Biotechnologie: theorie Stijn Vandelanotte
advertisement
Biotechnologie: theorie Hoofdstuk 1: Algemene inleiding Definitie Bio → leven Technologie → menselijke kunde en vaardigheid Biotechnologie → het gebruik van organismen of onderdelen van organismen voor de productie van stoffen Ontstaan na de ontdekking vd structuur vh DNA Toepassingsgebieden Gezondheidszorg Landbouw Voeding Fijne chemicaliën Papierproductie Types Witte biotechnologie → industriële toepassingen Groene biotechnologie → genetische modificatie van planten Rode biotechnologie → toepassingen in de medische sector, forensisch onderzoek Dankzij de moderne biotechnologie hebben we de mogelijkheid om genetisch materiaal binnen te brengen in microben, planten en dieren ⇒ Gevolgen We kunnen deze organismen op een nieuwe manier waardevolle moleculen en eiwitten laten maken Geneesmiddelen, vaccins, bioplastics We kunnen planten en dieren produceren die ziekte resistent zijn of tolerant voor moeilijke omgevingssituaties en/of hogere productieniveaus hebben van nuttige producten We kunnen methoden ontwikkelen om menselijke ziektes op te sporen, voorkomen of te bestrijden Veel methoden ontwikkeld om genetisch te transformeren, maar de grote lijnen blijven dezelfde: Isoleren en kloneren van genen en de constructie van vectoren die alle gewenste signalen bevatten die de expressie vh gen en de biochemische selectie van transformatie mogelijk maken De ontwikkeling van biologische of fysische methoden voor gen transfer Regeneratie, selectie en karakterisering van transformanten Stijn Vandelanotte -1- Biotechnologie: theorie Hoofdstuk 2: Het isoleren van genen Algemeen Genen komen meestal tot expressie via eiwitten → meestal als enzymen die specifiek Belangrijkste methode om de functies van genen en eiwitten te achterhalen is via de analyse van spontane of geïnduceerde mutanten bij modelorganismen De ontwikkeling van de Sanger methode voor de bepaling van de volgorde vd basen in een DNA sequentie Basisbegrippen bij de genstructuur van eukaryoten Sense en antisense: De antisense streng = de DNA streng die als mal dient voor de transcriptie → afleesbaar De sense streng = het resulterende RNA is een replica van de sense DNA streng (T → U) Intron en exon Exons = expressed regions → deze komen tot expressie, introns niet Na de transcriptie worden de introns tijdens de ‘processing’-stap geëlimineerd → de exons worden samengevoegd tot een mRNA De transcriptie loopt van het 5’ naar het 3’ uiteinde van de antisense DNA streng Stroomopwaarts en stroomafwaarts Start op positie +1: stroomopwaarts lig het promotor gebied → reguleert de transcriptie 25-30 bp stroomopwaarts van +1 ligt de TATA box → zorgt voor de correcte start vd RNA-polymerase Verder stroomopwaarts ligt de CCAAT-box → betrokken bij fixatie van RNA-polymerase De promotor bevat minstens 1 sequentie waarop een transcriptie factor kan binden Dit zijn proteïnen die het polymerase ertoe aanzetten aan de transcriptie te beginnen De transcriptie begint bij positie 1 en gaat dan stroomafwaarts verder Stroomafwaarts bevinden zich signaal sequenties die het einde vd transcriptie aanduiden Bv TAA, TAG, TGA De transcriptie wordt afgesloten als een terminatorsequentie herkend wordt Deze mag niet verward worden met een stopcodon dat in de translatie doet stoppen ♦ Bij een translatie wordt het mRNA afgelezen door een ribosoom, deze vertaalt de boodschap in een zichzelf opvouwende keten van AZ → een EW Chimeer gen Gen? Complex van promotor en de voor een eiwit coderende sequentie De promotor beslist onder welke voorwaarden het gen tot expressie zal komen Een promotor van bij prokaryoten kan ook werken als promotor voor eukaryoten en omgekeerd, maar voor een optimale expressie is het best een eukaryotenpromotor te gebruiken bij eukaryoten. Wanneer men het promotor gebied van het ene gen met het coderend gebied v/e gen v/e ander soort organisme combineert, spreekt men van een chimeer gen Soorten promotors 2 types: constitutieve promotors en specifieke promotors Constitutieve promotors: werken in alle weefsels en moeten dus niet geïnduceerd worden. Bv 1: pNOS = promotor vh nopalinesynthase gen Bv 2: p35S = deze sterker werkende 35S-promotor is afkomstig uit het Cauliflower Mosaic Virus. In een verbeterde versie (P35x2) werd de activatorsequentie verdubbeld ⇒ activiteit = 5 – 10x sterker Bv 3: pUBI = promotor vh ubiquitinegen → nog hogere expressieniveaus Specifieke promotors: zorgen er voor dat genen slechts tot expressie komen in bepaalde weefsels (wortel, pollen, delende cellen) zorgen er voor dat genen slechts induceerbaar tot expressie komt (warmte, verwonding, pathogenen) Stijn Vandelanotte -2- Biotechnologie: theorie Genisolatie vertrekkende van mutantenanalyse Modelorganismen vooraf: belang van specifieke genen in de ontwikkeling v/e organisme komen tot uiting als een spontane mutatie optreedt. essentieel in het gebruik van genen die aan de basis liggen van interessante eigenschappen is het isoleren van die genen. Probleem: spontane mutaties komen slechts zelden voor doel: de frequentie van nuttige mutaties verhogen door deze modelorganismen te onderwerpen aan chemische of genetische mutagenisatie systemen Reversed genetics: zoeken naar de functie v/e gen vertrekkende v/e niet-gekarakteriseerde mutant met een interessant fenotype Wanneer is een organisme een modelorganisme: eenvoudig op te groeien en in stand te houden met een korte levenscyclus als ze geschikt zijn voor moleculaire analyse → inductie van mutatie is mogelijk, eenvoudig ze zijn transformeerbaar in de planten genetica heeft het onkruidplantje Arabidopsis thaliana (zandraket) alle andere modelplanten verdrongen. Hoe is dit te verklaren? Het zit genetisch makkelijk in elkaar In 1 set v. 5 Chromosomen zitten 125 Mb→ deze bevatten alle instructies om een bloeiende plant te maken Levenscyclus van 5 – 6 weken: van 1 zaadje naar 10.000 andere zaadjes Zelfbestuiving → homozygoot kan in stand gehouden worden Kleine afmetingen en vereist dus bijgevolg weinig plaats Gemakkelijk mutanten induceerbaar en in stand gehouden worden Kan gemakkelijk getransformeerd worden In de dieren genetica is de vrijlevende nematode Caenorhabditis elegans een vergelijkbaar modelorganisme en wordt vooral in de genetica aangewend om wille vd volgende eigenschappen Zeer klein wormpje → behandelbaar als een mo Meestal hermafrodieten XX → zelfbevruchting → homozygoot Soms ontstaan er XO mannetjes die de eitjes vd hermafrodieten kunnen bevruchten Diploïd met 5 autosomale chromosomen en 1 paar seks-chromosomen Alle cellen zijn transparant en zichtbaar met microscoop Bij 20° is de levenscyclus slechts 3 dagen, bij gemiddelde temperaturen 2-3 weken In deze tijd legt de hermafrodiet ongeveer 300 eitjes Klassieke of chemische mutagenisatie en isolatie vh gen Ioniserend en niet-ioniserende bestraling → Radioactieve straling en UV straling Ioniserende straling: X stralen … mechanisme Veroorzaakt direct schade aan het DNA in de celkern zoals ss en ds breuken die leiden tot reorganisatie deleties en zelfs chromosoomverlies of wijzigingen in de basen waardoor mutaties ontstaan Door de hoge energie vd stralen ontstaan veel reactie vrije radicalen in het cytoplasma vd cel die kunnen interageren met DNA, eiwitten en lipiden in het celmembraan Niet ioniserende straling: UV straling … mechanisme De energie wordt geabsorbeerd door DNA basen en aromatische AZ waardoor er toch sterke biologische effecten optreden Veroorzaakt voornamelijk de vorming van thymine dimeren waardoor er een blokkering van replicatie of transcriptie optreedt die mutaties of reorganisaties vh chromosoom tot gevolg hebben Behandeling met chemicaliën die wijzigingen in het DNA veroorzaken → bv EMS De plaats vd mutatie is niet eenvoudig te bepalen EMS = ethylmethanosulfonaat = veel gebruikt chemisch mutagen dat een zeer hoge frequentie van puntmutaties kan opleveren Veroorzaakt methylatie van guanine residuen in het DNA Veroorzaakt GC/AT transities Het modelorganisme wordt aan zo’n mutagen blootgesteld en na zelfbevruchting worden nakomelingen gewonnen Pas in deze generatie kunnen recessieve mutaties tot uiting komen en geselecteerd worden Is er een interessante mutant? Dan moeten we deze trachten te isoleren Positional cloning: Wat? manier om gegevens over het op voorgaande manier gemuteerd gen te bekomen Hoe? Het gen wordt geisoleerd obv zijn chromosomale positie Werking? Men voert een testkruising uit met een niet verwante lijn en in de F2 vergelijkt men het overervingspatroon vd mutatie met dat van gekende genen Als de 2 loci bijna steeds samen overerven dan liggen ze dicht bij elkaar Zo maakt men een ruwe plaatsbepaling vh gen en bakent men een gebied af van gemiddeld 10 Mb, waarin 10tallen of 100en genen kunnen inliggen Stijn Vandelanotte -3- Biotechnologie: theorie Genetische mutagenisatie: mutaties met een vlaggetje (tag) Getagde mutaties zijn gemakkelijker op te sporen en worden veroorzaakt door mobiele genetische elementen en gekenmerkt worden door een tag. Tag? Stuk DNA dat zich nestelt op een willekeurige plaats in het genoom en dat zo een gen kan inactiveren Gebruikte tags? Vooral transposons (springende genen) en bij planten het T-DNA van A. Tumefaciens Transposons = springende genen, Voorkomen: in bacteriën, planten en dieren Functie: dragen bij tot de genetische variabiliteit van een organisme Mechanisme → een eenvoudige Tn bestaat uit ♦ 2 omgekeerde herhaalde sequenties (inverted repeat, IRs) ♦ Een gen dat codeert voor het transposase ♦ Het transposage herkent de IRs maakt een ds knip en doet het Tn integreren op een andere plaats in het genoom (cut and paste) T-DNA Mechanisme ♦ De bacterie herkend verwonde plantencellen ♦ In respons daarop wordt een ss T-streng aangemaakt ♦ Deze wordt getransfereerd naar de plantencel ♦ De T-streng wordt geïntegreerd in het genoom Vooral bij planten T – DNA transfer is onder laboconditites ook aangetoond voor schimmels en zelfs dierlijke cellen Werking? De mutant kan worden opgespoord door DNA-gelelektroforese en hybridisatie met de radioactief gemerkte tag-sequentie als probe Het stukje DNA waarop de probe bindt wordt uit de gel gesneden en met een “sequencer” wordt de base volgorde ervan achterhaald Deze gegevens kan men mbv bioinformatica het gedigitaliseerde genoom vd modelplant afscannen om de volledige sequentie vh gen op te sporen Opsporen van promotors: promotor trapping Wat? een meer gesofisticeerde manier van ‘tagging’ ⇒ promotor trapping Werking? Een promotorloos reportergen wordt via een transposon of T-DNA binnengebracht in een plant of dier Voorbeelden van reportergen: GUS of GFP gen Als deze reporter nu achter een actieve promotor komt, zal de promotor intact blijven maar zal het gen inactief worden → het reporter gen komt tot uiting in een bepaald orgaan Voorbeeld: promotor, die normaal in de bladsteel de transcript v/e gen voor een bepaald enzym start, zal nu het reportergen tot uiting brengen in de bladsteel OPM: het reportergen kan hier ook als ‘tag’ gebruikt worden om de promotor sequentie op te sporen Homologe of allelische mutaties Hoe kan men controleren of 2 gelijkaardige mutaties homoloog zijn? Stel 2 dwergmutanten → is deze mutatie vh zelfde gen? Oplossing: kruising van de 2 mutanten → F1 opnieuw dwerggroei → mutaties van hetzelfde gen → F1 normaal → mutaties van verschillende genen Het intacte alles vd ene ouder compenseert het defecte allel vh andere Small interfering RNA (siRNA) en RNA interferentie (RNAi) Vooraf: RNA wordt nooit vertaald tot eiwit, wel interageert het met RNA, DNA en eiwitten RNAi is een Post transcriptionele gene silencing? Bedoelt om cellen te beschermen tegen viraal RNA dsRNA is een teken van infectie en activeert een anti-virale respons RNAi is een mechanisme van gene silencing dat geïnduceerd wordt door dsRNA RNAi is sequentie-specifiek en leidt tot de degradatie van zowel ssRNA en dsRNA (meestal mRNA) RNAi is een zeer krachtig mechanisme: minder dan 50 moleculen siRNA kunnen een doelwit RNA uitschakelen dat in duizenden copijen per cel aanwezig is in planten en C. elegans kan het RNAi effect zich ook verspreiden doorheen het organisme Stijn Vandelanotte -4- Biotechnologie: theorie Werking een lange molecule wordt door het ribonuclease Dicer verknipt tot stukjes van 21-23bp (short interfering RNA) de siRNAs worden gebonden door proteïnen die samen het RNA-induced silencing complex (RISC) vormen in het geactiveerde RISC worden de strengen van het siRNA ontwonden zodat baseparing met het target RNA kan optreden in het geactiveerde RISC worden de strengen van het siRNA ontwonden zodat baseparing met het target RNA kan optreden het RNA-afhankelijk RNA polymerase gebruikt het afgebroken mRNA als template om dsRNA te maken dit dsRNA wordt opnieuw door Dicer verknipt tot siRNA, wat leidt tot een versterking van het RNAi effect dit kunnen we nu ook gebruiken om op een gerichte manier specifieke genen uit te schakelen → forward genetics forward genetics: vertrekken van een gen en een gerichte mutatie maken Genisolatie mbv informatica Wat? wetenschappelijke discipline die op de grens ligt tussen informatica en biologie Werking? Bioinformatici gebruiken de informatie die bekomen wordt uit “echte” experimenten uitgevoerd door (moleculair) biologen, biochemici, pathologen… om in silico of “droge” experimenten te doen Gebruik? In hedendaags onderzoek van zo goed als elke discipline komt bioinformatica van pas Belang? De bioinformatica is heel belangrijk geworden om te kunnen omgaan met de enorme hoeveelheid informatie die afkomstig is van genoomwijde studies (genomische sequenties, microarray- en andere expressiedata, ESTs, metabolische informatie, interactomen,…), om die te stockeren in databanken, om die ten volle te benutten, en om die te gebruiken om hypothesen voorop te stellen Hoe kan bioinformatica helpen bij genisolatie? Functionele genen liggen in een zee van junk-DNA, maar kunnen gelokaliseerd worden door de aanwezigheid van korte typische basenvolgorden. Door de sequentie van nieuwe genen te vergelijken met gekende genen kunnen ze in families in gedeeld worden en kan men een idee krijgen van hun functie. Stel bij een muis vindt men een gen voor een aandoening dan is er ook veel kans opdat het bij de mens ook voorkomt, afgezien het feit er veel variatie ontstaan is kan de pc gemakkelijk analoge delen eruit halen. De pc doorloopt de sequentie vh menselijk genoom en vindt heel snel vergelijkbare sequenties bij de mens. Deze informatica is een goed aanknopingspunt voor het ontwikkelen van geneesmiddelen Stijn Vandelanotte -5- Biotechnologie: theorie Hoofdstuk 3: Kloneren van genen Definities De basisstappen in een kloneringsexperiment zijn de volgende het te kloneren DNA wordt binnengebracht in een vector; dit resulteert in een recombinante DNA molecule de vector wordt binnengebracht in een gastheer, meestal E. coli in E. coli vermeerdert de vector waardoor talrijke copijen van het gekloneerde DNA ontstaan bij celdeling van de gastheercel krijgt elke dochtercel een aantal copijen van de vector na één nacht incuberen ontstaat een kolonie van identieke cellen die elk talrijke copijen van het recombinante DNA bevatten het gen is gekloneerd: het is vanuit zijn complexe genomische achtergrond geïsoleerd en kan eenvoudig vermeerderd worden in een technisch toegankelijk systeem Voorwaarden om kloneren mogelijk te maken Aanmaken van vectoren Transformatiesystemen ontwikkelen Technieken op punt te stellen om DNA te isoleren, visualiseren en te manipuleren Kloneren eenvoudig? Ja, maar! Er moeten talrijke stappen gerealiseerd kunnen worden om dit mogelijk te maken: het vector DNA moet gezuiverd en geopend kunnen worden het te kloneren DNA moet geïsoleerd kunnen worden het te kloneren DNA moet in de vector kunnen geïnsereerd worden het verloop van dit knippen en plakken moet kunnen gevolgd worden het resulterende recombinante DNA moet kunnen binnengebracht worden in een gastheercel E. Coli? Gram-negatieve bacterie die deel uitmaakt van de normale dikke darm flora en ons voorziet van vitamine K reeds sinds zeer lang gebruikt als modelsysteem relatief gemakkelijk te manipuleren Voordelen: gemakkelijk te groeien, zeer korte verdubbelingstijd (20 minuten onder optimale condities) Enzymen om DNA te manipuleren Een biotechnoloog heeft heel wat enzymen ter beschikking om DNA te manipuleren. Ze worden in 5 klassen onder verdeeld Nucleasen verknippen, verkorten of degraderen DNA; zoals exo- en endonucleasen en restrictie-enzymen Ligasen voegen DNA-strengen samen Polymerasen kopiëren DNA Modificerende enzymen verwijderen of voegen chemische groepen toe; zoals kinasen, fosfatasen en methyltransferasen Topo-isomerasen verwijderen draailussen in het DNA Restricitie-enzymen Wat? bacteriële endonuleasen die een bepaalde sequentie in het DNA herkennen en slechts DNA verknippen waarin deze sequent voorkomt Functie? ‘vreemd’ binnenkomend DNA af breken Types Type I: knippen op een onbepaalde willekeurige plaats buiten de herkende sequentie Type II: knippen binnen de sequentie die herkend worden in de moleculaire biologie worden enkel deze gebruikt Type III: knippen op een welbepaalde plaats op een korte afstand buiten de herkende sequentie Er moet gezorgd worden dat een organisme dat een specifiek restrictie-enzym aanmaakt natuurlijk zijn eigen DNA ter hoogt van die sequentie tegen afbraak beschermen Hoe? Door bij nieuw gesynthetiseerde dubbelstrengen één vd strengen te methyleren Methylasen → herkennen sequentie → methyleren op die plaats een andere streng → beschermd tegen activiteit vh restrictie-enzym In het DNA van alle zoogdieren, hogere planten en talrijke prokaryoten zijn bepaalde gebieden gemethyleerd wat problemen kan opleveren bij het gebruikt van restrictie-enzymen Benaming Letterwoord afgeleid vd geslacht- en voornaam en de stam vd bacterie waaruit ze zijn geisoleerd Bv: BamHI = bacillus amyloliquefaciens H Stijn Vandelanotte -6- Biotechnologie: theorie Werking Herkenningsequentie is vaak een palindroom. Bij het knippen kunnen even eindjes gevormd worden (blunt end) De herkende palindromen worden dan precies doormidden geknipt, als er oneven of overhangende uiteindjes gevormd spreekt men van sticky ends Optimale werking bij een bepaalde temperatuur een bepaalde ionensterkte zuurtegraad in aanwezigheid van specifieke co-factoren (divalente ionen en stabiliserende moleculen) Andere de specifieke activiteit: 1 U = de hoeveelheid enzyme nodig om 1 µg DNA af te breken in 1 uur een enzym kan meestal geïnactiveerd worden door een korte incubatie (10-tal minuten) bij 70°C Ligasen Normaal celmetabolisme → functie: tijdens DNA replicatie Recombinante DNA methoden → functie: 2 DNA fragmenten covalent met elkaar te verbinden door de vorming van 5’-3’ fosfodiester binding tussen het 5‘-fosfaat uiteinde van de ene DNA streng met het 3‘-OH uiteinde van de andere ATP wordt gebruikt als co-factor Voorbeeld ligase → T4 DNA ligase wordt het meest gebruikt voor kloneringen en is afkomstig van bacteriofaag T4 Polymerasen Types Klenow Fragment van DNA polymerase Heeft een 5’ → 3’ polymerase activiteit en een 3’ → 5’ exonuclease activiteit en beide kunnen gebruikt worden om overhangende eindjes om te zetten in blunt eindjes Taq DNA polymerase Gebruikt voor de exponentiele vermeerdering v/e DNA fragment in PCR Reactie Reverse transcriptase Probleem? Soms is het wenselijk om DNA sequenties te vermeerderen die in een bepaald weefsel tot expressie komen. ⇒mRNA’s van dat weefsel zijn de aangewezen startmodules Oplossing? Het mRNA moet worden omgezet in het complementaire DNA (cDNA) mbv reverse transcriptase Oorsprong: dit enzym is een RNA-afhankelijk DNA polymerase en is afkomstig van retrovirussen Werking? Topo-isomerasen DNA topo-isomerase I speelt een rol bij DNA replicatie en transcriptie: door een ss knip te maken kunnen supercoils ontwinden → daarna worden de 2 uiteinden terug aan elkaar geligeerd Scheiding en visualisatie van DNA-fragmenten De fragmenten worden gescheiden door gelelektroforese. Principe: Het DNA draagt een negatieve lading →beweegt hierdoor in een elektrisch veld naar de positieve pool Waar: De elektroforese wordt uitgevoerd in een gel. Dit kan een poly-acrylamidegel of een agarose-gel zijn, dat gevormd is uit een netwerk van polymeren. De kleine DNA-fragmenten bewegen er snel doorheen, de grote traag ⇒ DNA volgens grootte gescheiden. De fragmenten worden zichtbaar gemaakt door Toevoegen vh DNA-mengsel ethidiumbromide of sybergeen en achteraf met UV belichten Voordeel = zeer scherpe bandjes ↔ nadeel = zeer toxisch geheel Toevoegen van kleurstoffen zoals methylblauw Voordeel = minder toxisch en geen UV belichting nodig achteraf ↔minder scherpe bandjes OPM: Als referentie wordt in een aparte baan een DNA-ladder meegelopen. Dit is een mengsel van DNA-fragmenten met een exact gekende lengte. Dankzij deze moleculaire meetlat kan de grootte van elk experimenteel DNA-fragment geschat worden. Stijn Vandelanotte -7- Biotechnologie: theorie Recombinantie van genen Traditionele klonering via knippen en plakken De belangrijkste kloneringsvectoren zijn omgebouwde plasmiden Bv plasmide pBR322 uit E. Coli Het draagt genen voor antibioticum resistenties (bv ampicilline en tetracylineresistentie) → Enkel bacteriën die deze vector dragen zijn in staat te groeien op een medium die AB bevat Het heeft herkenningsplaatsen voor een reeks restrictie-enzymen Het heeft een specifiek replicatiepunt voor E. Coli, waarin het plasmide na transformatie autonoom kan repliceren. ⇒ vector wordt een replicatievector Werking Vector (bv pBR322) kan geknipt worden (bv met EcoRI) Een vreemd gen dat op dezelfde manier verknipt is kan dankzij sticky ends in het opgeknipte plasmide ingepast worden Een ligase katalyseert de binding wat resulteert in een gerecombineerd plasmide pBR322 is nu de vector vh vreemde gen OPM: door het inbouwen van multikloneringsplaatsen, oligonucleotiden met knipplaatsen voor meerdere restrictie-enzymen worden de toepassingsmogelijkheden vergroot multikloneringsplaatsen zijn echter wel slechts zinvol als hun restrictieplaatsen niet elders op het plasmide voorkomen en als ze ingebouwd worden in niet vitale gebieden vh plasmide TOPO-Kloneringen Probleem? Alhoewel ligasen bij het plakken van restricitieenzymen zeker hun nut bewezen hebben was er door het gebruik vd PCR reactie om te kloneren aan een meer efficiente ligeringsmethode → oplossing: TOPO vectoren TOPO-vectoren topo-isomerase I van vaccinia virus herkent de sequentie CCCTTAAGGG → topo-isomeraseknipt het tussen de 2 T-residues wat een overhangend eindje van één T-residue oplevert → het Taq polymerase dat gebruikt wordt bij PCR reacties hangt een extra A-residue aan het fragment → samenvoegen van de TOPO-vector en het PCR product ⇒ A en T vormen met elkaar baseparen en het topo-isomerase ligeert beide DNA fragmenten aan elkaar Deze reactie is zeer efficiënt Gateway technologie → meest moderne vorm van klonering Wat? technologie gebaseerd op toxine/antitoxine genen voor de stabiliteit van plasmiden met een laag kopij aantal (ccd B gen) mechanisme van plaatsspecifieke recombinatie van faag λ in en uit het genoom van E. coli Voordelen Overbrenging van DNA fragmenten vd ene vector naar de andere wordt sterk vereenvoudig, flexibel en efficiënt Verschillen met voorgaande methodes Werking van restrictieenzymen en ligase wordt vervangen door plaatsspecifieke recombinantie thvd attL, attR en attP recombinantiesites die gebruikt worden door bacteriofaag λ voor de uitwisseling vd DNA-fragmenten Werking → er zijn 2 verschillende reacties in dit kloneringssysteem (BP en de LR-reactie) BP – reactie spontane uitwisseling vd DNA sequentie tussen de attB1 en de attB2 sites op ene DNA molecule (bevat het te kloneren fragment, dit kan een vector of een PCR fragment zijn) en de sequentie tussen de attP1 en de attP2 sites op de Gateway donor vector (bevat het ccdB gen) door recombinantie thv deze sites ontstaat enerzijds een entry clone waarin het te kloneren fragment geflankeerd is door attL1 en attL2 sites anderzijds een bijproduct waarin het ccdB gen geflankeerd is door attR1 en attR2 sites OPM: essentieel is wel het toedienen van een BP Clonage mix van recombinante proteinen Stijn Vandelanotte -8- Biotechnologie: theorie LR – reactie (= zelfde principe) Nu zullen de attL1- en de attL2-sites vd entry clone en de attR1 en de attR2 sites vd Gateway destination clone vector met elkaar recombineren waardoor een expression clone gevormd wordt met het gewenste gen tussen attB sites en een bijproduct met attP sites OPM: essentieel is hier het toedienen van LR Clonage mix Zowel de donor vector uit de BP-reactie als de destination vector uit de LR-reactie dragen tussen hun recombinante sites het ccdB gen, dat lethaal is voor de meeste E.Coli stammen omdat het DNA gyrase inhibeert De bijproducten vd beide reacties en de niet-gerecombineerde donor en destination vectoren die aanwezig zijn in de reactiemix zullen dus niet vermeerderd worden doordat de E. coli bacteriën waarin ze getransformeerd worden zullen afsterven Wegselecteren van niet-gerecombineerde expressien en entry clone gebeurt dmv AB in het medium waarop de transformatiemengsels worden uitgeplaat: E. Coli cellen met niet-gerecombineerde expression clone uit de BP-reactie kunnen niet groeien op kanamycine en niet-gerecombineerde entry clone uit de LR-reactie kunnen niet groeien op ampiciline Gevolg is dat een heel groot percentage vd kolonies die zich na trransformatie ontwikkelen, het gewenste plasmide bezitten. Bovendien zal de orientatie vh gekloneerd gen steeds zoals gewenst zijn door de specifieke recombinatie tussen de att sites Transformatie, selectie en screening Transformatie? De opname door een levende cel van exogeen DNA en het stabiel overerven van dit DNA Onder geschikte voorwaarden wordt 1 enkele DNA-molecule in de gastheercel gevestigd en daar vermeerderd Bacteriën die exogeen DNA kunnen opnemen en vestigen worden competent genoemd E. coli vereist een speciale behandeling om competent te worden voor hitteschok transformatie Werking behandeling Inductie van competentie Voorgroeien tot een densiteit 2.108 /ml en koelen tot 0°C Cellen wassen met 0,1 M MgCl2 en daarna heropnemen in 0,1 M CaCl2 10min op ijs bewaren en concentreren via centrifugatie vanaf nu zijn ze competent voor transformatie ♦ → direct aanwenden of stockeren (in aanwezigheid van 30% glycerol bij -70°C) Eigenlijke transformatie Samenvoegen competente cellen met het te transforrmeren DNA en 10min op ijs houden Hitteschok van 50sec bij 42°C → belangrijk voor penetratie vh DNA in de cel Bacteriën terug 2 minuten op ijs houden Cellen 10-voudig verdunnen met groeimedium en 10min incuberen bij de geschikte groeitemperatuur Selectie De cellen uitplaten op selectieve media en overnacht geincubeerd bij 37°C Bij deze voorwaarden kunnen enkel de cellen groeien die het transformerend DNA hebben opgenomen en aanleiding geven tot stabiele overerving vd selectiekenmerken die erop vervat liggen Meer recente techniek om E. coli te transformeren is elektroporatie Principe: competente cellen mengen met het te transformeren DNA en oiv/e hoogelektrische puls wordt het DNA in de bacteriën gebracht Detectietechnieken en selectietechnieken om de gewenste recombinanten op te sporen. doel de bacteriën die een plasmide hebben opgenomen moeten kunnen worden onderscheiden vd oorspronkelijke De bacteriën met een recombinant plasmide moeten kunnen worden onderscheiden van deze die enkel de vector hebben opgenomen. Hoe Detectie Veel gebruikt zijn vectoren die een multikloneringsplaats (MCS) hebben in het LacZ gen. Lac Z codeert voor het enzym β-galactosidase en staat onder controle vd lac promotor De aanwezigheid van het intacte gen resulteert in blauwe kolonies op het medium met de inducer IPTG en het substraat X-gal Bij recombinante klonen heeft de insertie vh vreemde DNA-fragmen plaatsgevonden in de MCS ♦ Deze bevindt zich tussen de lac Z gen en de lac promotor ⇒ het gen wordt inactief ⇒ X-gal kan niet meer in blauwe kleurstof worden omgezet ⇒witte kolonies Selectie Door het creeren van voorwaarden waarbij uitsluitend cellen die een recombinante vector bezitten kunnen vermenigvuldigen. Veel gebruikt zijn antibioticumresistenties (bv ampicilineresistentie) Stijn Vandelanotte -9- Biotechnologie: theorie Hoofdstuk 4: Transformatie van planten Dit betekent hier de overdracht v/e specifiek en meestal goed gedefinieerde DNA streng naar een plantencel Het succes vd verschillende technieken is sterk afhankelijk van: Plantensoort, Leeftijd vh weefsel, het explanaat Methoden voor directe gentransfer polyethyleenglycol (PEG)-gemedieerde transformatie biolistics electroporatie T-DNA transformatie via weefselkweek in planta transformatie van zaden, bloemen Andere methodes directe opname via de pollenbuis ‘whiskers’ plantenvirussen Strategieën voor direct gentransfer omhelst de inbreng van grote hoeveelheden naakt DNA in plantencellen die tijdelijk permeabel zijn gemaakt veel gebruikt voor de transformatie van graangewassen, maar ook toepasbaar in vele andere planten in de meeste gevallen moet een in vitro regeneratiesyteem beschikbaar zijn om uit het getransformeerde plantenmateriaal volledige planten te bekomen Vectoren voor directe gentransfer Aangezien grote hoeveelheden DNA nodig zijn om een directe gentransfer nodig te maken gebruikt men vaak vectoren zoals pUC of pBluescript die in grote aantallen gekopieerd kunnen worden door E.coli Deze vectoren moeten volgende sequenties bevatten Voor E. Coli Restrictieplaatsen voor de insertie van het te transfereren DNA Een functioneel replicatiestartpunt voor E. coli Een antibioticaresistentie voor de selectie van gerecombineerde bacteriën Eventueel een detectiesysteem dat werkt in E. Coli Voor de plant Het te transfereren gen onder controle van plant-regulatorische sequenties Een merkergen dat de selectie mogelijk maakt van getransformeerde plantencellen Een eventueel detectiesysteem dat werkt in de plantencellen (reporter) PEG-gemedieerde transformatie van protoplasten Protoplasten Wat? plantencellen zonder de cellulose celwand, maar met een intacte celmembraan OPM : Voor sommige planten, zoals tabak, rijst en mais, kunnen de protoplasten in vitro regenereren tot nieuwe planten Polyethyleenglycol (PEG) Werking PEG = Is een niet toxische molecule die plaatselijk het plasmamembraan kan destabiliseren, Hierdoor kan het DNA in aanwezigheid van divalente kationen bv Ca2+ binnenglippen in de cel Het DNA migreert vervolgens naar de kern → DNA integreert in de chromosomen Wanneer de geïntegreerde genconstruct tot expressie komt, kan de recombinante protoplast geselecteerd worden door zijn nieuw verworven antibioticum- of herbicidenresistentie De protoplasten laten een nieuwe celwand aangroeien en kunnen geregenereerd worden tot een nieuw plant Voordelen vd PEG-gemedieerde transformatiemethode Het is eenvoudige, efficiënte en goedkope methode De methode is toegankelijk voor talrijke plantensoorten en weefsels aangezien het mogelijk is om grote hoeveelheden protoplasten te bereiden De getransformeerde cellen overleven en delen goed Nadelen vd PEG-gemedieerde transformatieperiode Protoplasten zijn vrij fragiel (→ geen celwand) en dus is er enige vaardigheid vereist om ermee te werken Gebruikte DNA is naakt⇒ het tijdens de procedure kan het afgebroken worden of reorganisaties ondergaan De regeneratie van vruchtbare planten vanuit protoplasten is moeilijk voor sommige plantensoorten Een alternatieve methode voor de transformatie van protoplasten maakt gebruik van liposomen Wat? kunstmatige blaasjes die ontstaan door spontane schikking van fosfolipiden Werking? Het te transfereren DNA wordt ingekapseld in deze fosfolipiden → fusie mogelijk met plasmamembraan in aanwezigheid van PEG → liposomen komen in cytoplasma vd protoplasten → lossen daar hun inhoud. Stijn Vandelanotte -10- Biotechnologie: theorie Transformatie door elektroporatie Deze techniek is gebaseerd op het principe dat de ontlading van een korte, hoog-voltage elektrische micropuls (5µs) tijdelijk poriën induceert in de celmembraan De fosfolipiden in het plasmamembraan hebben een sterk dipool karakter. Door middel van elektrische puls van een hoge veldsterkte worden ze allemaal gelijk gericht. Het plasmamembraan wordt permeabel waardoor het op de buitenkant van deze membraan geprecipiteerde DNA naar binnen glipt.na de puls herstellen de fosfolipiden hun oorspronkelijke configuratie. Voordeel Elektroporatie werd aanvankelijk enkel gebruikt voor de transformatie van protoplasten maar kan nu ook toegepast worden op intacte plantencellen van weefselstukjes waardoor regeneratie van transgene planten eenvoudiger is Nadeel elektroporatie Er zijn voor en nabehandelingen van het weefsel nodig Biolistics Principe: de celwand mechanisch te doorboren en het DNA doorheen de ontstane opening af te leveren aan de plantencel. Types technieken Dit zou in principe kunnen d.m.v. micro-injectie(zoals bij dierlijke systemen), maar deze methode staat bij planten nog in haar kinderschoenen. Een techniek waarmee nu reeds grote successen worden geboekt heet “particle gun bombardment”. Werking: Het te transfereren genconstruct wordt elektrostatisch gefixeerd op wolfraam of goudbolletjes. Deze bolletjes worden aangebracht op een nylonplaat die afgeschoten wordt en plots tot stilstand komt tegen een stopplaat met een opening. De microprojectielen worden met grote snelheid in de doelcellen of het doelweefsel geschoten. Dankzij hun soortelijk gewicht bezitten de bolletjes een hoge kinetische energie en zijn ze in staat de celwand te doorboren. Het DNA wordt massaal ingeschoten en kan zich in bepaalde gevallen integreren in het nucleair genoom of dat van de chloroplasten of mitochondriën. Nadeel Het DNA wordt dus niet zo netjes afgeleverd zoals A.tumefaciens dat doet. De efficiëntie van DNA integratie is eerder laag ⇒ stabiele transformatie wordt niet zo vaak bekomen Omdat een meristeem (alleruiterste groeipuntje) uit drie lagen van onafhankelijke cellijnen bestaat, is de kans op het bekomen van chimeren heel reëel. In dit geval is slechts een deel van de plant afkomstig van getransformeerde cellen. Voordeel: Vooral voor moeilijke (monocotyle) gewassen kan de techniek grote voordelen opleveren. Men kan immers ook meristemen beschieten, die gemakkelijker tot nieuwe planten uitgroeien dan bladweefsel of callus. door de hoge inbreng van DNA in talrijke cellen kan men gemakkelijke transiente genexpressie bestuderen Gentransfer met vectoren afgeleid naar Agrobacterium Crown gall en hairy root disease Agrobacterium tumefaciens is een in de grond voorkomende bacterie die de kroongal ziekte veroorzaakt Kroongal ziekte? Tumoren verschijnen op de wortelhals en op andere organen Gastheerplanten? Zeer breed gastheerspectrum (suikerbiet, roos, peer, appel) Ze bezitten naast een chromosomale DNA een groot plasmide het zg TI-plasmide (tumor inducing) Opines? nieuw soort molecule door tumoren Afgescheiden in hun intercellulaire ruimten Types: octopine, nopaline, agropine Type geproduceerd is afhankelijk van de bacteriele stam die de tumor induceerd Agrobacterium rhizogenes die de hairy root disease veroorzaakt Hairy root disease? Ter hoogt v/e verwonding de wortelcellen ertoe aanzetten te dedifferentieren en kluwens van wortels te vormen Ze bezitten naast een chromosomale DNA een plasmide het zgn RI-plasmide (root inducing) Opines? Types: agropine, mannopine, cucumopine De Ti en Ri-plasmiden hebben een replicatiestartpunt voor Agrobacterium een virulentiegebied (vir) → de vir genen kunnen zowel in cis als in trans werken genen voor het catabolisme van opines genen die instaan voor plasmide transfer tussen bacteriele cellen via conjugatie het T-DNA Stijn Vandelanotte -11- Biotechnologie: theorie Moleculaire basis vd interactie tussen agrobacterium en de plant om planten transformatie uit te voeren, maakt A tumefaciens gebruik van 3 sets van genen verschillende chromosomale genen bepalen chemotaxie naar (chvE) en aanhechting aan de (verwonde) plantencellen (chvA-B; cel ; pscA; exoC) het T-DNA op het Ti-plasmide wordt getransfereerd naar de plantencel en zorgt voor de symptoomontwikkeling het vir gebied op het Ti-plasmide staat in voor het mechanisme van T-streng vorming en transfer Stap 1: herkenning en aanhechting van de bacteriën aan gekwetste plantendelen Plantencel wordt gekwetst → productie van fenolische verbindingen (bv acetosyringone en hydroxyacetosyringone) →deze trekken Agrobacterium chemotactisch aan → bacterie hecht zich aan cel dankzij de constitutieve expressie van een aantal van haar chromosomale genen Stap 2: inductie van het vir systeem Acetosyringone en hydroxy-acetosyringone activeren het eiwit VirA VirA is het sensor histidine kinase v/e twee-component waarvan VirG de respons regulator is Eenmaal geactiveerd zorgt VirA voor de fosforylatie vh VirG eiwit dat in de cytosol aanwezig is Eenmaal geactiveerd zorgt VirG voor de activatie van de transcriptie van andere vir genen Deze genen coderen voor de eiwitten die noodzakelijk zijn voor de vorming vd T-streng, voor het transport vd T-streng uit de bacteriele cel naar de plantencel voor de integratie van de T-streng in de nucleus vh plantengenoom Stap 3: vorming van de T-streng Het T-gebied wordt aan de linker- en rechterzijde begrensd door repetitieve sequenties: left en right border Bij de vorming vh T-gebied zijn het virD en virC operon betrokken en het virE2 eiwit VirD1 ontwart specifiek het T-DNA gebied VirD2 kan nu thvd borders en via zijn endonuclease activiteit een enkelstrengige knip maken waardoor een enkelvoudig T-DNA-streng kan gevormd worden VirC1 en VirC2 helpen hierbij Het gevormde T-DNA moet beschermd worden tegen nucleasen en moet talrijke barrieres passeren Dit kan door het te complexeren met talrijke virE2 eiwitten VirD2 blijft gebonden op de terminus van dit T-complex en zorgt voor het verdere transport Stap 4: vorming van de T-pilus Transport vh T-complex uit de bacteriele cel → = 1e hindernis Hiervoor moet de dubbele membraan vd bacterie overbrugd worden VirB operon codeert voor de vorming vd zgn T-pilus Deze pilus zit verankerd in de beide membranen ⇒ vormt een porie doorheen de membraan Stap 5: transfer vh T-complex naar de plantencel Nog niet opgehelderd Stap 6: integratie van de T-streng in het plantengenoom VirE2 en VirD2 zorgen dat het T-DNA naar de celkern kan migreren Beide eiwitten hebben nucleaire lokalisatiesignalen die door specifieke plantenproteinen worden herkend Eens in de kern gaat de T-streng in een chromosoom integreren en is de transformatie een feit Stijn Vandelanotte -12- Biotechnologie: theorie Stap 7: expressie van hormoon biosynthese genen vh T-DNA door de plantcel leiden tot ongecontroleerde celdelingen en tumorvorming T-DNA bevat genen die coderen voor de productie van 2 plantenhormonen: cytokinine en auxine Veel plantpathogene bacteriën bevatten dergelijke genen, maar wat agrobacterium zo uniek maakt is dat in het T-DNA deze genen onder controle staan van eukaryote signalen ⇒ efficiente expressie eens het T-DNA in het plantengenoom is geintegreerd T-DNA bevat ook genen die de gevoeligheid en/of tolerantie vd plantencellen voor hormonen wijzigen De expressie van deze genen zorgt ervoor dat de plantencellen te veel auxine en cytokinine gaan produceren en gaan ze de celdeling activeren Bij A. tumefaciens ⇒ tumoren die bestaan uit ongedifferencieerde cellen Op kroongallen ontstaan normaal gezien geen scheuten door de hoge concentratie aan Aux en Cyt Bij A. rhizogenes ⇒ meeste genen betrokken bij productie van Aux ⇒ ontstaan van wortels Op hairy roots kunnen wel scheuten ontstaan → deze zijn transgeen en vertonen gewijzigde bladvormen, wortelvorming of bloeitijdstip Het T-gebied van A. Tumefaciens bevat Tms1 → tryptofaan converteren in IAM Tms2 → enzym die IAM hydroliseert tot IAA Tmr 6b → een oncogeen dat tumoren induceert. Het T-gebied van A. rhizogenes bevat 2 grote delen Rechtse deel: aux1 en aux2 (homoloog aan tms1 en tms2) Linkse deel: rolA,rolD → rol onbekend, rolB → maakt auxinen, rolC → maakt cytokininen vrijdag Stap 8: expressie van opine biosynthese genen vh T-DNA door de plantencel leiden tot productie van voedingsstoffen voor de koloniserende bacteriën T-DNA bevat ook genen voor de synthese van een nieuw soort molecule dat ontstaat door het verbinden v/e ketozuur en een aminozuur Op het T-DNA van A. tumefaciens staan de 0’, 1’, 2’ genen in voor de synthese van agropine en mannopine Het gen 6a codeert voor een permease voor de excretie van deze opines uit de getransformeerde cellen Het rechterdeel van A.rhizogenes bevat de opinesynthese genen 0’, 1’ en 2’ De plantencel is als het ware genetisch gekoloniseerd Ze wordt met een aantal genen opgezadeld waardoor ze een tumor vormt waarvan de cellen opines produceren Deze opines zijn komen ten goede aan de bacterie Agrobacterium transformeert de plant dus in een voedselfabriekje DNA-transfertechnieken mbv Agrobacterium De constructie van vectoren afgeleid van Ti-plasmiden Algemeen De oncogenen op het TI-plasmide maken de regeneratie van scheuten onmogelijk De oncogenen op het RI-plasmide zorgen voor ongewenste afwijkingen Al snel werd duidelijk dat de sequenties die zich tussen de left en right border bevonden niet van belang waren voor het transformatieproces op zich (uiteraard wel voor symptoomvorming), maar dat men tussen beide borders eender welk gen kon plaatsen → bij aanwezigheid vd vir-genen werden deze dan in de plantencel ingebouwd Dit leidde tot de ontwikkeling van ontwapende vectoren waarin de oncogenen waren verwijderd Aangezien de vir-genen ook in trans functioneren werd het mogelijk om het gewenst T-DNA op een andere vector in elkaar te knutselen (dus een vreemd gen tussen left en right border) om vervolgens dit plasmide te gebruiken als transformatievector. Om uiteindelijk de vereiste combinatie van T-DNA en vir gebied te bekomen zijn er 2 strategieen Binaire strategie coïntegratie strategie 2 Binaire strategie Stijn Vandelanotte -13- 1 Coïntegratie strategie Biotechnologie: theorie Om uiteindelijk de vereiste combinatie van T-DNA en vir gebied te bekomen zijn er 2 strategieen 1) cointegratiestrategie →Hier ligt het vir-gebied op een disarmed TI-plasmide waarin het T-gebied een intermediaire vector geïntegreerd werd door homologe recombinantie 2) binaire strategie → Hier worden het T-DNA en de vir-genen fysiek gescheiden. Het T-DNA wordt op een klein plasmide van E.Coli geplaatst. Dit plasmide draagt een replicatiestartpunt dat in diverse gastheren werkzaam is, waaronder Agrobacterium en E. Coli Tussen left en right border bevindt zich een multiple restriction site voor het gemakkelijk invoegen van vreemde genen Deze binaire vector wordt via elektroporatie of door een thermische schok in A. tumefaciens stam overgebracht, die over een vir-plasmide beschikt (een ontwapend TI-plasmide met enkel de vir-genen) Voordelen: zeer soepel en efficiënt binaire vectoren dragen meestal al selectiemerkers en zelfs al promotor en terminatorsequenties Transformatie van explanaten het succes van transformatie wordt bepaald door 3 factoren waardplanten spectrum verbeterde in vitro cultuurtechnieken → elke maand meer plantensoorten transformeerbaar er bestaan ook zgn recalcitrante soorten die in vitro niet te regenereren zijn celcyclus ouderdom en fysiologische staat vd waardplant zijn belangrijk bij de transformatie-efficiëntie soms zijn jonge planten of heel juveniele organen (cotylen en hypocotylen) transformeerbaar de mate van differentiatie en de celcyclusfase spelen eveneens een rol gebruikte explanaten veel explantaten zijn reeds gebruikt in transformatieprotocols bv: protoplasten, celsuspensies, callus, weefsel, wortels de enige vereiste is dat na de transformatie , scheutregeneratie moet mogelijk zijn methode die nu vaak wordt toegepast is: “Leaf disk”-methode van Horsch bladschijfjes worden 2-3 dagen samen met een jonge bacteriecultuur geincubeerd bacteriën steriel afspoelen blaadjes op een callusinducerend medium plaatsen waarin cefotaxime en kanamycine is toegevoegd om de resterende bacteriën te elimineren en de celdeling van niet getransformeerde cellen te beletten blaadjes op een scheutinducerend medium plaatsen met dezelfde AB , maar met een hoger cyt/aux verhouding de geinduceerde scheuten overbrengen op een bewortelingsmedium met cefotaxime en kanamycine alleen de getransformeerde scheuten kunnen wortels vormen op kanamycine nadien verder uitplanten en uittesten Floral dip methode een beperkt aantal gewassen (bv Arabidopsis en Petunia) kan men transformeren door de plant met de bloemen in een agrobacterium suspensie te dompelen Agrobacterium slaagt er blijkbaar in met de kiemende pollenkiembuis mee te reizen en de eicel binnen te dringen Ook hier bevat het T-gebied , naast het gewenste gen, een selectie gen (basta-resistentie) Slechts een fractie vd gevormde zaden (~1%) is getransformeerd Door de kiemplanten te bespuiten met het herbicide Basta worden deze transformanten geselecteerd Voordeel: zeer eenvoudige methode waar geen weefselkweek komt bij kijken Nadeel: enkel van toepassing bij Arabidopsis en Petunia Andere transformatiemethodes Aangezien voor sommige planten geen goede resultaten worden bekomen met de bovengenoemde technieken, probeert men nog steeds andere methodes uit Opname van DNA via pollen Rapporten, waarin wordt beschreven hoe transformatie wordt gerealiseerd bij granen door DNA over te brengen op stijlen waar een pollenbuis zojuist doorheen gegroeid was, zijn nogal controversieel. Het DNA zou hierbij via de pollenbuis in de eicel afgeleverd worden waardoor een getransformeerd embryo kan ontstaan. Whiskers wat? dunne holle siliconen buisjes gebruikt om naakt DNA binnen te brengen in plantencellen werking? Het naakt DNA mengen met de plantencellen en de whiskers en vervolgens stevig schudden De buisjes gaan doorheen de celwand en veroorzaken porien waarlangs het DNA kan binnendringen Probleem? → Ze zijn te vergelijken met asbestvezels en dus zijn ze een groot risico op longschade Stijn Vandelanotte -14- Biotechnologie: theorie DNA virussen Het aantal DNA-virussen is heel beperkt Best onderzochte voorbeeld = bloemkool mozaiek virus (CaMV) Dit is een dsDNA-virus met een heel bijzondere DNA-structuur en heel bijzonder replicatiemechanisme Werking ? Virus of virus-DNA aanbrengen op het blad vd gastheer → genen vh virus worden ingebouwd in de plant? Het DNA wordt niet ingebouwd in het gastheergenoom! Het DNA wordt massaal vermeerderd en tot expressie komen in de studie Voor de studie van transiente genexpressie kan de overdracht via CaMV dus nuttig zijn Probleem? Het grootste probleem is dat bij het gebruik van CaMV als vector dat tot nu toe bleek dat hoeveelheid DNA die in het virus kan ingebouwd worden zeer beperkt is Oorzaak: de mutaties kunnen gemakkelijk geëlimineerd worden uit het virusgenoom daarna treedt er een sterke selectiedruk op ten gunste van het wild-type virus De selectie van getransformeerde scheuten 2 types van selectiesystemen Positieve selectiesystemen → de getransformeerde cellen krijgen via de ingebrachte genen een selectief voordeel op de niet-getransformeerde die wel blijven leven maar niet verder delen of ontwikkelen Negatieve selectiesystemen → de niet-getransformeerde cellen sterven af, terwijl de getransformeerde cellen blijven verder groeien Negatieve selectiesystemen Vaak gebruik van een AB-resistentiegen als selectie merker Voorbeeld v/e veel gebruikt gen: nptII Afkomstig van een bacterieel transposon Het gen werd overgebracht naar het T-gebied en verleend resistentie aan kanamycine aan de transformant Met een selectie druk van 50mg/L kanamycine → bijna enkel transformante scheuten die uitgroeien Er zijn echter nog altijd zgn “ontsnappers” Dit kun je oplossen door een bewortelingstest op een bewortelingsmedium met kanamycine → meer zekerheid Als bij bepaalde gewassen de toegevoegde kanamycine de regeneratie van scheuten verhindert, kan overwogen worden om een herbicidenresistentie als selectiemerker te gebruiken Nadeel: de gebruikte componenten veroorzaken dikwijls een algemene toxiciteit en kunnen de groei en leefbaarheid van alle cellen in de cultuur beïnvloeden Positieve selectiesystemen Hierbij wordt het manA gen van E.Coli gebruikt als selecteerbare merker → codeert voor fosfomannose isomerase(PMI). Stel: mannose als enige koolstofbron toedienen aan een in vitro medium → vorming en accumulatie van mannose 6-fosfaat in een normale plant, ten koste van de anorganische voorraad fosfaten in de cellen. Alleen getransformeerde cellen die manA tot expressie brengen, kunnen het mannose-6-fosfaat converteren naar fructose6-fosfaat, dat wel verder gebruikt kan worden als C-bron. Voordelen Voor een groot aantal gewassen, waaronder aabidopsis, gerst, watermeloen, tomaat, kolen, zonnebloem,…, bleek dit “positief” selectiesysteem een technisch en superieur alternatief te zijn voor “negatieve” selectiesystemen op basis van kanamycineresistentie. Ook wat de publieksacceptatie van de gemodificeerde planten betreft, scoort dit systeem beter omdat er geen kanamycineresistentie meer ingebouwd hoeft te worden. GUS als positieve selectiemerker. Hier wordt gebruik gemaakt van de eigenschap van B-glucoronidase om glucose af te splitsen van een verbinding. Inactief zeatine-9-glucoside wordt toegevoegd aan het medium. Enkel GUS-getransformeerde cellen kunnen dit glucoside terug omzetten in het actieve cytokinine zeatine. Op die manier regenereren enkel getransformeerde plantencellen. De ongetransformeerde cellen sterven niet af maar kunnen ook niet regenereren tot scheutjes. Nadeel: Kostprijs en de techniek bevindt zich nog in het experimenteel stadium. Stijn Vandelanotte -15- Biotechnologie: theorie Hoofdstuk 5: Transformatie van dieren Directe gentransfer: micro-injectie Meest voor de handliggend → gezuiverd stukje DNA gewoon in de celkern spuiten? Merkwaardig genoeg is deze strategie de beste en dus meest gebruikte manier om transgene dieren te maken Het nieuwe DNA wordt kort na de bevruchting ingespoten met een micro-injectiecapillair dat dmv een micromanipulator bediend wordt. Laboratoriummuizen zijn de meest gebruikte dieren voor transgene onderzoek Het maken van een transgene muis dmv micro-injectie vh embryo gaat als volgt 1) bereiden van het DNA dat aan het genoom moet worden toegevoegd Na het vermeerderen in een plasmide wordt het te transfereren gen uitgeknipt met restrictie-enzymen en gezuiverd. Ook Vermeerderen via PCR is ook elegant 2) om aan embryo’s te komen, worden de maagdelijke vrouwtjesmuizen met hormonen behaneleld om uiteindelijk hun voortplantingscyclus te synchroniseren en het aantal eicellen op te voeren dmv superovulatie. Na bevruchting leveren deze vrouwtjesmuizen 20-40 embryo’s/muis. Na het verzamelen van deze embryo’s worden ze zichtbaar gemaakt door vergroting Ongeveer 8 – 12u na de bevruchting worden de pronuclei zichtbaar Elk bevrucht embryo bevat 2 pronuclei, waarvan één geinjecteerd wordt met 50-500 kopieën vh gen 3) 60 – 80% vd geinjecteerd embryo’s overleeft de mechanisme beschadiging vd injectie Deze embryo’s worden in geplant in de eileiders v/e schijnzwangere draagmoeder Een vrouwtje kan schijnzwanger gemaakt worden door ze te paren met een gesteriliseerd mannetje Het vrouwtje komt dan in de hormonale cyclus v/e zwangerschap, maar draagt geen embryo’s 4) Na herinplanting ondergaan de geinjecteerde embryo’s een normale foetale ontwikkeling Meestal worden de pasgeboren muisjes nog een 3 tal weken bij hun moeder gelaten Controle op integratie van het DNA in het genoom van de muizen gebeurt vaak d.m.v. PCR op DNA geïsoleerd uit een stukje staart. Meestal bij 15-30% van de muizen wordt integratie van het DNA aangetoond. Soms worden meerdere kopieën achter elkaar aangetroffen, lukraak ingebouwd. Niet al deze ingebouwde genen komen echter tot expressie. Gentransfer door injectie met retrovirus Een alternatieve methode om nieuwe genen toe te voegen aan het genoom van jonge embryo’s is infectie met retrovirussen. Voorbeeld: Het bekendste retrovirus is AIDS. Werking Retrovirussen → Retrovirussen kunnen genetische informatie van RNA in DNA omzetten. Wanneer een retrovirus en cel infecteert, wordt het retrovirale RNA in de cel geïnjecteerd en vervolgens gekopieerd in DNA door het retrovirale enzym reverse transcriptase. Het retrovirale DNA raakt geïntegreerd in het DNA van de besmette cel en dient als mal voor de productie van nieuwe, infectieuze virusdeeltjes met retroviraal RNA. Voor gentransfer moeten de retrovirussen defectief gemaakt, zodat ze zich niet kunnen repliceren, behalve onder speciale laboratoriumomstandigheden. Nadeel: Omdat retrovirale virussen slechts een beperkt hoeveelheid RNA kunnen omkapselen, zijn ze moeilijk te gebruiken voor de overdracht van grote genen. In dat geval is micro-injectie een betere oplossing. Voordeel retrovirussen kunnen DNA integreren zonder verlies van naburige sequenties op het genoom. Micro-injectie kan daarentegen wel bepaalde genen inactiveren voor DNA-integratie. Werking gentransfer door injectie met retrovirus Blastocyst wordt geisoleerd Deze infecteren met retrovirus Deze injecteren in een andere blastocyst Daarna vormen ze een deel vh embryo Chimere muizen die hieruit ontstaan kunnen nakomelingen krijgen die helemaal transgeen zijn Stijn Vandelanotte -16- Biotechnologie: theorie Hoofdstuk 6: Moleculair-genetische karakterisatie van getransformeerde organismen Southern blotting Ontwikkeld door Southern en gepubliceerd in 1975 Werking DNA vd plant wordt geextraheerd, gezuiverd en aan een digest met een restrictie-enzym onderworpen Het mengsel van restrictiefragmenten wordt in een eerste test gescheiden op een aragose gel via elektroforese Het DNA wordt zichtbaargemaakt met ethidiumbromide Het DNA in de gel wordt vervolgens gedenatureerd → enkelstrengig maken Hoe? Door incubatie in een alkalische oplossing Maken vd opstelling waarbij het gel op een absorberend papier gelegd wordt dat in contact is met de transferbuffer Op de gel wordt eerst nylomembraan gebracht Vervolgens een stapel absorberend papier Tenslotte een gewicht Door capillaire krachten loopt de transferbuffer doorheen de gel naar het nylonmembraan om zo een afdruk te bekomen vd gel op het membraan. Hybridisatie: het membraan wordt in contact gebracht met een radioactief gemerkte probe die aan homologe sequenties bind Niet gebonden probe worden weggewassen De gebonden probe worden ovv bandjes zichtbaar gemaakt dmv een radiofilm Northern blotting Benaming naar analogie met Southern blotting Verschil Hier wordt ipv DNA een RNA-extract vh transgene organisme op een gel gescheiden en op een nylonmembraan geblot. Het radiogelabelde probe kan een DNA- of RNA- fragment zijn dat obvd sequentie vh te onderzoeken gen gesynthetiseerd is Een positief signaal wijst erop dat het gen tot expressie komt PCR Inleiding Wat? → De Polymerase Chain Reaction (PCR) of polymerase kettingreactie is een in-vitro methode waarmee een specifiek DNA fragment op exponentiële wijze vermenigvuldigd kan worden. Deze techniek, die door Mulis in 1985 werd bedacht , zorgde voor een revolutie in de moleculaire biologie. Talrijke modificaties, verbetering en nieuwe toepassingen zien nog steeds het licht. Stijn Vandelanotte -17- Biotechnologie: theorie Principe Voor een typische PCR-reactie zijn volgende componenten vereist! DNA polymerase:een thermostabiel Taq-polymerase die ervoor zorgt dat enkelstrengig DNA terug dubbelstrengig wordt. DNA template:vb.een zuiver DNA-extract van een plant. 2 Primers:gesynthetiseerde oligonucleotiden. Deze primers moeten hybridiseren aan de 5’ uiteinden van de complementaire strengen van de te vermeerderen DNA sequentie. Ze moeten met hun 3’ uiteinde naar elkaar toe liggen. DNTP’s:een oplossing van gelijke delen ATP,GTP,CTP,TTP,de bouwstenen van het DNA Mg2+ ionen Buffer Minerale olie:vormt een laagje op het reactiemengsel en voorkomt verdamping en condensatie. Dit is niet meer nodig in moderne toestellen,deze bezitten een verwarmd deksel dat condensatie op het dekseltje van het PCR-eppendorfje verhindert. Gedestilleerd water De reactie gebeurt in een PCR-toestel, in wezen een programmeerbare temperatuurblok waarin plastic eppendorf erlenmeyertjes inpassen. Het temperatuursverloop kan er als volgt uitzien. 2min bij 94°C;initiële denaturatie;de DNA strengen wijken uit elkaar. 30 cycli met het volgende programma 60sec bij 94°C;denaturatie(niet echt nodig in de eerste cyclus) 60sec bij 55°C:Primer anealing:de primers hechten zich aan een complementair sequentie. 60sec bij 72°C: primer extension:m.b.v. het Taq-polymerase worden de dNTP’s in het verlengde van de primers ingebouwd. 7min bij 72°C:final extention: afwerking van alle vermenigvuldigde enkele strengen. Bij iedere cyclus wordt , in theorie, het aanwezige DNA waarop de primers kunnen binden verdubbeld. De primers laten toe een specifiek fragment in een complex mengsel te amplificeren De specificiteit wordt bepaald door de sequentie van de primers, en de afstand tussen de twee primers bepaalt de lengte van het geamplificeerde fragment. Deze fragmenten kunnen zichtbaar worden gemaakt met na scheiding door gel-elektroforesescheiding(3.4.). Voordelen Weinig DNA nodig Het DNA mag gedeeltelijk gedegradeerd zijn(zoals in fossielen). Zeer snel en gemakkelijk (itt Southern blotting en klonen) om te bepalen of in de regeneraten of de transgene nakomelingen het genconstruct op een corret manier geintegreerd is Problemen inzake specificiteit en contaminatie Mispriming Oorzaak: bij minder hoge T kunnen primers annealen op sequentie die niet volledig homoloog zijn Gevolg: dit leidt in de eerste cycli tot efficiënt amplificeren van deze foute sequenties in de verdere PCR reactie Dit wordt als voordeel aangewend voor het introduceren van extra bp aan de uiteinden vd te amplificeren sequentie of van specifieke mutaties in vitro Een Hot Start Doel: verhogen vd specificiteit door voldoende lange primers te gebruiken met genoeg GC zodat een hoge annealing T kan gekozen worden Werking: specificiteit ↑ doordat het polymerase bij het opwarmen vh reactiemengsel nog niet kan werken wegens het ontbreken v/e essentieel ingredient. Dit wordt toegevoegd of beschikbaar bij 94°C in de 1E cyclus Nested Doel: methode om foutieve geamplificeerde fragmenten te elimineren Werking: doordat de kans dat een 3E primer specifiek voor de gewenste sequentie tegen foutief geamplificeerde fragmenten kan annealen zeer klein is, kan het gebruik van een derde neste primer leiden tot een eventueel mengsel met enkel het juist fragment nog eens geamplificeerd Contaminatie Stel: contaminatie van negatief staal met enkele moleculen v/e positief staal zullen na amplificatie een positief resultaat geven ⇒ dit moet vermeden worden ⇔ pre-PCR mengsels en post-PCR mengsels goed scheiden Voorzorgsmaatregelen →Aparte lokalen, speciale pipettips, dragen van handschoenen Vernietigen van PCR contaminaties → gebruik maken van UTP ipv dTTP in de PCR reactie Ipv de T wordt dan U ingebouwd in het DNA Een behandeling vh mengsel met het enzym UNG vernietigd alle eventuele DNA-contaminaties van vorige PCR reacties die U bevatten → daarna wordt UNG vernietigd door de hoge T Stijn Vandelanotte -18- Biotechnologie: theorie Hoofdstuk 7: Biochemische karakterisatie, evalutatie en selectie van transgene planten Probleem -Met voorgaande moleculair-genetische methoden wordt de aanwezigheid of de transcriptie vh genconstruct aangetoond -Het is echter steeds mogelijk dat het geintegreerde gen, ondanks transcriptie, geen aanleiding geeft tot het gewenst eiwit -Daarom werden een aantal biochemische methoden ontwikkeld om de effectieve expressie vh gen vast te stellen Immunologische detectie van eiwitten Via Western blotting is het mogelijk eiwitten, en in het bijzonder enzymen, aan te tonen. Wat is er nodig voor we een Western blotting kunnen uitvoeren een transgene plant primaire antilichamen tegen het nieuwe eiwit een overexpressie construct waarmee we veel recombinant eiwit kunnen aanmaken opgezuiverd eiwit of -peptide muis, rat, konijn, kip, of geit om antilichamen in op te wekken secundaire antilichamen tegen het primaire antilichaam Werking Primaire AL beschikbaar → bereiden v/e totaal eiwit vd transgene plant Dit eiwitextract scheiden op een poly-acrylamide gel in aanwezigheid van SDS Deze denatureert de EW en geeft ze een negatieve lading De proteinen worden naar een nitrocellulosemembraan getransfereerd → deze heeft sterke affiniteit voor EW overdracht gebeurt onder invloed van een elektrisch veld (snel en efficiënt) bv de “sandwich” methode door de hoge affiniteit van de membraan voor eiwitten, moeten de plaatsen waar geen eiwit is op overgebracht geblokkeerd worden → achtergrond ↓ en specificiteit ↑ de blokkering kan gebeuren met melk (caseïne) of met opgezuiverde eiwitten (BSA) Het primaire AL-eiwit complex wordt gevisualiseerd met een secundair AL dat het primair AL herkent Deze secundaire AL kunnen bv gekoppeld zijn met enzymatische of radioactieve labels Het nadeel van Western blotting De eiwitten die op het membraan gebonden zijn zijn gedenatureerd ⇒ hierdoor gaat hun driedimensionale configuratie verloren. Enkel antilichamen die specifieke aminozuursequenties herkennen zijn dus bruikbaar. Zeer arbeidsintensief Zeer dure techniek die veel voorbereiding vergt Detectie via kwantificeerbare reporters Inleiding Verschil reportergenen met merkergenen Merkergenen → gebruikt voor selectie van genactiviteit Reportergenen → gebruikt voor screening vd genactiviteit Coderen voor enzymen waarvan de activiteit via een reactieproduct makkelijk aantoonbaar en kwantificeerbaar is Reportergenen kunnen onder controle geplaatst worden van de expressiesignalen vh gen dat we willen bestuderen hierdoor kunnen we zien waar het gen onder studie tot expressie komt en hoe die expressie gereguleerd wordt er kan ook een fusie-eiwit gemaakt worden tussen het reportergen en het gen onder studie op die manier visualiseren we het eiwit en kunnen we ook het effect vh nieuwe eiwit op de plant bestuderen Voorbeelden Cat, lacZ, nptII (deze is ook gebruikt als selectiemerker) gusA en luc → deze 2 zijn de kwantificeerbare reportergenen bij uitstek Chloramfenicolacetyltransferase (=cat gen) algemeen: afkomstig van bacteriën en het oudste reportersysteem werking eiwitextracten van planten die met het cat gen getransformeerd zijn worden geincubeerd met radioactief of fluorescent chloramfenicol reactieproducten scheiden via dunne laag chromatografie opm: de aan- of afwezigheid van acetylgroepen zorgt er voor dat het product een andere migratiesnelheid heeft intensiteit van de geacetyleerde spot ~ expressieniveau vd promotor waaronder het cat gen geplaatst is Stijn Vandelanotte -19- Biotechnologie: theorie Luciferase (=luc gen) het luciferase gen is afkomstig van de vuurvlieg waar het tot expressie komt in gespecialiseerde lichtorganen Doel vh geproduceerde licht de larven produceren licht vermoedelijk om vijanden te verwittigen dat ze zeer slecht smaken de volwassen dieren produceren lichtflitsen om elkaar aan te trekken De luciferase reactie stuurt geel-groen licht (560nm) uit door de oxidatie van het substraat luciferin dit vereist de co-factoren ATP, Mg2+, O2 In tegenstelling tot het cat gen kan expressie in levende organismen gevolgd worden De ontwikkeling van gespecialiseerde camera’s laat toe om in vivo expressie te meten Voordelen Expressie van het luc gen is niet nadelig voor het metabolisme van het transgene organisme Bovendien wordt het luciferine als estervorm vlot opgenomen door cellen en is niet toxisch Aangezien het luciferase niet voorkomt in planten, is er geen achtergrond activiteit β-glucoronidase (= gus gen) Het gusA gen is afkomstig van E. coli en stelt deze bacterie in staat om complexe suikers te gebruiken als C-bron Afhankelijk van het gebruikte substraat kan men de GUS reporter gebruiken voor de localisatie van genexpressie of eiwitactiviteit → histochemische kleuring β-glucuronidase hydrolyseert X-gluc tot XH (dit is in dynamisch evenwicht met X X en XH kunnen vrij diffunderen uit de cel In aanwezigheid van moleculaire zuurstof ondergaan ze een oxidatieve dimerisatie en slaan ze neer als een blauwe kleurstof (= diXindigo) Opm: Naast X-gluc zijn ook andere substraten ontwikkeld die na de glucuronidase een ander gekleurd reactieproduct vormen Bv: magenta-glcu geeft aanleiding tot een diep roze precipitaat Bv: salmon-gluc geeft aanleiding tot een zalm-leurig precipitaat voor de kwantificatie van genexpressie → fluorimetrische bepaling β-glucuronidase hydrolyseert het substraat MUG tot 4-MU 4-MU fluoresceert sterk bij pH> 8,2 en kan op deze manier kwantitatief gemeten worden Voordelen planten hebben geen β-glucuronidase activiteit ⇒ dus is er geen achtergrond diX-indigo diffundeert niet uit de cel het substraat diffundeert wel relatief gemakkelijk in de plantencellen Nadeel Deze assay laat geen in vivo detectie toe Detectie via fluorescerende reporters Groen fluorescent proteine (GFP) In de plant fluoresceert GFP (stabiel eiwit) in afwezigheid van exogene cofactoren ⇒ dit maakt GFP een aantrekkelijk reporter gen Visualisatie vereist enkel excitatie met near UV of blauw licht en observatie met een fluorescentiemicroscoop GFP is veel gebruikt bij het ontwikkelen van transformatieprotocols bij Mo’s, planten en dieren Verbetering door puntmutaties Diverse mutante vormen vh gen werden geconstrueerd die de stabiliteit, de intensiteit en fluorescentie of de kleur vh uitgestraalde licht veranderen Door 1 AZ te wijzigen kon de intensiteit vd fluorescentie met een factor 6 opgedreven De verbetering vh opgevouwen vh eiwit ⇒ helderheid verbeterd Er bestaan ook andere kleuren ipv groen BFP (blauw), CFP (cyaan) en YFP (geel) DsRed Gen codeert voor het rood fluorescent proteine DsRed en is afkomstig van een anemoon. Nadeel Chlorofyl kleurt onder belichting met UV rood ⇒ niet bruikbaar in groene delen vd plant, wel in de wortels Het wordt vaak gebruikt als alternatieve reporter voor dierlijke systemen Stijn Vandelanotte -20- Biotechnologie: theorie Hoofdstuk 8: Andere moleculaire identificatie en karakterisatie technieken Fingerprinting Wat? fingerprinting is het gebruik van biochemische (eiwit) of moleculaire merkers (DNA) om een individu te identificeren of om de aan- of afwezigheid van een kenmerk aan te tonen Voordelen moleculaire merkers tov klassieke uitwendige eigenschappen Ze zijn genetisch ⇒ ze worden overgeërfd en zijn niet afhankelijk van omgevingsfactoren Ze zijn overvloedig ter beschikking Ze komen zewel in coderende als in niet-coderende gebieden voor Ze zijn zeer polymorf Polymorf ? een kenmerk is polymorf als het onder verschillende vormen kan voorkomen Dit is zeker het geval bij eiwitten en DNA Bv bij mensen, met uitzondering van eeneiïge tweelingen, heeft geen enkele mens hetzelfde genoom 2 types van moleculaire merkers Moleculaire merkers specifiek voor een bepaald organisme of zelfs voor een allel en kunnen dus gebruikt worden om bv een bepaald virus in een plant aan te tonen of een erfelijke ziekte te detecteren Moleculaire merkers kunnen bij verschillende individuen polymorfismen aantonen Bv in een diagnose te specificieren welke virusstam in de plant aanwezig is of welke persoon op de plaats vd misdaad aanwezig was Proteinemerkers Zymogrammen Principe: identificatie door gebruik te maken van eiwitten die een bepaalde te visualiseren enzymreactie katalyseren Werking 1) de eiwitten scheiden door gelelektroforese onder niet-denaturerende omstandigheden Niet denatureren ⇒ enzymatische activiteit blijft behouden 2) de eiwitten migreren in een zetmeel naar de negatieve / positieve pool Snelheid is afhankelijk van hun netto lading 3) de gel wordt gebufferde oplossing gebracht met een geschikt chromogeen of fluorogeen substraat 4) na de reactie treedt er een verkleuring en een precipitatie op Overal waar een bandje op de gel verschijnt , was een specifiek enzym actief Het bandenprofiel bekomen met een dergelijke test kan verschillen tussen individuen Isozymen → verschillende enzymen kunnen dezelfde reactie katalyseren Bv ACP, EST en PRX Allozymen → een mutatie in het gen v/e enzym kan een andere lading in het eiwit tot gevolg hebben zodat in een heterozygoot individu de eiwitten van deze 2 allelen verschillend migreren en twee verschillende bandjes geven Bij een zymogram assay is het niet nodig om eiwitextracties te doen, maar kan de enzymatische activiteit rechtstreeks van weefsels of kiemende zaden afgelezen worden mits een incubatie op een geschikte substraatoplossing. Voordelen Nadelen Toepassingen eenvoudig heeft niet zo’n hoge resolutie populatiestudies geen nood aan DNA alle eiwitten worden niet in alle weefsels diversiteit in extractie of sequentie gemaakt (dus toch afhankelijk van gewassen en hun informatie, primers of « omgeving ») ‘voorouders’ probes co-migratie betekent niet noodzakelijk dat het hybride analyse snel en relatief goedkoop om hetzelfde eiwit gaat Stijn Vandelanotte -21- Biotechnologie: theorie DNA-merkers Wat? DNA fingerprints = DNA patronen die zo specifiek zijn dat ze alle individuen van elkaar kunnen scheiden RFLP Wat? restricition fragment length polymorphism Werking: Een restricitie digest van DNA v/e organisme levert een groot aantal fragmenten op die door gelelektroforese gescheiden worden Via southern hybridisatie met een probe naar keuze kunnen specifieke sequenties onderscheiden worden Als de organismen die met elkaar vergeleken worden, verschillen in het gebied vd probe dan zal een verschillend bandenpatroon ontstaan RFLP zijn co-dominant ⇒ er kan slechts 1 locu per keer geanalyseerd worden Met de komstig van PCR techniek werd het mogelijk om DNA fingerprints te bekomen van kleine hoeveelheden DNA. Hiervoor zijn verschillende methoden: AFLP Wat? amplified fragment length polymorphism→meest gebruikte, betrouwbare en efficiente fingerprinttechniek Principe? De selectieve amplificatie van restrictie fragmenten mbv PCR Werking? 1) genomisch DNA afbreken met restrictie enzymen tot specifieke fragmenten 2) op de uiteinden vd restrictiefragmenten worden ‘adaptors’ geligeerd Adaptors? Goed gedefinieerde korte DNA strengetjes met dezelfde uiteinden als de restrictiefragmenten 3) gevolg hiervan is dat het mogelijk is om de restrictiefragmenten te amplificeren met primers die homoloog zijn met de adaptoruiteinden 4) slechts een subfractie vh complex mengsel van restrictiefragmenten wordt geamplificeerd doordat men primers gebruikt die naast de adaptorsequentie ook enkele selectieve nucleotiden bevatten aan het 3’ uiteinde Enkel de restrictie fragmenten die aan hun uitende precies de selectieve nucleotiden vd AFLP-primers bevatten, worden geamplificeerd ⇒ gevolg is dat voor elke selectieve nucleotide die aan het uiteinde v/e AFLP-primer wordt toegevoegd een selectie gebeurt op één op vier fragmenen ♦ Door één, tweee of drie selectieve nucleotiden te gebriuken kan hiermee respectievelijk geselecteerd worden met een factor 4, 16 of 64 Optimale amplificatie wordt verkregen door 2 verschillende restrictie enzymen te gebruiken ♦ dus ook twee verschillende adaptorsequenties en 2 verschillende primers 5) na elektroforese vh PCR product wordt een bandenpatroon zichtbaar Polymorfismen komen tot uiting als tussen individuen een verschillend bandenpatroon te zien is AFLP zijn dominant ⇒ er kunnen verschillende loci per keer geanalyseerd worden Voordelen, nadelen en toepassingen Voordelen Nadelen Toepassingen redelijk polymorf arbeidsintensief studies naar genetische zeer abundant duur identiteit (bvb. ouderschap) willekeurige distributie van AFLP veel materiaal identificatie van clones en merkers nodig cultivars redelijk reproduceerbaar fylogenetische studies generatie van zeer veel informatieve fragmenten Stijn Vandelanotte -22- Biotechnologie: theorie Anker – PCR Wat? afgeleid van AFLP en is een techniek die gebruikt wordt wanneer een deel v/e sequentie gekend is en we de informatie meoten bekomen vd naburige DNA regio’s Werking → bij een T-DNA insertiemutant De eerst primer (het anker) wordt gekozen obv vd sequenties binnen het getransformeerde T-gebied De andere primer moet homoloog zijn aan een sequentie buiten het vreemde gen Men weet nu niet waar het gen ingevoegd is → probleem → oplossing Oplossing: gebasseerd op AFLP 1) DNA afbreken met een restrictie enzym tot specifieke fragmenten ♦ Dicht bij het vreemde gen verwacht men statistisch gezien ook een knipplaats 2) op de gekende uiteinden van de restrictiefragmenten worden de ‘adaptors’ geligeerd 3) kiezen v/e tweede primer obv deze adaptor 4) een PCR reactie met deze 2 primers amplificeert twee types DNA fragmenten ♦ Enerzijds zijn de gewenste stukjes DNA, die door primer 1 en 2 geamplificeerd werden ♦ Anderzijds zijn het stukjes die door 2 exemplaren van primer 2 vermenigvuldigd werden Deze DNA fragmenten die door het restrictie-enzym geknipt werden, waarop de adaptor bond en waar dus ook primer 2 op landde 5) zichtbaar maken vd gewenste DNA fragmenten kan men doordat de primer 1 gelabeld is ♦ Voor elk kopie van het vreemde gen zijn de omgevende plantensequenties anders en is het geamplificeerde fragment verschillend in lengte 6) elektroforese vh PCR product → fluorescerend bandenpatroon wordt zichtbaar ♦ Elk bandje staat voor een kopie vh vreemde gen Toepassingen Opzoeken van transgene planten Bepalen vh aantal geintegreerde kopieen v/e vreemd gen RAPD Wat? random aplified polymorphic DNA → PCR reactie waarbij alle willekeurige DNA fragmenten vermeerderd worden mbv/e korte primer met een arbitraire sequentie Na elektroforese wordt een bandenpatroon zichtbaar Verschillende banden patroon? → een aantal gewijzigde bindingsplaatsen voor de primers door polymorfismen tussen individuen RAPD zijn dominant ⇒ er kunnen verschillende loci per keer geanalyseerd worden Microsatellieten Wat? korte DNA fragmenten met een repetitief motief van twee of vier bp Voorbeelden met als basismotief: TA, CA, GTG, TAA, GATA, GGAT Dergelijke nonsense sequenties komen dan bvb 10 tot 100 maal direct achter elkaar in zgn tandem repeats Voorbeeld: TATATATATA meervoudige tandem repeats van zeer korte sequenties (2-10 bp) microsatelliet meervoudige tandem repeats van langere sequenties (5-100 bp) minisatelliet Polymorfismen zijn veroorzaakt door het verschil in het aantal herhalingen van het basismotief Deze verschillen zijn veroorzaakt door fouten tijdens de DNA replicatie of tijdens de meiose De variaties kunnen gevisualiseerd worden via PCR met lange primers die complementair zijn tegen de flankerende sequenties Microsattelieten zijn co dominant ⇒ er kan slechts 1 locu per keer geanalyseerd worden Voordelen zeer abundant willekeurige distributie zeer reproduceerbaar Stijn Vandelanotte Nadelen sequentie informatie van borders is nodig mutaties in primer annealing sites kunnen tot valse negatieven leiden -23- Toepassingen populatiegenetica verwantschappen tussen nauw verwante species Biotechnologie: theorie cDNA-AFLP en DNA chips cDNA-AFLP Probleemstelling: traditionele methodes in de moleculaire biologie onderzoeken per experiment meestal één of een beperkt aantal genen, waardoor een totaalbeeld van de interacties moeilijk te bekomen is Mogelijk oplossing → een aanpassing van de AFLP om zo de vele interacties tussen duizenden genen te bekomen Aanpassing tov AFLP Uitgansmateriaal: RNA vh weefsel of organisme ↔ itt DNA Dit RNA wordt via reverse transcriptase omgezet tot cDNA Dit cDNA wordt onderworpen aan de AFLP techniek en leidt tot een banden patroon dat nu verschillen in genexpressie weergeeft eerder dan verschillen in DNA samenstelling of structuur Voordelen, nadelen en toepassingen Voordelen Nadelen Toepassingen genoomwijde informatie zelfs als de arbeidsintensief expressie analyse in genomische sequentie niet gekend is duur eender welk na sequenering van differentiële bandjes veel materiaal organisme kunnen we de genen identificeren nodig DNA-chips Probleemstelling: cDNA techniek kon groot aantal gentranscripten tegelijk bekijken, maar er was nood aan een technologie die het mogelijk maakt om alle genen in een organisme in 1 enkel experiment te evalueren Mogelijke oplossing → ontwikkeling vd zgn DNA-MicroArrays, DNA Chips of biochips Chip? Meestal kleine glasplaatjes waarop mbv robots kleine druppeltjes gekend cDNA of oligonucleotiden, die het volledige genoom weergeven, gefixeerd worden in arrays Dank zij de kleine afmetingen van de druppeltjes werd het mogelijk om 10.000 oligonucleotiden op 1 draagglaasje te ‘spotten’ Werking? Uit twee biologische bronnen (ziek blad / gezond blad) worden RNA geëxtraheerd) Elke RNA staal → omzetten in cDNA en fluorescerent labelen Met teststaal rood en referentiestaal groen Dit gemerkte DNA kan vervolgens hybridiseren met de ‘gespotte’ nucleotiden op de DNA chip Het ongebonden DNA afwassen Het gebonden DNA met een confocale laser scanner en beeldanalysesysteem visualiseren en verwekken Rood → gen komt tot expressie in het zieke blad Groen → gen komt tot expressie in het gezonde blad Rood + groen = geel → het gen komt tot expressie in beide bladeren Zwart → geen expressie van dit gen Voordelen, nadelen en toepassingen Voordelen Nadelen genoomwijde analyse levert zeer veel informatie arbeidsintensief duur gespecialiseerd materiaal en software nodig Toepassingen aanvankelijk is de microarray techniek ontwikkeld om differentiële genexpressie tussen 2 stalen aan te tonen hieruit zijn belangrijke toepassingen gevolgd voor de geneeskunde bvb. aantonen van andere expressiepatronen in tumoren (expressie fingerprints), of het effect van nieuwe geneesmiddelen op genexpressie toepassingen in de landbouw bvb. effect van nieuwe pesticiden op genexpressie maar tegenwoordig gaan de toepassingen veel verder bvb. vergelijkende genoomanalyse, identificatie van populaties in natuurlijke microbiële stalen, identificatie van single nucleotide polymorfismen (SNPs), enz Stijn Vandelanotte -24- Biotechnologie: theorie DNA sequeneringstechnieken 1970 → Sanger → ontwikkeling v/e methode om de volgorde vd basen te bepalen in de DNA sequentie Werking: gebaseerd op de inbouw v/e terminator molecule die tijdens de DNA replicatie gestart wordt vanuit een radioactief gemerkte DNA primer → didoxynucleotiden ddNTP die geen 3’ OH groep dragen, wel ingebouwd worden door het DNA polymerase, maar geen fosfodiester binding kunnen maken met het volgende nucleotide dat moet ingebouwd worden en dus replicatie moet stoppen Voor elke base wordt een aparte reactie gestart met het overeenkomstige ddNTP Elk reactie mengsel wordt gescheiden op een polyacrylamidegel via elektroforese De volgorde vd bandjes die worden zichtbaar na het aanbrengen v/e radiografiefilm Dit laat toe om de sequentie af te lezen Probleem → zeer arbeidsintensief en duur → zoeken naar alternatieven (goedkoper, automatischer, eenvoudiger) 1e generatie sequencers → midden jaren 80 Verschil met daarvoor: radioactieve isotopen vervangen door fluorescente moleculen stoppen met de primer te merken, maar de ddNTP’s elk koppelen aan een andere fluorescent gekleurde kleurstof ⇒ hierdoor kunnen alle 4 de reacties in één buisje uitgevoerd worden het lezen van de gels wordt geautomatiseerd gevolgen vd aanpassingen snelheid waarmee sequenties konden bepaald worden ↑ aantal manipulaties ↓ eind jaren 90 werd een beta versie van deze 1e generatie sequencers ontwikkeld de verbetering was vooral dat de polyacrilamidegelelektroforese vervangen door capillairelektroforese hierdoor ging alles nog veel sneller en konden meerdere reacties tegelijkertijd op één enkel toestel geanalyseerd worden opm: dit wordt nu nog steeds zeer veel gebruikt! Probleem → nog niet snel genoeg, nog steeds te duur en de 1e generatie methode kon niet meer verbeterd worden 2e generatie sequencers → vanaf 2000 Gebruik van micromatrices geinspireerd op de microarrays waarop kleine fragmenten vh te sequeneren DNA waren aangebracht Werking Aan de fragmentjes worden adaptors geligeerd Deze enkelstrengige bibliotheek van het te sequeneren DNA wordt geimmobiliseerd op een drager Via PCR wordt voldoende DNA bekomen van elke fragment om sequenering toe te laten ♦ Men spreekt nu van polonies (= kolonies van PCR fragmenten) Mbv cyclische manipulaties met polymerasen of ligasen in de aanwezigheid van fluorescente moleculen kan men de extensie vd DNA strengen volgen met microscopische detectiesystemen gekoppeld aan gespecialiseerde camera’s Door bij elke cyclus de array te analyseren kan men mbv gespecialiseerde computer algoritmes de sequentie vh DNA afleiden 3e generatie sequencers → vanaf nu Loskomen van de op flurorescentie gebaseerde detectiemethoden en van de biochemie, men investeert nu vooral in de nanotechnologie en zeer geavanceerde niet-optische microscopie Nanotechnologe: de DNA streng doorheen een nanoporie te laten passeren en dan obv één of andere elektrofysische parameter af te leiden welke van de 4 basen de porie passeert Niet optische microscopie: het idee om uit een foto vh DNA in een resolutie die toelaat om de basen te zien en aldus de sequentie ‘gewoon’ te lezen Stijn Vandelanotte -25- Biotechnologie: theorie Tilling Wat? Targeting induced local lesions in genomes Dit is een reverse genetics strategie die het mogelijk maakt op grote schaal te screenen naar planten die in een specifiek gen gemuteerd zijn Werking Chemische mutagentia (bv EMS) veroorzaken willekeurige puntmutaties in het DNA Zaden van bv Arabidopsis worden in een 25mM EMS-oplossing geweekt en vervolgens uitgezaaid De zgn M1 planten groeien op in trays en leveren na zelfbestuiving zaden voor de M2 generatie M2 DNA wordt bereidt uit 0,2g bladweefsel van elke M2-plant De helft vh DNA wordt apart gehouden De andere helft wordt per 8 samengevoegd in multiwellplanten Via PCR wordt het gen waarin men geinteresseerd is geamplificeerd mbv specifieke, fluorescent gelabeld primers De forward en reverse primer dragen een verschillende fluorescentiekleur Mengsel verhitten → DNA strengen gaan uit elkaar Mengsel afkoelen → Complementaire strengen gaan terug op elkaar Een mutante streng combineert met een normale streng → uitstulping in de dubbelstreng op de plaats vd mutatie ⇒ mismatch CELI nuclease → endonuclease met grote specificiteit thv/e foute paring of DNA uitstulping die het DNA in 1 vd 2 strengen knipt Doordat de primers met verschillende fluorescentiekleur gelabeld waren, zijn er bij elk dubbelstrengig PCR product twee halfgeknipte producten mogelijk Denatureren vd PCR producten met formamide en op gel uitscheiden De gel wordt dan in 2 kanalen gescand Als 2 verschillend gekleurde fragmenten gedetecteerd worden, dan wijst dit erop dat er zich een mutant tussen de 8 gepoolde individuen bevind De 8 DNA stalen worden uit het archief gehaald en doorlopen elk apart nog eens dezelfde procedure Zo wordt de bewust mutant vlot teruggevonden Doordat dat de lengte vd twee fragmenten gekend is, kan men de plaats van de mutatie via een beperkte sequentiebepaling snel opsporen Via genetische modificatie met antisense genen of RNAi is een gen ook uit te schakelen → waarom deze methode dan nog te gebruiken Met gerobotiseerde werkstations kan men op korte termijn duizenden planten gescreend worden waardoor de kans om een mutant gen te vinden realistisch is geworden Er kunnen subletale mutaties gevonden worden ⇒ subletale? Mutaties die een gen bv half werkzaam maken. Dit kan niet met de RNAi of antisense technologie Mutanten zijn geen genetisch gemodificeerde organismen en kunnen zonder veel formaliteiten op de markt gebracht worden Stijn Vandelanotte -26- Biotechnologie: theorie Hoofdstuk 9: Biotechnologische toepassingen bij land- en tuinbouwgewassen Planten die insecticide aanmaken Endotoxine uit Bacillus thuringiensis (Bt) Probleem → de europese stengelboorder zorgt voor veel schade bij mais De larven eten zich een weg binnen in de plant → plant wordt zwak → plant kan plooien of breken Als het eenmaal in de plant zit is het niet meer gevoelig voor insecticiden Voorkomen vd insecten is arbeidsintensief en zeer duur Bacillus thuringiensis Wat? bodembacterie die tijdens sporulatie kristalvormige proteinen produceert met insecticide werking Het zijn toxines die toxisch zijn voor larven van lepidopteren en kevers, voor andere organismen totaal niet Ze scheiden inactieve prototoxines af die in de larven omgezet worden tot echte toxines Nadelen → zeer duur en onbruikbaar tegen insecten die binnenin de plant leven Oplossing → Bt- Genen isoleren en fusioneren met constitutieve of specifieke promotors Met deze chimere genen werd mais getransformeerd Stel aanval door het insect → Bt-eiwit kan de toxines nu produceren in het planten weefsel Gevaar? ! → zoals bij pesticiden verwacht men ook vroeg of laat resistentie tegen het Bt-gen. Dit kan men deels opvangen door Inbouwen van 2 resistentie genen → kans dat door mutatie resistentie ontstaat tegen 2 verschillende toxines is erg onwaarschijnlijk Telen van rijen gewone planten naast Bt-planten van hetzelfde gewas → het idee is dat niet-resistente insecten kunnen overleven op percelen met klassieke cultivars, zogeheten ‘refuge-zones’. Een eventuele resistente mutant kan dan kruisen met deze gevoelige insecten waardoor een resistente populatie minder snel zal opgebouwd worden Bt- genen wordt ook al gebruikt bij Soja, aardappel, tabak, katoen, populier Proteïnase-inhibitoren uit planten Er bestaan ook eiwitten die de proteinasen in de verteringssapen van insecten specifiek remmen Het gaat om een hele familie-iso-inhibitoren → bv de proeinase-inhibitor II bij de aardappel Virusresistente planten Transfer van manteleiwitgenen Stel tabaksplanten besmetten met zwak tabaksmozaiekvirus → resistent tegen sterkere stammen TMV Hoe? De aanwezige mantel eiwitten vd zwakke stam inhiberen de bouw vd manteleiwitten van de virulente stam Technologie bootst dit na cDNA maken vh RNA-genoom van dit virus het manteleiwit-DNA werd onder controle v/e constitutieve promotor gesteld, gevolgd door terminatorsequenties voor eukaryoten via leaf-disk techniek werd dit genconstruct met A. Tumefaciens in tabak over gezet de bekomen transgene tabaksplanten waren minder gevoelig voor TMV transgene tomaten en aardappelen werden op analoge manier verkregen en vertonen resistentie in veldstudies Virusresistentie met antisense-RNA Antisense RNA wordt verkregen door transcriptie met de normale sense-sequentie als mal ⇒ antisense Antisense RNA is complementair aan en kan binden op het overeenkomende sense mRNA Gevolg: hierdoor kan er geen translatie van dit mRNA plaatsvinden Dus: eigenlijk kan men de productie v/e manteleiwit uitschakelen door de sequentie vh corresponderende gen invers en achterste voren te plaatsen onder controle v/e constitutieve promotor en af te sluiten met een terminator signaal Na transformatie maakt dit gen voortdurend antisense mRNA aan dat, bij infectie door het virus, op het manteleiwit bindt. Resistentie tegen schimmels Chitinaseproducerende planten Resistentie onderzoek tegen schimmels is nu pas volop op dreef Chitine komt niet alleen voor als hoofdbestanddeel van de skeleten van insecten en schaaldieren maar komt ook in de celwand van schimmels voor In planten komen heel vaak chitinasen voor → afweerreacties tegen binnendringende schimmels Planten resistent maken tegen schimmels door ze te transformeren met een plantaardig chitinase gen onder controle v/e constitutieve promotor Gewassen met dergelijke chitinase genen vertonen een hogere resistentie → bv wortel, tomaat, rijst, druif Stijn Vandelanotte -27- Biotechnologie: theorie Herbicidenresistentie Glufosinaatresistentie (Basta, PPT) Glufosinaat? Verkorte naam voor glufosinaat-ammonium. Het is een breedspectrum contactherbicide dat ook als loofdoder bij aardappel en droge erwt wordt toegepast. Oorsprong? Een natuurlijk product geisoleerd uit de schimmel streptomyces Werking? Inhibeert de activiteit vh glutaminesynthase Glutaminesynthase → dit is nodig voor de productie van glutamine en detoxificatie van ammoniak Gebruik? Men kan planten bespuiten met glufosinaat → glutamineconcentratie↓ en ammoniakconcentraties↑ Gevolg: FS stopt → plant sterft af Glyfosaatresistentie (Roundup) Glyfosaat? Structuuranaloog van het AZ glycine Werking? Remt bij planten het enzym EPSPS → blokkeert de shikiminezuurbiosynthese → geen aanmaak meer van aromatische AZ (bv Tryptofaan, fenylalanine, ..) → gebrek → afsterven plant Probleem! → Uit Agrobacterium werd het gen CP4-EPSPS geïsoleerd,voor een enzym dat sterk lijkt op EPSPS. Het heeft dezelfde functie maar is niet gevoelig voor glyfosaat. Het gen werd overgebracht naar diverse gewassen en bleek een hogere glyfosaattolerantie op te leveren. Om overdracht vh gen via pollen te voorkomen werd het gen in het chloroplastgenoom van tabak ingebouwd. Chloroplasten erven uitsluitend maternaal over omdat pollen geen chloroplasten bevatten. Varia Monsanto werd de grootste agrochemische multinational door het patent op glyfosaat Glyfosaat is niet kankerverwekkend of giftig voor mens en dier, kan echter wel huidirritatie veroorzaken Het stapelt zich niet op in de plant en wordt gemakkelijk afgebroken in de bodem Verbeterde bewaarbaarheid en transportgevoeligheid FlavrSavr tomaten Probleemstelling → rijpende vruchten als tomaten hebben een enzym PG die zorgt dat de pectinen afgebroken worden in de middenlamella ⇒ de vrucht wordt zacht Rijpe, zachte tomaten zijn kwetsbaar tijdens het transport en daarom worden ze vaak onrijp geplukt Oplossing het was mogelijk het gen voor PG te isoleren een vruchtspecifieke promotor laat enkel expressie in de vruchten toe het PG-gen werd invers achter de 35S-promotor geplaatst en met de leaf disk techniek in tomaten overgebracht in transgene tomatenplanten bindt het antisense mRNA van PG op het sens mRNA → PG productie stopt →tomaten worden veel trager zacht + als neveneffect worden ze resistenter tegen vruchtrot Helaas is dit niet toegelaten door protestacties van milieuorganisaties De oude verbeteringstechnieken werden ingehaald door een natuurlijke mutatie van het PG-gen Een wetenschapper kruiste die mutant en verkreeg cultivars met een hoge opbrengst aan smakelijke vruchten die aan de plant konden rijpen en tijdens het transport stevig bleven Een langer vaasleven voor anjers Probleemstelling → snijbloemen hebben een beperkt vaasleven. De verwelking start door de productie van het gasvormige plantenhormoon ethyleen Dit kan enigszins voorkomen worden door zilverthiosulfaat (= chemische inhibitor van ethyleenbiosynthese) Nadeel → te duur en belast het milieu Oplossing Getransformeerde Florigene anjer met een antisense kopie vh ACC synthase → ethyleenproductie ↓↓↓↓ Geen ethyleen meer → houdbaarheid ↑ Eeuwige jeugd Probleemstelling → planten verouderen → blad vergeelt en valt af of verdroogd Oplossing Ontdekking van een promotor die specifiek geinduceerd wordt tijdens de senescentie en koppelen die aan het PT gen → dit gen codeert voor isopentenyl transferase → cytokinine productie ↑ → verjongende werking Voorbeeld met tabak Niet abnormale ontwikkeling, maar telkens als een weefsel begint te verouderen wordt het IPT-gen ter plaatse geactiveerd en wordt er voldoende cytokinine geproduceerd om de senescentie tegen te gaan Inhibitie van senescentie → activiteit vd senescentie-specifieke promotor ↓ → productie cytokinine ↓ De bladeren van deze transgene tabak hebben een veel langere levensduur en zijn fotosynthetisch langer actief De planten zijn het levende bewijs dat het verouderingsprogramma vd plant kan gemanipuleerd worden. Stijn Vandelanotte -28- Biotechnologie: theorie Gewijzigde samenstelling Veranderde vetzuursamenstelling bij koolzaad Vooraf: 14% vd wereldproductie aan plantaardige oliën en vetten wordt als grondstof in de chemische industrie aangewend Probleemstelling → Koolzaad levert olie dat een mengsel van vetzuren met verschillende technische eigenschappen is → voor veel technische toepassingen zou er maar 1 VZ aanwezig mogen zijn Doel? Men wil koolzaad hoogwaardige oliën laten produceren, die tot nu toe enkel door oliepalm kunnen geleverd worden. Voorbeeld: de Amerikaanse transgene koolzaadcultivars die laurinezuur bevatten Gewijzigde zetmeelsamenstelling bij de aardappel Vooraf: 25% vd Europese aardappelen worden gebruikt als industriële grondstof voor de productie van zetmeel en bioethanol Probleemstelling → de samenstelling van zetmeel is echter niet ideaal voor industriële toepassingen. → er komen nl twee zetmeelfracties voor (amylose (20-30%) en amylopectine (70-80%)) In voedingsoogpunt zijn deze gelijkwaardig In industrieel oogpunt is hun chemische en technische eigenschappen te verschillend Met sterk vertakte polymeer amylose kunnen biodegradeerbare films gevormd worden. Het kettingachtige amylopectine heeft sterk klevende eigenschappen die van pas komen bij de productie van lijmen De twee fracties worden chemisch en fysisch van elkaar gescheiden → dit is duur!! Oplossing Het gen GBSS codeert voor een enzym dat de amylase productie regeld Het gen kan uitgeschakeld worden (antisense)⇒ amylose productie ↓↓ ⇒ zetmeel met enkel nog amylopectine Goudenrijst Wat? rijst met een veel hogere concentratie aan vitamine A Probleemstelling 1 → in tropische gebieden wordt de olierijke aleuronlaag van rijst verwijderd omdat de rijst anders ranzig wordt Wat overblijft is het endosperm dat verschillende essentiële nutriënten mist bv provitamine A ⇒ blindheid Terwijl het rijstendosperm GGPP bevat, een precursor van β-caroteen Oplossing 1 Door het overbrengen overbrengen van vier genen uit narcis kon men de biosynthese weg vervolledigen Fytoeen syntase, fytoeen desaturase, x-caroteen desaturase en lycopeen cyclase Hierdoor werden lijnen gecreeerd met geel gekleurde endosperm ⇒ β caroteen ⇒ genoeg vit A Probleemstelling 2 → 60% vd bevolking in ontwikkelingslanden heeft bloedarmoede door een ijzer tekort Oplossing 2 → In deze rijst werd ook het ijzergehalte en de opneembaarheid van ijzer opgekrikt Beschikbaarheid van ijzer verhogen door het ijzer gehalte te verdubbelen door een ferritine uit de boon in te bouwen. Ferritine is een ijzeropslag eiwit dat in vele dieren, planten wordt aangetroffen Rijstendosperm bevat echter fytinezuur die de opname van ijzer in het darmkanaal inhibeert Dit werd voorkomen door het inbouwen van een fytase gen die fytinezuur afbreekt Al deze constructen werden voorzien van een endospermspecifieke promotor Gewijzigde ligninegehalte bij populier Vooraf lignine Na cellulose is lignine het meest voorkomende biopolymeer op aarde Functie: zorgt voor stevigheid en maakt de wanden van de vaatbundels hydrofoob Probleemstelling → hout bestaat grotendeels uit cellulose en hemicelluose (de grondstoffen voor papier en bioethanol) → ze liggen helaas wel ingebed in lignine waardoor ze moeilijk toegankelijk zijn voor chemicalen en enzymen Oplossing Wijzigingen door transformatie met een antisense vercie van het CCR gen Dit is een sleutelenzym in de biosynhtese van de lignine monomeren CCR gen ↓ → productie van lignine bouwstenen zoals hydroxycinnamaldehyden en S-monomeren ↓ →lignine gehalte ↓ → afbreekbaarheid vh hout ↑ Hierdoor werd de productie van papier veel minder vervuilend 12% minder chemicaliën nodig en de productie van bioethanol gebeurt 50% efficienter Nadelen Doordat het lignine gehalte gedaald was er een roodverkleuring vh hout Dit komt door een toename van ferulaatesters Verminderde groei Stijn Vandelanotte -29- Biotechnologie: theorie Gewijzigde bloemkleur Paarse anjers Probleemstelling → Witte anjers zijn wit omdat ze enzymen missen in de biosynthese weg van pigmenten Deze pigmenten zorgen voor een blauwe en rode bloemkleur Oplossing: Een australische firma transformeerde witte anjers met twee ontbrekende biosynthese genen → de genetisch gewijzigde planten produceren in hun kroonbladeren delphinidine → bloemen met paarse kleur Blauwe rozen → Ontwikkeling van de blauwe roos De ontwikkeling gebeurde door een ontbrekend gen voor de productie vd kleurstof delphinidine in te planten ⇒bloemen met lavendelblauwe kleur Om echt blauw te zijn moeten er nog een acetyleringsgen bijkomen en moet de pH vd vacuolen omhoog Mannelijke steriliteit Moderne plantenveredeling → streven naar zoveel mogelijk F1-hybriden 2 ingeteelde homozygote inteeltlijnen worden geselecteerd voor hun combinatie geschiktheid Dankzij heterosis effecten wordt een uniforme en superieure F1 hybride gevormd Om te vermijden dat de moederplanten zichzelf bestuiven maakt men gebruik van bv een zelfincompatibilieit en cytoplasmatische en mannelijke steriliteit Mbv gametociden kan men de productie van pollen bij moederplant verhinderen PGS ontwikkelde een genconstruct voor mannelijke steriliteit dat geschikt is voor alle plantensoorten De promotorsequentie TA29 werkt specifiek in de tapetumcellen vd anthere Tapetum = de cellaag die de pollenkorrels van voedingsstoffen voorziet tijdens hun ontwikkeling Deze promotor werd gefusioneerd met een sequentie die voor een sterk RNAse codeert → barnase Deze RNAse vernietigd alle RNA in de cel waar het tot expressie komt → celdood Door de specifieke werking worden enkel de tapetumcellen vernietigd. De ontwikkelde transgene planten is heel normaal, maar ontwikkeld geen pollen meer Wanneer de vaderplant homozygoot is voor het gen voor een specifieke inhibitor vh Barnase ⇒ mannelijke ferteliteit hersteld in de F1 hybride Barstar is een intracellulair eiwit dat bescherming biedt tegen de lethale effecten van barnase door er een stabiel, enzymatisch inactief complex mee te vormen Het herstel van de fertiliteit is voor veel gewassen noodzakelijk om een goede vruchtzetting te garanderen Voor vegetatieve gewassen is dit herstel niet nodig OPM → Naast TA29:Barnase werd het basta-resistentiegen(35S::bar)geplaatst. Nuttig als selectiemerkergen bij de transformatie + vermeerdering vd vrouwelijke lijn. Nadeel De helft van de vrouwelijke planten die het construct niet dragen kunnen op het veld geelimineerd worden met een basta bespuiting ⇒ De slechts 50% bastaresistent vd F1 hybrides ⇒ landbouwer is er dus niets mee, de helft van zijn gewas zou afsterven na een basta-behandeling Wordt reeds toegepast in oa. Maisteelt, koolzaadteelt, … Terminator → terminator gen is een vd meest controversiele toepassingen vd plantenbiologie Vooraf Een promotorsequentie, afkomstig vh LEA gen, activeert de genen waaraan het gekoppeld is enkel wanneer de zaden aan het rijpen zijn. Dit gebeurt niet in de zaden, maar in de weefsels vd moederplant Onderzoekers koppelden de LEA promotor aan een gen dat codeert voor een proteine die de kieming verhindert De planten die dit gen dragen zijn gezond, maar op het einde van het groeiseizoen wordt het gen geactiveerd waardoor de rijping verhinderd wordt ⇒ zaden verliezen hun kiemkracht Het gen is enkel actief in rijpe transgene planten → stel transgene pollen bevruchten een wild-type plant → het gen komt niet tot expressie in het zich ontwikkelde zaad doordat de moederplant het gen niet bezit Zoniet zouden ze nooit kiemkrachtig zaad kunnen verkopen Voordelen De gangbare systemen om nabouw van zaden te bemoeilijken, nl het op de markt brengen van F1-hybriden, heeft nu een alternatief → vorm van copyright bescherming Zaden die het terminator gen dragen zijn wel geschikt voor consumptie, maar kunnen niet kiemen Schot van zaden wordt vermeden Nadeel De pollenkorrels van terminator-cultivars kunnen zich gemakkelijk verspreiden over nabijgelegen velden Ze kunnen nu kiemen op de stempels van bloemen v/e ongetransformeerde cultivars, die dan voor een deel zaden zullen dragen met het terminatorgen → de zaden die geteeld worden zullen enerzijds bij de bloei opnieuw het terminator gen verspreiden via hun pollen en zullen anderzijds niet meer kiemkrachtig zijn. →tegenstanders beweren dat het terminatorgen zich zo als een olievlek over de velden zal verspreiden →uitsterven van de niet-transgene rassen door gebrek aan kiemkrachtig zaad → = ramp !!!! → onder de grote druk heeft Monsanto besloten het onderzoek in het terminator gen stop te zetten Stijn Vandelanotte -30- Biotechnologie: theorie Verminator De plant wordt getransformeerd met en promotorsequentie met speciale eigenschappen. De activiteit van de promotors, die uiteraard een gen sturen, kan worden aan-of uitgeschakeld door de plant te bespuiten met een bepaalde chemische verbinding. Er worden verschillende toepassingen voorzien: De promotor wordt gekoppeld aan het “fat rat”-gen. Dit is een lethaal gen dat zaadkieming en plantengroei onmogelijk maakt. Zonder regelmatige bespuiting met een zgn. “uitschakelverbinding” is kieming en verder plantengroei onmogelijk. Nabouw is zinloos zonder aankoop van het product. Nadeel: Ook hier is de kans reëel dat het pollen van dergelijk planten zich over naburige velden verspreidt. De buurman-boer blijft dan achter met zaden die niet meer kiemen omdat hij ze niet met de aanschakelverbinding bespuit. Dit genconstruct kan zich, itt het terminatorgen echter niet verder verspreiden over een plantenpopulatie. De promotor wordt gekoppeld aan een aantal gunstige gepatenteerde genen (ziekte- en herbicideresistenties). Zonder regelmatige bespuiting met deze “uitschakelverbinding” komen deze genen niet tot expressie. Dit betekent een effectieve bescherming vd eigendomsrechten op deze genen, ook in latere zaadgeneraties. Deze genconstructies kunnen zich via pollenkorrels over naburige velden verspreiden maar kunnen geen schade aanrichten omdat ze niet tot expressie komen. Een combinatie van de twee voorgaande systemen ”Verminator-gen” is in principe het “Europese” antwoord op de terminator-technologie Antivrieseiwitten (= AVE) Probleemstelling → sommige gewassen (bv wortelen) kunnen goed overwinteren → ze maken AVE aan Deze groep eiwitten werd ook terug gevonden bij antarctische vissen en in bepaalde insecten Deze AVE werken niet zoals antivries in een autoradiator Werking → EW binden specifiek op ijskristallen → groei vd ijskristallen stopt → cellen beschadiging stopt In 1998 werd voor het eerst het gen voor dit AVE uit Daucus carota geisoleerd en getransfereerd naar het tabak, waar het tot exrpessie kwam Toepassingen De kwaliteit en houdbaarheid van diepgevroren voeding te verbeteren mbv een natuurlijk extract van wortelen Medische wereld: veiliger invriezen van weefsels Bij cultuurgewassen: vorstresistentie ↑ ⇒ teeltseizoen en teeltgebied kan nu gewijzigd worden Fytoremediëring Probleemstelling → door mijnbouw of irrigatie leven vele mensen op bodems die gecontamineerd zijn met uiterst giftige kwik of arsenicumverbindingen Oplossing → fytoremediering Principe: gebaseerd op de eigenschap van planten om met hun fijnmazig wortelstelsel toxische stoffen uit de bodem en water op te nemen, te detoxificeren en op te slaan in de bovengrondse organen De planten daarna oogsten en verbranden, waarbij de ZM uit de as gerecupereerd kunnen worden Via genetische modificatie is men erin geslaagd om de tolerantie vd planten tegen Hg en As te verhogen en het transport ervan naar de bovengrondse organen te verbeteren Stijgende arealen met genetisch gemodificeerde GGO-gewassen In 2008 waren 3.3 miljoen boeren die GGO gewassen telen De oppervlakte waarop de GGO’s stonden is van 2007-2008 met 9,4 % gestegen tot 125milj hectare Vooral: soja, mais en katoen Vooral: Amerika (VS, Canada, Argentinie en Brazilie) maar ook op enorme oppervlaktes in het Verre Oosten In Europa wordt alleen Bt-mais MON 810 geteelt In totaal ongeveer 110000 ha Dit is een schril contrast met de VS die alleen al 60 milj ha GGO-gewassen teelt Stijn Vandelanotte -31- Biotechnologie: theorie Hoofdstuk 10: biotechnologische toepassingen bij dieren Transgene dieren die extra groeihormoon produceren of met extra spieren Toediening van groeihormoon bij runderen Voordeel: Verhoogde melk en vleesproductie In de VS is het toegelaten om het natuurlijke runderhormoon (geproduceert in recombinante bacteriën) toe te dienen. Er zijn ondertussen al transgene dieren gegenereerd die zelf hogere hoeveelheden groeihormoon aanmaken De eerste experimenten met het inbouwen van een extra groeihormoongen werden ondertussen al uitgevoerd bij: De muis → maar ook varkens, schapen, vissen Varkens en schapen Problemen of nadelen Transgene landbouwhuisdieren zijn moeilijk te verwezenlijken wegens de beperkte hoeveelheid beschikbare eicellen en het relatief lage aantal met DNA geinjecteerde embryo’s die uiteindelijk aanleiding geven tot transgene nakomelingen. Het chimere gen leidde niet tot verschillen in groeisnelheid of grootte De dieren werden veel stress gevoeliger Ontwikkelden gemakkelijker maagzweren Lagere vruchtbaarheid Voordelen De karkaskwaliteit verbeterde wel en de voederconversie liep efficienter Minder onderhuis vet en meer spierweefsel terwijl ze minder voeder opnamen Vissen Gebruik van metallothioninepromotor Wat? Metallothionines zijn eiwitten die in dieren en mensen ZM binden Werking? In de aanwezigheid van ZM of steroide hormonen starten hun promotors de transcriptie van elk gen dat eraan gehecht is Voordelen Sterke groeibevordering bij zalmen en forellen Transgene zalmen waren na 14 maanden gem. 11 keer groter dan de gewone nakomelingen Een dierlijke receptor, PPAR-delta, regelt de verbrandingssnelheid van vet Men heeft een muis gecreeerd waarbij dit gen geactiveerd werd in de spieren ⇒ spectaculaire toename in spierweefseltype dat minder snel vermoeid geraakt en vet verbrand ipv suiker Bij mensen en dieren zijn hart en het diafragma opgebouwd uit dergelijke spieren Ook sporters waarvoor uithouding belangrijk is ontwikkelen ook dit type spieren→genetische doping mogelijk? Inbouwen van ziekteresistentie in dieren Transgene kippen die het env eiwit van ALV tot expressie brengen → resistent tegen latere infecties met het ALV Bepaalde muizenlijnen bezitten een gen dat resistentie verleent tegen influenza Dit gen kan door genetische manipulatie bv in varkens ingebouwd worden Verbetering van de wolproductie bij schapen Essentieel voor de productie van wol is het AZ cysteine Opname cysteine gebeurt door voederopname → in maagdarmkanaal gebruikt door mo’s → cysteine is beperkende factor voor goede wolproductie → tegenwoordig tracht men schapen te maken die cysteine vormen vanuit serine Productie van farmaceutische eiwitten in melk of bloed van vee Probleemstelling → de in vitro cultuur van dierlijke cellen is vaak moeilijk en duur Alternatief → de gewenste eiwitten in de melk van koeien of schapen te produceren Voordeel: goedkope en eenvoudige manier om grote hoeveelheden EW te produceren Werking: β-lactoglobuline (eiwit in de melk van herkauwers) → de promotor werd gefusioneerd met verschillende sequenties coderend voor farmaceutische eiwitten, bv α-antitrypsine Resultaat: bij transgene schapen is het gelukt om tot 10kg α-antitrypsine te produceren per lactatie Ondertussen zijn al een hele reeks producties van therapeutische eiwitten die de markt hebben bereikt: Bv: Lactoferrine in koeienmelk Antithrombine III in geitenmelk α-antitrypsine in schapenmelk Protein C in varkens melk Menselijke bloedfactoren kunnen ook geproduceerd worden in bloed van transgene varkens Een groot varken kan zonder problemen tot 10l bloed afstaan per jaar Men is nu zelf aan het onderzoeken of varkens zouden kunnen dienen als orgaan donoren voor de mens Stijn Vandelanotte -32- Biotechnologie: theorie Klonen van dieren Wat? creeren van dieren met een identiek genetische achtergrond, voortplanting zonder seksuele recombinatie dus Normaal: Ontwikkeling embryo → individuele cellen beginnen te differentieren → vanaf nu kunnen ze niet meer tot om het even welke cel uitgroeien Bv in het geval v/e levercel worden alle genen gemethyleerd behalve deze die noodzakelijk zijn om een levercel op te bouwen → Onomkeerbare blokkering → geen omschakeling meer mogelijk Levercellen bleven levercellen, huidcellen bleven huidcellen 1996! Eerste kloning was een feit dankzij het team van Ian Wilmut in schotland Werking Uiercellen v/e volwassen ooi werden in rusttoestand gebracht Door ze geleidelijk aan voedingsstoffen te onttrekken aan het medium waarin ze gekweekt werden Door de uithongering staakten de cellen de productie van RNA 227 ‘uitgehongerde’ uiercellen werden elk versmolten met een pas geovuleerde onbevruchte eicel waarvan de kern werd verwijderd Een dergelijke eicel bevat speciale regulatie-eiwitten die bepaald embryonale genen activeren Een kleine stroomstoot deed de slapende kern ontwaken en zette de eicel aan tot celdeling 29 prille embryo’s werden overgebracht naar de baarmoeder van draagmoederschapen 1 embryo ontwikkelde zich verder normaal en werd na 5 maanden dracht geboren: Dolly!!!!! Sindsdien werden heel wat landbouw- en huisdieren gekloond: koeien, paarden, varkens, honden, muizen Het klonen van volgende dieren belooft een miljoenenbussiness te worden Klonen van waardevolle al dan niet transgene fokouders (runderen, racepaarden) Bijzondere eigenschappen (drugshonden, blindegeleidehonden), geliefde huisdieren Met uitsterven bedreigde diersoorten (gaur, banteng, panda) Problemen De meeste embryo’s komen niet tot ontwikkeling of eindigen spontaan door abnormaliteiten aan de foetus Vooral schapen en runderen hebben dit probleem, terwijl varkens en geiten ‘kloonvriendelijkere’ dieren zijn Een veel voorkomend probleem bij runderen en schapen is LOS (large offspring syndrome) Dit betekent dat minstens 20% vd kalfjes zwaarder zijn dan het normale geboortegewicht of abnormaal grote organen hebben Dieren met LOS hebben vaak last van vochtophoping Andere gezondheidsproblemen bij het klonen van dieren zijn Spierpeescontracties, ademhalingsproblemen en dystocia (= een te grote navel → kans op infecties ↑) Telomeerverkorting → bij celdeling verkorten deze uiteinden vd chromosomen terwijl bij klonen vertrokken wordt van cellen die al verkorte telomeren hebben De vrees bestaat dat gekloonde dieren als gevolg hiervan minder lang zouden leven Bv: dolly stierf aan 6,5 jaar terwijl een gemiddeld schaap 11 jaar kan worden Stamcellen Als het embryo nog slechts enkele dagen oud is ⇒ dan is het niet meer dan een bolletje cellen ⇒ mogelijk om een klein gebied, de zgn binnenste cellen of inner cell mass, ICM, te isoleren en in een kweekschaaltje te laten groeien De ICM kan alle weefsels vh volwassen organisme vormen Als de ICM op haar plek gelaten wordt, ontwikkeld deze zich tot de foetus zelf, terwijl uit de omliggende cellen de placenta en embryonale vliezen ontstaan Bij bepaalde omstandigheden kan men uit de ICM zelfs embryonale stamcellen (ES) krijgen 1) ES produceren doorlopend identiek dochtercellen → ES kan zichzelf vernieuwen → ES cellen kunnen lang in kweek gehouden worden 2) ES kunnen ook bij veranderde kweekomstandigheden omgevormd worden tot bijna alle celtypes ! Dit leidde tot het idee dat ES een eindeloze bron zouden kunnen zijn van gespecialiseerde cellen voor diverse vervangingstherapieen Bv hersencellen bij neuro-degeneratieve stoornissen, hartcellen bij hartziekten Ethische bezwaren bij het gebruik van ES Een chinese groep bewees dat het mogelijk is muizencellen te herprogrammeren, zodat ze veel lijken op ES Deze zgn iPS-cellen werden bekomen door bindweefselcellen via virustransformatie te voorzien van 4 extra genen en het GFP gen iPS cellen v/e muizenlijn met zwarte vachtkleur werden ingespoten in een klompje embryonale cellen v/e muis met een witte vacht als beide celtypen zouden bijdragen aan de ontwikkeling vh embryo zou de vacht gedeeltelijk wit en gedeeltelijk zwarte moeten zijn, maar het muisje dat geboren werd was compleet zwart oorzaak: de cellen uit het klompje embryonale cellen waren enkel instaat om het weefsel vd placenta te maken ⇒ de iPS cellen vormden de complete muis Stijn Vandelanotte -33- Biotechnologie: theorie Hoofdstuk 11: Andere toepassingen van moleculaire technieken DNA-fingerprinting in de plantenveredeling en –biotechnologie Verwantschapsanalyse tussen cultivars of wilde soorten Indentificatie van hybriden Cultivars kunnen worden geidentificeerd Aantonen van misbruik van inteeltlijnen door concurrerende veredelaars Zaadkwaliteit (vb moederlijn in een zaadpartij v/e F1-hybride Microsatellieten zijn bruikbaar voor bv cultivar indentificatie en populatiestudies Toepassingen van DNA-chips Volgen vd genexpressie gedurende differentiatie en groei Opsporen vd betrokken genen of veranderende genexpressiepatronen bij ziekte en of behandeling met medicijnen of plantenbeschermingsmiddelen Snelle in vitro screening van nieuwe geneesmiddelen of pesticiden en opstellen van expressie-fingerprints / middel Determinatie van bacteriele populaties in bv bodem- en waterstalen Vergelijkende genoomanalyse Identificatie van SNP’s Toepassingen van sequenering Identificatie van SNP’s Identificatie van genetische variaties in genomen Vergelijkende genoomanalyse Gepersonaliseerde geneeskunde Sequenering van transcriptomen Paleobiologie: sequenering van oude genomen Metagenomics: sequenering van volledige bacteriele populaties Toepassingen in de maatschappij Criminologie Een dader kan geidentificeerd worden adv/e paar zaadcellen bij verkrachting, een haar in een auto, .. Enkele haren per dier zijn voldoende om een fingerprint v/e hele stapel te maken Paleontologie, archeologie, evolutieleer DNA van mummies , museumdieren, ingevroren mammoet, gedroogd plantenblad Populatie en ecologisch onderzoek Identificatie van stoffelijke overschotten na rampen of aanslagen Snelle diagnose van ernstige bacteriele of virale ziektes Vaststellen van genetische afwijkingen Snelle weefseltypering voor dringende transplantaties Stijn Vandelanotte -34- Biotechnologie: theorie Hoofdstuk 12: Transgene planten en bioveiligheid Inleiding Samen met de komst van moderne technologie is ook wereldwijd de wetgeving inzake bioveiligheid tot stand gekomen Bioveiligheid → def: de veiligheid voor de menselijke gezondheid en voor het leefmilieu met inbegrip van de bescherming vd biodiversiteit bij het gebruik van GGO’s Wetgeving inzake bioveiligheid Europese richtlijnen 1990: de Europese commissie publiceert 2 richtlijnen betreffende bioveiligheidsaspecten van onderzoek en ontwikkeling in de sector vd biotechnologie alsook vd productie en het in de handel brengen van biotechnologische producten Richtlijn 90/219/EEG: reglementeert het ingeperkt gebruik van GGO’s in laboratoria of productie-eenheden Richtlijn 90/220/EEG: reglementeert de doelbewuste introductie van GGO’s in het leefmilieu 1998-2004 → voorzichtigheidsprincipe → alle lokale productie van genetisch gewijzigde landbouwgewassen was opgeschort Vanaf 1998 was het wel weer mogelijk om transgene gewassen te verbouwen in Europa nadat ze , geval per geval, gunstig geëvalueerd werden Ingeperkt gebruik van GGO’s Richtlijn 90/219/EEG In België werd de implementatie van deze richtlijn op regionaal niveau verwezenlijkt dmbv 3 wetenschappelijk identieke wetgevingen Het begrip bioveiligheid werd in de ruimere betekenis geinterpreteerd waarbij alle levende organismen die een risico kunnen betekenen voor de menselijke gezondheid, het leef milieu en de biodiversiteit betrokken zijn Er zijn specifieke voorzieningen getroffen voor toepassingen van Gentherape, voor serres, animalaria en virale vectoren Er werden 4 biologische risicoklassen gedefinieerd met de overeenkomstige inperkingsniveaus Elke inrichting die een ingeperkt gebruik met pathogene en/of genetisch gemodificeerde organisme uitvoert of voorziet komt in aanmerking voor toepassing van bovenvermelde wetgeving en moet daarvan melding maken aan de regionale bevoegdheid en een ‘bioveiligheidsdosier’ opstellen In België is dit verbonden met de milieuvergunning Voor al deze inrichtingen is een milieuvergunning van klasse 1 vereist Het bioveiligheidsdosier bestaat uit een technisch dosier en een publiek dossier Het technisch dossier omvat een gedetailleerde beschrijving vd wetenschappelijke activiteiten Infrastructuur, laboratoriumpraktijken, … Het publiek dossier is een gevulgariseerde en niet-vertrouwelijke versie vh technisch dossier In geval van een nieuw milieuvergunning of exploitatievergunning voorzien de regionale procedures een publieke enquête. Het publiek dossier kan door elke burger geconsulteerd worden bij de gemeente Ingeperkt gebruik van transgene planten Vooraf Goedkeuring van ingeperkt gebruik is vereist voor ook de eerste stadia vd ontwikkeling van bv de design vd vectoren en de plantentransformatie in het labo of de cultuur in de plantenkweekkamer en in de serre Als een goed ‘kandidaatlijn’ verkregen wordt zal men overgaan tot veldproeven dit gereglementeerd worden onder de 90/220/EEG De evaluatie vd risico’s is uiterst belangrijk: Eens een GGO is losgelaten in de natuur is het in bepaalde gevallen moeilijk weer te verwijderen Daarom moeten alle negatieve effecten voorzien en vermeden worden Voorbeeld van negatief effect: de risico dat een GGO de plaats zou innemen van andere soorten door een selectief voordeel. Daarom moet er een individuele evaluatie gebeuren obv volgende informatie Wat zijn de eigenschappen van donor- en receptororganismen Welke vector en transformatie methode werd gebruikt Welke nieuwe kenmerken heeft het organisme verkregen door genetische modificaties Hoe wordt het in de natuur gebracht In welk milieu komt het GGO terecht Hoe overleeft het GGO, hoe plant het zich voort en hoe verspreid het zich Zijn er monitoringstechnieken om controle vd verspreiding toe te laten Stijn Vandelanotte -35- Biotechnologie: theorie Veldproeven met GGO’s De meeste europese veldproeven werden uitgevoerd met: mais, koolzaad, aardappel en suikerbiet De meest voorkomende geintroduceerde kenmerken zijn: herbicidenresistentie, instectenresistentie en mannelijke steriliteit Voor je een veldproef mag uitvoeren moet: 1) aanvraag van autorisatie door de firma ovv een technisch dossier naar de bevoegde overheid gestuurd worden 2) bevoegde overheid evalueert de risico’s van de disseminatie alsook de opmerkingen van de andere lidstaten 3) de bevoegde overheid brengt de aanvrager, de Commissie en de lidstaten op de hoogte → 90 dagen de tijd om dit te verwerken 4) bij beëindiging vd veldproef stelt de kennisgever een rapport op met de resultaten van de introductie 5) indien voldoende ervaring is opgedaan met de introductie v/e bepaalde GGO kan de kennisgever verzoeken om de toepassing v/e eenvoudigere procedure 6) indien goedgekeurd kan de procedure over meerdere jaren lopen en wordt eenmaal een algemene toestemming gegeven Men moet dan wel jaarlijks een specifieke toelating aanvragen en een verslag indienen vd proefnemingen vh voorgaand jaar In de handel brengen van GGO’s Voor je een GGO in de handel mag brengen moet: De firma die een GGO wil introduceren stuurt een technisch dossier met o.a. een milieurisicobeoordeling naar de bevoegde overheid van een lidstaat naar keuze de bevoegde overheid evalueert de risico’s voor de menselijke gezondheid en het leefmilieu voor het formuleren v/e advies →90 dagen voor advies moet gegeven worden stel: negatief advies → het product wordt verworpen stel: positief advies → dossier doorsturen naar de Europese Commisie De europese commissie verspreidt dit dossier naar de bevoegde overheden vd andere lidstaten → 60dagen voor bezwaar aan te tekenen Vaak wordt het voorzichtigheidsprincipe aangehaald als reden om x niet goed te keuren Hierdoor laat men toe om beschermende maatregelen te treffen zonder dat hiervoor sluitend wetenschappelijk oorzaak-gevolg-bewijs geleverd moet worden 100% wetenschappelijk bewijs kan zelden of nooit geleverd worden. In de praktijk komt het erop neer dat men GGO’s tegenhoud obv vermoedens van risico’s Hierdoor beschuldigen de Amerikanen Europa ervan dat zij het voorzichtigheidsprincipe gebruiken als legitimatie om verdoken handelsbarrières tegen Amerikaanse producten op te zetten Nieuwe wind in de Europese commissie Besef dat een 0% risico maatschappij alle vooruitgang tegenhoudt Men besloot dat het verbieden van GGO’s obv vermoedens zonder wetenschappelijke analyse niet altijd meer kan. Het is vaak zinvoller verder onderzoek te laten uitvoeren naar de onzekerheden in de analyse. Uiteindelijk oordeelt het Europees Hof van justitie over de wettelijkheid vd genomen maatregel De algemene toepassingsprincipes zijn de volgende Proportionaliteit: de maatregelen moeten in verhouding zijn met het risico, waarbij niet moet streven naar een 0% risico Non-discriminatie: dwz dat in vergelijkbare situaties ook vergelijkbare maatregelen moeten getroffen worden De wetgeving moet zich richten tot de eigenschappen vh product en niet op de gebruikte productiemethode Consistentie: nieuw genomen maatregelen moeten overeenkomen met vroeger genomen maatregelen onder gelijkaardige omstandigheden. 2001: invoering van een nieuw regelgevingssysteem Deze is effectiever en doorzichtiger dan het systeem van Richtlijn 90/220/EEG inzake de doelbewuste introductie van GGO’s in het milieu 2004 → De opheffing vh moratorium, geaard met twee verordeningen (EC) NO. 1829/2003: betreffende GGO’s in diervoeder en levensmiddelen (EC) NO. 1830/2003: betreft de traceerbaarheid en etikettering van GGO en van met GGO-geproduceerde levensmiddelen en dieren voeders Wat zijn de essentiële verschillen met de vroegere wetgeving Stijn Vandelanotte -36- Biotechnologie: theorie Hoofdstuk 13: Vele betrokken partijen Multinationale ondernemingen en kleinere biotechbedrijven Just eki leezn De landbouwer Voordelen en risico’s voor de landbouwer Het voordeel vd landbouwer hangt af van de aard vd ingebrachte genen Genen die de samenstelling vh geoogste product verbeteren kunnen de markt verruimen De winst hiervan zal voor een deel opgaan in duurder zaaigoed Zolang de landbouwer de vrije keuze heeft tussen een transgene en een niet-transgene cultivar zal zijn keuze bepaald worden door de verwachte winst In België is de commerciele teelt van transgene planten nog niet toegelaten De voordelen (die gevonden zijn bij landbouwgewassen in Amerika en Canada) kunnen we indelen in 4 groepen Hoger rendement: door vermindering vh oogst verlies Reductie vd bestrijdingskost: dit kan door het aantal sproeibeurten terug te brengen door resistent rassen te gebruiken Lagere risico’s: Bt-mais vormt een verzekering tegen jaarlijks varierende schade door de stengelboorder Tijdswinsten: de lange periode van bescherming beperkt informatie en leerkosten bij het gebruik van steeds nieuwe insecticiden Consument Voordelen voor de consument Vroeger: landbouwkundige vooruitgang → lagere voedselprijzen Nu: de kostprijs vd basisingredienten van ons voedselpakket is nu in verhouding met de verkoopprijs in de winkel zeer laag Bv: een 20% lagere kostprijs voor graan zou nauwelijks gevolgen hebben voor de broodprijs Oorzaak: niet de productieprijs bepaald de winkel prijs, wel de wetten van vraag en aanbod De transgene planten kunnen hierop een uitzondering worden eens de consument ze als beter ervaart dan de gewone planten of producten Bv: de Flavr-Sav tomatenketchup deed het zeer goed in de Engelse supermarkten doordat het veel lekkerder zou zijn Risico’s voor de consument Naargelang de categorie vd biotechnologische toepassing, is de aanvaarding vd consument anders Als het gaat om eiwitten die ingezet worden in de gezondheidszorg → geen bezwaren Als het gaat om afgeleide producten van hierboven → geen bezwaren Als het gaat om het rechtstreeks consumeren van GGO’s →wel bezwaren Oorzaak: de taalcreativiteit van biotechnologietegenstanders met ruime toegang tot de media laat bij de consument duidelijk gevoelens van twijfel en bezorgdheid hangen Hierdoor krijgt de consument dat de bezorgdheid vd overheid niet ernstig genoeg is De risico’s worden nochtans even veel onderzocht als de eerste 2 toepassingen, maar hier wordt de objectieve informatie naar de consument niet correct uitgespeeld Allergie Algemeen Ongeveer 1 – 2 % vd bevolkings vertoont allergische reacties tegen eiwitten in bepaalde levensmiddelen De voornaamste natuurlijk voorkomende allergenen worden teruggevonden in: Melk, eieren, aardnoten, noten, vissen, sojabonen Bij genetische modificatie wordt de genetische code vd plant gewijzigd waardoor er een ‘nieuw’ eiwit in de plant wordt aangemaakt Alle eiwitten zijn mogelijk allergenen → de nieuwe eiwitten zouden dus ook allergieën kunnen veroorzaken De Term ‘nieuw’ heeft meestal slechts betekenis voor de gemodificeerde plant Het gen dat toegevoegd wordt , is immers afkomstig van een andere plant ⇒ de personen die allergisch zijn voor de nieuwe plant zullen ook reeds lang allergisch reageren op de donorplant Een veel geciteerd voorbeeld is dat van soja met het paranootgen Op wereld vlak is soja het belangrijkste eiwitgewas! Het heeft een relatief gebrek aan het AZ methionine Men haalde het gen voor zo’n hoogwaardig eiwit uit de paranoot Uit testen bleek met de transgene soja bleek dat het eiwit een allergeen was dat bij mensen (die ook allergisch waren voor paranoten) een allergische reactie kon opgeroepen worden → het project werd stopgezet Stijn Vandelanotte -37- Biotechnologie: theorie Andere De kans dat een ingeplant gen een allergeen blijkt te zijn is zeer klein Bij genetische modificatie wordt slechts 1 of een beperkt aantal eiwitten in de plant gewijzigd Als een patient allergisch reageert is dit het gevolg v/e reactie tegen verschillende eiwitten Ook bij klassieke kruissingstechnieken kunnen ‘nieuwe’ EW ontstaan of nieuwe planten waarin bestaande eiwitten in verschillende relatieve hoeveelheden aanwezig zijn. Zo’n planten mogen wel geproduceert worden maar kunnen dus ook grote ‘allergeen-leveranciers’ zijn (kiwi, aardbeien, hydrowitloof) De wetgeving verplicht dat elke genetisch gemodificeerde plant die op de markt komt , eerst getest moet worden op zijn vermogen om een allergische reactie uit te lokken Plantengenetici gebruiken hiervoor immunologische technieken om vast te stellen of een genetische gemodificeerde plant allergenen bevat die voorkomen in de donorplant In het serum van personen die allergisch zijn voor de donorplant vind men immers antistoffen waarmee men de bewuste eiwitten in de gemodificeerde plant kan detecteren De biotechnologie biedt ook de mogelijkheid om gewassen te maken die geen of minder allergenen bevatten Antibioticumresistentie Algemeen Bij elke hap verse groenen of fruit eten we ontelbare genen In transgene planten zit vaak ook een antibioticumgen dat als selectiemerker werd gebruikt tijdens het transformatieproces. (vaak kanamycine resistentie, die wijd verspreid in de natuur voorkomt) Tegenstanders van transgene planten wijzen op het gevaar dat het gen voor kanamycineresistentie in de darmbacterien vd mens kan binnenglippen Als de persoon dan ooit door een ziekteverwekkende bacterie geinfecteerd word is de kans dat het gen overgedragen wordt naar deze bacterie waardoor deze resistent wordt tegen kanamycine Volgende argumenten pleiten tegen deze hypothese Een grote hoeveelheid DNA wordt in het menselijke verteringskanaal vernietigd De bacteriën moten dan uit de miljoen overblijvende genen net het kanamycinegen opneme Deze kans is klein omdat er geen positieve selectiedruk heerst in de darmen Als het gen ooit opgenomen wordt en doorgegeven aan een ziekteverwekker, moet het er nog aangeschakeld worden. De gebruikte promotor (CaMV) werkt enkel in eukaryoten en niet in bacteriën Als het gen toevallig voor een bacteriële promotor komt te zitten zou het inderdaad werken en resistentie opleveren voor de ziekte verwekker Kanamycine wordt tegenwoordig niet meer gebruikt in de menselijke geneeskunde wegens haar toxiciteit Kanamycineresistentie komt wijd verspreid voor in de natuur ⇒ het gevaar op overdracht naar een ziekte verwekker komt niet alleen vd transgene planten Het risico is dus vrijwel onbestaand. Toch gebruiken tegenstanders het te pas en te onpas om de consument ongerust te maken Bescherming van de consument Invoering van ‘novel food’ → deze verordening is van toepassing op het in de handel brengen van voedingsmiddelen en voedsel ingrediënten die tot dusver niet voor de menselijke voeding gebruikt zijn. Voedingsmiddelen of voedsel ingrediënten die GGO zijn GGO’s bevatten of afgeleid zijn van GGO’s vallen allemaal onder deze richtlijn Deze producten hebben een goedkeuring nodig vooraleer ze op de markt mogen komen 4 categorieën van novel foods die rechtstreeks of onrechtstreeks biotechnologisch geproduceert worden Deze waar het voedsel zelf het resultaat is van een recombinant-DNA ingreep Voedingsmiddelen waarin zich nog genetisch gemodificeerde mo’s bevinden op het ogenblik van consumtie Bv yoghurt, kaas, wijn Voedingsmiddelen die geproduceerd worden via tussenkomst v/e enzym of eiwit bekomen door recombinantDNA technologie Voedingsstoffen geproduceerd door GGO’s , vooral niet eiwitten Bv suiker uit transgene bieten, inuline uit transgene cichorei, olie uit koolzaad Belangrijkste voorwaarden voor goedkeuring van dergelijke nieuwe voedingsmiddelen Geen gevaar voor de consument De consument mag niet misleid worden Ze moeten ‘substantieel equivalent’ zijn Stijn Vandelanotte -38- Biotechnologie: theorie Consument moet weten wat hij eet → overheid verplicht etikettering Als GGO’s verwerkt worden moet dit op het etiket vermeld worden door de producent Zelfs wanneer de algemene samenstelling niet wordt beïnvloed en het landbouwproduct ‘substantieel equivalent’ wordt bevonden met de bestaande conventionele producten Voor onopzettelijke vermenging met GGO’s wordt een grenswaarde van 0,9% gehanteerd Voor ‘nog niet toegelaten’ GGO’s wordt een grenswaarde van 0,5% gehanteerd De aanwezigheid van ‘nieuwe’ stoffen die gevolgen kunnen hebben voor de gezondheid of ethische bezwaren kunnen opleveren moet eveneens aangegeven worden Gezondheid → opwekken van allergenen? Ethisch → planten met dierlijke genen voor vegetariërs? Consumentenverenigingen Testaankoop publiceerde al 2x onderzoeksresultaten naar de aanwezigheid van vreemde genen in voedsel Laatste rapport onderzochten ze 53 producten op basis van mais of soja Via PCR kon men in 4 gevallen sporen van vreemde genen vinden 2X bij chips 2X bij hespenworst Consumentenvereniging zijn groot voorstander van duidelijke etikettering Milieu De pollen van transgene planten kunnen verwante onkruiden bevruchten Koolzaad kan bv bepaalde rassen van wilde brassicaceae bevruchten ⇒ een gen kan zo ontsnappen aan de controle vd mens In het geval van genen voor herbicidenresistentie kunnen resistente onkruiden bestaan Door jaarlijks te wisselen van herbicide kan dit probleem uitgesteld , maar niet vermeden worden Het ontstaan van een superonkruid dat de velden overwoekerd en waartegenover de mens machteloos staat is echter biologisch niet realistisch Ideologische oppositie Regelmatig duiden krantenkoppen op de bezorgdheid die rond biotechnologische producten heerst Mensen stellen zich vragen en verschillende organisaties bv greenpeace, agalev, de belgische boerenbod, broederlijk delen, maken zich zorgen over de ecologisch, sociaal-economische en politieke gevolgen vd biotechnologische toepassingen en de mogelijke risico’s voor de gezondheid De houding van de grote internationale milieuorganisaties komt voor veel wetenschappers uit de biotechnologische sector over als onredelijk en eenzijdig negatief Biotechnologie en de derde wereld Wat is de impact van plantenbiotechnologie op de bedreigde socio-economische situatie van de kleinere landbouwers en de derde wereldboeren? Discussie omtrent de problematiek van de patentering van genen en uiteraard daaraan gebonden socioeconomische aspecten. 1) kan men wel genen patenteren, gezien het niet echt om nieuwe verbindingen gaat? 2) wie kan de patentering winnen? De oorspronkelijke eigenaar van het gen of van het organisme of de organisatie die het gen isoleerde en sequeneerde of de maker v/e product obv/e gen Ontwikkelingslanden vrezen dat ze zullen moeten betalen voor genen die westerse bedrijven oorspronkelijk bij hen kwamen halen Discussie omtrent de plannen om vervangproducten te fabriceren voor allerlei tropisch planten (bv cacao Bv: de vervanging van suiker door fructosestroop uit mais → rijke landen kunnen zich hierdoor onafhankelijk maken van Derde wereldlanden wat de voedselproductie betreft ⇒ export ↓ ⇒ inkomsten ↓ Actiegroepen wijzen op de toenemende greep van grote multinational bedrijven (zaad- , fytopharmaceutische bedrijven) op de voedselvoorziening wat vermoedelijk zal leiden tot een verminderde autonomie vd kleine boeren (zie koppelverkoop van herbicidenresistente cultivar) Uiteindelijk is de vraag of men de commerciele drijfveren vd biotechnologie in evenwicht zal kunnen brengen met de bezorgdheid voor een duurzame ontwikkeling voor zowel rijk als arm Biotechnologie kan nochtans van groot belang zijn voor de Derde wereld → dankzij hogere productiecijfers van landbouwproducten waarbij minder land en water nodig is De gestage groei vd wereldbevolking concentreert zich vooral in de ontwikkelingslanden ⇒ alle beschikbare landbouwgrond wordt door bevolking ingepalmd ⇒ massaal verlies aan biodiversiteit Stijn Vandelanotte -39-
