NIPT - Stichting Prenatale screening regio Nijmegen

NIPT: praktische
aspecten, eerste
resultaten en een blik
vooruit
Kornelia Neveling (PhD) en Lean Beulen (MD)
4th November 2014
Inhoud
• Wat is NIPT?
• Hoe werkt NIPT?
(van bloedafname tot testresultaat)
• Betrouwbaarheid NIPT
• Technische ontwikkelingen
• Klinische (proef)implementatie
• Counseling
• Eerste resultaten
• Een blik vooruit
Human Genetics Nijmegen
Wat is NIPT?
Human Genetics Nijmegen
NIPT
Non-invasive prenatal testing
• niet-invasieve prenatale test
• bij vrouwen met verhoogd risico op T21/T18/T13
> prenataal onderzoek zonder invasieve ingreep
(vlokkentest of vruchtwaterpunctie) mogelijk
• vermijden van kans op miskraam
(3-5 op 1000 testen)
http://www.meerovernipt.nl
Human Genetics Nijmegen
Wat is een trisomie?
• een gezond individu heeft 46 chromosomen in een cel
(23 van moeder en 23 van vader)
• twee zijn geslachtschromosomen (XX of XY)
• 44 autosomen: chr 1 tot en met chr 22 (2x) > diploïd
• trisomie: 3 in plaats van 2 kopieën van een chromosoom
• foutje in celdeling van eicel of zaadcel
• vaak oorzaak van ernstige aandoening van het kind
Trisomie 21 (downsyndroom)
Trisomie 18 (edwardssyndroom)
Trisomie 13 (patausyndroom)
Human Genetics Nijmegen
Testen op een trisomie
combinatietest:
> bloedtest, nekplooimeeting, maternale leeftijd
> bij verhoogd risico: vlokkentest of vruchtwaterpunctie
nieuw: mogelijkheid om niet-invasief onderzoek te doen
1997
Human Genetics Nijmegen
Wat betekent dat?
• chromosomen bestaan uit DNA
• in het bloed van de moeder: DNA-fragmenten
van foetus
> circulating cell-free fetal DNA (ccffDNA)
• afkomstig van placenta
• sterk gefragmenteerd
• detecteerbaar vanaf week 5 van zwangerschap
• in totaal: ~2-10 ng ccf DNA per ml maternaal
plasma
• slechts 5-15% hiervan is foetaal DNA
• dit foetaal DNA onderzoeken op T13/18/21
Hui and Bianchi, Trends in Genetics, 2013
Human Genetics Nijmegen
Verschillen zijn heel subtiel
Lo LYM, Chiu RWK. Nat Rev Genet,
2007;8:71-77.
trisomie 21
monster
% foetaal DNA
 chr 21 (%)
 chr 21 (-fold)
chorionic villus
100%
50%
1.5
maternaal plasma
~10%
5%
1.05
• de techniek moet heel subtiele verschillen kunnen detecteren
• minstens 10 million reads/monster
Human Genetics Nijmegen
Hoe werkt het?
Human Genetics Nijmegen
Bloed afnemen > DNA isoleren > sequencing
placenta
Maternal blood
Fetal DNA
• DNA isolatie
• sequencing (NGS)
Maternal DNA
> bepalen van sequentie
(lezen van DNA)
> informatie interpreteren
Human Genetics Nijmegen
DNA voorbereiden…
genomisch
DNA
DNA
fragmenteren
adaptoren
binden
sequentie amplificeren
vertalen naar miljoenen losse reads
AAGTGTTGAGGCTTTGTGATGCTTATATTATATTAGCAAACTTAGA
Human Genetics Nijmegen
Lezen van de DNA
we vergelijken de reads met een bekende referentie sequentie (mapping)
chromosoom 3
Reference Genome
chromosoom 15
> nu weten we waar de fragmenten DNA vandaan komen
> voor elk chromosoom hebben we vele fragmenten DNA gelezen
> en dan tellen we: hoeveel fragmenten DNA (reads) zien we per
chromosoom?
Human Genetics Nijmegen
Hoeveel reads per chromosoom?
Bepalen of er van een chromosoom meer (of minder) materiaal aanwezig is,
ten opzichte van een referentie set van normale individuen/plasma’s
subtiel
verschil!!!
Human Genetics Nijmegen
Goede analyse tools nodig: Z-score
• tellen van alle reads op een chromosoom
• corrigeren voor het gemiddelde aantal reads (referentie monsters)
• berekenen van een score
Z-score =
% reads (monster) – gemiddelde % reads (ref)
standaarddeviatie (ref)
• Z-score < -3 = loss/monosomie
• Z-score > 3 = gain/trisomie
Human Genetics Nijmegen
Betere analyse tools beschikbaar
vele verschillende opties:
 Z-score (Chiu et al., 2008)
 Normalized Chromosome Value (Sehnert et al., 2011)
 student’s t -test-based (Jiang et al., 2012)
 WISECONDOR (Straver et al., 2013)
 .....
WISECONDOR:
within sample copy
number aberration
detector
Human Genetics Nijmegen
Resultaten WISECONDOR – Voorbeeld 1
chromosoom 13
chromosoom 18
chromosoom 21
> Wisecondor kijkt naar alle autosomen, niet naar geslachtschromosomen
Human Genetics Nijmegen
Voorbeeld 2
duplicatie
18p
Human Genetics Nijmegen
Voorbeeld 3
15 Mb deletie
op 11p
Human Genetics Nijmegen
Hoe betrouwbaar zijn
de resultaten?
Human Genetics Nijmegen
Sensitiviteit en specificiteit
Sensitiviteit:
T21: 99%
T18: 97%
T13: 92%
N
N T21
Sensitivity
Specificity
Chiu 2011
232
86
100%
97,9%
Ehrich 2011
449
39
100%
99,8%
Palomaki 2011
1683
212
98,6%
99,8%
Sehnert 2011
47
13
100%
100%
Ashoor 2012
397
50
100%
100%
Bianchi 2012
493
89
100%
100%
Lau 2012
108
11
100%
100%
Norton 2012
3080
81
100%
99,97%
Sparks 2012
167
36
100%
100%
Jiang 2012
903
16
100%
100%
Liang 2013
412
40
100%
100%
Nicolaides 2013
242
25
100%
100%
Human Genetics Nijmegen
Discrepanties
Mogelijke oorzaken voor discrepanties:
• Technisch (waaronder lage foetale fractie)
• Vanishing twin
• Confined placental mosaicism (CPM,
mozaïek beperkt tot placenta)
• Maternaal of foetaal mozaïek
• Maternale deletie of duplicatie
• Maternale geslachtschromosomale afwijking
• Maternale maligniteit
Osborne et al., Prenat Diagn 2013, 33(6),609–611
NIPT (duplo metingen)
 trisomie 13
 monosomie 18?
 vruchtwater  46,XY en normaal array profiel
 Postnatale analyse van placenta biopten  normaal
> Maternale tumor met cytogenetisch numerieke afwijkingen (#13 als #18)
Human Genetics Nijmegen
Wat kunnen we (niet) met NIPT?
• test is gevalideerd voor
- Trisomie 21 (downsyndroom)
- Trisomie 18 (edwardssyndroom)
- Trisomie 13 (patausyndroom)
• WISECONDOR detecteert ook andere trisomieën
• grotere partiële afwijkingen (>15 Mb)
op dit moment niet mogelijk (in Nederland):
• detecteren van (veranderingen op) geslachtschromosomen
• kleine partiële afwijkingen (<15 Mb)
niet mogelijk met deze test:
• triploïdie
• gebalanceerde translokaties
• puntmutaties in genen
Human Genetics Nijmegen

()
Technische
ontwikkelingen
Human Genetics Nijmegen
April-September: sequencen op SOLiD 5500XL
• SOLiD 5500XL
• 32 sample op 1 flowchip
• run tijd 6-7 dagen
Human Genetics Nijmegen
April-September: sequencen op SOLiD 5500XL
Week 1
ma/di:
Binnenkomst materiaal
Afdraaien  plasma scheiden van buffy coat
Week 2
di/woe:
DNA isolatie
do/vrij
Library prep
ma/di
ePCR en starten NGS machine (5500xl)
Runnen NGS machine
Week 3
do/vrij
Week 4
ma
Human Genetics Nijmegen
Data analyse en interpretatie
Uitslag
3 wkn
Sinds September: 2 NextSeq 500 (Illumina)
• NextSeq500 (Illumina)
• max 24 samples op een run
• run tijd: 11 uur (!!!)
Human Genetics Nijmegen
Sinds September: 2 NextSeq 500 (Illumina)
Week 1
ma/di:
Binnenkomst materiaal
Afdraaien  plasma scheiden van buffy coat
di/woe:
Week 2
DNA isolatie / Library prep
do
Library prep
vrij
Runnen NGS machine (NextSeq)
ma
Data analyse en interpretatie
di
Uitslag
Human Genetics Nijmegen
(>) 1 week
Verdere technische ontwikkelingen
• kleinere afwijkingen
• geslachtschromosomen
• meten (en verrijken) van foetale fractie
• ontwikkeling van sample tracking methode
• gebruiken van Streck®-buizen (of andere buizen)
hoeveelheid ccffDNA kritisch:
• zichtbaar vanaf week 5 in zwangerschap
• percentage foetaal DNA voldoende vanaf
~ week 10
Wat kunt u doen?
• stuur (4x) 10ml EDTA bloed
• let op positie van de sticker!
Human Genetics Nijmegen
XXXX