseld in deze fosfolipiden → fusie mogelijk met plasmamembraan in
aanwezigheid van PEG → liposomen komen in cytoplasma vd protoplasten → lossen daar hun inhoud.
Stijn Vandelanotte
-10-
Biotechnologie: theorie
Transformatie door elektroporatie
Deze techniek is gebaseerd op het principe dat de ontlading van een korte, hoog-voltage
elektrische micropuls (5µs) tijdelijk poriën induceert in de celmembraan
De fosfolipiden in het plasmamembraan hebben een sterk dipool karakter. Door middel van
elektrische puls van een hoge veldsterkte worden ze allemaal gelijk gericht. Het
plasmamembraan wordt permeabel waardoor het op de buitenkant van deze membraan
geprecipiteerde DNA naar binnen glipt.na de puls herstellen de fosfolipiden hun
oorspronkelijke configuratie.
Voordeel Elektroporatie
werd aanvankelijk enkel gebruikt voor de transformatie van protoplasten maar kan nu ook toegepast worden op
intacte plantencellen van weefselstukjes waardoor regeneratie van transgene planten eenvoudiger is
Nadeel elektroporatie
Er zijn voor en nabehandelingen van het weefsel nodig
Biolistics
Principe: de celwand mechanisch te doorboren en het DNA doorheen de ontstane opening af te leveren aan de
plantencel.
Types technieken
Dit zou in principe kunnen d.m.v. micro-injectie(zoals bij dierlijke systemen), maar deze methode staat bij
planten nog in haar kinderschoenen.
Een techniek waarmee nu reeds grote successen worden geboekt heet “particle gun bombardment”.
Werking:
Het te transfereren genconstruct wordt elektrostatisch gefixeerd op wolfraam of goudbolletjes.
Deze bolletjes worden aangebracht op een nylonplaat die afgeschoten wordt en plots tot stilstand komt
tegen een stopplaat met een opening.
De microprojectielen worden met grote snelheid in de doelcellen of het doelweefsel geschoten.
Dankzij hun soortelijk gewicht bezitten de bolletjes een hoge kinetische energie en zijn ze in staat de
celwand te doorboren.
Het DNA wordt massaal ingeschoten en kan zich in bepaalde gevallen integreren in het nucleair
genoom of dat van de chloroplasten of mitochondriën.
Nadeel
Het DNA wordt dus niet zo netjes afgeleverd zoals A.tumefaciens dat doet.
De efficiëntie van DNA integratie is eerder laag ⇒ stabiele transformatie wordt niet zo vaak bekomen
Omdat een meristeem (alleruiterste groeipuntje) uit drie lagen van onafhankelijke cellijnen bestaat, is de kans
op het bekomen van chimeren heel reëel. In dit geval is slechts een deel van de plant afkomstig van
getransformeerde cellen.
Voordeel:
Vooral voor moeilijke (monocotyle) gewassen kan de techniek grote voordelen opleveren. Men kan immers ook
meristemen beschieten, die gemakkelijker tot nieuwe planten uitgroeien dan bladweefsel of callus.
door de hoge inbreng van DNA in talrijke cellen kan men gemakkelijke transiente genexpressie bestuderen
Gentransfer met vectoren afgeleid naar Agrobacterium
Crown gall en hairy root disease
Agrobacterium tumefaciens is een in de grond voorkomende bacterie die de kroongal ziekte veroorzaakt
Kroongal ziekte? Tumoren verschijnen op de wortelhals en op andere organen
Gastheerplanten? Zeer breed gastheerspectrum (suikerbiet, roos, peer, appel)
Ze bezitten naast een chromosomale DNA een groot plasmide het zg TI-plasmide (tumor inducing)
Opines? nieuw soort molecule door tumoren Afgescheiden in hun intercellulaire ruimten
Types: octopine, nopaline, agropine
Type geproduceerd is afhankelijk van de bacteriele stam die de tumor induceerd
Agrobacterium rhizogenes die de hairy root disease veroorzaakt
Hairy root disease? Ter hoogt v/e verwonding de wortelcellen ertoe aanzetten te dedifferentieren en kluwens
van wortels te vormen
Ze bezitten naast een chromosomale DNA een plasmide het zgn RI-plasmide (root inducing)
Opines?
Types: agropine, mannopine, cucumopine
De Ti en Ri-plasmiden hebben een replicatiestartpunt voor
Agrobacterium
een virulentiegebied (vir) → de vir genen kunnen zowel in cis als in trans werken
genen voor het catabolisme van opines
genen die instaan voor plasmide transfer tussen bacteriele cellen via conjugatie
het T-DNA
Stijn Vandelanotte
-11-
Biotechnologie: theorie
Moleculaire basis vd interactie tussen agrobacterium en de plant
om planten transformatie uit te voeren, maakt A tumefaciens gebruik van 3 sets van genen
verschillende chromosomale genen bepalen chemotaxie naar (chvE) en aanhechting aan de (verwonde)
plantencellen (chvA-B; cel ; pscA; exoC)
het T-DNA op het Ti-plasmide wordt getransfereerd naar de plantencel en zorgt voor de
symptoomontwikkeling
het vir gebied op het Ti-plasmide staat in voor het mechanisme van T-streng vorming en transfer
Stap 1: herkenning en aanhechting van de bacteriën aan
gekwetste plantendelen
Plantencel wordt gekwetst → productie van fenolische
verbindingen (bv acetosyringone en hydroxyacetosyringone)
→deze trekken Agrobacterium chemotactisch aan
→ bacterie hecht zich aan cel dankzij de constitutieve
expressie van een aantal van haar chromosomale genen
Stap 2: inductie van het vir systeem
Acetosyringone en hydroxy-acetosyringone activeren het
eiwit VirA
VirA is het sensor histidine kinase v/e twee-component
waarvan VirG de respons regulator is
Eenmaal geactiveerd zorgt VirA voor de fosforylatie vh
VirG eiwit dat in de cytosol aanwezig is
Eenmaal geactiveerd zorgt VirG voor de activatie van de transcriptie van andere vir genen
Deze genen coderen voor de eiwitten die noodzakelijk zijn voor
de vorming vd T-streng,
voor het transport vd T-streng uit de bacteriele cel naar de plantencel
voor de integratie van de T-streng in de nucleus vh plantengenoom
Stap 3: vorming van de T-streng
Het T-gebied wordt aan de linker- en rechterzijde begrensd door repetitieve sequenties: left en right border
Bij de vorming vh T-gebied zijn het virD en virC operon betrokken en het virE2 eiwit
VirD1 ontwart specifiek het T-DNA gebied
VirD2 kan nu thvd borders en via zijn endonuclease activiteit een enkelstrengige knip maken waardoor een
enkelvoudig T-DNA-streng kan gevormd worden
VirC1 en VirC2 helpen hierbij
Het gevormde T-DNA moet beschermd worden tegen nucleasen en moet talrijke barrieres passeren
Dit kan door het te complexeren met talrijke virE2 eiwitten
VirD2 blijft gebonden op de terminus van dit T-complex en zorgt voor het verdere transport
Stap 4: vorming van de T-pilus
Transport vh T-complex uit de bacteriele cel → = 1e hindernis
Hiervoor moet de dubbele membraan vd bacterie overbrugd worden
VirB operon codeert voor de vorming vd zgn T-pilus
Deze pilus zit verankerd in de beide membranen ⇒ vormt een porie doorheen de membraan
Stap 5: transfer vh T-complex naar de plantencel
Nog niet opgehelderd
Stap 6: integratie van de T-streng in het plantengenoom
VirE2 en VirD2 zorgen dat het T-DNA naar de celkern kan migreren
Beide eiwitten hebben nucleaire lokalisatiesignalen die door specifieke plantenproteinen worden herkend
Eens in de kern gaat de T-streng in een chromosoom integreren en is de transformatie een feit
Stijn Vandelanotte
-12-
Biotechnologie: theorie
Stap 7: expressie van hormoon biosynthese genen vh T-DNA door de plantcel leiden tot ongecontroleerde celdelingen en
tumorvorming
T-DNA bevat genen die coderen voor de productie van 2 plantenhormonen: cytokinine en auxine
Veel plantpathogene bacteriën bevatten dergelijke genen, maar wat agrobacterium zo uniek maakt is dat in het
T-DNA deze genen onder controle staan van eukaryote signalen ⇒ efficiente expressie eens het T-DNA in het
plantengenoom is geintegreerd
T-DNA bevat ook genen die de gevoeligheid en/of tolerantie vd plantencellen voor hormonen wijzigen
De expressie van deze genen zorgt ervoor dat de plantencellen te veel auxine en cytokinine gaan produceren en
gaan ze de celdeling activeren
Bij A. tumefaciens ⇒ tumoren die bestaan uit ongedifferencieerde cellen
Op kroongallen ontstaan normaal gezien geen scheuten door de hoge concentratie aan Aux en Cyt
Bij A. rhizogenes ⇒ meeste genen betrokken bij productie van Aux ⇒ ontstaan van wortels
Op hairy roots kunnen wel scheuten ontstaan → deze zijn transgeen en vertonen gewijzigde
bladvormen, wortelvorming of bloeitijdstip
Het T-gebied van A. Tumefaciens bevat
Tms1 → tryptofaan converteren in IAM
Tms2 → enzym die IAM hydroliseert tot IAA
Tmr
6b → een oncogeen dat tumoren induceert.
Het T-gebied van A. rhizogenes bevat 2 grote delen
Rechtse deel: aux1 en aux2 (homoloog aan tms1 en tms2)
Linkse deel: rolA,rolD → rol onbekend, rolB → maakt auxinen, rolC → maakt cytokininen vrijdag
Stap 8: expressie van opine biosynthese genen vh T-DNA door de plantencel leiden tot productie van voedingsstoffen
voor de koloniserende bacteriën
T-DNA bevat ook genen voor de synthese van een nieuw soort molecule dat ontstaat door het verbinden v/e
ketozuur en een aminozuur
Op het T-DNA van A. tumefaciens staan de 0’, 1’, 2’ genen in voor de synthese van agropine en mannopine
Het gen 6a codeert voor een permease voor de excretie van deze opines uit de getransformeerde cellen
Het rechterdeel van A.rhizogenes bevat de opinesynthese genen 0’, 1’ en 2’
De plantencel is als het ware genetisch gekoloniseerd
Ze wordt met een aantal genen opgezadeld waardoor ze een tumor vormt waarvan de cellen opines produceren
Deze opines zijn komen ten goede aan de bacterie
Agrobacterium transformeert de plant dus in een voedselfabriekje
DNA-transfertechnieken mbv Agrobacterium
De constructie van vectoren afgeleid van Ti-plasmiden
Algemeen
De oncogenen op het TI-plasmide maken de regeneratie van scheuten onmogelijk
De oncogenen op het RI-plasmide zorgen voor ongewenste afwijkingen
Al snel werd duidelijk dat de sequenties die zich tussen de left en right border bevonden niet van belang waren
voor het transformatieproces op zich (uiteraard wel voor symptoomvorming), maar dat men tussen beide
borders eender welk gen kon plaatsen → bij aanwezigheid vd vir-genen werden deze dan in de plantencel
ingebouwd
Dit leidde tot de ontwikkeling van ontwapende vectoren waarin de oncogenen waren verwijderd
Aangezien de vir-genen ook in trans functioneren werd het mogelijk om het gewenst T-DNA op een andere
vector in elkaar te knutselen (dus een vreemd gen tussen left en right border) om vervolgens dit plasmide te
gebruiken als transformatievector.
Om uiteindelijk de vereiste combinatie van T-DNA en vir gebied te bekomen zijn er 2 strategieen
Binaire strategie
coïntegratie strategie
2 Binaire strategie
Stijn Vandelanotte
-13-
1 Coïntegratie strategie
Biotechnologie: theorie
Om uiteindelijk de vereiste combinatie van T-DNA en vir gebied te bekomen zijn er 2 strategieen
1) cointegratiestrategie →Hier ligt het vir-gebied op een disarmed TI-plasmide waarin het T-gebied een
intermediaire vector geïntegreerd werd door homologe recombinantie
2) binaire strategie → Hier worden het T-DNA en de vir-genen fysiek gescheiden. Het T-DNA wordt op een
klein plasmide van E.Coli geplaatst. Dit plasmide draagt een replicatiestartpunt dat in diverse gastheren
werkzaam is, waaronder Agrobacterium en E. Coli
Tussen left en right border bevindt zich een multiple restriction site voor het gemakkelijk invoegen van
vreemde genen
Deze binaire vector wordt via elektroporatie of door een thermische schok in A. tumefaciens stam
overgebracht, die over een vir-plasmide beschikt (een ontwapend TI-plasmide met enkel de vir-genen)
Voordelen:
zeer soepel en efficiënt
binaire vectoren dragen meestal al selectiemerkers en zelfs al promotor en terminatorsequenties
Transformatie van explanaten
het succes van transformatie wordt bepaald door 3 factoren
waardplanten spectrum
verbeterde in vitro cultuurtechnieken → elke maand meer plantensoorten transformeerbaar
er bestaan ook zgn recalcitrante soorten die in vitro niet te regenereren zijn
celcyclus
ouderdom en fysiologische staat vd waardplant zijn belangrijk bij de transformatie-efficiëntie
soms zijn jonge planten of heel juveniele organen (cotylen en hypocotylen) transformeerbaar
de mate van differentiatie en de celcyclusfase spelen eveneens een rol
gebruikte explanaten
veel explantaten zijn reeds gebruikt in transformatieprotocols
bv: protoplasten, celsuspensies, callus, weefsel, wortels
de enige vereiste is dat na de transformatie , scheutregeneratie moet mogelijk zijn
methode die nu vaak wordt toegepast is: “Leaf disk”-methode van Horsch
bladschijfjes worden 2-3 dagen samen met een jonge bacteriecultuur geincubeerd
bacteriën steriel afspoelen
blaadjes op een callusinducerend medium plaatsen waarin cefotaxime en kanamycine is toegevoegd om de
resterende bacteriën te elimineren en de celdeling van niet getransformeerde cellen te beletten
blaadjes op een scheutinducerend medium plaatsen met dezelfde AB , maar met een hoger cyt/aux verhouding
de geinduceerde scheuten overbrengen op een bewortelingsmedium met cefotaxime en kanamycine
alleen de getransformeerde scheuten kunnen wortels vormen op kanamycine
nadien verder uitplanten en uittesten
Floral dip methode
een beperkt aantal gewassen (bv Arabidopsis en Petunia) kan men transformeren door de plant met de bloemen in
een agrobacterium suspensie te dompelen
Agrobacterium slaagt er blijkbaar in met de kiemende pollenkiembuis mee te reizen en de eicel binnen te dringen
Ook hier bevat het T-gebied , naast het gewenste gen, een selectie gen (basta-resistentie)
Slechts een fractie vd gevormde zaden (~1%) is getransformeerd
Door de kiemplanten te bespuiten met het herbicide Basta worden deze transformanten geselecteerd
Voordeel: zeer eenvoudige methode waar geen weefselkweek komt bij kijken
Nadeel: enkel van toepassing bij Arabidopsis en Petunia
Andere transformatiemethodes
Aangezien voor sommige planten geen goede resultaten worden bekomen met de bovengenoemde technieken, probeert
men nog steeds andere methodes uit
Opname van DNA via pollen
Rapporten, waarin wordt beschreven hoe transformatie wordt gerealiseerd bij granen door DNA over te brengen op
stijlen waar een pollenbuis zojuist doorheen gegroeid was, zijn nogal controversieel. Het DNA zou hierbij via de
pollenbuis in de eicel afgeleverd worden waardoor een getransformeerd embryo kan ontstaan.
Whiskers
wat? dunne holle siliconen buisjes gebruikt om naakt DNA binnen te brengen in plantencellen
werking?
Het naakt DNA mengen met de plantencellen en de whiskers en vervolgens stevig schudden
De buisjes gaan doorheen de celwand en veroorzaken porien waarlangs het DNA kan binnendringen
Probleem? → Ze zijn te vergelijken met asbestvezels en dus zijn ze een groot risico op longschade
Stijn Vandelanotte
-14-
Biotechnologie: theorie
DNA virussen
Het aantal DNA-virussen is heel beperkt
Best onderzochte voorbeeld = bloemkool mozaiek virus (CaMV)
Dit is een dsDNA-virus met een heel bijzondere DNA-structuur en heel bijzonder replicatiemechanisme
Werking ?
Virus of virus-DNA aanbrengen op het blad vd gastheer → genen vh virus worden ingebouwd in de plant?
Het DNA wordt niet ingebouwd in het gastheergenoom!
Het DNA wordt massaal vermeerderd en tot expressie komen in de studie
Voor de studie van transiente genexpressie kan de overdracht via CaMV dus nuttig zijn
Probleem?
Het grootste probleem is dat bij het gebruik van CaMV als vector dat tot nu toe bleek dat hoeveelheid DNA die
in het virus kan ingebouwd worden zeer beperkt is
Oorzaak:
de mutaties kunnen gemakkelijk geëlimineerd worden uit het virusgenoom
daarna treedt er een sterke selectiedruk op ten gunste van het wild-type virus
De selectie van getransformeerde scheuten
2 types van selectiesystemen
Positieve selectiesystemen → de getransformeerde cellen krijgen via de ingebrachte genen een selectief
voordeel op de niet-getransformeerde die wel blijven leven maar niet verder delen of ontwikkelen
Negatieve selectiesystemen → de niet-getransformeerde cellen sterven af, terwijl de getransformeerde cellen
blijven verder groeien
Negatieve selectiesystemen
Vaak gebruik van een AB-resistentiegen als selectie merker
Voorbeeld v/e veel gebruikt gen: nptII
Afkomstig van een bacterieel transposon
Het gen werd overgebracht naar het T-gebied en verleend resistentie aan kanamycine aan de transformant
Met een selectie druk van 50mg/L kanamycine → bijna enkel transformante scheuten die uitgroeien
Er zijn echter nog altijd zgn “ontsnappers”
Dit kun je oplossen door een bewortelingstest op een bewortelingsmedium met kanamycine → meer
zekerheid
Als bij bepaalde gewassen de toegevoegde kanamycine de regeneratie van scheuten verhindert, kan overwogen
worden om een herbicidenresistentie als selectiemerker te gebruiken
Nadeel: de gebruikte componenten veroorzaken dikwijls een algemene toxiciteit en kunnen de groei en leefbaarheid
van alle cellen in de cultuur beïnvloeden
Positieve selectiesystemen
Hierbij wordt het manA gen van E.Coli gebruikt als selecteerbare merker → codeert voor fosfomannose
isomerase(PMI).
Stel: mannose als enige koolstofbron toedienen aan een in vitro medium → vorming en accumulatie van
mannose 6-fosfaat in een normale plant, ten koste van de anorganische voorraad fosfaten in de cellen.
Alleen getransformeerde cellen die manA tot expressie brengen, kunnen het mannose-6-fosfaat converteren
naar fructose6-fosfaat, dat wel verder gebruikt kan worden als C-bron.
Voordelen
Voor een groot aantal gewassen, waaronder aabidopsis, gerst, watermeloen, tomaat, kolen, zonnebloem,…,
bleek dit “positief” selectiesysteem een technisch en superieur alternatief te zijn voor “negatieve”
selectiesystemen op basis van kanamycineresistentie.
Ook wat de publieksacceptatie van de gemodificeerde planten betreft, scoort dit systeem beter omdat er
geen kanamycineresistentie meer ingebouwd hoeft te worden.
GUS als positieve selectiemerker.
Hier wordt gebruik gemaakt van de eigenschap van B-glucoronidase om glucose af te splitsen van een
verbinding. Inactief zeatine-9-glucoside wordt toegevoegd aan het medium. Enkel GUS-getransformeerde
cellen kunnen dit glucoside terug omzetten in het actieve cytokinine zeatine. Op die manier regenereren enkel
getransformeerde plantencellen. De ongetransformeerde cellen sterven niet af maar kunnen ook niet regenereren
tot scheutjes.
Nadeel: Kostprijs en de techniek bevindt zich nog in het experimenteel stadium.
Stijn Vandelanotte
-15-
Biotechnologie: theorie
Hoofdstuk 5: Transformatie van dieren
Directe gentransfer: micro-injectie
Meest voor de handliggend → gezuiverd stukje DNA gewoon in de celkern spuiten?
Merkwaardig genoeg is deze strategie de beste en dus meest gebruikte manier om transgene dieren te maken
Het nieuwe DNA wordt kort na de bevruchting ingespoten met een micro-injectiecapillair dat dmv een
micromanipulator bediend wordt.
Laboratoriummuizen zijn de meest gebruikte dieren voor transgene onderzoek
Het maken van een transgene muis dmv micro-injectie vh embryo gaat als volgt
1) bereiden van het DNA dat aan het genoom moet worden toegevoegd
Na het vermeerderen in een plasmide wordt het te transfereren gen uitgeknipt met restrictie-enzymen en
gezuiverd. Ook Vermeerderen via PCR is ook elegant
2) om aan embryo’s te komen, worden de maagdelijke vrouwtjesmuizen met hormonen behaneleld om
uiteindelijk hun voortplantingscyclus te synchroniseren en het aantal eicellen op te voeren dmv superovulatie.
Na bevruchting leveren deze vrouwtjesmuizen 20-40 embryo’s/muis.
Na het verzamelen van deze embryo’s worden ze zichtbaar gemaakt door vergroting
Ongeveer 8 – 12u na de bevruchting worden de pronuclei zichtbaar
Elk bevrucht embryo bevat 2 pronuclei, waarvan één geinjecteerd wordt met 50-500 kopieën vh gen
3) 60 – 80% vd geinjecteerd embryo’s overleeft de mechanisme beschadiging vd injectie
Deze embryo’s worden in geplant in de eileiders v/e schijnzwangere draagmoeder
Een vrouwtje kan schijnzwanger gemaakt worden door ze te paren met een gesteriliseerd mannetje
Het vrouwtje komt dan in de hormonale cyclus v/e zwangerschap, maar draagt geen embryo’s
4) Na herinplanting ondergaan de geinjecteerde embryo’s een normale foetale ontwikkeling
Meestal worden de pasgeboren muisjes nog een 3 tal weken bij hun moeder gelaten
Controle op integratie van het DNA in het genoom van de muizen gebeurt vaak d.m.v. PCR op DNA geïsoleerd uit
een stukje staart. Meestal bij 15-30% van de muizen wordt integratie van het DNA aangetoond. Soms worden
meerdere kopieën achter elkaar aangetroffen, lukraak ingebouwd. Niet al deze ingebouwde genen komen echter tot
expressie.
Gentransfer door injectie met retrovirus
Een alternatieve methode om nieuwe genen toe te voegen aan het genoom van jonge embryo’s is infectie met
retrovirussen.
Voorbeeld: Het bekendste retrovirus is AIDS.
Werking Retrovirussen → Retrovirussen kunnen genetische informatie van RNA in DNA omzetten.
Wanneer een retrovirus en cel infecteert, wordt het retrovirale RNA in de cel geïnjecteerd en vervolgens
gekopieerd in DNA door het retrovirale enzym reverse transcriptase.
Het retrovirale DNA raakt geïntegreerd in het DNA van de besmette cel en dient als mal voor de productie
van nieuwe, infectieuze virusdeeltjes met retroviraal RNA.
Voor gentransfer moeten de retrovirussen defectief gemaakt, zodat ze zich niet kunnen repliceren, behalve
onder speciale laboratoriumomstandigheden.
Nadeel:
Omdat retrovirale virussen slechts een beperkt hoeveelheid RNA kunnen omkapselen, zijn ze moeilijk te
gebruiken voor de overdracht van grote genen. In dat geval is micro-injectie een betere oplossing.
Voordeel
retrovirussen kunnen DNA integreren zonder verlies van naburige sequenties op het genoom. Micro-injectie kan
daarentegen wel bepaalde genen inactiveren voor DNA-integratie.
Werking gentransfer door injectie met retrovirus
Blastocyst wordt geisoleerd
Deze infecteren met retrovirus
Deze injecteren in een andere blastocyst
Daarna vormen ze een deel vh embryo
Chimere muizen die hieruit ontstaan kunnen
nakomelingen krijgen die helemaal transgeen zijn
Stijn Vandelanotte
-16-
Biotechnologie: theorie
Hoofdstuk 6: Moleculair-genetische karakterisatie van getransformeerde organismen
Southern blotting
Ontwikkeld door Southern en gepubliceerd in 1975
Werking
DNA vd plant wordt geextraheerd, gezuiverd en aan een digest met een restrictie-enzym onderworpen
Het mengsel van restrictiefragmenten wordt in een eerste test gescheiden op een aragose gel via elektroforese
Het DNA wordt zichtbaargemaakt met ethidiumbromide
Het DNA in de gel wordt vervolgens gedenatureerd → enkelstrengig maken
Hoe? Door incubatie in een alkalische oplossing
Maken vd opstelling waarbij het gel op een absorberend papier gelegd wordt dat in contact is met de
transferbuffer
Op de gel wordt eerst nylomembraan gebracht
Vervolgens een stapel absorberend papier
Tenslotte een gewicht
Door capillaire krachten loopt de transferbuffer doorheen de gel naar het nylonmembraan om zo een afdruk te
bekomen vd gel op het membraan.
Hybridisatie: het membraan wordt in contact gebracht met een radioactief gemerkte probe die aan homologe
sequenties bind
Niet gebonden probe worden weggewassen
De gebonden probe worden ovv bandjes zichtbaar gemaakt dmv een radiofilm
Northern blotting
Benaming naar analogie met Southern blotting
Verschil
Hier wordt ipv DNA een RNA-extract vh transgene organisme op een gel gescheiden en op een nylonmembraan
geblot.
Het radiogelabelde probe kan een DNA- of RNA- fragment zijn dat obvd sequentie vh te onderzoeken gen
gesynthetiseerd is
Een positief signaal wijst erop dat het gen tot expressie komt
PCR
Inleiding
Wat? → De Polymerase Chain Reaction (PCR) of polymerase kettingreactie is een in-vitro methode waarmee een
specifiek DNA fragment op exponentiële wijze vermenigvuldigd kan worden. Deze techniek, die door Mulis in 1985
werd bedacht , zorgde voor een revolutie in de moleculaire biologie. Talrijke modificaties, verbetering en nieuwe
toepassingen zien nog steeds het licht.
Stijn Vandelanotte
-17-
Biotechnologie: theorie
Principe
Voor een typische PCR-reactie zijn volgende componenten vereist!
DNA polymerase:een thermostabiel Taq-polymerase die ervoor
zorgt dat enkelstrengig DNA terug dubbelstrengig wordt.
DNA template:vb.een zuiver DNA-extract van een plant.
2 Primers:gesynthetiseerde oligonucleotiden. Deze primers moeten
hybridiseren aan de 5’ uiteinden van de complementaire strengen
van de te vermeerderen DNA sequentie. Ze moeten met hun 3’
uiteinde naar elkaar toe liggen.
DNTP’s:een oplossing van gelijke delen ATP,GTP,CTP,TTP,de
bouwstenen van het DNA
Mg2+ ionen
Buffer
Minerale olie:vormt een laagje op het reactiemengsel en voorkomt
verdamping en condensatie. Dit is niet meer nodig in moderne
toestellen,deze bezitten een verwarmd deksel dat condensatie op het dekseltje van het PCR-eppendorfje
verhindert.
Gedestilleerd water
De reactie gebeurt in een PCR-toestel, in wezen een programmeerbare temperatuurblok waarin plastic eppendorf
erlenmeyertjes inpassen. Het temperatuursverloop kan er als volgt uitzien.
2min bij 94°C;initiële denaturatie;de DNA strengen wijken uit elkaar.
30 cycli met het volgende programma
60sec bij 94°C;denaturatie(niet echt nodig in de eerste cyclus)
60sec bij 55°C:Primer anealing:de primers hechten zich aan een complementair sequentie.
60sec bij 72°C: primer extension:m.b.v. het Taq-polymerase worden de dNTP’s in het
verlengde van de primers ingebouwd.
7min bij 72°C:final extention: afwerking van alle vermenigvuldigde enkele strengen.
Bij iedere cyclus wordt , in theorie, het aanwezige DNA waarop de primers kunnen binden verdubbeld. De primers
laten toe een specifiek fragment in een complex mengsel te amplificeren De specificiteit wordt bepaald door de
sequentie van de primers, en de afstand tussen de twee primers bepaalt de lengte van het geamplificeerde fragment.
Deze fragmenten kunnen zichtbaar worden gemaakt met na scheiding door gel-elektroforesescheiding(3.4.).
Voordelen
Weinig DNA nodig
Het DNA mag gedeeltelijk gedegradeerd zijn(zoals in fossielen).
Zeer snel en gemakkelijk (itt Southern blotting en klonen) om te bepalen of in de regeneraten of de transgene
nakomelingen het genconstruct op een corret manier geintegreerd is
Problemen inzake specificiteit en contaminatie
Mispriming
Oorzaak: bij minder hoge T kunnen primers annealen op sequentie die niet volledig homoloog zijn
Gevolg: dit leidt in de eerste cycli tot efficiënt amplificeren van deze foute sequenties in de verdere PCR reactie
Dit wordt als voordeel aangewend voor het introduceren van extra bp aan de uiteinden vd te amplificeren
sequentie of van specifieke mutaties in vitro
Een Hot Start
Doel: verhogen vd specificiteit door voldoende lange primers te gebruiken met genoeg GC zodat een hoge
annealing T kan gekozen worden
Werking: specificiteit ↑ doordat het polymerase bij het opwarmen vh reactiemengsel nog niet kan werken
wegens het ontbreken v/e essentieel ingredient. Dit wordt toegevoegd of beschikbaar bij 94°C in de 1E cyclus
Nested
Doel: methode om foutieve geamplificeerde fragmenten te elimineren
Werking: doordat de kans dat een 3E primer specifiek voor de gewenste sequentie tegen foutief geamplificeerde
fragmenten kan annealen zeer klein is, kan het gebruik van een derde neste primer leiden tot een eventueel
mengsel met enkel het juist fragment nog eens geamplificeerd
Contaminatie
Stel: contaminatie van negatief staal met enkele moleculen v/e positief staal zullen na amplificatie een positief
resultaat geven ⇒ dit moet vermeden worden ⇔ pre-PCR mengsels en post-PCR mengsels goed scheiden
Voorzorgsmaatregelen →Aparte lokalen, speciale pipettips, dragen van handschoenen
Vernietigen van PCR contaminaties → gebruik maken van UTP ipv dTTP in de PCR reactie
Ipv de T wordt dan U ingebouwd in het DNA
Een behandeling vh mengsel met het enzym UNG vernietigd alle eventuele DNA-contaminaties van vorige
PCR reacties die U bevatten → daarna wordt UNG vernietigd door de hoge T
Stijn Vandelanotte
-18-
Biotechnologie: theorie
Hoofdstuk 7: Biochemische karakterisatie, evalutatie en selectie van transgene planten
Probleem
-Met voorgaande moleculair-genetische methoden wordt de aanwezigheid of de transcriptie vh genconstruct aangetoond
-Het is echter steeds mogelijk dat het geintegreerde gen, ondanks transcriptie, geen aanleiding geeft tot het gewenst eiwit
-Daarom werden een aantal biochemische methoden ontwikkeld om de effectieve expressie vh gen vast te stellen
Immunologische detectie van eiwitten
Via Western blotting is het mogelijk eiwitten, en in het bijzonder enzymen, aan te tonen.
Wat is er nodig voor we een Western blotting kunnen uitvoeren
een transgene plant
primaire antilichamen tegen het nieuwe eiwit
een overexpressie construct waarmee we veel recombinant eiwit kunnen aanmaken
opgezuiverd eiwit of -peptide
muis, rat, konijn, kip, of geit om antilichamen in op te wekken
secundaire antilichamen tegen het primaire antilichaam
Werking
Primaire AL beschikbaar → bereiden v/e totaal eiwit vd transgene plant
Dit eiwitextract scheiden op een poly-acrylamide gel in aanwezigheid van SDS
Deze denatureert de EW en geeft ze een negatieve lading
De proteinen worden naar een nitrocellulosemembraan getransfereerd → deze heeft sterke affiniteit voor EW
overdracht gebeurt onder invloed van een elektrisch veld (snel en efficiënt)
bv de “sandwich” methode
door de hoge affiniteit van de membraan voor eiwitten, moeten de plaatsen waar geen eiwit is op
overgebracht geblokkeerd worden → achtergrond ↓ en specificiteit ↑
de blokkering kan gebeuren met melk (caseïne) of met opgezuiverde eiwitten (BSA)
Het primaire AL-eiwit complex wordt gevisualiseerd met een secundair AL dat het primair AL herkent
Deze secundaire AL kunnen bv gekoppeld zijn met enzymatische of radioactieve labels
Het nadeel van Western blotting
De eiwitten die op het membraan gebonden zijn zijn gedenatureerd ⇒ hierdoor gaat hun driedimensionale
configuratie verloren. Enkel antilichamen die specifieke aminozuursequenties herkennen zijn dus bruikbaar.
Zeer arbeidsintensief
Zeer dure techniek die veel voorbereiding vergt
Detectie via kwantificeerbare reporters
Inleiding
Verschil reportergenen met merkergenen
Merkergenen → gebruikt voor selectie van genactiviteit
Reportergenen → gebruikt voor screening vd genactiviteit
Coderen voor enzymen waarvan de activiteit via een reactieproduct makkelijk aantoonbaar en kwantificeerbaar is
Reportergenen kunnen onder controle geplaatst worden van de expressiesignalen vh gen dat we willen bestuderen
hierdoor kunnen we zien waar het gen onder studie tot expressie komt en hoe die expressie gereguleerd wordt
er kan ook een fusie-eiwit gemaakt worden tussen het reportergen en het gen onder studie
op die manier visualiseren we het eiwit en kunnen we ook het effect vh nieuwe eiwit op de plant bestuderen
Voorbeelden
Cat, lacZ, nptII (deze is ook gebruikt als selectiemerker)
gusA en luc → deze 2 zijn de kwantificeerbare reportergenen bij uitstek
Chloramfenicolacetyltransferase (=cat gen)
algemeen: afkomstig van bacteriën en het oudste reportersysteem
werking
eiwitextracten van planten die met het cat gen getransformeerd zijn worden geincubeerd met radioactief of
fluorescent chloramfenicol
reactieproducten scheiden via dunne laag chromatografie
opm:
de aan- of afwezigheid van acetylgroepen zorgt er voor dat het product een andere migratiesnelheid heeft
intensiteit van de geacetyleerde spot ~ expressieniveau vd promotor waaronder het cat gen geplaatst is
Stijn Vandelanotte
-19-
Biotechnologie: theorie
Luciferase (=luc gen)
het luciferase gen is afkomstig van de vuurvlieg waar het tot expressie komt in gespecialiseerde lichtorganen
Doel vh geproduceerde licht
de larven produceren licht vermoedelijk om vijanden te verwittigen dat ze zeer slecht smaken
de volwassen dieren produceren lichtflitsen om elkaar aan te trekken
De luciferase reactie stuurt geel-groen licht (560nm) uit door de oxidatie van het substraat luciferin
dit vereist de co-factoren ATP, Mg2+, O2
In tegenstelling tot het cat gen kan expressie in levende organismen gevolgd worden
De ontwikkeling van gespecialiseerde camera’s laat toe om in vivo expressie te meten
Voordelen
Expressie van het luc gen is niet nadelig voor het metabolisme van het transgene organisme
Bovendien wordt het luciferine als estervorm vlot opgenomen door cellen en is niet toxisch
Aangezien het luciferase niet voorkomt in planten, is er geen achtergrond activiteit
β-glucoronidase (= gus gen)
Het gusA gen is afkomstig van E. coli en stelt deze bacterie in staat om complexe suikers te gebruiken als C-bron
Afhankelijk van het gebruikte substraat kan men de GUS reporter gebruiken voor
de localisatie van genexpressie of eiwitactiviteit → histochemische kleuring
β-glucuronidase hydrolyseert X-gluc tot XH (dit is in dynamisch evenwicht met X
X en XH kunnen vrij diffunderen uit de cel
In aanwezigheid van moleculaire zuurstof ondergaan ze een oxidatieve dimerisatie en slaan ze neer als
een blauwe kleurstof (= diXindigo)
Opm: Naast X-gluc zijn ook andere substraten ontwikkeld die na de glucuronidase een ander gekleurd
reactieproduct vormen
Bv: magenta-glcu geeft aanleiding tot een diep roze precipitaat
Bv: salmon-gluc geeft aanleiding tot een zalm-leurig precipitaat
voor de kwantificatie van genexpressie → fluorimetrische bepaling
β-glucuronidase hydrolyseert het substraat MUG tot 4-MU
4-MU fluoresceert sterk bij pH> 8,2 en kan op deze manier kwantitatief gemeten worden
Voordelen
planten hebben geen β-glucuronidase activiteit ⇒ dus is er geen achtergrond
diX-indigo diffundeert niet uit de cel
het substraat diffundeert wel relatief gemakkelijk in de plantencellen
Nadeel
Deze assay laat geen in vivo detectie toe
Detectie via fluorescerende reporters
Groen fluorescent proteine (GFP)
In de plant fluoresceert GFP (stabiel eiwit) in afwezigheid van exogene cofactoren ⇒ dit maakt GFP een
aantrekkelijk reporter gen
Visualisatie vereist enkel excitatie met near UV of blauw licht en observatie met een fluorescentiemicroscoop
GFP is veel gebruikt bij het ontwikkelen van transformatieprotocols bij
Mo’s, planten en dieren
Verbetering door puntmutaties
Diverse mutante vormen vh gen werden geconstrueerd die de stabiliteit, de intensiteit en fluorescentie of de
kleur vh uitgestraalde licht veranderen
Door 1 AZ te wijzigen kon de intensiteit vd fluorescentie met een factor 6 opgedreven
De verbetering vh opgevouwen vh eiwit ⇒ helderheid verbeterd
Er bestaan ook andere kleuren ipv groen
BFP (blauw), CFP (cyaan) en YFP (geel)
DsRed
Gen codeert voor het rood fluorescent proteine DsRed en is afkomstig van een anemoon.
Nadeel
Chlorofyl kleurt onder belichting met UV rood ⇒ niet bruikbaar in groene delen vd plant, wel in de wortels
Het wordt vaak gebruikt als alternatieve reporter voor dierlijke systemen
Stijn Vandelanotte
-20-
Biotechnologie: theorie
Hoofdstuk 8: Andere moleculaire identificatie en karakterisatie technieken
Fingerprinting
Wat? fingerprinting is het gebruik van biochemische (eiwit) of moleculaire merkers (DNA) om een individu te
identificeren of om de aan- of afwezigheid van een kenmerk aan te tonen
Voordelen moleculaire merkers tov klassieke uitwendige eigenschappen
Ze zijn genetisch ⇒ ze worden overgeërfd en zijn niet afhankelijk van omgevingsfactoren
Ze zijn overvloedig ter beschikking
Ze komen zewel in coderende als in niet-coderende gebieden voor
Ze zijn zeer polymorf
Polymorf ? een kenmerk is polymorf als het onder verschillende vormen kan voorkomen
Dit is zeker het geval bij eiwitten en DNA
Bv bij mensen, met uitzondering van eeneiïge tweelingen, heeft geen enkele mens hetzelfde genoom
2 types van moleculaire merkers
Moleculaire merkers specifiek voor een bepaald organisme of zelfs voor een allel en kunnen dus gebruikt
worden om
bv een bepaald virus in een plant aan te tonen of een erfelijke ziekte te detecteren
Moleculaire merkers kunnen bij verschillende individuen polymorfismen aantonen
Bv in een diagnose te specificieren welke virusstam in de plant aanwezig is of welke persoon op de plaats
vd misdaad aanwezig was
Proteinemerkers
Zymogrammen
Principe: identificatie door gebruik te maken van eiwitten die een bepaalde te visualiseren enzymreactie
katalyseren
Werking
1) de eiwitten scheiden door gelelektroforese onder niet-denaturerende omstandigheden
Niet denatureren ⇒ enzymatische activiteit blijft behouden
2) de eiwitten migreren in een zetmeel naar de negatieve / positieve pool
Snelheid is afhankelijk van hun netto lading
3) de gel wordt gebufferde oplossing gebracht met een geschikt chromogeen of fluorogeen substraat
4) na de reactie treedt er een verkleuring en een precipitatie op
Overal waar een bandje op de gel verschijnt , was een specifiek enzym actief
Het bandenprofiel bekomen met een dergelijke test kan verschillen tussen individuen
Isozymen → verschillende enzymen kunnen dezelfde reactie katalyseren
Bv ACP, EST en PRX
Allozymen → een mutatie in het gen v/e enzym kan een andere lading in het eiwit tot gevolg hebben zodat in
een heterozygoot individu de eiwitten van deze 2 allelen verschillend migreren en twee verschillende bandjes
geven
Bij een zymogram assay is het niet nodig om eiwitextracties te doen, maar kan de enzymatische activiteit
rechtstreeks van weefsels of kiemende zaden afgelezen worden mits een incubatie op een geschikte
substraatoplossing.
Voordelen
Nadelen
Toepassingen
eenvoudig
heeft niet zo’n hoge resolutie
populatiestudies
geen nood aan DNA
alle eiwitten worden niet in alle weefsels
diversiteit in
extractie of sequentie
gemaakt (dus toch afhankelijk van
gewassen en hun
informatie, primers of
« omgeving »)
‘voorouders’
probes
co-migratie betekent niet noodzakelijk dat het
hybride analyse
snel en relatief goedkoop
om hetzelfde eiwit gaat
Stijn Vandelanotte
-21-
Biotechnologie: theorie
DNA-merkers
Wat? DNA fingerprints = DNA patronen die zo specifiek zijn dat ze alle individuen van elkaar kunnen scheiden
RFLP
Wat? restricition fragment length polymorphism
Werking:
Een restricitie digest van DNA v/e organisme levert een groot aantal fragmenten op die door
gelelektroforese gescheiden worden
Via southern hybridisatie met een probe naar keuze kunnen specifieke sequenties onderscheiden worden
Als de organismen die met elkaar vergeleken worden, verschillen in het gebied vd probe dan zal een
verschillend bandenpatroon ontstaan
RFLP zijn co-dominant ⇒ er kan slechts 1 locu per keer geanalyseerd worden
Met de komstig van PCR techniek werd het mogelijk om DNA fingerprints te bekomen van kleine hoeveelheden
DNA. Hiervoor zijn verschillende methoden:
AFLP
Wat? amplified fragment length polymorphism→meest gebruikte, betrouwbare en efficiente fingerprinttechniek
Principe? De selectieve amplificatie van restrictie fragmenten mbv PCR
Werking?
1) genomisch DNA afbreken met restrictie enzymen tot specifieke fragmenten
2) op de uiteinden vd restrictiefragmenten worden ‘adaptors’ geligeerd
Adaptors? Goed gedefinieerde korte DNA strengetjes met dezelfde uiteinden als de
restrictiefragmenten
3) gevolg hiervan is dat het mogelijk is om de restrictiefragmenten te amplificeren met primers die
homoloog zijn met de adaptoruiteinden
4) slechts een subfractie vh complex mengsel van restrictiefragmenten wordt geamplificeerd doordat men
primers gebruikt die naast de adaptorsequentie ook enkele selectieve nucleotiden bevatten aan het 3’
uiteinde
Enkel de restrictie fragmenten die aan hun uitende precies de selectieve nucleotiden vd AFLP-primers
bevatten, worden geamplificeerd ⇒ gevolg is dat voor elke selectieve nucleotide die aan het uiteinde
v/e AFLP-primer wordt toegevoegd een selectie gebeurt op één op vier fragmenen
♦ Door één, tweee of drie selectieve nucleotiden te gebriuken kan hiermee respectievelijk
geselecteerd worden met een factor 4, 16 of 64
Optimale amplificatie wordt verkregen door 2 verschillende restrictie enzymen te gebruiken
♦ dus ook twee verschillende adaptorsequenties en 2 verschillende primers
5) na elektroforese vh PCR product wordt een bandenpatroon zichtbaar
Polymorfismen komen tot uiting als tussen individuen een verschillend bandenpatroon te zien is
AFLP zijn dominant ⇒ er kunnen verschillende loci per keer geanalyseerd worden
Voordelen, nadelen en toepassingen
Voordelen
Nadelen
Toepassingen
redelijk polymorf
arbeidsintensief
studies naar genetische
zeer abundant
duur
identiteit (bvb. ouderschap)
willekeurige distributie van AFLP
veel materiaal
identificatie van clones en
merkers
nodig
cultivars
redelijk reproduceerbaar
fylogenetische studies
generatie van zeer veel informatieve
fragmenten
Stijn Vandelanotte
-22-
Biotechnologie: theorie
Anker – PCR
Wat? afgeleid van AFLP en is een techniek die gebruikt wordt wanneer een deel v/e sequentie gekend is en we
de informatie meoten bekomen vd naburige DNA regio’s
Werking → bij een T-DNA insertiemutant
De eerst primer (het anker) wordt gekozen obv vd sequenties binnen het getransformeerde T-gebied
De andere primer moet homoloog zijn aan een sequentie buiten het vreemde gen
Men weet nu niet waar het gen ingevoegd is → probleem → oplossing
Oplossing: gebasseerd op AFLP
1) DNA afbreken met een restrictie enzym tot specifieke fragmenten
♦ Dicht bij het vreemde gen verwacht men statistisch gezien ook een knipplaats
2) op de gekende uiteinden van de restrictiefragmenten worden de ‘adaptors’ geligeerd
3) kiezen v/e tweede primer obv deze adaptor
4) een PCR reactie met deze 2 primers amplificeert twee types DNA fragmenten
♦ Enerzijds zijn de gewenste stukjes DNA, die door primer 1 en 2 geamplificeerd werden
♦ Anderzijds zijn het stukjes die door 2 exemplaren van primer 2 vermenigvuldigd werden
Deze DNA fragmenten die door het restrictie-enzym geknipt werden, waarop de adaptor bond
en waar dus ook primer 2 op landde
5) zichtbaar maken vd gewenste DNA fragmenten kan men doordat de primer 1 gelabeld is
♦ Voor elk kopie van het vreemde gen zijn de omgevende plantensequenties anders en is het
geamplificeerde fragment verschillend in lengte
6) elektroforese vh PCR product → fluorescerend bandenpatroon wordt zichtbaar
♦ Elk bandje staat voor een kopie vh vreemde gen
Toepassingen
Opzoeken van transgene planten
Bepalen vh aantal geintegreerde kopieen v/e vreemd gen
RAPD
Wat? random aplified polymorphic DNA → PCR reactie waarbij alle willekeurige DNA fragmenten
vermeerderd worden mbv/e korte primer met een arbitraire sequentie
Na elektroforese wordt een bandenpatroon zichtbaar
Verschillende banden patroon? → een aantal gewijzigde bindingsplaatsen voor de primers door
polymorfismen tussen individuen
RAPD zijn dominant ⇒ er kunnen verschillende loci per keer geanalyseerd worden
Microsatellieten
Wat? korte DNA fragmenten met een repetitief motief van twee of vier bp
Voorbeelden met als basismotief: TA, CA, GTG, TAA, GATA, GGAT
Dergelijke nonsense sequenties komen dan bvb 10 tot 100 maal direct achter elkaar in zgn tandem repeats
Voorbeeld: TATATATATA
meervoudige tandem repeats van zeer korte sequenties (2-10 bp) microsatelliet
meervoudige tandem repeats van langere sequenties (5-100 bp) minisatelliet
Polymorfismen zijn veroorzaakt door het verschil in het aantal herhalingen van het basismotief
Deze verschillen zijn veroorzaakt door fouten tijdens de DNA replicatie of tijdens de meiose
De variaties kunnen gevisualiseerd worden via PCR met lange primers die complementair zijn tegen de
flankerende sequenties
Microsattelieten zijn co dominant ⇒ er kan slechts 1 locu per keer geanalyseerd worden
Voordelen
zeer abundant
willekeurige distributie
zeer reproduceerbaar
Stijn Vandelanotte
Nadelen
sequentie informatie van borders is
nodig
mutaties in primer annealing sites
kunnen tot valse negatieven leiden
-23-
Toepassingen
populatiegenetica
verwantschappen tussen
nauw verwante species
Biotechnologie: theorie
cDNA-AFLP en DNA chips
cDNA-AFLP
Probleemstelling: traditionele methodes in de moleculaire biologie onderzoeken per experiment meestal één of een
beperkt aantal genen, waardoor een totaalbeeld van de interacties moeilijk te bekomen is
Mogelijk oplossing → een aanpassing van de AFLP om zo de vele interacties tussen duizenden genen te bekomen
Aanpassing tov AFLP
Uitgansmateriaal: RNA vh weefsel of organisme
↔ itt DNA
Dit RNA wordt via reverse transcriptase omgezet tot cDNA
Dit cDNA wordt onderworpen aan de AFLP techniek en leidt tot een banden patroon dat nu verschillen in
genexpressie weergeeft eerder dan verschillen in DNA samenstelling of structuur
Voordelen, nadelen en toepassingen
Voordelen
Nadelen
Toepassingen
genoomwijde informatie zelfs als de
arbeidsintensief
expressie analyse in
genomische sequentie niet gekend is
duur
eender welk
na sequenering van differentiële bandjes
veel materiaal
organisme
kunnen we de genen identificeren
nodig
DNA-chips
Probleemstelling: cDNA techniek kon groot aantal gentranscripten tegelijk bekijken, maar er was nood aan een
technologie die het mogelijk maakt om alle genen in een organisme in 1 enkel experiment te evalueren
Mogelijke oplossing → ontwikkeling vd zgn DNA-MicroArrays, DNA Chips of biochips
Chip? Meestal kleine glasplaatjes waarop mbv robots kleine druppeltjes gekend cDNA of oligonucleotiden, die
het volledige genoom weergeven, gefixeerd worden in arrays
Dank zij de kleine afmetingen van de druppeltjes werd het mogelijk om 10.000 oligonucleotiden op 1
draagglaasje te ‘spotten’
Werking?
Uit twee biologische bronnen (ziek blad / gezond blad) worden RNA geëxtraheerd)
Elke RNA staal → omzetten in cDNA en fluorescerent labelen
Met teststaal rood en referentiestaal groen
Dit gemerkte DNA kan vervolgens hybridiseren met de ‘gespotte’ nucleotiden op de DNA chip
Het ongebonden DNA afwassen
Het gebonden DNA met een confocale laser scanner en beeldanalysesysteem visualiseren en verwekken
Rood → gen komt tot expressie in het zieke blad
Groen → gen komt tot expressie in het gezonde blad
Rood + groen = geel → het gen komt tot expressie in beide bladeren
Zwart → geen expressie van dit gen
Voordelen, nadelen en toepassingen
Voordelen
Nadelen
genoomwijde analyse levert zeer veel informatie
arbeidsintensief
duur
gespecialiseerd materiaal en software nodig
Toepassingen
aanvankelijk is de microarray techniek ontwikkeld om differentiële genexpressie tussen 2 stalen aan te tonen
hieruit zijn belangrijke toepassingen gevolgd voor de geneeskunde bvb. aantonen van andere expressiepatronen
in tumoren (expressie fingerprints), of het effect van nieuwe geneesmiddelen op genexpressie
toepassingen in de landbouw bvb. effect van nieuwe pesticiden op genexpressie
maar tegenwoordig gaan de toepassingen veel verder bvb. vergelijkende genoomanalyse, identificatie van
populaties in natuurlijke microbiële stalen, identificatie van single nucleotide polymorfismen (SNPs), enz
Stijn Vandelanotte
-24-
Biotechnologie: theorie
DNA sequeneringstechnieken
1970 → Sanger → ontwikkeling v/e methode om de volgorde vd basen te bepalen in de DNA sequentie
Werking:
gebaseerd op de inbouw v/e terminator molecule die tijdens de DNA replicatie gestart wordt vanuit een
radioactief gemerkte DNA primer → didoxynucleotiden ddNTP die geen 3’ OH groep dragen, wel ingebouwd
worden door het DNA polymerase, maar geen fosfodiester binding kunnen maken met het volgende nucleotide
dat moet ingebouwd worden en dus replicatie moet stoppen
Voor elke base wordt een aparte reactie gestart met het overeenkomstige ddNTP
Elk reactie mengsel wordt gescheiden op een polyacrylamidegel via elektroforese
De volgorde vd bandjes die worden zichtbaar na het aanbrengen v/e radiografiefilm
Dit laat toe om de sequentie af te lezen
Probleem → zeer arbeidsintensief en duur → zoeken naar alternatieven (goedkoper, automatischer, eenvoudiger)
1e generatie sequencers → midden jaren 80
Verschil met daarvoor:
radioactieve isotopen vervangen door fluorescente moleculen
stoppen met de primer te merken, maar de ddNTP’s elk koppelen aan een andere fluorescent gekleurde
kleurstof ⇒ hierdoor kunnen alle 4 de reacties in één buisje uitgevoerd worden
het lezen van de gels wordt geautomatiseerd
gevolgen vd aanpassingen
snelheid waarmee sequenties konden bepaald worden ↑
aantal manipulaties ↓
eind jaren 90 werd een beta versie van deze 1e generatie sequencers ontwikkeld
de verbetering was vooral dat de polyacrilamidegelelektroforese vervangen door capillairelektroforese
hierdoor ging alles nog veel sneller en konden meerdere reacties tegelijkertijd op één enkel toestel
geanalyseerd worden
opm: dit wordt nu nog steeds zeer veel gebruikt!
Probleem → nog niet snel genoeg, nog steeds te duur en de 1e generatie methode kon niet meer verbeterd worden
2e generatie sequencers → vanaf 2000
Gebruik van micromatrices geinspireerd op de microarrays waarop kleine fragmenten vh te sequeneren
DNA waren aangebracht
Werking
Aan de fragmentjes worden adaptors geligeerd
Deze enkelstrengige bibliotheek van het te sequeneren DNA wordt geimmobiliseerd op een drager
Via PCR wordt voldoende DNA bekomen van elke fragment om sequenering toe te laten
♦ Men spreekt nu van polonies (= kolonies van PCR fragmenten)
Mbv cyclische manipulaties met polymerasen of ligasen in de aanwezigheid van fluorescente
moleculen kan men de extensie vd DNA strengen volgen met microscopische detectiesystemen
gekoppeld aan gespecialiseerde camera’s
Door bij elke cyclus de array te analyseren kan men mbv gespecialiseerde computer algoritmes de
sequentie vh DNA afleiden
3e generatie sequencers → vanaf nu
Loskomen van de op flurorescentie gebaseerde detectiemethoden en van de biochemie, men investeert nu
vooral in de nanotechnologie en zeer geavanceerde niet-optische microscopie
Nanotechnologe: de DNA streng doorheen een nanoporie te laten passeren en dan obv één of andere
elektrofysische parameter af te leiden welke van de 4 basen de porie passeert
Niet optische microscopie: het idee om uit een foto vh DNA in een resolutie die toelaat om de basen te
zien en aldus de sequentie ‘gewoon’ te lezen
Stijn Vandelanotte
-25-
Biotechnologie: theorie
Tilling
Wat?
Targeting induced local lesions in genomes
Dit is een reverse genetics strategie die het
mogelijk maakt op grote schaal te screenen naar
planten die in een specifiek gen gemuteerd zijn
Werking
Chemische mutagentia (bv EMS) veroorzaken
willekeurige puntmutaties in het DNA
Zaden van bv Arabidopsis worden in een 25mM
EMS-oplossing geweekt en vervolgens uitgezaaid
De zgn M1 planten groeien op in trays en leveren
na zelfbestuiving zaden voor de M2 generatie
M2 DNA wordt bereidt uit 0,2g bladweefsel van elke M2-plant
De helft vh DNA wordt apart gehouden
De andere helft wordt per 8 samengevoegd in multiwellplanten
Via PCR wordt het gen waarin men geinteresseerd is geamplificeerd mbv specifieke, fluorescent gelabeld
primers
De forward en reverse primer dragen een verschillende fluorescentiekleur
Mengsel verhitten → DNA strengen gaan uit elkaar
Mengsel afkoelen → Complementaire strengen gaan terug op elkaar
Een mutante streng combineert met een normale streng → uitstulping in de dubbelstreng op de plaats vd
mutatie ⇒ mismatch
CELI nuclease → endonuclease met grote specificiteit thv/e foute paring of DNA uitstulping die het DNA in 1
vd 2 strengen knipt
Doordat de primers met verschillende fluorescentiekleur gelabeld waren, zijn er bij elk dubbelstrengig PCR
product twee halfgeknipte producten mogelijk
Denatureren vd PCR producten met formamide en op gel uitscheiden
De gel wordt dan in 2 kanalen gescand
Als 2 verschillend gekleurde fragmenten gedetecteerd worden, dan wijst dit erop dat er zich een mutant tussen
de 8 gepoolde individuen bevind
De 8 DNA stalen worden uit het archief gehaald en doorlopen elk apart nog eens dezelfde procedure
Zo wordt de bewust mutant vlot teruggevonden
Doordat dat de lengte vd twee fragmenten gekend is, kan men de plaats van de mutatie via een beperkte
sequentiebepaling snel opsporen
Via genetische modificatie met antisense genen of RNAi is een gen ook uit te schakelen → waarom deze methode
dan nog te gebruiken
Met gerobotiseerde werkstations kan men op korte termijn duizenden planten gescreend worden waardoor de
kans om een mutant gen te vinden realistisch is geworden
Er kunnen subletale mutaties gevonden worden ⇒ subletale? Mutaties die een gen bv half werkzaam maken.
Dit kan niet met de RNAi of antisense technologie
Mutanten zijn geen genetisch gemodificeerde organismen en kunnen zonder veel formaliteiten op de markt
gebracht worden
Stijn Vandelanotte
-26-
Biotechnologie: theorie
Hoofdstuk 9: Biotechnologische toepassingen bij land- en tuinbouwgewassen
Planten die insecticide aanmaken
Endotoxine uit Bacillus thuringiensis (Bt)
Probleem → de europese stengelboorder zorgt voor veel schade bij mais
De larven eten zich een weg binnen in de plant → plant wordt zwak → plant kan plooien of breken
Als het eenmaal in de plant zit is het niet meer gevoelig voor insecticiden
Voorkomen vd insecten is arbeidsintensief en zeer duur
Bacillus thuringiensis
Wat? bodembacterie die tijdens sporulatie kristalvormige proteinen produceert met insecticide werking
Het zijn toxines die toxisch zijn voor larven van lepidopteren en kevers, voor andere organismen totaal niet
Ze scheiden inactieve prototoxines af die in de larven omgezet worden tot echte toxines
Nadelen → zeer duur en onbruikbaar tegen insecten die binnenin de plant leven
Oplossing → Bt- Genen isoleren en fusioneren met constitutieve of specifieke promotors
Met deze chimere genen werd mais getransformeerd
Stel aanval door het insect → Bt-eiwit kan de toxines nu produceren in het planten weefsel
Gevaar? ! → zoals bij pesticiden verwacht men ook vroeg of laat resistentie tegen het Bt-gen.
Dit kan men deels opvangen door
Inbouwen van 2 resistentie genen
→ kans dat door mutatie resistentie ontstaat tegen 2 verschillende toxines is erg onwaarschijnlijk
Telen van rijen gewone planten naast Bt-planten van hetzelfde gewas
→ het idee is dat niet-resistente insecten kunnen overleven op percelen met klassieke cultivars,
zogeheten ‘refuge-zones’. Een eventuele resistente mutant kan dan kruisen met deze gevoelige insecten
waardoor een resistente populatie minder snel zal opgebouwd worden
Bt- genen wordt ook al gebruikt bij Soja, aardappel, tabak, katoen, populier
Proteïnase-inhibitoren uit planten
Er bestaan ook eiwitten die de proteinasen in de verteringssapen van insecten specifiek remmen
Het gaat om een hele familie-iso-inhibitoren → bv de proeinase-inhibitor II bij de aardappel
Virusresistente planten
Transfer van manteleiwitgenen
Stel tabaksplanten besmetten met zwak tabaksmozaiekvirus → resistent tegen sterkere stammen TMV
Hoe? De aanwezige mantel eiwitten vd zwakke stam inhiberen de bouw vd manteleiwitten van de virulente
stam
Technologie bootst dit na
cDNA maken vh RNA-genoom van dit virus
het manteleiwit-DNA werd onder controle v/e constitutieve promotor gesteld, gevolgd door
terminatorsequenties voor eukaryoten
via leaf-disk techniek werd dit genconstruct met A. Tumefaciens in tabak over gezet
de bekomen transgene tabaksplanten waren minder gevoelig voor TMV
transgene tomaten en aardappelen werden op analoge manier verkregen en vertonen resistentie in veldstudies
Virusresistentie met antisense-RNA
Antisense RNA wordt verkregen door transcriptie met de normale sense-sequentie als mal ⇒ antisense
Antisense RNA is complementair aan en kan binden op het overeenkomende sense mRNA
Gevolg: hierdoor kan er geen translatie van dit mRNA plaatsvinden
Dus: eigenlijk kan men de productie v/e manteleiwit uitschakelen door de sequentie vh corresponderende gen
invers en achterste voren te plaatsen onder controle v/e constitutieve promotor en af te sluiten met een
terminator signaal
Na transformatie maakt dit gen voortdurend antisense mRNA aan dat, bij infectie door het virus, op het
manteleiwit bindt.
Resistentie tegen schimmels
Chitinaseproducerende planten
Resistentie onderzoek tegen schimmels is nu pas volop op dreef
Chitine komt niet alleen voor als hoofdbestanddeel van de skeleten van insecten en schaaldieren maar komt ook in
de celwand van schimmels voor
In planten komen heel vaak chitinasen voor → afweerreacties tegen binnendringende schimmels
Planten resistent maken tegen schimmels door ze te transformeren met een plantaardig chitinase gen onder controle
v/e constitutieve promotor
Gewassen met dergelijke chitinase genen vertonen een hogere resistentie → bv wortel, tomaat, rijst, druif
Stijn Vandelanotte
-27-
Biotechnologie: theorie
Herbicidenresistentie
Glufosinaatresistentie (Basta, PPT)
Glufosinaat? Verkorte naam voor glufosinaat-ammonium. Het is een breedspectrum contactherbicide dat ook als
loofdoder bij aardappel en droge erwt wordt toegepast.
Oorsprong? Een natuurlijk product geisoleerd uit de schimmel streptomyces
Werking? Inhibeert de activiteit vh glutaminesynthase
Glutaminesynthase → dit is nodig voor de productie van glutamine en detoxificatie van ammoniak
Gebruik? Men kan planten bespuiten met glufosinaat → glutamineconcentratie↓ en ammoniakconcentraties↑
Gevolg: FS stopt → plant sterft af
Glyfosaatresistentie (Roundup)
Glyfosaat? Structuuranaloog van het AZ glycine
Werking? Remt bij planten het enzym EPSPS → blokkeert de shikiminezuurbiosynthese
→ geen aanmaak meer van aromatische AZ (bv Tryptofaan, fenylalanine, ..) → gebrek → afsterven plant
Probleem! → Uit Agrobacterium werd het gen CP4-EPSPS geïsoleerd,voor een enzym dat sterk lijkt op EPSPS.
Het heeft dezelfde functie maar is niet gevoelig voor glyfosaat.
Het gen werd overgebracht naar diverse gewassen en bleek een hogere glyfosaattolerantie op te leveren.
Om overdracht vh gen via pollen te voorkomen werd het gen in het chloroplastgenoom van tabak ingebouwd.
Chloroplasten erven uitsluitend maternaal over omdat pollen geen chloroplasten bevatten.
Varia
Monsanto werd de grootste agrochemische multinational door het patent op glyfosaat
Glyfosaat is niet kankerverwekkend of giftig voor mens en dier, kan echter wel huidirritatie veroorzaken
Het stapelt zich niet op in de plant en wordt gemakkelijk afgebroken in de bodem
Verbeterde bewaarbaarheid en transportgevoeligheid
FlavrSavr tomaten
Probleemstelling → rijpende vruchten als tomaten hebben een enzym PG die zorgt dat de pectinen afgebroken
worden in de middenlamella ⇒ de vrucht wordt zacht
Rijpe, zachte tomaten zijn kwetsbaar tijdens het transport en daarom worden ze vaak onrijp geplukt
Oplossing
het was mogelijk het gen voor PG te isoleren
een vruchtspecifieke promotor laat enkel expressie in de vruchten toe
het PG-gen werd invers achter de 35S-promotor geplaatst en met de leaf disk techniek in tomaten overgebracht
in transgene tomatenplanten bindt het antisense mRNA van PG op het sens mRNA → PG productie stopt
→tomaten worden veel trager zacht + als neveneffect worden ze resistenter tegen vruchtrot
Helaas is dit niet toegelaten door protestacties van milieuorganisaties
De oude verbeteringstechnieken werden ingehaald door een natuurlijke mutatie van het PG-gen
Een wetenschapper kruiste die mutant en verkreeg cultivars met een hoge opbrengst aan smakelijke vruchten
die aan de plant konden rijpen en tijdens het transport stevig bleven
Een langer vaasleven voor anjers
Probleemstelling → snijbloemen hebben een beperkt vaasleven.
De verwelking start door de productie van het gasvormige plantenhormoon ethyleen
Dit kan enigszins voorkomen worden door zilverthiosulfaat (= chemische inhibitor van ethyleenbiosynthese)
Nadeel → te duur en belast het milieu
Oplossing
Getransformeerde Florigene anjer met een antisense kopie vh ACC synthase → ethyleenproductie ↓↓↓↓
Geen ethyleen meer → houdbaarheid ↑
Eeuwige jeugd
Probleemstelling → planten verouderen → blad vergeelt en valt af of verdroogd
Oplossing
Ontdekking van een promotor die specifiek geinduceerd wordt tijdens de senescentie en koppelen die aan het
PT gen → dit gen codeert voor isopentenyl transferase → cytokinine productie ↑ → verjongende werking
Voorbeeld met tabak
Niet abnormale ontwikkeling, maar telkens als een weefsel begint te verouderen wordt het IPT-gen ter plaatse
geactiveerd en wordt er voldoende cytokinine geproduceerd om de senescentie tegen te gaan
Inhibitie van senescentie → activiteit vd senescentie-specifieke promotor ↓ → productie cytokinine ↓
De bladeren van deze transgene tabak hebben een veel langere levensduur en zijn fotosynthetisch langer actief
De planten zijn het levende bewijs dat het verouderingsprogramma vd plant kan gemanipuleerd worden.
Stijn Vandelanotte
-28-
Biotechnologie: theorie
Gewijzigde samenstelling
Veranderde vetzuursamenstelling bij koolzaad
Vooraf: 14% vd wereldproductie aan plantaardige oliën en vetten wordt als grondstof in de chemische industrie
aangewend
Probleemstelling → Koolzaad levert olie dat een mengsel van vetzuren met verschillende technische eigenschappen
is → voor veel technische toepassingen zou er maar 1 VZ aanwezig mogen zijn
Doel? Men wil koolzaad hoogwaardige oliën laten produceren, die tot nu toe enkel door oliepalm kunnen geleverd
worden.
Voorbeeld: de Amerikaanse transgene koolzaadcultivars die laurinezuur bevatten
Gewijzigde zetmeelsamenstelling bij de aardappel
Vooraf: 25% vd Europese aardappelen worden gebruikt als industriële grondstof voor de productie van zetmeel en
bioethanol
Probleemstelling → de samenstelling van zetmeel is echter niet ideaal voor industriële toepassingen. → er komen nl
twee zetmeelfracties voor (amylose (20-30%) en amylopectine (70-80%))
In voedingsoogpunt zijn deze gelijkwaardig
In industrieel oogpunt is hun chemische en technische eigenschappen te verschillend
Met sterk vertakte polymeer amylose kunnen biodegradeerbare films gevormd worden.
Het kettingachtige amylopectine heeft sterk klevende eigenschappen die van pas komen bij de productie
van lijmen
De twee fracties worden chemisch en fysisch van elkaar gescheiden → dit is duur!!
Oplossing
Het gen GBSS codeert voor een enzym dat de amylase productie regeld
Het gen kan uitgeschakeld worden (antisense)⇒ amylose productie ↓↓ ⇒ zetmeel met enkel nog amylopectine
Goudenrijst
Wat? rijst met een veel hogere concentratie aan vitamine A
Probleemstelling 1 → in tropische gebieden wordt de olierijke aleuronlaag van rijst verwijderd omdat de rijst anders
ranzig wordt
Wat overblijft is het endosperm dat verschillende essentiële nutriënten mist bv provitamine A ⇒ blindheid
Terwijl het rijstendosperm GGPP bevat, een precursor van β-caroteen
Oplossing 1
Door het overbrengen overbrengen van vier genen uit narcis kon men de biosynthese weg vervolledigen
Fytoeen syntase, fytoeen desaturase, x-caroteen desaturase en lycopeen cyclase
Hierdoor werden lijnen gecreeerd met geel gekleurde endosperm ⇒ β caroteen ⇒ genoeg vit A
Probleemstelling 2 → 60% vd bevolking in ontwikkelingslanden heeft bloedarmoede door een ijzer tekort
Oplossing 2 → In deze rijst werd ook het ijzergehalte en de opneembaarheid van ijzer opgekrikt
Beschikbaarheid van ijzer verhogen door het ijzer gehalte te verdubbelen door een ferritine uit de boon in te
bouwen. Ferritine is een ijzeropslag eiwit dat in vele dieren, planten wordt aangetroffen
Rijstendosperm bevat echter fytinezuur die de opname van ijzer in het darmkanaal inhibeert
Dit werd voorkomen door het inbouwen van een fytase gen die fytinezuur afbreekt
Al deze constructen werden voorzien van een endospermspecifieke promotor
Gewijzigde ligninegehalte bij populier
Vooraf lignine
Na cellulose is lignine het meest voorkomende biopolymeer op aarde
Functie: zorgt voor stevigheid en maakt de wanden van de vaatbundels hydrofoob
Probleemstelling → hout bestaat grotendeels uit cellulose en hemicelluose (de grondstoffen voor papier en
bioethanol) → ze liggen helaas wel ingebed in lignine waardoor ze moeilijk toegankelijk zijn voor chemicalen en
enzymen
Oplossing
Wijzigingen door transformatie met een antisense vercie van het CCR gen
Dit is een sleutelenzym in de biosynhtese van de lignine monomeren
CCR gen ↓ → productie van lignine bouwstenen zoals hydroxycinnamaldehyden en S-monomeren ↓
→lignine gehalte ↓ → afbreekbaarheid vh hout ↑
Hierdoor werd de productie van papier veel minder vervuilend
12% minder chemicaliën nodig en de productie van bioethanol gebeurt 50% efficienter
Nadelen
Doordat het lignine gehalte gedaald was er een roodverkleuring vh hout
Dit komt door een toename van ferulaatesters
Verminderde groei
Stijn Vandelanotte
-29-
Biotechnologie: theorie
Gewijzigde bloemkleur
Paarse anjers
Probleemstelling → Witte anjers zijn wit omdat ze enzymen missen in de biosynthese weg van pigmenten
Deze pigmenten zorgen voor een blauwe en rode bloemkleur
Oplossing: Een australische firma transformeerde witte anjers met twee ontbrekende biosynthese genen → de
genetisch gewijzigde planten produceren in hun kroonbladeren delphinidine → bloemen met paarse kleur
Blauwe rozen → Ontwikkeling van de blauwe roos
De ontwikkeling gebeurde door een ontbrekend gen voor de productie vd kleurstof delphinidine in te planten
⇒bloemen met lavendelblauwe kleur
Om echt blauw te zijn moeten er nog een acetyleringsgen bijkomen en moet de pH vd vacuolen omhoog
Mannelijke steriliteit
Moderne plantenveredeling → streven naar zoveel mogelijk F1-hybriden
2 ingeteelde homozygote inteeltlijnen worden geselecteerd voor hun combinatie geschiktheid
Dankzij heterosis effecten wordt een uniforme en superieure F1 hybride gevormd
Om te vermijden dat de moederplanten zichzelf bestuiven maakt men gebruik van bv een
zelfincompatibilieit en cytoplasmatische en mannelijke steriliteit
Mbv gametociden kan men de productie van pollen bij moederplant verhinderen
PGS ontwikkelde een genconstruct voor mannelijke steriliteit dat geschikt is voor alle plantensoorten
De promotorsequentie TA29 werkt specifiek in de tapetumcellen vd anthere
Tapetum = de cellaag die de pollenkorrels van voedingsstoffen voorziet tijdens hun ontwikkeling
Deze promotor werd gefusioneerd met een sequentie die voor een sterk RNAse codeert → barnase
Deze RNAse vernietigd alle RNA in de cel waar het tot expressie komt → celdood
Door de specifieke werking worden enkel de tapetumcellen vernietigd.
De ontwikkelde transgene planten is heel normaal, maar ontwikkeld geen pollen meer
Wanneer de vaderplant homozygoot is voor het gen voor een specifieke inhibitor vh Barnase
⇒ mannelijke ferteliteit hersteld in de F1 hybride
Barstar is een intracellulair eiwit dat bescherming biedt tegen de lethale effecten van barnase door er een stabiel,
enzymatisch inactief complex mee te vormen
Het herstel van de fertiliteit is voor veel gewassen noodzakelijk om een goede vruchtzetting te garanderen
Voor vegetatieve gewassen is dit herstel niet nodig
OPM → Naast TA29:Barnase werd het basta-resistentiegen(35S::bar)geplaatst.
Nuttig als selectiemerkergen bij de transformatie + vermeerdering vd vrouwelijke lijn.
Nadeel
De helft van de vrouwelijke planten die het construct niet dragen kunnen op het veld geelimineerd worden
met een basta bespuiting ⇒ De slechts 50% bastaresistent vd F1 hybrides ⇒ landbouwer is er dus niets
mee, de helft van zijn gewas zou afsterven na een basta-behandeling
Wordt reeds toegepast in oa. Maisteelt, koolzaadteelt, …
Terminator → terminator gen is een vd meest controversiele toepassingen vd plantenbiologie
Vooraf
Een promotorsequentie, afkomstig vh LEA gen, activeert de genen waaraan het gekoppeld is enkel wanneer de
zaden aan het rijpen zijn. Dit gebeurt niet in de zaden, maar in de weefsels vd moederplant
Onderzoekers koppelden de LEA promotor aan een gen dat codeert voor een proteine die de kieming verhindert
De planten die dit gen dragen zijn gezond, maar op het einde van het groeiseizoen wordt het gen geactiveerd
waardoor de rijping verhinderd wordt ⇒ zaden verliezen hun kiemkracht
Het gen is enkel actief in rijpe transgene planten → stel transgene pollen bevruchten een wild-type plant → het
gen komt niet tot expressie in het zich ontwikkelde zaad doordat de moederplant het gen niet bezit
Zoniet zouden ze nooit kiemkrachtig zaad kunnen verkopen
Voordelen
De gangbare systemen om nabouw van zaden te bemoeilijken, nl het op de markt brengen van F1-hybriden,
heeft nu een alternatief → vorm van copyright bescherming
Zaden die het terminator gen dragen zijn wel geschikt voor consumptie, maar kunnen niet kiemen
Schot van zaden wordt vermeden
Nadeel
De pollenkorrels van terminator-cultivars kunnen zich gemakkelijk verspreiden over nabijgelegen velden
Ze kunnen nu kiemen op de stempels van bloemen v/e ongetransformeerde cultivars, die dan voor een deel
zaden zullen dragen met het terminatorgen → de zaden die geteeld worden zullen enerzijds bij de bloei
opnieuw het terminator gen verspreiden via hun pollen en zullen anderzijds niet meer kiemkrachtig zijn.
→tegenstanders beweren dat het terminatorgen zich zo als een olievlek over de velden zal verspreiden
→uitsterven van de niet-transgene rassen door gebrek aan kiemkrachtig zaad
→ = ramp !!!!
→ onder de grote druk heeft Monsanto besloten het onderzoek in het terminator gen stop te zetten
Stijn Vandelanotte
-30-
Biotechnologie: theorie
Verminator
De plant wordt getransformeerd met en promotorsequentie met speciale eigenschappen.
De activiteit van de promotors, die uiteraard een gen sturen, kan worden aan-of uitgeschakeld door de plant te
bespuiten met een bepaalde chemische verbinding.
Er worden verschillende toepassingen voorzien:
De promotor wordt gekoppeld aan het “fat rat”-gen.
Dit is een lethaal gen dat zaadkieming en plantengroei onmogelijk maakt.
Zonder regelmatige bespuiting met een zgn. “uitschakelverbinding” is kieming en verder plantengroei
onmogelijk.
Nabouw is zinloos zonder aankoop van het product.
Nadeel: Ook hier is de kans reëel dat het pollen van dergelijk planten zich over naburige velden verspreidt.
De buurman-boer blijft dan achter met zaden die niet meer kiemen omdat hij ze niet met de
aanschakelverbinding bespuit.
Dit genconstruct kan zich, itt het terminatorgen echter niet verder verspreiden over een plantenpopulatie.
De promotor wordt gekoppeld aan een aantal gunstige gepatenteerde genen (ziekte- en herbicideresistenties).
Zonder regelmatige bespuiting met deze “uitschakelverbinding” komen deze genen niet tot expressie.
Dit betekent een effectieve bescherming vd eigendomsrechten op deze genen, ook in latere zaadgeneraties.
Deze genconstructies kunnen zich via pollenkorrels over naburige velden verspreiden maar kunnen geen
schade aanrichten omdat ze niet tot expressie komen.
Een combinatie van de twee voorgaande systemen
”Verminator-gen” is in principe het “Europese” antwoord op de terminator-technologie
Antivrieseiwitten (= AVE)
Probleemstelling → sommige gewassen (bv wortelen) kunnen goed overwinteren → ze maken AVE aan
Deze groep eiwitten werd ook terug gevonden bij antarctische vissen en in bepaalde insecten
Deze AVE werken niet zoals antivries in een autoradiator
Werking → EW binden specifiek op ijskristallen → groei vd ijskristallen stopt → cellen beschadiging stopt
In 1998 werd voor het eerst het gen voor dit AVE uit Daucus carota geisoleerd en getransfereerd naar het tabak,
waar het tot exrpessie kwam
Toepassingen
De kwaliteit en houdbaarheid van diepgevroren voeding te verbeteren mbv een natuurlijk extract van wortelen
Medische wereld: veiliger invriezen van weefsels
Bij cultuurgewassen: vorstresistentie ↑ ⇒ teeltseizoen en teeltgebied kan nu gewijzigd worden
Fytoremediëring
Probleemstelling → door mijnbouw of irrigatie leven vele mensen op bodems die gecontamineerd zijn met uiterst
giftige kwik of arsenicumverbindingen
Oplossing → fytoremediering
Principe: gebaseerd op de eigenschap van planten om met hun fijnmazig wortelstelsel toxische stoffen uit de
bodem en water op te nemen, te detoxificeren en op te slaan in de bovengrondse organen
De planten daarna oogsten en verbranden, waarbij de ZM uit de as gerecupereerd kunnen worden
Via genetische modificatie is men erin geslaagd om de tolerantie vd planten tegen Hg en As te verhogen en het
transport ervan naar de bovengrondse organen te verbeteren
Stijgende arealen met genetisch gemodificeerde GGO-gewassen
In 2008 waren 3.3 miljoen boeren die GGO gewassen telen
De oppervlakte waarop de GGO’s stonden is van 2007-2008 met 9,4 % gestegen tot 125milj hectare
Vooral: soja, mais en katoen
Vooral: Amerika (VS, Canada, Argentinie en Brazilie) maar ook op enorme oppervlaktes in het Verre Oosten
In Europa wordt alleen Bt-mais MON 810 geteelt
In totaal ongeveer 110000 ha
Dit is een schril contrast met de VS die alleen al 60 milj ha GGO-gewassen teelt
Stijn Vandelanotte
-31-
Biotechnologie: theorie
Hoofdstuk 10: biotechnologische toepassingen bij dieren
Transgene dieren die extra groeihormoon produceren of met extra spieren
Toediening van groeihormoon bij runderen
Voordeel: Verhoogde melk en vleesproductie
In de VS is het toegelaten om het natuurlijke runderhormoon (geproduceert in recombinante bacteriën) toe te
dienen.
Er zijn ondertussen al transgene dieren gegenereerd die zelf hogere hoeveelheden groeihormoon aanmaken
De eerste experimenten met het inbouwen van een extra groeihormoongen werden ondertussen al uitgevoerd bij:
De muis → maar ook varkens, schapen, vissen
Varkens en schapen
Problemen of nadelen
Transgene landbouwhuisdieren zijn moeilijk te verwezenlijken wegens de beperkte hoeveelheid
beschikbare eicellen en het relatief lage aantal met DNA geinjecteerde embryo’s die uiteindelijk aanleiding
geven tot transgene nakomelingen.
Het chimere gen leidde niet tot verschillen in groeisnelheid of grootte
De dieren werden veel stress gevoeliger
Ontwikkelden gemakkelijker maagzweren
Lagere vruchtbaarheid
Voordelen
De karkaskwaliteit verbeterde wel en de voederconversie liep efficienter
Minder onderhuis vet en meer spierweefsel terwijl ze minder voeder opnamen
Vissen
Gebruik van metallothioninepromotor
Wat? Metallothionines zijn eiwitten die in dieren en mensen ZM binden
Werking? In de aanwezigheid van ZM of steroide hormonen starten hun promotors de transcriptie van elk
gen dat eraan gehecht is
Voordelen
Sterke groeibevordering bij zalmen en forellen
Transgene zalmen waren na 14 maanden gem. 11 keer groter dan de gewone nakomelingen
Een dierlijke receptor, PPAR-delta, regelt de verbrandingssnelheid van vet
Men heeft een muis gecreeerd waarbij dit gen geactiveerd werd in de spieren ⇒ spectaculaire toename in
spierweefseltype dat minder snel vermoeid geraakt en vet verbrand ipv suiker
Bij mensen en dieren zijn hart en het diafragma opgebouwd uit dergelijke spieren
Ook sporters waarvoor uithouding belangrijk is ontwikkelen ook dit type spieren→genetische doping mogelijk?
Inbouwen van ziekteresistentie in dieren
Transgene kippen die het env eiwit van ALV tot expressie brengen → resistent tegen latere infecties met het ALV
Bepaalde muizenlijnen bezitten een gen dat resistentie verleent tegen influenza
Dit gen kan door genetische manipulatie bv in varkens ingebouwd worden
Verbetering van de wolproductie bij schapen
Essentieel voor de productie van wol is het AZ cysteine
Opname cysteine gebeurt door voederopname → in maagdarmkanaal gebruikt door mo’s → cysteine is beperkende
factor voor goede wolproductie → tegenwoordig tracht men schapen te maken die cysteine vormen vanuit serine
Productie van farmaceutische eiwitten in melk of bloed van vee
Probleemstelling → de in vitro cultuur van dierlijke cellen is vaak moeilijk en duur
Alternatief → de gewenste eiwitten in de melk van koeien of schapen te produceren
Voordeel: goedkope en eenvoudige manier om grote hoeveelheden EW te produceren
Werking:
β-lactoglobuline (eiwit in de melk van herkauwers) → de promotor werd gefusioneerd met verschillende
sequenties coderend voor farmaceutische eiwitten, bv α-antitrypsine
Resultaat: bij transgene schapen is het gelukt om tot 10kg α-antitrypsine te produceren per lactatie
Ondertussen zijn al een hele reeks producties van therapeutische eiwitten die de markt hebben bereikt: Bv:
Lactoferrine in koeienmelk
Antithrombine III in geitenmelk
α-antitrypsine in schapenmelk
Protein C in varkens melk
Menselijke bloedfactoren kunnen ook geproduceerd worden in bloed van transgene varkens
Een groot varken kan zonder problemen tot 10l bloed afstaan per jaar
Men is nu zelf aan het onderzoeken of varkens zouden kunnen dienen als orgaan donoren voor de mens
Stijn Vandelanotte
-32-
Biotechnologie: theorie
Klonen van dieren
Wat? creeren van dieren met een identiek genetische achtergrond, voortplanting zonder seksuele recombinatie dus
Normaal:
Ontwikkeling embryo → individuele cellen beginnen te differentieren → vanaf nu kunnen ze niet meer tot om
het even welke cel uitgroeien
Bv in het geval v/e levercel worden alle genen gemethyleerd behalve deze die noodzakelijk zijn om een
levercel op te bouwen → Onomkeerbare blokkering → geen omschakeling meer mogelijk
Levercellen bleven levercellen, huidcellen bleven huidcellen
1996! Eerste kloning was een feit dankzij het team van Ian Wilmut in schotland
Werking
Uiercellen v/e volwassen ooi werden in rusttoestand gebracht
Door ze geleidelijk aan voedingsstoffen te onttrekken aan het medium waarin ze gekweekt werden
Door de uithongering staakten de cellen de productie van RNA
227 ‘uitgehongerde’ uiercellen werden elk versmolten met een pas geovuleerde onbevruchte eicel waarvan
de kern werd verwijderd
Een dergelijke eicel bevat speciale regulatie-eiwitten die bepaald embryonale genen activeren
Een kleine stroomstoot deed de slapende kern ontwaken en zette de eicel aan tot celdeling
29 prille embryo’s werden overgebracht naar de baarmoeder van draagmoederschapen
1 embryo ontwikkelde zich verder normaal en werd na 5 maanden dracht geboren: Dolly!!!!!
Sindsdien werden heel wat landbouw- en huisdieren gekloond: koeien, paarden, varkens, honden, muizen
Het klonen van volgende dieren belooft een miljoenenbussiness te worden
Klonen van waardevolle al dan niet transgene fokouders (runderen, racepaarden)
Bijzondere eigenschappen (drugshonden, blindegeleidehonden), geliefde huisdieren
Met uitsterven bedreigde diersoorten (gaur, banteng, panda)
Problemen
De meeste embryo’s komen niet tot ontwikkeling of eindigen spontaan door abnormaliteiten aan de foetus
Vooral schapen en runderen hebben dit probleem, terwijl varkens en geiten ‘kloonvriendelijkere’ dieren zijn
Een veel voorkomend probleem bij runderen en schapen is LOS (large offspring syndrome)
Dit betekent dat minstens 20% vd kalfjes zwaarder zijn dan het normale geboortegewicht of abnormaal
grote organen hebben
Dieren met LOS hebben vaak last van vochtophoping
Andere gezondheidsproblemen bij het klonen van dieren zijn
Spierpeescontracties, ademhalingsproblemen en dystocia (= een te grote navel → kans op infecties ↑)
Telomeerverkorting → bij celdeling verkorten deze uiteinden vd chromosomen terwijl bij klonen vertrokken
wordt van cellen die al verkorte telomeren hebben
De vrees bestaat dat gekloonde dieren als gevolg hiervan minder lang zouden leven
Bv: dolly stierf aan 6,5 jaar terwijl een gemiddeld schaap 11 jaar kan worden
Stamcellen
Als het embryo nog slechts enkele dagen oud is ⇒ dan is het niet meer dan een bolletje cellen ⇒ mogelijk om een
klein gebied, de zgn binnenste cellen of inner cell mass, ICM, te isoleren en in een kweekschaaltje te laten groeien
De ICM kan alle weefsels vh volwassen organisme vormen
Als de ICM op haar plek gelaten wordt, ontwikkeld deze zich tot de foetus zelf, terwijl uit de omliggende cellen
de placenta en embryonale vliezen ontstaan
Bij bepaalde omstandigheden kan men uit de ICM zelfs embryonale stamcellen (ES) krijgen
1) ES produceren doorlopend identiek dochtercellen → ES kan zichzelf vernieuwen → ES cellen kunnen lang
in kweek gehouden worden
2) ES kunnen ook bij veranderde kweekomstandigheden omgevormd worden tot bijna alle celtypes !
Dit leidde tot het idee dat ES een eindeloze bron zouden kunnen zijn van gespecialiseerde cellen voor
diverse vervangingstherapieen
Bv hersencellen bij neuro-degeneratieve stoornissen, hartcellen bij hartziekten
Ethische bezwaren bij het gebruik van ES
Een chinese groep bewees dat het mogelijk is muizencellen te herprogrammeren, zodat ze veel lijken op ES
Deze zgn iPS-cellen werden bekomen door bindweefselcellen via virustransformatie te voorzien van 4 extra
genen en het GFP gen
iPS cellen v/e muizenlijn met zwarte vachtkleur werden ingespoten in een klompje embryonale cellen v/e muis
met een witte vacht
als beide celtypen zouden bijdragen aan de ontwikkeling vh embryo zou de vacht gedeeltelijk wit en
gedeeltelijk zwarte moeten zijn, maar het muisje dat geboren werd was compleet zwart
oorzaak: de cellen uit het klompje embryonale cellen waren enkel instaat om het weefsel vd placenta te
maken ⇒ de iPS cellen vormden de complete muis
Stijn Vandelanotte
-33-
Biotechnologie: theorie
Hoofdstuk 11: Andere toepassingen van moleculaire technieken
DNA-fingerprinting in de plantenveredeling en –biotechnologie
Verwantschapsanalyse tussen cultivars of wilde soorten
Indentificatie van hybriden
Cultivars kunnen worden geidentificeerd
Aantonen van misbruik van inteeltlijnen door concurrerende veredelaars
Zaadkwaliteit (vb moederlijn in een zaadpartij v/e F1-hybride
Microsatellieten zijn bruikbaar voor bv cultivar indentificatie en populatiestudies
Toepassingen van DNA-chips
Volgen vd genexpressie gedurende differentiatie en groei
Opsporen vd betrokken genen of veranderende genexpressiepatronen bij ziekte en of behandeling met medicijnen of
plantenbeschermingsmiddelen
Snelle in vitro screening van nieuwe geneesmiddelen of pesticiden en opstellen van expressie-fingerprints / middel
Determinatie van bacteriele populaties in bv bodem- en waterstalen
Vergelijkende genoomanalyse
Identificatie van SNP’s
Toepassingen van sequenering
Identificatie van SNP’s
Identificatie van genetische variaties in genomen
Vergelijkende genoomanalyse
Gepersonaliseerde geneeskunde
Sequenering van transcriptomen
Paleobiologie: sequenering van oude genomen
Metagenomics: sequenering van volledige bacteriele populaties
Toepassingen in de maatschappij
Criminologie
Een dader kan geidentificeerd worden adv/e paar zaadcellen bij verkrachting, een haar in een auto, ..
Enkele haren per dier zijn voldoende om een fingerprint v/e hele stapel te maken
Paleontologie, archeologie, evolutieleer
DNA van mummies , museumdieren, ingevroren mammoet, gedroogd plantenblad
Populatie en ecologisch onderzoek
Identificatie van stoffelijke overschotten na rampen of aanslagen
Snelle diagnose van ernstige bacteriele of virale ziektes
Vaststellen van genetische afwijkingen
Snelle weefseltypering voor dringende transplantaties
Stijn Vandelanotte
-34-
Biotechnologie: theorie
Hoofdstuk 12: Transgene planten en bioveiligheid
Inleiding
Samen met de komst van moderne technologie is ook wereldwijd de wetgeving inzake bioveiligheid tot stand
gekomen
Bioveiligheid → def: de veiligheid voor de menselijke gezondheid en voor het leefmilieu met inbegrip van de
bescherming vd biodiversiteit bij het gebruik van GGO’s
Wetgeving inzake bioveiligheid
Europese richtlijnen
1990: de Europese commissie publiceert 2 richtlijnen betreffende bioveiligheidsaspecten van onderzoek en
ontwikkeling in de sector vd biotechnologie alsook vd productie en het in de handel brengen van biotechnologische
producten
Richtlijn 90/219/EEG: reglementeert het ingeperkt gebruik van GGO’s in laboratoria of productie-eenheden
Richtlijn 90/220/EEG: reglementeert de doelbewuste introductie van GGO’s in het leefmilieu
1998-2004 → voorzichtigheidsprincipe → alle lokale productie van genetisch gewijzigde landbouwgewassen was
opgeschort
Vanaf 1998 was het wel weer mogelijk om transgene gewassen te verbouwen in Europa nadat ze , geval per geval,
gunstig geëvalueerd werden
Ingeperkt gebruik van GGO’s
Richtlijn 90/219/EEG
In België werd de implementatie van deze richtlijn op regionaal niveau verwezenlijkt dmbv 3 wetenschappelijk
identieke wetgevingen
Het begrip bioveiligheid werd in de ruimere betekenis geinterpreteerd waarbij alle levende organismen die een
risico kunnen betekenen voor de menselijke gezondheid, het leef milieu en de biodiversiteit betrokken zijn
Er zijn specifieke voorzieningen getroffen voor toepassingen van
Gentherape, voor serres, animalaria en virale vectoren
Er werden 4 biologische risicoklassen gedefinieerd met de overeenkomstige inperkingsniveaus
Elke inrichting die een ingeperkt gebruik met pathogene en/of genetisch gemodificeerde organisme uitvoert of
voorziet komt in aanmerking voor toepassing van bovenvermelde wetgeving en moet daarvan melding maken aan de
regionale bevoegdheid en een ‘bioveiligheidsdosier’ opstellen
In België is dit verbonden met de milieuvergunning
Voor al deze inrichtingen is een milieuvergunning van klasse 1 vereist
Het bioveiligheidsdosier bestaat uit een technisch dosier en een publiek dossier
Het technisch dossier omvat een gedetailleerde beschrijving vd wetenschappelijke activiteiten
Infrastructuur, laboratoriumpraktijken, …
Het publiek dossier is een gevulgariseerde en niet-vertrouwelijke versie vh technisch dossier
In geval van een nieuw milieuvergunning of exploitatievergunning voorzien de regionale procedures
een publieke enquête.
Het publiek dossier kan door elke burger geconsulteerd worden bij de gemeente
Ingeperkt gebruik van transgene planten
Vooraf
Goedkeuring van ingeperkt gebruik is vereist voor ook de eerste stadia vd ontwikkeling van bv de design vd
vectoren en de plantentransformatie in het labo of de cultuur in de plantenkweekkamer en in de serre
Als een goed ‘kandidaatlijn’ verkregen wordt zal men overgaan tot veldproeven dit gereglementeerd worden onder
de 90/220/EEG
De evaluatie vd risico’s is uiterst belangrijk:
Eens een GGO is losgelaten in de natuur is het in bepaalde gevallen moeilijk weer te verwijderen
Daarom moeten alle negatieve effecten voorzien en vermeden worden
Voorbeeld van negatief effect: de risico dat een GGO de plaats zou innemen van andere soorten door een
selectief voordeel.
Daarom moet er een individuele evaluatie gebeuren obv volgende informatie
Wat zijn de eigenschappen van donor- en receptororganismen
Welke vector en transformatie methode werd gebruikt
Welke nieuwe kenmerken heeft het organisme verkregen door genetische modificaties
Hoe wordt het in de natuur gebracht
In welk milieu komt het GGO terecht
Hoe overleeft het GGO, hoe plant het zich voort en hoe verspreid het zich
Zijn er monitoringstechnieken om controle vd verspreiding toe te laten
Stijn Vandelanotte
-35-
Biotechnologie: theorie
Veldproeven met GGO’s
De meeste europese veldproeven werden uitgevoerd met:
mais, koolzaad, aardappel en suikerbiet
De meest voorkomende geintroduceerde kenmerken zijn:
herbicidenresistentie, instectenresistentie en mannelijke steriliteit
Voor je een veldproef mag uitvoeren moet:
1) aanvraag van autorisatie door de firma ovv een technisch dossier naar de bevoegde overheid gestuurd worden
2) bevoegde overheid evalueert de risico’s van de disseminatie alsook de opmerkingen van de andere lidstaten
3) de bevoegde overheid brengt de aanvrager, de Commissie en de lidstaten op de hoogte
→ 90 dagen de tijd om dit te verwerken
4) bij beëindiging vd veldproef stelt de kennisgever een rapport op met de resultaten van de introductie
5) indien voldoende ervaring is opgedaan met de introductie v/e bepaalde GGO kan de kennisgever verzoeken
om de toepassing v/e eenvoudigere procedure
6) indien goedgekeurd kan de procedure over meerdere jaren lopen en wordt eenmaal een algemene
toestemming gegeven
Men moet dan wel jaarlijks een specifieke toelating aanvragen en een verslag indienen vd proefnemingen
vh voorgaand jaar
In de handel brengen van GGO’s
Voor je een GGO in de handel mag brengen moet:
De firma die een GGO wil introduceren stuurt een technisch dossier met o.a. een milieurisicobeoordeling naar
de bevoegde overheid van een lidstaat naar keuze
de bevoegde overheid evalueert de risico’s voor de menselijke gezondheid en het leefmilieu voor het
formuleren v/e advies
→90 dagen voor advies moet gegeven worden
stel: negatief advies → het product wordt verworpen
stel: positief advies → dossier doorsturen naar de Europese Commisie
De europese commissie verspreidt dit dossier naar de bevoegde overheden vd andere lidstaten
→ 60dagen voor bezwaar aan te tekenen
Vaak wordt het voorzichtigheidsprincipe aangehaald als reden om x niet goed te keuren
Hierdoor laat men toe om beschermende maatregelen te treffen zonder dat hiervoor sluitend
wetenschappelijk oorzaak-gevolg-bewijs geleverd moet worden
100% wetenschappelijk bewijs kan zelden of nooit geleverd worden. In de praktijk komt het erop neer
dat men GGO’s tegenhoud obv vermoedens van risico’s
Hierdoor beschuldigen de Amerikanen Europa ervan dat zij het voorzichtigheidsprincipe gebruiken als
legitimatie om verdoken handelsbarrières tegen Amerikaanse producten op te zetten
Nieuwe wind in de Europese commissie
Besef dat een 0% risico maatschappij alle vooruitgang tegenhoudt
Men besloot dat het verbieden van GGO’s obv vermoedens zonder wetenschappelijke analyse niet altijd meer kan.
Het is vaak zinvoller verder onderzoek te laten uitvoeren naar de onzekerheden in de analyse.
Uiteindelijk oordeelt het Europees Hof van justitie over de wettelijkheid vd genomen maatregel
De algemene toepassingsprincipes zijn de volgende
Proportionaliteit: de maatregelen moeten in verhouding zijn met het risico, waarbij niet moet streven naar een
0% risico
Non-discriminatie: dwz dat in vergelijkbare situaties ook vergelijkbare maatregelen moeten getroffen worden
De wetgeving moet zich richten tot de eigenschappen vh product en niet op de gebruikte productiemethode
Consistentie: nieuw genomen maatregelen moeten overeenkomen met vroeger genomen maatregelen onder
gelijkaardige omstandigheden.
2001: invoering van een nieuw regelgevingssysteem
Deze is effectiever en doorzichtiger dan het systeem van Richtlijn 90/220/EEG inzake de doelbewuste
introductie van GGO’s in het milieu
2004 → De opheffing vh moratorium, geaard met twee verordeningen
(EC) NO. 1829/2003: betreffende GGO’s in diervoeder en levensmiddelen
(EC) NO. 1830/2003: betreft de traceerbaarheid en etikettering van GGO en van met GGO-geproduceerde
levensmiddelen en dieren voeders
Wat zijn de essentiële verschillen met de vroegere wetgeving
Stijn Vandelanotte
-36-
Biotechnologie: theorie
Hoofdstuk 13: Vele betrokken partijen
Multinationale ondernemingen en kleinere biotechbedrijven
Just eki leezn
De landbouwer
Voordelen en risico’s voor de landbouwer
Het voordeel vd landbouwer hangt af van de aard vd ingebrachte genen
Genen die de samenstelling vh geoogste product verbeteren kunnen de markt verruimen
De winst hiervan zal voor een deel opgaan in duurder zaaigoed
Zolang de landbouwer de vrije keuze heeft tussen een transgene en een niet-transgene cultivar zal zijn keuze
bepaald worden door de verwachte winst
In België is de commerciele teelt van transgene planten nog niet toegelaten
De voordelen (die gevonden zijn bij landbouwgewassen in Amerika en Canada) kunnen we indelen in 4 groepen
Hoger rendement: door vermindering vh oogst verlies
Reductie vd bestrijdingskost: dit kan door het aantal sproeibeurten terug te brengen door resistent rassen te
gebruiken
Lagere risico’s: Bt-mais vormt een verzekering tegen jaarlijks varierende schade door de stengelboorder
Tijdswinsten: de lange periode van bescherming beperkt informatie en leerkosten bij het gebruik van steeds
nieuwe insecticiden
Consument
Voordelen voor de consument
Vroeger: landbouwkundige vooruitgang → lagere voedselprijzen
Nu: de kostprijs vd basisingredienten van ons voedselpakket is nu in verhouding met de verkoopprijs in de winkel
zeer laag
Bv: een 20% lagere kostprijs voor graan zou nauwelijks gevolgen hebben voor de broodprijs
Oorzaak: niet de productieprijs bepaald de winkel prijs, wel de wetten van vraag en aanbod
De transgene planten kunnen hierop een uitzondering worden eens de consument ze als beter ervaart dan de gewone
planten of producten
Bv: de Flavr-Sav tomatenketchup deed het zeer goed in de Engelse supermarkten doordat het veel lekkerder zou
zijn
Risico’s voor de consument
Naargelang de categorie vd biotechnologische toepassing, is de aanvaarding vd consument anders
Als het gaat om eiwitten die ingezet worden in de gezondheidszorg → geen bezwaren
Als het gaat om afgeleide producten van hierboven → geen bezwaren
Als het gaat om het rechtstreeks consumeren van GGO’s →wel bezwaren
Oorzaak: de taalcreativiteit van biotechnologietegenstanders met ruime toegang tot de media laat bij de
consument duidelijk gevoelens van twijfel en bezorgdheid hangen
Hierdoor krijgt de consument dat de bezorgdheid vd overheid niet ernstig genoeg is
De risico’s worden nochtans even veel onderzocht als de eerste 2 toepassingen, maar hier wordt de
objectieve informatie naar de consument niet correct uitgespeeld
Allergie
Algemeen
Ongeveer 1 – 2 % vd bevolkings vertoont allergische reacties tegen eiwitten in bepaalde levensmiddelen
De voornaamste natuurlijk voorkomende allergenen worden teruggevonden in:
Melk, eieren, aardnoten, noten, vissen, sojabonen
Bij genetische modificatie wordt de genetische code vd plant gewijzigd waardoor er een ‘nieuw’ eiwit in de plant
wordt aangemaakt
Alle eiwitten zijn mogelijk allergenen → de nieuwe eiwitten zouden dus ook allergieën kunnen veroorzaken
De Term ‘nieuw’ heeft meestal slechts betekenis voor de gemodificeerde plant
Het gen dat toegevoegd wordt , is immers afkomstig van een andere plant
⇒ de personen die allergisch zijn voor de nieuwe plant zullen ook reeds lang allergisch reageren op de
donorplant
Een veel geciteerd voorbeeld is dat van soja met het paranootgen
Op wereld vlak is soja het belangrijkste eiwitgewas!
Het heeft een relatief gebrek aan het AZ methionine
Men haalde het gen voor zo’n hoogwaardig eiwit uit de paranoot
Uit testen bleek met de transgene soja bleek dat het eiwit een allergeen was dat bij mensen (die ook allergisch
waren voor paranoten) een allergische reactie kon opgeroepen worden → het project werd stopgezet
Stijn Vandelanotte
-37-
Biotechnologie: theorie
Andere
De kans dat een ingeplant gen een allergeen blijkt te zijn is zeer klein
Bij genetische modificatie wordt slechts 1 of een beperkt aantal eiwitten in de plant gewijzigd
Als een patient allergisch reageert is dit het gevolg v/e reactie tegen verschillende eiwitten
Ook bij klassieke kruissingstechnieken kunnen ‘nieuwe’ EW ontstaan of nieuwe planten waarin bestaande
eiwitten in verschillende relatieve hoeveelheden aanwezig zijn. Zo’n planten mogen wel geproduceert worden
maar kunnen dus ook grote ‘allergeen-leveranciers’ zijn (kiwi, aardbeien, hydrowitloof)
De wetgeving verplicht dat elke genetisch gemodificeerde plant die op de markt komt , eerst getest moet
worden op zijn vermogen om een allergische reactie uit te lokken
Plantengenetici gebruiken hiervoor immunologische technieken om vast te stellen of een genetische
gemodificeerde plant allergenen bevat die voorkomen in de donorplant
In het serum van personen die allergisch zijn voor de donorplant vind men immers antistoffen waarmee
men de bewuste eiwitten in de gemodificeerde plant kan detecteren
De biotechnologie biedt ook de mogelijkheid om gewassen te maken die geen of minder allergenen bevatten
Antibioticumresistentie
Algemeen
Bij elke hap verse groenen of fruit eten we ontelbare genen
In transgene planten zit vaak ook een antibioticumgen dat als selectiemerker werd gebruikt tijdens het
transformatieproces. (vaak kanamycine resistentie, die wijd verspreid in de natuur voorkomt)
Tegenstanders van transgene planten wijzen op het gevaar dat het gen voor kanamycineresistentie in de
darmbacterien vd mens kan binnenglippen
Als de persoon dan ooit door een ziekteverwekkende bacterie geinfecteerd word is de kans dat het gen
overgedragen wordt naar deze bacterie waardoor deze resistent wordt tegen kanamycine
Volgende argumenten pleiten tegen deze hypothese
Een grote hoeveelheid DNA wordt in het menselijke verteringskanaal vernietigd
De bacteriën moten dan uit de miljoen overblijvende genen net het kanamycinegen opneme
Deze kans is klein omdat er geen positieve selectiedruk heerst in de darmen
Als het gen ooit opgenomen wordt en doorgegeven aan een ziekteverwekker, moet het er nog
aangeschakeld worden.
De gebruikte promotor (CaMV) werkt enkel in eukaryoten en niet in bacteriën
Als het gen toevallig voor een bacteriële promotor komt te zitten zou het inderdaad werken en resistentie
opleveren voor de ziekte verwekker
Kanamycine wordt tegenwoordig niet meer gebruikt in de menselijke geneeskunde wegens haar
toxiciteit
Kanamycineresistentie komt wijd verspreid voor in de natuur ⇒ het gevaar op overdracht naar een ziekte
verwekker komt niet alleen vd transgene planten
Het risico is dus vrijwel onbestaand. Toch gebruiken tegenstanders het te pas en te onpas om de consument
ongerust te maken
Bescherming van de consument
Invoering van ‘novel food’ → deze verordening is van toepassing op het in de handel brengen van
voedingsmiddelen en voedsel ingrediënten die tot dusver niet voor de menselijke voeding gebruikt zijn.
Voedingsmiddelen of voedsel ingrediënten die GGO zijn GGO’s bevatten of afgeleid zijn van GGO’s vallen
allemaal onder deze richtlijn
Deze producten hebben een goedkeuring nodig vooraleer ze op de markt mogen komen
4 categorieën van novel foods die rechtstreeks of onrechtstreeks biotechnologisch geproduceert worden
Deze waar het voedsel zelf het resultaat is van een recombinant-DNA ingreep
Voedingsmiddelen waarin zich nog genetisch gemodificeerde mo’s bevinden op het ogenblik van consumtie
Bv yoghurt, kaas, wijn
Voedingsmiddelen die geproduceerd worden via tussenkomst v/e enzym of eiwit bekomen door recombinantDNA technologie
Voedingsstoffen geproduceerd door GGO’s , vooral niet eiwitten
Bv suiker uit transgene bieten, inuline uit transgene cichorei, olie uit koolzaad
Belangrijkste voorwaarden voor goedkeuring van dergelijke nieuwe voedingsmiddelen
Geen gevaar voor de consument
De consument mag niet misleid worden
Ze moeten ‘substantieel equivalent’ zijn
Stijn Vandelanotte
-38-
Biotechnologie: theorie
Consument moet weten wat hij eet → overheid verplicht etikettering
Als GGO’s verwerkt worden moet dit op het etiket vermeld worden door de producent
Zelfs wanneer de algemene samenstelling niet wordt beïnvloed en het landbouwproduct ‘substantieel
equivalent’ wordt bevonden met de bestaande conventionele producten
Voor onopzettelijke vermenging met GGO’s wordt een grenswaarde van 0,9% gehanteerd
Voor ‘nog niet toegelaten’ GGO’s wordt een grenswaarde van 0,5% gehanteerd
De aanwezigheid van ‘nieuwe’ stoffen die gevolgen kunnen hebben voor de gezondheid of ethische bezwaren
kunnen opleveren moet eveneens aangegeven worden
Gezondheid → opwekken van allergenen?
Ethisch → planten met dierlijke genen voor vegetariërs?
Consumentenverenigingen
Testaankoop publiceerde al 2x onderzoeksresultaten naar de aanwezigheid van vreemde genen in voedsel
Laatste rapport onderzochten ze 53 producten op basis van mais of soja
Via PCR kon men in 4 gevallen sporen van vreemde genen vinden
2X bij chips
2X bij hespenworst
Consumentenvereniging zijn groot voorstander van duidelijke etikettering
Milieu
De pollen van transgene planten kunnen verwante onkruiden bevruchten
Koolzaad kan bv bepaalde rassen van wilde brassicaceae bevruchten
⇒ een gen kan zo ontsnappen aan de controle vd mens
In het geval van genen voor herbicidenresistentie kunnen resistente onkruiden bestaan
Door jaarlijks te wisselen van herbicide kan dit probleem uitgesteld , maar niet vermeden worden
Het ontstaan van een superonkruid dat de velden overwoekerd en waartegenover de mens machteloos staat is echter
biologisch niet realistisch
Ideologische oppositie
Regelmatig duiden krantenkoppen op de bezorgdheid die rond biotechnologische producten heerst
Mensen stellen zich vragen en verschillende organisaties bv greenpeace, agalev, de belgische boerenbod, broederlijk
delen, maken zich zorgen over de ecologisch, sociaal-economische en politieke gevolgen vd biotechnologische
toepassingen en de mogelijke risico’s voor de gezondheid
De houding van de grote internationale milieuorganisaties komt voor veel wetenschappers uit de biotechnologische
sector over als onredelijk en eenzijdig negatief
Biotechnologie en de derde wereld
Wat is de impact van plantenbiotechnologie op de bedreigde socio-economische situatie van de kleinere
landbouwers en de derde wereldboeren?
Discussie omtrent de problematiek van de patentering van genen en uiteraard daaraan gebonden socioeconomische aspecten.
1) kan men wel genen patenteren, gezien het niet echt om nieuwe verbindingen gaat?
2) wie kan de patentering winnen? De oorspronkelijke eigenaar van het gen of van het organisme of de
organisatie die het gen isoleerde en sequeneerde of de maker v/e product obv/e gen
Ontwikkelingslanden vrezen dat ze zullen moeten betalen voor genen die westerse bedrijven
oorspronkelijk bij hen kwamen halen
Discussie omtrent de plannen om vervangproducten te fabriceren voor allerlei tropisch planten (bv cacao
Bv: de vervanging van suiker door fructosestroop uit mais → rijke landen kunnen zich hierdoor
onafhankelijk maken van Derde wereldlanden wat de voedselproductie betreft ⇒ export ↓ ⇒ inkomsten ↓
Actiegroepen wijzen op de toenemende greep van grote multinational bedrijven (zaad- ,
fytopharmaceutische bedrijven) op de voedselvoorziening wat vermoedelijk zal leiden tot een verminderde
autonomie vd kleine boeren (zie koppelverkoop van herbicidenresistente cultivar)
Uiteindelijk is de vraag of men de commerciele drijfveren vd biotechnologie in evenwicht zal kunnen
brengen met de bezorgdheid voor een duurzame ontwikkeling voor zowel rijk als arm
Biotechnologie kan nochtans van groot belang zijn voor de Derde wereld
→ dankzij hogere productiecijfers van landbouwproducten waarbij minder land en water nodig is
De gestage groei vd wereldbevolking concentreert zich vooral in de ontwikkelingslanden ⇒ alle
beschikbare landbouwgrond wordt door bevolking ingepalmd ⇒ massaal verlies aan biodiversiteit
Stijn Vandelanotte
-39-
Download
Random flashcards
fff

2 Cards Rick Jimenez

mij droom land

4 Cards Lisandro Kurasaki DLuffy

Rekenen

3 Cards Patricia van Oirschot

Create flashcards