Aanmaak van T-cellen tegen tumor- specifieke antigenen

Aanmaak van T-cellen tegen tumorspecifieke antigenen: Analyse van
de autoreactiviteit van in vitro
gematureerde T-cellen
Malicorne Buysse
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof.Dr.B.VANDEKERCKHOVE
Vakgroep Klinische biologie, Microbiologie en Immunologie
Academiejaar 2013-2014
Toelating tot bruikleen
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar
te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder
de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking toe de verplichting
uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uti deze masterproef.”
16 mei 2014
Malicorne Buysse
Prof.dr. B. Vandekerckhove
Voorwoord
Een masterproef schrijven is als op weg gaan naar een verre reisbestemming. Je wil boven
alles het einddoel bereiken, maar op het einde van de reis komt het besef dat de reis zelf een
veel belangrijker leerproces is geweest. Bij de start van de masterproef waren er meer vragen
dan antwoorden: wat is al geweten over je onderwerp, wat is wel en wat niet relevant van die
berg wetenschappelijke literatuur, hoe kan je daar nog iets aan toevoegen, welke methoden
zijn daartoe het best geschikt? Maar gaandeweg is het inzicht gegroeid, kwam er structuur in
dat onontwarbare kluwen van papers, onderzoeken en resultaten, heb ik tal van problemen
leren overwinnen en is het labo is bijna een natuurlijke biotoop geworden. Toch is er geen
garantie dat dit finaal tot een masterproef leidt. Daarvoor moet ook voldaan zijn aan 2 andere
belangrijke voorwaarden. De eerste betreft het onderwerp: meewerken in een
wetenschappelijk traject dat op termijn betekenisvol kan zijn voor de behandeling van kanker,
was al van bij de start van mijn opleiding Biomedische Wetenschappen een droom. Maar een
uitdagend onderwerp is op zich ook niet voldoende. De tweede voorwaarde is dat je kan
terugvallen op een omgeving die je voor allerlei aspecten met raad en daad kan bijstaan.
Op UGent waren alvast de volgende 2 personen cruciaal wat dat betreft: mijn promotor
Prof.dr. B. Vandekerckhove en mijn mijn begeleidster Mevr. G.Verstichel. Hartelijk bedankt
voor de begeleiding van dit traject en voor de kans die ik kreeg om aan dit onderzoek deel te
nemen. Verder ben ik ook zeer erkentelijk voor de sterke technische ondersteuning bij het
opzetten van de experimenten door Glenn Goetgeluk. Bedankt Glenn, voor het vele geduld en
de vele tips! Jij maakte me wegwijs in het labo en vond altijd de tijd om vragen te
beantwoorden en verbeteringen aan te brengen.Verder wil ik ook prof. dr. Tom Boterberg
bedanken voor het bestralen van de cellen.
Bedankt ook aan Sofie, Jelle en Alexander die voor de aangename werksfeer zorgden op het
bureau. Sofie en Katia wil ik extra bedanken omdat jullie altijd paraat waren om hulp te
bieden bij flowcytometrie en sorteren. Imke, jij was het zonnetje van het labo. Ik wens je een
heel goede zwangerschap toe! Sarah, Jasmine en Stijn, ik bewonder jullie
doorzettingsvermogen en energie. Jasminen wil ik heel hard bedanken voor het nalezen van
mijn eerste versie. Stijn, jij gaf ons allemaal een duwtje in de goede richting als we er wat
sipjes bijliepen met jouw aanmoedigende woorden. Je was eveneens altijd paraat om zaken te
verduidelijken en me te leren werken met de FlowJo software.
Dacha, Laura, Elien en Soetkin: ik vond het heel fijn dat jullie ook in blok A stage liepen en
we onze ervaringen konden delen en elkaar konden steunen. Buiten UGent wil ik mijn lieve
vriendinnen Rosalia en Kim bedanken voor het luisterend oor en de momenten waarop jullie
me moed inspraken, toen het eens wat minder ging met de experimenten. Mama en papa,
jullie wil ik extra in de bloemetjes zetten, want voor jullie kom ik altijd op de eerste plaats.
Jullie helpen mij alles te relativeren en vooruit te kijken in het leven. Ten slotte wil ik mijn
vriend Musti ongelooflijk bedanken: jij bent mijn rots in de branding en gaf me het
zelfvertrouwen wanneer het tekort schoot.
Inhoud
Samenvatting .............................................................................................................................. 1
Summary .................................................................................................................................... 2
1
Inleiding .............................................................................................................................. 3
1.1
De werking van het humane immuunsysteem ............................................................. 3
1.2
T-cel ontwikkeling ....................................................................................................... 5
1.2.1
De vroege T-cel ontwikkelingsfasen .................................................................... 5
1.2.2
De selectiemechanismen ...................................................................................... 7
Positieve selectie ........................................................................................... 7
1.2.2.2
Negatieve selectie ......................................................................................... 8
1.2.2.3
Agonist selectie ............................................................................................. 8
1.2.3
Maturatie en migratie naar de periferie ................................................................ 9
1.2.4
T-cel activatie ..................................................................................................... 10
1.3
In vitro T-cel differentiatie ........................................................................................ 11
1.3.1
Notch pathway.................................................................................................... 11
1.3.2
Het OP9-DL1 model .......................................................................................... 12
1.4
Selectie in OP9-DL1 co-cultuur ................................................................................ 13
1.5
Immunotherapie ......................................................................................................... 13
1.5.1
Adoptieve T-cel transfer..................................................................................... 14
1.5.2
In vitro gedifferentieerde T-cellen uit hematopoëtische stam cellen ................. 16
1.5.3
Chimere antigen receptor gemodificeerde T-cellen ........................................... 17
1.6
2
1.2.2.1
Vraagstelling .............................................................................................................. 17
Materiaal en methoden ...................................................................................................... 18
2.1
Isolatie van CD34+ HSPCs ........................................................................................ 18
2.2
Cellijnen cultiveren.................................................................................................... 19
2.3
OP9-DL1 coculturen.................................................................................................. 20
2.4
Flowcytometrie en sorteren van de cellen ................................................................. 20
3
2.5
T-cel expansie ............................................................................................................ 21
2.6
CellTrace proliferatie assay ....................................................................................... 22
2.7
Activatie-assay .......................................................................................................... 22
2.8
Chroom release assay ................................................................................................ 22
2.9
Limiting dilution assay .............................................................................................. 23
Resultaten .......................................................................................................................... 24
3.1
Fenotype van de spontaan gematureerde T-cellen in OP9-DL1 co-cultuur .............. 24
3.2
Analyse van de auto- en alloreactiviteit van de in vitro gematureerde T-cellen ....... 28
3.2.1
Aantonen van alloreactiviteit bij T-cellen uit PBMC......................................... 28
3.2.2
Aantonen van alloreactiviteit bij mature T-cellen uit PNT ................................ 31
3.2.3
Maturatie van immature in vitro gegenereerde T-cellen .................................... 34
3.2.4
Aantonen van allo- en autoreactiviteit bij in vitro gematureerde T-cellen ........ 36
3.3
3.2.4.1
T-cel activatie assay .................................................................................... 36
3.2.4.2
Cytotoxiciteit assays ................................................................................... 38
Kloneringsexperiment ............................................................................................... 40
4
Discussie ........................................................................................................................... 44
5
Besluit ............................................................................................................................... 46
6
Referenties ........................................................................................................................ 47
7
Bijlagen ................................................................................................................................ I
2
Samenvatting
Kankers vormen de tweede belangrijkste doodsoorzaak in België. Omdat voor vele tumoren
de combinatie van chirurgie, bestralings- en chemotherapie niet tot genezing leiden, wordt
volop verder onderzoek verricht naar alternatieve behandelingsstrategieën.
In deze masterproef staat de ontwikkeling van adoptieve T-cel therapie centraal. Specifiek
wordt gefocust op de in vitro ontwikkeling van mature CD8+ T-cellen uit humane CD34+
hematopoietische stam/progenitorcellen (HSPC) geïsoleerd uit een kinderthymus in een OP9DL1 cultuursysteem. De gerapporteerde experimenten hebben respectievelijk tot doel 1) de
ideale T-cel densiteit te bepalen in de co-cultuur, 2) na te gaan of T-cel maturatie kan
geïnduceerd worden door stimulatie met autologe en allogene B-cellijnen en 3) te bepalen of
er sprake is van autoreactiviteit van de in vitro gematureerde T-cellen. Om de in vitro
selectiemechanismen te kunnen vergelijken met de in vivo selectieprocessen werden in vivo
gematureerde thymocyten gebruikt als positieve controle. Aanvullend werden de resultaten
van een kloneringsexperiment gepresenteerd, waarbij zowel verse als geactiveerde PBMCs en
verschillende sera uitgetest werden.
Wat de T-cel densiteit betreft, bleek dat, ondanks de lagere celaantallen die verkregen werden
tijdens het verloop van de co-cultuur, toch de grootste populatie van DP, TCRαβ+, en mature
TCRαβ+ cellen werd gegenereerd in de hoge densiteit conditie.
De experimenten wezen verder uit dat T-cel maturatie kan waargenomen worden, maar niet
meer dan de achtergrond die in de negatieve controle conditie werd gezien.
Vervolgens werd autoreactiviteit van spontaan gematureerde cellen in co-cultuur bestudeerd
aan de hand van de activatiemerker CD137 met behulp van drie opeenvolgende T-cel activatie
assays. Op basis van deze analyses werd geen uitgesproken auto- of alloreactiviteit voor de in
vitro gematureerde T-cellen geobserveerd. Aangezien de voorgaande experimenten geen
sluitende conclusies toelieten over de autoreactiviteit van de co-cultuur T-cellen, werden twee
cytotoxiciteit-assays uitgevoerd op zowel in vitro als in vivo gematureerde thymocyten.
Hieruit kon besloten worden dat de in vitro gematureerde thymocyten zowel autoreactieve als
alloreactieve karakteristieken vertoonden. De in vivo gematureerde thymocyten aangerijkt
voor zowel de SPS, JY als autologe KT BCL vertoonden geen autoreactiviteit, maar wel wat
alloreactiviteit op basis van het chroomexperiment.
Het kloneringsexperiment wees ten slotte uit dat de beste groei waargenomen werd voor de
PBMC in aanwezigheid van 20% FCS.
1
Summary
Background
In this study we investigate how hematopoietic stem cells (HSC) isolated from a postnatal
thymus and grown in vitro on OP9-DL1 stromal cells mature and whether they show
autoreactivity. In vivo double positive T cells, when facing a strong antigen stimulus, are
eliminated due to negative selection. In vitro however, recent evidence based on TCRtransduced human HSC suggests that these cells survive due to agonist selection. The main
purpose of this study is to investigate whether spontaneous in vitro maturation is also driven
by a strong antigen stimulus. If agonist selection is the case, these cells should display
autoreactivity.
Methods
Cell trace assay was done to assess the proliferation capacity of the immature in vitro
generated T cells after stimulation with autologous and allogeneic B cell lines (BCL).
Flowcytometric analysis for CD137 was used to evaluate the specificity of spontaneously
matured T cells in coculture. In addition, chrome assays were implemented to measure the
cytotoxicity of these T cells.
Results
T cell maturation was observed in the presence of both autologous and allogeneic BCL.
However, the intensity of maturation did not exceed that of the cells lacking stimulation.
Based on the chrome release assay autoreactivity as well as alloreactivity of the in vitro
generated T cells was observed. However the results were not replicated in the CD137 assays.
Conclusions
Stimulation of spontaneously maturated T cells in vitro with BCL revealed both auto and
alloreactivity, so not all of the mature cells were agonist selected.
2
1
1.1
Inleiding
De werking van het humane immuunsysteem
Het immuunsysteem (IS) vertegenwoordigt alle cellen die de mens verdedigen tegen externe
schadelijke micro-organismen en maligne celtransformaties. Het immuunsysteem werkt in
twee fasen. De eerstelijnsverdediging wordt uitgevoerd door het aangeboren of innate IS.
Pathogenen worden eerst geconfronteerd met de fysieke barrières aanwezig in het lichaam,
zoals de mucus- en epitheellagen en cilia. Bij infectie van de weefsels wordt echter vooral
beroep gedaan op fagocyten (macrofagen, monocyten en neutrofielen), die de degradatie van
deze indringers tot stand brengen. Hiernaast zijn ook niet-cellulaire factoren van belang voor
de innate immuunrespons. Ook NK-cellen en cellen die inflammatoire mediatoren secreteren,
zoals basofielen, mastcellen en eosinofielen, zijn actief in deze fase (1). De innate IS treedt
snel in werking maar draagt niet bij tot het immunologische geheugen en daardoor blijft de
reactie bij een latere confrontatie met het antigen (Ag) ongewijzigd (2).
Wanneer het innate IS de infectie niet onder controle krijgt, treedt het specifieke adaptieve
immuunsysteem in werking. Hoewel het adaptieve IS trager geactiveerd wordt, genereert het
wel langlevende geheugencellen. De adaptieve immuunrespons start in de secundaire
lymfoïde weefsels en wordt gestuurd door de T- en B-cellen. Deze lymfocyten expresseren
receptoren op hun celoppervlak die specifiek antigenen kunnen herkennen, de B-cel receptor
(BCR) en T-cel receptor (TCR) respectievelijk (1). De T- en B-cellen worden op
verschillende plaatsen in het lichaam gegenereerd. Zo vindt de ontwikkeling en maturatie van
B-cellen plaats in het beenmerg terwijl de voorlopers van T-cellen eerst migreren naar de
thymus vooraleer hun ontwikkeling kan plaatsvinden (1, 2). Het aantal specifieke lymfocyten
in het lichaam is beperkt waardoor T- en B-cellen genoodzaakt zijn te circuleren in het
lichaam om zo meer kans te maken hun specifiek Ag te herkennen. Om geactiveerd te
worden, moeten ze nl. Ag presenterende cellen (APC) tegenkomen (3). Het immuunsysteem
bevat maar een beperkt aantal gespecialiseerde APC. Dit zijn de dendritische cellen (DC),
macrofagen en B-cellen. Opdat de T-cel geactiveerd zou kunnen worden moet naast de
microbiële structuur ook een lichaamseigen component herkend worden. Deze functie wordt
vervuld door de major histocompatibility complex (MHC) molecule (ook gekend als human
leukocyte antigen (HLA) molecules). MHC klasse I en MHC klasse II kunnen onderscheiden
worden, die vervolgens nog eens extra opgedeeld kunnen worden in subgroepen (HLA-A,-B,C behorend tot klasse I en HLA-DP, DQ en DR behorend tot klasse II). MHC klasse II wordt
enkel geëxpresseerd op APC, terwijl MHC klasse I tot expressie komt op alle gekernde cellen
3
(1,3). Deze glycoproteïnes bevinden zich ondermeer op het oppervlak van de APC en zijn in
staat zowel endogeen gecodeerde zelf-Ag als extern gecodeerde pathogene Ag te presenteren
aan de T-cel in aanwezigheid van costimulatoire molecules. Het Ag wordt eerst intracellulair
proteolytisch gekliefd tot kleinere peptiden vooraleer het gepresenteerd wordt in de groeve
van een MHC molecule (4).
Er bestaat een groot gamma aan TCRs die elk specifieke Ag herkennen. De TCR wordt at
random gegenereerd in de thymus door somatische herschikkingen van de Variable (V),
Diversity (D) en Joining (J) segmenten van de TCRβ locus en de V en J segmenten van de
locus die coderen voor de TCRα-keten met behulp van recombinase activerende genen
(RAG1 en RAG2) (5). Elke herschikking verloopt op een unieke manier waardoor er een
divers functioneel receptor repertoire gegenereerd wordt. Door variatie of insertie van
nucleotiden aan de juncties waar de segmenten aan elkaar gelinkt worden, neemt de diversiteit
van de TCR toe (1, 2). T-cellen kunnen opgedeeld worden in TCRαβ T-cellen en in TCRγδ Tcellen al naargelang de ketens die ze expresseren (6). Interactie van de heterodimere CD3-γε,
CD3-δε, en homodimere CD3-ζ ketens met de TCR is van structureel belang voor het T-cel
receptor complex. De CD4 en CD8 coreceptoren spelen tevens een belangrijke rol tijdens de
T-cel ontwikkeling. De TCRαβ cellen kunnen enerzijds aanleiding geven tot CD4+ T-cellen,
die ook wel T-helper cellen genoemd worden. Ze ondersteunen B-cellen in het vormen van
AL en activeren macrofagen. Binnen de CD4+ T-cellen onderscheidt men Th1, Th2, Th17 en
T-regulatoire cellen (Tregs). Ze zijn in staat peptides te herkennen gepresenteerd door een
MHC klasse II molecule. Anderzijds ontstaan uit TCRαβ cellen ook CD8+ cytotoxische
cellen, die het Ag herkennen in de context van een MHC klasse I molecule. CD8+ T-cellen
kunnen viraal geïnfecteerde en maligne cellen doden. Dit gebeurt met behulp van perforines
en granzymes of is het gevolg van het binden van een Fas molecule op de geïnfecteerde cel
met het Fas ligand dat op de T-cellen geëxpresseerd wordt. In beide gevallen worden de
caspasen geactiveerd en zal apoptose optreden (1, 3).
De γδT-cellen vormen een populatie T-cellen die vooral aangetroffen worden in het epitheel
van de huid en in het gastro-intestinale stelsel waar ze een ondersteunende rol vervullen in de
mucosale immuniteit. Ze zijn niet strikt afhankelijk van een MHC molecule maar zijn in staat
om het Ag ofwel direct te herkennen ofwel na presentatie via een MHC-like molecule zoals
CD1 (2, 7). Ze zijn veel minder talrijk aanwezig in het lichaam dan de TCRαβ T-cellen (8).
Hun cytotoxische effector functie en de eerder lage reactiviteit tegen niet-getransformeerde
cellen maakt hen aantrekkelijk voor kanker immunotherapie, al dan niet in combinatie met
4
chemotherapie (7). Aangezien in deze masterproef het onderzoek wordt toegespitst op αβ Tcellen wordt niet dieper ingegaan op de γδT-cellen.
Voor T-cel activatie is naast de interactie van de TCR met het peptide-MHC-complex
eveneens een co-stimulatoir signaal vereist. Afwezigheid van co-stimuli geeft aanleiding tot
anergie of apoptosis (9). De voornaamste interacties zijn deze van CD28 en CD40 ligand
(CD40L) op de T-cel met B7-1 (CD80) of B7-2 (CD86) en CD40 op de APC (10). Er bestaan
evenwel nog andere vormen van co-stimulatie die behoren tot de ‘tumor necrosis factor’
(receptor) familie zoals CD27-CD70 binding, die een rol spelen in T-cel activatie, overleving
en expansie (11). Cytotoxic T lymphocyte-associated protein (CTLA4) is tevens aanwezig op
de T-cel en staat in competitie met CD28 om te interageren met B7 en zo T-cel activatie te
onderdrukken.
Deze
immuun
checkpoint
molecule
voorkomt
dat
langdurige
immuunresponsen schade toebrengen aan normale, gezonde weefsels (3, 10, 11, 12)
Figuur 1. Het two-signal-model voor T-cel activatie. Naast
de herkenning van het specifieke Ag door de TCR is een
tweede co-stimulatoir gemedieerd signaal noodzakelijk voor
efficiënte T-cel activatie. Wanneer dit tweede signaal afwezig
is wordt de cel geïnactiveerd of gedood. (Figuur
overgenomen uit Harlan, 1999).
Hoewel het innate en adaptieve IS elk een specifieke rol vervullen in het humane
afweersysteem is de interactie van beide noodzakelijk om afdoende bescherming te
garanderen. Het innate IS onderscheidt de schadelijke pathogenen van de onschadelijke of
zelfs voordelige microben en geeft deze informatie door aan het adaptieve IS. Excessieve
immuunresponsen gericht tegen lichaamseigen weefsels worden hierdoor vermeden (1).
1.2
T-cel ontwikkeling
T-cellen ondergaan verschillende differentiatiestappen alvorens ze hun functie kunnen
uitoefenen. De verschillende fasen worden hieronder besproken.
1.2.1 De vroege T-cel ontwikkelingsfasen
De migratie van hematopoëtische stam/progenitorcellen (HSPC) vanuit het beenmerg naar de
thymus is de eerste stap in het proces van de T-cel ontwikkeling. Eens de HSPC de thymus
bereiken verliezen ze de capaciteit om zichzelf te hernieuwen. Om de populatie aan T-cellen
in de thymus in stand te houden is dus een constante toevoer van T-cel progenitoren nodig
(13). T-cel ontwikkeling vergt de tussenkomst van thymus epitheliale cellen (TECs) (14). Dit
zijn stromale cellen voorzien van Notch liganden, die binden op de Notch receptor op de
HSPCs. Tijdens hun differentiatie zullen de T-cel precursoren bewegen doorheen alle regio’s
5
van de thymus onder invloed van verschillende chemokines. Zo migreren de T-cel
precursoren in het vroege ontwikkelingsstadium naar de buitenste subcapsulaire zone (SCZ)
waarna ze opnieuw bewegen door de cortex en zich finaal begeven naar de medulla. Hier
zullen de cellen matureren en 4 tot 5 dagen verblijven vooraleer ze de thymus verlaten (15,
16, 17).
Figuur 2. Schematische weergave van de humane T-cel ontwikkeling. De hematopoïetische
stam/progenitorcellen (HSPC) die vanuit het beenmerg (BM) of vanuit de foetale lever (FL) migreren naar de
thymus vertonen een CD34+CD38- fenotype. De immature dubbel negatieve (DN) cellen zijn de vroegste T-cel
progenitoren. Deze cellen verwerven de expressie van CD7 op hun celoppervlak waarna competitieve
herschikkingen van de TCR β-, γ-, en δ-genen doorgaan. Wanneer de cellen vervolgens CD1a+ opreguleren
worden ze beperkt om enkel nog verder te ontwikkelen langs de T-cel-pathway (commitment), waarbij ze verder
nog over de mogelijkheid beschikken zowel tot TCRαβ+ als tot TCRγδ+ T-cellen te differentiëren. De
thymocyten die erin slagen op productieve wijze hun β-keten te herschikken (β-selection) zullen beide coreceptoren CD4 en CD8 expresseren (dubbel positieve (DP) cellen). Na positieve selectie matureren de DP
thymocyten tot ofwel CD4+ helper MHC-II gerestricteerde (CD4 SP) ofwel CD8+ cytotoxische MHC-I
gerestricteerde (CD8 SP) single positieve T-cellen. NK: Natural Killer cellen. (figuur overgenomen uit Plum et
al., 2008)
De T-cel ontwikkeling wordt gekenmerkt door opeenvolgende stadia waarin de thymocyten
genetische transformaties ondergaan en verschillende celoppervlaktemerkers tot expressie
brengen (6, 18). De vroegste T-cel precursoren die de thymus binnenkomen ter hoogte van de
cortico-medullaire junctie expresseren geen co-receptoren CD4 of CD8. Ze worden dubbel
negatieve (DN) T-cellen genoemd (15). Deze uiterst immature cellen zijn CD34+CD38CD45RA+CD7- en worden gekenmerkt door de afwezigheid van lineage-specifieke merkers
(Lin-) (19). Zoals in figuur 2 is weergegeven zullen de T-cel progenitoren bij opregulatie van
CD7 het potentieel verliezen om verder te ontwikkelen tot andere celtypes dan T- of NKcellen (20, 21). Deze cellen evolueren onder invloed van NOTCH1 tot een pre-T1 cel die
6
CD1a zal opreguleren. Vanaf dit punt zal T-cel commitment doorgaan waardoor de
progenitoren niet meer kunnen differentiëren tot andere celtypes (6, 18, 21, 22).
Deze precursoren kunnen nog steeds ontwikkelen tot zowel αβ als γδ T-cellen. Volgens het
instructieve model herschikken de thymocyten op competitieve wijze hun δ, γ en β-loci.
Wanneer een cel de δ en γ locus eerst succesvol herschikt, dan ontstaan TCRγδ+CD3+-cellen
(8). Wanneer de β-keten in frame herschikt wordt, dan wordt een pre-TCR gegenereerd door
associatie van de TCRβ-keten met een surrogaat TCRα-keten, pTα. Ten gevolge β-selectie
zullen cellen met een functioneel herschikte β-keten geselecteerd worden om hun
ontwikkeling verder te zetten langs de α/β-pathway (23). Tijdens β-selectie zullen de cellen de
co-receptor CD4 induceren op hun celoppervlak. Ze worden dan CD4+ immature positieve
cellen (CD4 ISP) genoemd. β-selectie is niet strikt gebonden aan één specifiek
ontwikkelingsstadium van de T-cel: dit proces kan reeds een aanvang nemen in de
CD34+CD1a+ fase maar gaat vooral door in de CD4 ISP fase (13, 18). Na β-selectie zal
proliferatie optreden en worden TCRα locus herschikkingen geïnduceerd. Vervolgens
ontwikkelen de cellen tot het CD4+CD8α+CD8β-CD3- early dubbel positive (EDP) stadium
waarbij ze nog steeds de mogelijkheid bezitten te ontwikkelen tot γδ T-cellen. In een
volgende fase worden de cellen CD4+CD8α+CD8β+CD3- dubbel positieve (DP) T-cellen, die
beperkt zijn tot het αβ fenotype. Wanneer alle herschikkingen succesvol doorlopen zijn, dan
zal een endogene TCRαβ tot expressie gebracht worden en CD3 opgereguleerd worden (6,
14). Deze DP cellen hebben een korte levensduur. Eens ze een TCR-signaal ontvangen, dan
stopt het recombinatieproces en is de aanwezigheid van een Ag bepalend voor hun
voortbestaan (3, 24).
1.2.2 De selectiemechanismen
1.2.2.1 Positieve selectie
De somatische herschikkingen van de TCR-ketens resulteren in een groot gamma aan TCR
die echter niet allen bruikbaar zijn. Om de autoreactieve en nutteloze T-cellen te elimineren
worden de DP cellen tijdens het eind-maturatieproces onderworpen aan selectieprocessen. De
meeste DP T-cellen vertonen een TCRαβ op hun celoppervlak die niet in staat is te binden
met MHC molecules. Als gevolg daarvan sterven ze door gebrek aan overlevingssignalen
(‘death by neglect’). Slechts weinig DP T-cellen vertonen een intermediaire affiniteit voor
lichaamseigen peptiden gepresenteerd via MHC molecules op corticale thymus epitheliale
cellen (cTEC). Enkel deze DP T-cellen zullen na positieve selectie in de thymuscortex in staat
zijn verder te differentiëren en te matureren (1, 14, 25, 26) .
7
1.2.2.2 Negatieve selectie
De T-cellen met een hoog-affiene TCR worden vervolgens in de medulla geëlimineerd als
gevolg van negatieve selectie (1, 14, 18, 25, 26) (Figuur 3). De medullaire epitheliale cellen
(mTECs) en de dendritische cellen (mDC) spelen hierbij een centrale rol. Zij controleren voor
autoreactiviteit door lichaamseigen eiwitten, die normaal enkel tot uiting komen in de perifere
weefsels (zoals insuline), tot expressie te brengen onder de controle van de transcriptiefactor
autoimmune regulator (AIRE) (17, 27).
Figuur 3. Selectie van mature T-cellen uit
thymocyten.
CD4+CD8+
DP
thymocyten
expresseren αβT-cel-receptoren die nog geen
selectieproces ondergaan hebben. Wanneer de
αβTCR er niet in slaagt het peptide-MHC complex
te herkennen zullen deze DP cellen sterven door
gebrek aan overlevingssignalen (‘death by neglect’).
Negatieve selectie treedt op wanneer de DP cellen
een αβTCR expresseren die zelf-peptide-MHC
liganden hekennen met hoge affiniteit, wat leidt tot
apoptose van de cellen.Wanneer de TCR echter een
lage affiniteit vertoont voor zelf-peptide/MHC
liganden zal positieve selectie doorgaan waardoor
de cellen zullen overleven en matureren tot CD4+ of CD8+ SP thymocyten. Deze SP cellen zullen de thymus
verlaten en migreren naar de perifere lymfoïde organen. Hierdoor worden zelf-reactieve thymocyten
geëlimineerd en wordt een groot repertoire perifere T-cellen gegenereerd die zowel zelf-MHC gerestricteerd als
zelf-tolerant zijn. (Figuur overgenomen uit Palmer, 2003).
Het staat nog niet vast of de aanwezigheid van costimulatoire signalen vereist is voor
efficiënte negatieve selectie (24). Het negatieve selectie proces kan eveneens doorgaan in de
cortex maar aangezien de cTEC geen co-stimulatoire molecules tot expressie brengen zijn
deze minder performant dan de APC (26).
1.2.2.3 Agonist selectie
Negatieve selectie van zelf-specifieke T lymfocyten in de thymus is cruciaal voor het
vermijden van auto-immuun reacties. Toch werden een aantal T-cel subsets geïdentificeerd
die, ondanks dat ze een grote affiniteit vertonen voor lichaamseigen peptides, het negatieve
selectieproces kunnen omzeilen en hierdoor ontsnappen aan eliminatie. Sommige T-cellen
volgen dus een alternatieve pathway die in de literatuur aangeduid wordt als “agonist
selectie”. Deze bijzondere cellen zijn de CD4+CD25+ en Foxp3+ natural regulatory (nTreg)
cellen, de CD1d reactieve natural killer T-cellen met een invariante TCRα keten (iNKT), de
natural T helper 17 (nTh17) cellen, en tenslotte ook de CD8αα+ TCRαβ+ intra-epitheliale Tcellen (IEL) (24, 28).
Deze laatste groep betreft een van de meest voorkomende types van T-cellen, die vooral
gesitueerd worden in de mucosa van de dunne darm (28, 29, 30). Deze lymfocyten werden
8
vooral bestudeerd in muizen. Ze beschermen de mucosale barrière zowel tegen vreemde
pathogenen als tegen excessieve of onnodige inflammatoire immuunresponsen (31). In de
muis wordt een onderscheid gemaakt tussen twee soorten IELs, enerzijds de ‘geïnduceerde’
IELs (iIEL) en anderzijds de ‘natuurlijke’ IELs (nIEL). De iIELs zijn afkomstig van
conventionele T-cellen die in de thymus de klassieke selectieprocessen ondergaan en na
migratie uit de thymus geactiveerd worden door perifere Ag. Hierdoor verwerven ze de
capaciteit om naar de darm te migreren onder invloed van chemokine receptoren en
integrines. Als gevolg van negatieve selectie tijdens hun ontwikkeling in de thymus vertonen
deze iIELs geen autoreactieve TCR meer (30). Met betrekking tot de nIELs is aangetoond dat
deze geëvolueerd zijn in de thymus uit DP cellen (31). De positief geselecteerde DP cellen
onderdrukken de expressie van de CD8 co-receptor waardoor ze in een intermediaire fase
terecht komen. Pobezinsky et al. suggereerden dat door afwezigheid van CD28 co-stimulatie
de thymocyten kunnen ontsnappen aan clonale deletie (24). De cellen zijn hier echter niet
meer in staat de ontwikkeling verder te zetten van DP tot conventionele SP T-cellen maar
beschikken wel nog steeds over het potentieel om een ander ontwikkelingsproces te
ondergaan. Deze cellen zullen als reactie op een agonist peptide differentiëren tot anergische
thymocyten. In tegenstelling tot conventionele T-cellen zullen ze geen co-receptoren meer
expresseren maar wel CD69 wat aangeeft dat ze in een partieel geactiveerde status verkeren
(28). Na het verlaten van de thymus migreren deze cellen preferentieel naar de darm waar ze
onder invloed van IL-15 zowel Runx3 als CD8α opreguleren en verder differentiëren tot
CD8αα+ IELs. Deze onconventionele cellen vertonen een verminderde functionaliteit. Hun
autoreactieve capaciteit neemt af door de afwezigheid van de co-receptoren, die normaal
bijdragen aan de TCR-signalisatie, en door de expressie van negatieve co-stimulatoire
receptoren zoals PD-1 (24). Bovendien zullen homodimeren van de CD8α co-receptor
(CD8αα) ook het kinase LCK onttrekken aan de TCR waardoor tevens de autoreactieve
capaciteit van de IELs verder vermindert (24, 31).
1.2.3 Maturatie en migratie naar de periferie
Door middel van de positieve en negatieve selectieprocessen worden enkel functionele Tcellen gegenereerd die zowel MHC-gerestricteerd als zelf-tolerant zijn. Dit kleine aantal
overblijvende naïeve T-cellen (ca. 5%) zal prolifereren en vervolgens uitrijpen van DP tot
single positieve (SP) cellen die enkel één van beide co-receptoren zullen expresseren,
namelijk helper CD4 SP of cytotoxische CD8 SP cellen. Hierbij is het belangrijk dat er T-
9
cellen gevormd worden waarbij de TCR en co-receptor dezelfde affiniteit vertonen voor hun
MHC molecule (1, 2, 4, 14).
Brugnera et al. toonden aan dat de DP cellen tijdens dit proces initieel de transcriptie van CD8
beeïndigen en een intermediair CD4+CD8low fenotype verwerven. Onder invloed van IL-7
kunnen deze cellen toch nog ontwikkelen tot CD8+ T-cellen door CD4+ transcriptie te
onderdrukken. Dit wordt “co-receptor reversal” genoemd. Wanneer echter TCR-signalisatie
blijft doorgaan wordt dit proces geblokkeerd en zullen de cellen verder ontwikkelen tot CD4+
T-cellen (32, 33). Hiernaast werden tevens de sleuteltranscriptiefactoren, die de uiteindelijke
bestemming van de T-cel beïnvloeden, in kaart gebracht. De transcriptiefactor Runt-related
transcription factor 3 (Runx3) is nl. noodzakelijk voor de generatie van CD8+ T-cellen terwijl
de Th inducing POZ kruppel factor (ThPOK) betrokken is bij de generatie van CD4+ T-cellen
(27, 33, 34). ThPOK zou voorafgegaan worden door GATA3 expressie en is hiervoor
afhankelijk voor de activatie van genen specifiek voor T-helper cellen. Het is dan aan ThPOK
om deze lineage keuze te bevestigen door opregulatie van Runx3 te antagoneren en CD4
onderdrukking op te heffen (35).
Figuur 4. Het kinetische model van CD4/CD8lineage keuze. Tijdens positieve selectie beëindigen
de DP thymocyten onafhankelijk van hun MHCspecificiteit CD8 gen transcriptie. De CD4 gen
transcriptie blijft onveranderd. Hieruit resulteert een
intermediaire
CD4+CD8low
celpopulatie.
Dit
celstadium bepaalt tot welke lineage de cel verder zal
ontwikkelen.
Aangehouden
TCR
signalisatie
blokkeert
interleukine-7
(IL7)-gemedieerde
signalisatie waardoor mature CD4+ SP T-cellen
gevormd worden terwijl verstoring van de TCR
signalisatie net IL7-afhankelijke co-receptor reversal
toelaat en resulteert in CD8+ SP T-cellen. (figuur
overgenomen uit Singer et al., 2008)
Tijdens maturatie worden de T-cellen gekenmerkt door een verhoogde expressie van CD69 en
CD27. Wanneer vervolgens de expressie van CD1a verloren gaat kan er gesproken worden
over functionele mature T-cellen (36). Opregulatie van CD27 bevestigt finaal de CD4 dan wel
de CD8 lineage. Hierna worden de cellen CD45RA+ vooraleer ze opnieuw CD69 expressie
verliezen (18). Deze naïeve mature T-cellen zullen nadien de thymus verlaten en migreren
naar secundaire lymfoïde organen, zoals de lymfeknopen, onder invloed van homing
receptoren (CD62L en CCR7) (37).
1.2.4 T-cel activatie
Wanneer de TCR bindt aan het peptide-MHC complex op de APC in de lymfeknoop wordt de
T-cel geactiveerd. De T-cellen differentiëren vervolgens tot effector cellen. De eerste stap in
10
deze signaalcascade is de fosforylatie van zowel de tyrosine-gebaseerde activatie motieven
(ITAM) in de cytoplasmatische domeinen van de CD3 receptoren als ZAP70, door de kinasen
Lck en Fyn, behorende tot de Src familie kinasen (SFK). Fosforylatie van het activerende
tyrosine residu aanwezig in het katalytische domein van het kinase zal resulteren in een open
conformatie van het kinase waardoor het geactiveerd wordt. Vervolgens zorgt ZAP70 voor
activatie van linker for activation of T-cells (LAT). Met behulp van adaptor- en
signaalmolecules zullen downstream drie signaalpathways geactiveerd worden, nl. de
Calcium-gemedieerde signaal pathway, de MAPK-extracellular signal-regulated kinase
(ERK) en de nuclear factor-κB (NF-κB) pathway (38, 39). Transcriptionele activatie van
genen, belangrijk voor T-cel groei en differentiatie, vindt vervolgens plaats (2).
Om complete T-cel activatie te bekomen is contact tussen de TCR en zijn ligand gedurende
meerdere uren vereist. Om immuunpathologieën te voorkomen, moet de T-cel signalisatie op
een perfect gecoördineerde manier verlopen en de terugkoppelingsystemen, die de T-cel erna
opnieuw kunnen inactiveren, goed functioneren. (38, 39). Al deze activatieprocessen zullen
uiteindelijk leiden tot proliferatie en differentiatie tot effector T-cellen (TE). Deze cellen
verliezen de capaciteit om naar de secundaire lymfoide weefsels te migreren en zullen vooral
aangetrokken worden naar plaatsen van inflammatie in het lichaam (28). De terminaal
gedifferentieerde effector cellen zullen ofwel sterven door geprogrammeerde celdood ofwel
differentiëren tot CD45RO+ CD8+ geheugen cellen die bij een herhaalde infectie een
versnelde cytotoxische respons induceren. Er bestaan 2 populaties geheugen cellen namelijk
centrale memory T-cellen (TCM) en effector memory T-cellen (TEM), die een lagere
proliferatiecapaciteit vertonen (40).
1.3
In vitro T-cel differentiatie
1.3.1 Notch pathway
Notch signalering is vereist voor het induceren van T-cel onwikkeling en de generatie van een
functionele TCR-β keten (15, 41, 42, 43). In zoogdieren komen 4 verschillende Notch
celoppervlakte receptoren voor en zijn ook verschillende liganden bekend waaronder DeltaLike-1 (DL-1), DL-3, -4 en Jagged 1 en 2 (25).
De Notch-signaaltransductie wordt beschreven en geïllustreerd aan de hand van figuur 5
(overgenomen uit Bray, 2006 (44)). DL-1, geëxpresseerd door de stromale cellen zal binden
aan het extracellulaire domein van Notch1 receptor waardoor de Notch pathway geactiveerd
wordt. Hierna volgen er 2 fasen van klieving. De eerste klieving laat het extracellulaire
domein van de Notch receptor vrij en wordt gereguleerd door TNF a converting enzyme
11
(TACE). De tweede klieving wordt
gemedieerd
door
een
preseniline-
afhankelijk γ-secretase. Vervolgens
zal het intracellulair domein van de
Notch receptor (ICN) migreren naar de
nucleus waar het interageert met coactivator Mastermind-like protein 1
(MamL1) die op zijn beurt het corepressor complex zal verdrijven van
het
DNA-bindend
eiwit
CSL
(CBF1/RBPJk, Suppressor of Hairless, Lag-1). Dit resulteert in de transcriptie van Notchtarget genen, zoals Deltex 1, Nrarp, HES1, Notch3 (15, 18, 23, 43, 44).
Notch signalisatie speelt een rol op verschillende punten in de T-cel differentiatie pathway
(25). Notch is in eerste instantie belangrijk voor de T/B lineage beslissing (13, 16). Bij een
inductief signaal van Notch1 zal de bipotente T/B precursor tot een T-cel ontwikkelen. In
tweede instantie promoot Notch 1 de ontwikkeling van αβ T-cellen (45). Ingeval van een
zwak of afwezig signaal groeien de precursoren uit tot γδ T-cellen. Na de β-selectie wordt de
Notch pathway minder belangrijk voor latere differentiatie. De continue proliferatie onder
invloed van Notch signalisatie zou de cellulaire differentiatie mogelijk zelfs tegenwerken (19,
25). Notch signalisatie wordt toch ook in verband gebracht met de differentiatie tot CD4SP of
CD8SP cellen. Een sterk TCR signaal in positief geselecteerde cellen zou CD4 lineage
bevoordelen terwijl een zwak TCR signaal eerder CD8 cellen zou opleveren. Recentere
studies trekken de directe impact evenwel in twijfel (25, 46).
1.3.2 Het OP9-DL1 model
Tot 2002 werd verondersteld dat het genereren van T-lymfocyten (lymphopoeisis) alleen maar
mogelijk was in de drie-dimensionele structuur van een intacte thymus. Op grond daarvan
werden fetal thymus organ cultures (FTOC) gekweekt. Dit zijn fetale thymische explants uit
muizen die worden gedepleteerd en waarin humane T-cel progenitor cellen geïntroduceerd
worden. Hieruit kon humane T-cel differentiatie in vitro bekomen worden (18). Het probleem
van deze aanpak is dat de cellen slechts in beperkte mate prolifereren. De differentiatie is
tevens technisch complex, duur en tijdsintensief (47).
Sinds 2002 wordt een complementair model geïmplementeerd, nl. het OP9-DL1 co-cultuur
systeem. Hiervoor worden OP9 stromale cellen, verkregen uit beenmerg van Op/Op muizen
12
deficiënt voor macrofaag colony stimulating factor M-CSF, gebruikt. Deze cellen
ondersteunen de differentiatie van verschillende types van cellen, behalve van T-cellen (48).
Door deze cellen te transduceren met het Notch ligand DL1 zullen ze Notch signalisatie
kunnen aansturen en bijgevolg T-cel differentiatie induceren (47). Naast Notch signalisatie is
de combinatie van lage niveaus van cytokine interleukine 7 (IL-7) met FMS-like tyrosine
kinase 3 ligand (Flt3L) en stamcelfactor (SCF) vereist voor de overleving, proliferatie en
differentiatie van de cellen (34, 49, 50).
Het in vitro OP9-DL1 cultuur systeem laat toe om op efficiënte wijze TCRαβ+ DP T-cellen in
afwezigheid van het thymusorgaan te genereren uit HSPC geïsoleerd uit humaan beenmerg
(20), navelstrengbloed (19, 51), postnatale thymus (37, 52) of gemobiliseerd perifeer bloed
(37) (18, 53). Het OP9DL1-model heeft als voordeel dat het gebruik van foetaal materiaal of
dieren niet langer nodig is. Toch vertonen de T-cel precursoren een beperkte capaciteit om te
matureren. Doordat de OP9-DL1 cellen geen MHC klasse II tot expressie brengen zijn ze niet
in staat om efficiënte positieve selectie te genereren van CD4+ (15). Het blijft ook onduidelijk
of de resulterende CD8+ SP T-cellen dezelfde functionele eigenschappen bezitten en identieke
selectieprocessen ondergaan als in vivo mature CD8 T-cellen (52, 53).
1.4
Selectie in OP9-DL1 co-cultuur
Lang werd aangenomen dat cTEC de enige cellen waren in staat tot het induceren van in vitro
positieve selectie van CD4+CD8+ thymocyten (54). In het OP9-DL1 model ontbreken echter
TEC, die in vivo de selectieprocessen mediëren. Toch werden reeds mature SP TCRαβ+ Tcellen gevormd in OP9-DL1 cultuur. Hierdoor ontstond het vermoeden dat andere cellen de
selectie uitlokken. Specifiek werd gedacht aan de OP9-DL1 cellen die een lage expressie van
MHC klasse I en II vertonen of aan de DC waarvoor ook al aangetoond werd dat ze positieve
selectie induceren. Een tweede verklaring betreft kruispresentatie: de DP T-cellen kunnen
zelf-Ag presenteren aan de overige T-cellen aangezien ze MHC klasse I tot expressie brengen
op hun celoppervlak (34, 52). Ten slotte zou er ook sprake kunnen zijn van agonist selectie:
hoewel de T-celpercursoren een zelf-peptide-MHC complex herkennen, worden zij toch niet
geëlimineerd (28) (cfr.1.2.2.3).
1.5
Immunotherapie
De courante kankerbehandelingen zoals radio- en chemotherapie zijn vaak niet in staat om
tumorpatiënten te genezen en gaan gepaard met vele bijwerkingen. Daarom is er nood aan
immunotherapeutische benaderingen die een duurzame anti-tumorale respons induceren (55).
In het domein van de immunotherapie zoekt men vandaag nog steeds naar betere strategieën
13
met een zo laag mogelijke toxiciteit gericht op de verhoging van de anti-tumorale immuniteit.
Het immuunsysteem kan slechts in zeldzame gevallen de tumoren elimineren. Deze
immuundysfunctie is te wijten aan het feit dat de meeste tumor-Ag lichaamseigen zijn en dus
als gevolg van negatieve selectie het aantal tumor-antigen reactieve T-cellen in de thymus erg
gereduceerd wordt. Het merendeel van de resterende cellen in de thymus zal dus een zwakke
TCR-affiniteit vertonen voor zelf-tumor-antigenen. Dit obstakel dient overwonnen te worden
om tumoreliminatie te bekomen (56).
Twee verschillende vormen van immunotherapie kunnen onderscheiden worden, namelijk
actieve en passieve strategieën. Naast peptide- en DNA-vaccins wordt ook dendritische cel
vaccinatie ondergebracht bij actieve immunotherapie. Aangezien in deze masterproef T-cel
ontwikkeling in vitro centraal staat ligt de focus verder op passieve immunotherapie. In
tegenstelling tot actieve immunotherapie is de passieve behandeling niet gericht op het
verhogen van de reeds door de patiënt gegenereerde anti-tumorale immuunrespons. Daardoor
kan deze therapie ook ingezet worden bij immunodeficiënte patiënten. Bij passieve
immunotherapie worden concreet anti-tumor Al of tumor-reactieve lymfocyten toegediend
(57). Infusie van monoklonale Al laat toe te reageren tegen een specifiek zelf-Ag en
stimuleert de migratie van immuun effector cellen naar de plaats van de tumor. Recent wordt
ook onderzoek gedaan naar immuunmodulerende Al die specifiek de regulatoire signaalbanen
die anti-tumorimmuniteit verhinderen, omzeilen. Hiervoor komen zowel Al die inhibitoire
receptoren CLTA-4 en PD-1 antagoneren als costimulatoire receptoren activeren in
aanmerking (58).
1.5.1 Adoptieve T-cel transfer
Adoptieve T-cel transfer voorafgegaan door lymfodepleterende chemotherapie, is tot op
vandaag nog de meest efficiënte therapie om patiënten met solide tumoren zoals metastatische
melanoma te behandelen. Tumor-infiltrerende lymfocyten (TILs) worden uit de patiënt
geïsoleerd. Vervolgens worden ze ex vivo geëxpandeerd door toevoeging van IL-2 en CD3specifiek Al. In afwezigheid van het tumoronderdrukkend milieu genereert dit grote aantallen
tumor-reactieve T-cellen. Deze gestimuleerde cellen worden nadien terug in de patiënt
ingebracht en kunnen zo tumorgroei onderdrukken (55). Eerder toonden klinische studies in
40% tot 72% van deze patiënten tumorregressie, waarbij 40 % van de behandelde personen
een complete tumorrespons ondervonden tot 7 jaar na aanvang van de therapie (59).
Deze techniek kent echter ook beperkingen. In eerste instantie blijft het een grote uitdaging
om grote aantallen tumor-reactieve T-cellen te genereren in vitro uit geïsoleerde TILs.
14
Hiernaast is het moeilijk om met deze techniek tumorregressie te induceren bij andere
kankertypes dan melanoma. Bovendien vertonen de geëxpandeerde CD8+ T-cellen geen naïef
fenotype meer en bevinden ze zich in een terminaal gedifferentieerd stadium. Hoewel er een
hogere anti-tumorale activiteit werd waargenomen in vitro kunnen de CD8+ T-cellen door
fenotypische en functionele veranderingen senescent en uitgeput geraken waardoor ze hun
effect niet meer kunnen uitoefenen in vivo. De generatie van grote aantallen early effector Tcellen met een hoge ‘fitheid’ blijft een van de grootste uitdagingen voor ACT (55, 60). TILs
kunnen enkel uit het tumorweefsel verkregen worden m.b.v. een invasieve techniek en deze
gaat gepaard met een hoog risico op morbiditeit, zeker indien de tumoren zich bevinden op
chirurgisch moelijk bereikbare plaatsen (zoals de longen of pancreas) (61).
Figuur 6. Adoptieve T cel therapie voor metastatisch melanoma. Ag-specifieke T-cellen kunnen op
verschillende manieren uit de patiënt verkregen worden. (A) Tumor-infiltrerende lymfocyten kunnen geïsoleerd
worden uit tumorweefsel van de patiënt en geëxpandeerd worden ex vivo in de aanwezigheid van IL-2. De
geselecteerde tumor-reactieve TILs worden verder geëxpandeerd (“rapid expansion protocol”) door middel van
anti-CD3 activatie, IL2 en bestraalde PBMC feeder cellen. Een week voor de TIL-infusie worden de endogene
lymfocyten in de patiënt gedepleteerd door behandeling met chemotherapeutische agentia om plaats te maken
voor de TILs. (B) perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) kunnen op verschillende manieren
gemodificeerd worden om tumor-Ag-specifieke T-cellen te verkrijgen. (i) CD4+ of CD8+T-cellen kunnen
geactiveerd worden door Ag presenterende cellen die het tumor-Ag aanbrengen. (ii) Hiernaast kan ook een hoogaffiene T-cel receptor, die een specifiek tumor Ag herkent, getransduceerd worden in deze T-cellen. (iii) De
meest recente toepassing is de tranductie van een chimere antigen receptor (CAR) in de T-cellen. Zowel de Aggeactiveerde als genetisch gemodificeerde PBMCs worden verder een aantal weken geëxpandeerd om voldoende
cellen te verkrijgen voor adoptieve tranfer. (Figuur overgenomen uit Lizée et al., 2013)
Om deze problemen te omzeilen kunnen autologe T-cellen, bekomen uit perifeer bloed van de
patiënt, genetisch gemodificeerd worden voor adoptieve transfer waardoor ze een betere antitumorale efficaciteit verkrijgen. Zowel introductie van hoog-affiene TCR als chimere antigen
receptoren (CAR) met de gewenste specificiteit bleek een succesvolle strategie in klinische
studies (62). In tegenstelling tot TIL-therapie kunnen de lymfocyten eenvoudig uit het bloed
15
gehaald worden wat de therapie minder invasief maakt. De eerste studies waar patiënten
behandeld werden met autologe T-cellen getransduceerd met MART-1-reactieve TCR of
gp100-reactieve TCR leidden tot positieve klinische resultaten. Tevens bleek het risico op
toxiciteit niet denkbeeldig: de T-cellen veroorzaakten immers gehoorverlies, uveïtis en huid
rash bij sommige patiënten (63). Hiernaast verkreeg men op basis van TCR-getransduceerde
T-cellen ook klinische veelbelovende resultaten bij patiënten met synoviaal cel sarcoom, een
niet-melanoma tumor (61, 64).
Een groot nadeel van deze techniek is echter dat de ingebrachte TCRα- en β-ketens kunnen
recombineren met de respectievelijke α- en β- ketens van de endogene TCR, wat mispairing
kan veroorzaken en tot TCR’s kan leiden met een ongekende specificiteit (65). Mispairing
wordt in diverse studies in verband gebracht met verlaagde functionele activiteit van de Tcellen. Hoewel recent wel technieken ontdekt zijn om deze problemen te vermijden (zoals
uitwisseling van de constante domeinen van de humane TCR-ketens met deze van de muis)
kan dergelijke mispairing toch niet helemaal uitgesloten worden. Tevens vereist adoptieve
celtherapie massieve ex vivo expansie, wat opnieuw kan leiden tot verzwakking en uitputting
van de T-cellen (60). Hematopoetische stamcellen kunnen voor een aantal van deze
problemen een oplossing bieden.
1.5.2 In vitro gedifferentieerde T-cellen uit hematopoëtische stam cellen
Door de ontwikkeling van een in vitro OP9DL1 cultuur systeem werd het mogelijk om
mature T-cellen in afwezigheid van het thymusorgaan te genereren uit HSPC (15). Met dit in
vitro systeem kunnen nu tumor-specifieke TCR ketens getransduceerd worden in CD34+
HSPC waarna T-cel differentiatie doorgaat. Het is belangrijk om herschikte TCRα- en βketens in een vroeg stadium van T-cellen tot expressie te brengen. Hierdoor wordt expressie
van de Rag-genen onderdrukt waardoor de endogene TCR ketens niet of minder herschikt
worden. Op deze manier wordt het fenomeen van mispairing omzeild (47, 55). Een
bijkomend voordeel van TCR-gemodificeerde HSPC in vitro is dat ze geen uitputting
vertonen en er gecontroleerd kan worden in welke mate het TCR construct perfect ingebouwd
werd in de HSPC. Hierdoor zal er meer zekerheid zijn over de veiligheid van de klinische
toepassingen. Doordat in vitro gematureerde T-cellen uit HSPC geen afstotingsverschijnselen
oproepen na transfer in de patiënt zijn deze cellen eveneens aantrekkelijk voor de
therapeutische behandeling van immunodeficiëntie bij patienten die stamcel transplantatie
ondergingen (34).
16
1.5.3
Chimere antigen receptor gemodificeerde T-cellen
Tenslotte worden binnen de immunotherapie chimere antigen receptoren (CAR) ontwikkeld
(CAR) die het meest succesvol gebleken zijn in de strijd tegen haematologische kankers.
Deze CARs combineren het Ag-bindend domein van het variabel fragment van een
monoclonaal tumor specifiek antilichaam (scFv) met een signaaltransductie component van
de TCR (CD3-ζ)(66). Een voordeel van deze techniek is dat CAR T-cellen het tumor-Ag op
een niet-MHC gerestricteerde wijze kunnen herkennen. Dit voorkomt dat tumorcellen die hun
MHC molecule neer reguleren ontsnappen aan het immuunsysteem (67, 68). Een limitatie aan
de eerste generatie CARs was hun beperkte capaciteit om in vivo te expanderen en hun
functionele activiteit te behouden, waardoor ze de T-cellen niet ten volle konden activeren
(69). Om deze tekortkoming te omzeilen werden de signaaldomeinen van costimulatoire
moleculen zoals CD28, OX40, 41BB in de CARs ingebracht (65, 70). Deze tweede en derde
generatie CARs leidden tot betere cytokine secretie, cytotoxiciteit en klonale expansie na
contact met een tumor (71).
CAR therapieën kunnen evenwel ook gepaard gaan met koorts en cytokine storm, wat reeds in
twee verschillende humane klinische trials tot de dood geleid heeft van patiënten (72, 73). Er
dient verder onderzoek gedaan te worden naar een dosis die veilig is maar waarbij de CAR Tcellen niet inboeten op efficaciteit. Tevens zijn de toepassingsmogelijkheden beperkt omwille
van het feit dat de CAR T-cellen enkel AG herkennen die geëxpresseerd worden op het
oppervlak van de tumor. Daardoor kunnen intracellulaire melanoma tumor-AG zoals gp100
en MART-1 niet getarget worden. Het grootste gevaar van CAR T-cel transfer is dat de CAR
T-cellen het tumor Ag herkennen op normale cellen of crossreactiviteit vertonen met een
gelijkaardig Ag (61). Daarom moet men voorzichtig te werk gaan bij de keuze van het Ag
target en enkel selecteren voor die Ag die geëxpresseerd worden op tumoren of op niet-vitale
weefsels (67, 68). Het meest recente onderzoek tracht nu, met behulp van CAR-transductie,
functionele T-cellen te genereren uit HSPC in vitro (68).
1.6
Vraagstelling
In vivo wordt aangetoond dat dubbel positieve (DP) T-cellen onder invloed van een sterke Ag
stimulus negatieve selectie zullen ondergaan en bijgevolg geëlimineerd worden. In vitro stelt
men echter vast dat de in co-cultuur gedifferentieerde DP cellen overleven en zelfs matureren
na stimulatie met een hoge-affiniteits peptide (37). Wanneer een sterke TCR stimulus in vitro
leidt tot maturatie, dan kan men verwachten dat de spontaan gematureerde cellen autoreactief
zullen zijn. In deze masterproef wordt daarom ingegaan op de volgende probleemstelling:
17
Vertonen mature T-cellen, die in vitro gegenereerd werden uit HSPC op OP9-DL1 culturen,
auto- of alloreactiviteit na stimulatie met geïmortaliseerde B-cellijnen (BCL)?
Om dit te onderzoeken worden verschillende assays opgezet waarbij de T-cellen gestimuleerd
worden door zowel autologe als allogene BCL. Deze cellijnen brengen nog steeds eigen HLA
en costimulatoire molecules tot expressie en zullen een antigen presenteren aan de T-cellen.
Eerst wordt de maturatie en proliferatie van de immature T-cellen geanalyseerd aan de hand
van een Cell trace assay. Auto- en alloreactiviteit van de spontaan gematureerde T-cellen in
vitro wordt in eerste instantie bestudeerd aan de hand van activatiemerkers. In tweede
instantie wordt de cytotoxiciteit van de CD8+ T-cellen vastgesteld m.b.v. een chrome release
assay. PBMC en mature thymocyten, verkregen uit de thymus van dezelfde patiënt, worden
als controle conditie meegenomen. De vergelijking van de in vitro en in vivo condities in de
hiervoor genoemde experimenten, zou dan moeten toelaten een uitspraak te doen over de in
vitro selectieprocessen.
Tevens zal worden nagegaan in welke densiteit de T-cellen op de platen in co-cultuur kunnen
gebracht worden op een optimale celgroei te verkrijgen. Ten slotte, zal een
kloneringsexperiment opgezet worden met verse en geactiveerde PBMCs om de accuraatheid
van het sorteringsproces door de sorter te evalueren.
2
2.1
Materiaal en methoden
Isolatie van CD34+ HSPCs
Humane CD34+ HSPC werden geïsoleerd uit een postnatale thymus (PNT) van kinderen die
cardiale chirurgie ondergingen in het Universitair Ziekenhuis Gent (UZGent). Informed
consent werd bekomen conform de Declaratie van Helsinki en de richtlijnen van het Medisch
Ethisch Comité van het UZGent werden gerespecteerd. De thymus werd eerst verwerkt tot
een celsuspensie in Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM; Gibco, Life
TechnologiesTM, Carlsbad, Californië, USA) met 10% foetaal kalfsserum (FCS; Biochrome,
Berlijn, Duitsland) door middel van snijden met chirurgische mesjes en pletten met de zuiger
van een steriele spuit. Op basis van Ficoll densiteit gradiënt centrifugatie werden
mononucleaire cellen verkregen. Hierbij werd de celsuspensie aangelengd met phosphate
buffered saline (PBS; Lonza, BioWhittaker, Verviers, België) en onderaan de celsuspensie
werd lymfoprep (LP; 1,077 g/ml; Axis-Shield, Oslo, Noorwegen) gebracht onder een hoek
van 45°. De interfase werd afgenomen na 20 minuten centrifugatie (2300 rpm,
kamertemperatuur (KT), acc 3, rem 3) met een pasteurpipet, 2 maal gewassen met PBS en
geteld na verdunning in Türk-kleurstof (Merck Millipore, Darmstadt, Duitsland). Hierbij kan
18
een onderscheid gemaakt worden tussen de leukocyten en de rode bloedcellen (RBC), die
gehemolyseerd worden door het azijnzuur in de oplossing. Hiervoor werd een verdunning van
1 op 10 gebruikt om te tellen.
CD34+ cellen uit PNT werden vervolgens gelabeld met anti-CD34 microbeads en gezuiverd
met magnetische antilichaam cel sorteringskolommen (magnetically activated cell sorting
(MACS) CD34 microbead kit; Mylteni Biotec, Leiden, Nederland) tot een minimum 95%
pure CD34+ populatie, bevestigd door middel van flowcytometrie. Cellen werden eerst
geresuspendeerd in MACS buffer (PBS + 2% FCS en 1 mM EDTA) en vervolgens met Fc
Receptor blocking reagens en CD34 magnetische beads gelabeld. Na een wasstap met MACS
buffer werden de cellen over een kolom gebracht en onder invloed van een magnetisch veld
bleven de CD34+cellen aan de kolom gebonden. Voor mature T-cel isolatie uit dezelfde PNT
werd de doorloop CD34- fractie na MACS gecollecteerd en vervolgens gesorteerd op CD1a-.
De CD34+ cellen echter werden opgevangen nadat de kolom uit de magneet verwijderd werd
door spoelen van de kolom.
Om geïmortaliseerde B-cellijnen (BCL) te genereren werden de thymuscellen 1 dag na LP in
Roswell Park Memoral Institute Medium (RPMI; Gibco, Life TechnologiesTM, Carlsbad,
Californië, USA) met 10% FCS, streptomycine, penicilline en L-glutamine gebracht. 2,5 ml
Epstein-Barr virus (EBV) bevattend supernatant uit B95-8 cellen werd vervolgens toegevoegd
aan de cellen. Na 2 uur incubatie in het 37° warm waterbad werden medium met het lectine
phytohaemagglutinine (PHA; Remel, Dartford, UK) toegediend. Hierna werd de celsuspensie
verdeeld over een 24-well plaat. Het medium werd om de 4 dagen ververst. Na 25 dagen werd
expressie van CD3 en CD19 nagegaan door middel van flowcytometrische analyse. Expressie
van CD3 ging verloren en enkel de cellen positief voor CD19 bleven over. De verkregen BCL
werd vervolgens in kweek gehouden.
2.2
Cellijnen cultiveren
De OP9-DL1 cellijn werd verkregen van Prof. Dr. E.V. Rothenberg (California Institute of
Technology, Passadena, USA). Deze cellijn, afkomstig van beenmerg uit op-muizen, werd
genetisch gemodificeerd om humaan notch ligand delta-like1 (DL1) tot expressie te brengen.
Minimim Essential Medium alpha (MEM-α; Gibco, Life TechnologiesTM, Carlsbad,
Californië, USA), aangerijkt met 20% FCS, 100 IU penicilline/streptomycine (PenStrep) en
100 IU L-glutamine (alles: Gibco, Life TechnologiesTM, Carlsbad, Californië, USA) werd
gebruikt om de cellen in kweek te houden. De OP9-DL1 cellen werden 3 keer per week
geoogst en gesplitst met trypsine (Lonza, BioWhittaker, Verviers, België) wanneer ze een
19
densiteit van 80 à 90% bereikten en werden geoogst elke 2 à 3 dagen. Hierna werden ze
geteld en standaard aan 2 x 105 cellen in een T175 fles (BD bioscience) gebracht. Wanneer na
het maken van de OP9-DL1 plaatjes niet genoeg cellen overbleven werden ze in kweek
gebracht aan 6,5 x 104 cellen in een T75 falcon. eGFP expressie die correleert met DL1
expressie werd opgevolgd aan de hand van de flowcytometrie in het fluoresceine
isothiocyanate (FITC) kanaal. Op deze manier werd nagegaan of de stromale cellen nog
voldoende DL-1 tot expressie brachten.
De EBV-getransformeerde B-cellijnen HLA-A2+ JY, HLA-A2- SPS, HLA-A2- TE8 (home
made verkregen uit PBMCs) werden in IMDM medium gesuplementeerd met 10% FCS,
PenStrep en L-Glutamine in kweek gehouden. Wanneer de cellijnen te dens zaten werden ze
gesplist, anders werd enkel het medium ververst. De autologe HLA-A2- BCL KT 12/09/2013,
afkomstig van dezelfde PNT die gebruikt werd om CD34+ cellen uit te isoleren, werd
ontdooid en op dezelfde wijze in kweek gehouden in gesupplementeerd IMDM.
2.3
OP9-DL1 coculturen
2 dagen voor de start van de co-culturen werden OP9-DL1 cellen op 6-well platen voorzien.
Om de co-culturen op te starten werden op een 6-well plaat gemiddeld 50 000 à 100 000
CD34+ cellen per well in contact gebracht met OP9-DL1cellen. Alle coculturen werden
uitgevoerd in verse MEM-α met 20% FCS, samen met PenStrep en L-glutamine. Eveneens
werden cytokines toegevoegd voor stimulatie nl. 10 ng/ml IL7, 10 ng/ml Flt3-Ligand (beide:
R&D Systems, Minneapolis, USA) en 5 ng/ml stem cell factor (SCF; Amgen, Brussels,
Belgium). 2 à 3 dagen voor het oogsten van de T-cellen werd een monolayer van OP9DL1
cellen op nieuwe 6 well-platen gebracht aan respectievelijk 25 000 of 12 500 cellen per well
in compleet MEM-α medium. Na 5 dagen werden de thymocyten telkens geoogst door ze na
krachtig te pippeteren over te brengen naar een 50 ml falcon (BD FalconTM; Erembodegem;
België), waarna de OP9-DL1 cellen daalden naar de bodem en de celsuspensie gefilterd werd
zodat enkel de T-cellen overbleven. Vervolgens werden de cellen overgebracht op nieuwe 6well platen (VWR, Corning Incorporated, Durham, USA), gecoat met OP9-DL1 cellen, in
vers medium.
2.4
Flowcytometrie en sorteren van de cellen
Flowcytometrische metingen werden uitgevoerd op de BD LSR II cytometer (BD
Biosciences, Erembodegem, België) en geanalyseerd m.b.v. het BD FACSDiva software
programma (BD Biosciences, Erembodegem, België). Op basis van de isotype- of
ongelabelde stalen werden de vensters uitgezet. Er werden 0,5 x 105 tot 1 x 105 cellen, in een
20
maximum volume van 100 µl uit de celsuspensie overgebracht in een 5 ml FACS-buisje en
aangekleurd met de geschikte fluorochroom-gelabelde antilichamen (AL) volgens de
aanwijzingen van de fabrikant. Na vortexen werden de cellen 30 minuten geïncubeerd bij 4°C
in het donker. De cellen werden 1 maal gewassen met 2 ml wasbuffer (PBS + 1,125% BSA,
0,02% NaN3; home made) en gecentrifugeerd op kamertemperatuur (aan 1500 RPM, 6
minuten, acc 9, rem 9). Propidium iodide (PI; Life Technologies, Carlsbad, Californië, USA)
werd vlak voor elke meting toegevoegd om de dode cellen te visualiseren.
Voor het sorteren werden, zoals bij flowcytometrie, de cellen eveneens eerst membranair
gelabeld. Er werd steriel gewerkt wanneer men de gesorteerde cellen opnieuw in kweek wilde
zetten. In plaats van wasbuffer werd hier medium gebruikt om de cellen te wassen. De steriele
opvangbuisjes werden gevuld met 2 ml MEMα medium gesupplementeerd met 20% FCS,
PenStrep en L-glutamine. Alle sorts werden uitgevoerd met behulp van het BD FACSAria III
toestel (BD Biosciences, Erembodegem, België) waarbij zuiverheden werden bekomen hoger
dan 95%.
2.5
T-cel expansie
T-cellen werden geëxpandeerd op feedercellen bestaande uit bestraalde PBMC en JY, in een
verhouding van 10 op 1. Hiervoor werden eerst uit buffy coats (PBMCs), verkregen uit 2
verschillende donoren via het bloedtransfusiecentrum (Rode Kruis, Gent), door middel van
Ficoll densiteitsgradiënt centrifugatie mononucleaire cellen bekomen. Deze cellen en de JY
cellen werden bestraald aan 4000 GY en 5000 GY respectievelijk door Prof. Dr. Tom
Boterberg. De bestraalde cellen werden hierna in IMDM gesupplementeerd met 10% FCS,
PenStrep en L-glutamine gebracht. Ook PHA werd toegevoegd wat de proliferatie en activatie
van de T-cellen bevorderde. Deze feedercellen werden uitverdeeld ofwel in 96-platen (platbodem; U-well Tissue Culture Plate; Microtest, Becton Dickinson, Frankrijk) aan 1 x 10 5
PBMC samen met 1 x 104 JY ofwel in 24-well platen aan 1 x 106 PBMC en 1 x 105 JY. De
gesorteerde T-cellen werden in een volume van 50 µl compleet IMDM medium per well
gebracht bij de feedercellen op de 96-well plaat waardoor het volume medium per well
verdubbeld werd. Wanneer echter rechtstreeks in de platen gesorteerd werd, werden de
feedercellen reeds in een volume van 100 μl per well voorzien aangezien de sorter achteraf
enkel cellen zonder medium in de wells sorteert. Op de 24-well plaat werd de overschot van
de gesorteerde T-cel fractie in een volume van 0,5 ml per well in bulk opgekweekt. Vers
medium (50 µl per 96-well of 500 µl per 24-well) en humaan IL-2 (40 IU/ml, Roche,
Vilvoorde, België) werden om de 4 dagen toegevoegd aan een concentratie van 2,5 ng/ml.
21
2.6
CellTrace proliferatie assay
Deze assay werd gebruikt om celproliferatie na te gaan. De cellen werden geresuspendeerd in
PBS en vervolgens gelabeld met de CellTraceTM Violet cell proliferatie kit (Life
TechnologiesTM, Eugene, Oregon, USA; 1 µl in 1 ml PBS per 106 cellen) volgens de
instructies van de producent. Elke stap van het protocol gebeurde in het donker. Na 20
minuten incubatie op 37° C en bij 5% CO2 werd verdere opname van de kleurstof verhinderd
door het toevoegen van warm gesupplementeerd MEMα. De cellen werden 2 maal gewasen
en de labeling werd vervolgens gecontroleerd op de BD LSRII cytometer. Celproliferatie
werd nagegaan op dag 2,4,6 en 8 aan de hand van flowcytometrie. Een conditie op colhemid
(10 µg/ml; Sigma-Aldrich, Diegem, België) werd aangewend als negatieve controle.
2.7
Activatie-assay
De expressie van CD137, CD154 en CD69 werd gemeten om na te gaan of de in vitro
gedifferentieerde mature T-cellen geactiveerd werden. Voor dit experiment werden in een 24well plaat 106 effectoren (thymocyten) in contact gebracht met 2 x 105 targets (B-cellijnen die
AG presenteren aande T-cellen). Daarentegen werden in een 96-well plaat 105 effectoren
samen met 2 x 104 targets gebracht. 24 uur later werd opregulatie van activatiemerkers
CD137, CD154 en CD69 op de cellen geanalyseerd door flowcytometrie. De experimenten
werden steeds in duplo uitgevoerd in MEMα medium waaraan IL7 werd toegevoegd. aCD28
(BD Biosciences) werd toegevoegd aan de geschikte wells aan 2 µl/24-well. Gelijkaardige
experimenten werden herhaald met PBMC in afwezigheid van IL7. Tevens werd een isotype
IgG meegenomen. De expressie werd zowel na 24 als na 48uur nagegaan. De PBMC werden
bovendien 10 dagen in kweek gezet met bestraalde BCL waarna een tweede stimulatie
plaatsvond. Met de CD34- cellen verkregen uit de MACS doorloop werden dezelfde testen
uitgevoerd, na sortering op CD1-.
2.8
Chroom release assay
De cytotoxiciteit van in vitro gegenereerde cellen werd geanalyseerd aan de hand van chroom
release experimenten. Als targets voor deze assay werden autologe KT BCL en twee allogene
SPS en JY BCL aangewend. 0,5 x 106 cellen van elke BCL werden gelabeld met radioactief
51
chroom (5 mCi/ml; PerkinElmer) en geïncubeerd gedurende 90 minuten bij 37° en 5% CO2.
Hierna werden de cellen drie maal gewassen met compleet IMDM met als doel het chroom,
dat niet was opgenomen door de cellen, te verwijderen. De hoeveelheid target cellen per well
toegevoegd aan de effectoren op een NUNC-plaat (met V-bodem) bleef altijd hetzelfde,
namelijk 1000 cellen in 50 µl compleet IMDM per 96-well. De hoeveelheid effectoren per
22
well toegevoegd varieerde naargelang de effect-target (E/T) ratio die getest werd (50/1, 25/1,
12,5/1, 6,25/ 1, 3,125/1, 1,56/1), maar ook telkens in 50 µl compleet IMDM per 96-well.
51
Cr-gelabelde B-cellen die enkel in IMDM medium werden gebracht, werden meegenomen
in de analyse als negatieve controle om spontane lyse te bepalen. Eveneens werden een aantal
wells voorzien ter positieve controle waarin de BCL voorzien worden van medium
gesupplementeerd met 2% Triton X-100 (ICN Biomedicals Inc, SigmAldrich) om maximale
lysis na te gaan. Om goed contact tussen de targets en effectoren te verzekeren dienden de
platen gecentrifugeerd te worden (3 min, 1200 RPM, kamertemperatuur). Na 4 uur incubatie
bij 37° en 5% CO2 werd 70 μl van het supernatans van elke well afgenomen en samen met
230 μl scintillatievloeistof (OptiPhase Supermix, PerkinElmer) gebracht in een 96-well PET
plaat (PerkinElmer). Chroom release in het sypernatans werd gemeten m.b.v. de MicroBeta
TriLux gammateller (Perkin-Elmer; Waltham, USA) als counts per minute (cpm). Specifieke
lyse werd berekend na toepassing van volgende formule: specifieke lyse(%) = [(gemeten lyse
(cpm) – lyse negatieve controle (cpm))][(lyse positieve controle (cpm) – lyse negatieve
controle (cpm))] x 100.
2.9
Limiting dilution assay
Voor het kloneringsexperiment werden verse en geactiveerde PBMC uitgesorteerd op een 96well plaat, voorzien van feeders, bestaande uit 1 x 105 bestraalde PBMC en 1 x 104 bestraalde
JY cellen per well, en na toevoeging van PHA. Telkens werden PBMC aan 1, 10, 100 of 1000
cellen per well uitverdeeld. Naast FCS werd eveneens 10% Hyclone (Thermo Scientific,
Cramlington, UK) uitgetest als serum. Na 4 en 8 dagen werd het medium ververst en humaan
IL-2 toegevoegd aan de wells. Expansie van de cellen werd gescoord na 13 dagen expansie op
feeders m.b.v lichtmicroscopie. De frequenties van de wells waarin de cellen expandeerden
werden berekend met Extreme Limiting Dilution Analysis (ELDA; Walter and Eliza Hall
Insitute Bioinformatics, (74)).
23
3
3.1
Resultaten
Fenotype van de spontaan gematureerde T-cellen in OP9-DL1 co-cultuur
Figuur 7. Overzicht verloop van de co-cultuur. Na lymfoprep en MACS werden CD34+ HPSC verkregen uit
een postnatale kinderthymus (PNT) en in kweek gezet op OP9-DL1cellen in de aanwezigheid van cytokines IL7, SCF en Flt3L aan lage densiteit. De cellen werden op dag 10 opgesplitst en apart zowel aan lage densiteit
(LOW) als aan hoge densiteit (HIGH) opnieuw in co-cultuur gebracht met OP9-DL1cellen.
In een eerste deel werd nagegaan in welke densiteit de T-cellen op de platen in co-cultuur
kunnen gebracht worden om een optimale celgroei te verkrijgen. Er werd dus onderzocht of
het zinvol is om in de toekomst standaard een hoger aantal cellen per well te brengen.
Hiervoor werden CD34+ HSPC, verkregen uit de kinderthymus van een HLA-A2- donor, in
co-cultuur gebracht op een OP9-DL1 cellen samen met cytokines IL-7, Flt3L en SCF. Deze
niet-getransduceerde HPSC konden zo spontaan differentiëren en matureren. De cellen
werden elke 5 dagen geoogst en vervolgens werd het fenotype van de thymocyten
gekarakteriseerd met behulp van flowcytometrie. Vanaf dag 10 werden de cellen opgesplitst
in lage densiteit (LD), gemiddeld aan 1 x 106 cellen per well, en in hoge densiteit (HD) tot 5 x
106 cellen/well. De cellen werden steeds apart op een gelijk aantal 6-well platen in cultuur
gehouden. De LD en HD condities werden vergeleken aan de hand van celaantal en fenotype
(Figuur 7).
Figuur 8. Absolute celaantallen van niet-getransduceerde HSPC na co-cultuur op OP9-DL1. Links werden
de absolute totale celaantallen gedurende de eerste 10 dagen van de co-cultuur weergegeven, waarbij de cellen
aan lage densiteit (donkerblauw) zaten. Rechts werden de absolute celaantallen, genormaliseerd tegenover de
beginwaarden op dag 10, uitgezet apart per densiteit. Lage densiteit (donkerblauw), hoge densiteit (rood).
De cellen groeiden het sterkst gedurende de eerste 10 dagen van de co-cultuur waarbij de
cellen eerst 29 maal toenamen en vervolgens 4 maal (Figuur 8). Wanneer het celaantal op dag
24
10 gelijkgesteld werd aan 1, bleek dat de LD conditie een sterkere groei vertoonden tot dag 31
dan de HD cellen. Na dag 28 daalden de celaantallen in beide condities onder het niveau van
dag 10.
Figuur 9. Generatie van TCRαβ+ en TCRγδ+ T-cellen in OP9-DL1 co-cultuur. Boven: Om de vijf dagen
werd expressie van de TCRαβ en TCRγδ samen met CD3 op zowel de lage densiteit (LD) als hoge densiteit
(HD) cellen geanalyseerd en uitgedrukt in percentages (weergegeven in de plots). Onder: Deze grafieken geven
het verloop weer van het genormaliseerde aantal cellen (x106) die de expressie van hun TCR (αβ of γδ)
verwerven, in functie van de tijd in co-cultuur. De blauwe staven stellen de LD conditie voor terwijl de rode
staven representatief zijn voor de HD conditie.
Figuur 9 geeft de expressie van TCRαβ en TCRγδ op de cellen weer vanaf dag 6. Op dag 6
werd reeds een heel klein aantal γδ T-cellen waargenomen (0,2%) terwijl er nog geen αβ Tcellen aanwezig waren. Het is weinig waarschijnlijk dat deze γδ-cellen door contaminatie
veroorzaakt waren, aangezien ze op dag 10 nog steeds relatief immatuur waren (bijlage B).
Gedurende de eerste co-cultuur daalden de percentages TCRγδ+CD3+ T-cellen eerst tot op dag
28 waarna er opnieuw een stijgende trend opgemerkt kon worden. De expressie van TCRαβ
kende echter een verschillend verloop doorheen de co-cultuur. Zo verschenen pas vanaf dag
15 de eerste αβ T-cellen. Samen met de TCRαβ werd eveneens CD3 opgereguleerd wat
aantoonde dat het TCRαβ-complex op het celoppervlak gevormd werd. Zowel in de LD als
HD condities nam het percentage TCRαβ toe tot aan dag 28 waarna opnieuw een daling
geobserveerd werd. Het aandeel van de αβT-cellen was steeds hoger bij de HD conditie dan
25
bij de LD conditie. Voor de γδT-cellen gold het omgekeerde. Dit kan zowel geconcludeerd
worden op grond van de celpercentages als op basis van de absolute celaantallen.
Figuur 10. Generatie van dubbel positieve (DP) T-cellen in OP9-DL1 co-cultuur. Verloop van het
genormaliseerd celaantal CD8β+CD8α+, CD8α+CD4+, CD8β+CD4+ van dag 6 t.e.m. dag 35 van de co-cultuur
voor de lage densiteit conditie (donkerblauw) ten opzichte van de hoge densiteit conditie (rood).
De expressie van CD4 en CD8 wordt bepaald door het ontwikkelingsstadium waarin de T-cel
zich bevindt. De T-cel precursoren zullen tijdens hun ontwikkeling in de thymus
achtereenvolgens overgaan van een dubbel negatief (DN) stadium, via een CD4 immatuur
single positief stadium tot een dubbel positief (DP) stadium. Terwijl deze immature T-cellen
in het dubbel positieve (DP) stadium nog beide co-receptoren expresseren, gaat de expressie
van een van deze molecules verloren bij maturatie in de thymus. In de finale fase zijn de
cellen single positief (SP) (6). De meeste cellen in deze co-cultuur waren dubbel negatief
(DN) op dag 6 maar gingen erna hun co-receptoren CD4 en CD8 opreguleren. Er was reeds
een duidelijke populatie dubbel positieve (DP) cellen te zien op dag 15. Globaal werden
hogere DP celaantallen vastgesteld in de HD conditie (Figuur 10). Het overgangsstadium
tussen DN en DP cellen, waarbij CD4 immatuur single positieve cellen gevormd worden in de
in vivo T-cel ontwikkeling, werd in co-cultuur niet duidelijk waargenomen. Het
daaropvolgende stadium waar zowel CD8α als CD8β tot expressie komen op de T-cel werd
duidelijk geobserveerd op dag 10 (niet getoond).
In co-cultuur worden voornamelijk DP cellen gegenereerd en in mindere mate mature SP
cellen. Deze inefficiënte maturatie is toe te schrijven aan de afwezigheid van TEC in deze
cultuur, die noodzakelijk zijn om de positieve selectieprocessen in vivo te mediëren (52). Op
dag 15 werd geobserveerd dat de αβT-cellen nog immatuur waren, nl. CD27-CD1a+, terwijl de
γδT-cellen reeds een matuurder fenotype vertoonden (een deel van de cellen was
CD27+CD1a+). De αβT-cellen werden pas matuur vanaf dag 31 en op basis van zowel de
absolute als relatieve celaantallen werd een grotere stijging geobserveerd in het aantal mature
cellen bij de HD conditie (Figuur 11).
26
Figuur 11. Generatie van mature CD27+CD1a- T-cellen in
OP9-DL1 co-cultuur. Flowcytometrische analyse van de
expressie van maturatiemerkers CD27 en CD1a. Boven:
bovenaan werd gevensterd op TCRαβ cellen en onderaan op
TCRγδ cellen. Het percentage mature cellen werd weergegeven
in de plots. Onder: Verloop van de mature TCRαβ cellen tijdens
de co-cultuur voorgesteld in genormaliseerde celaantallen. LD:
lage densiteit (donkerblauw); HD: hoge densiteit (rood).
Om op een alternatieve manier de optimale celdensiteit na te gaan werden in een tweede cocultuur vanaf dag 10 meer plaatjes voorzien voor de LD dan voor de HD conditie. Na oogsten
en tellen van de afzonderlijke celpopulaties werden de cellen bijeen gebracht om opnieuw een
homogene populatie te verkrijgen. Vervolgens werden de cellen nogmaals opgesplitst in de 2
verschillende densiteiten en zo opnieuw op aparte platen in kweek gebracht (Figuur 12). Deze
benadering had als voordeel dat een afwijking van het celaantal bij een bepaalde conditie niet
doorgetrokken werd gedurende het verloop van de hele co-cultuur maar gecorrigeerd werd.
Figuur 12. Overzicht verloop tweede co-cultuur. Cellen werden spontaan gematureerd in co-cultuur met OP9DL1 cellen en op dag 10 zowel aan lage (LOW) als aan hoge densiteit (HIGH) in kweek gebracht. 5 dagen later,
wanneer de cellen geoogst en geteld werden, werden beide condities gehomogeniseerd vooraleer ze opnieuw in
LD en HD uitgesplitst werden.
TCRαβ kwam veel later tot expressie op de cellen en er werd een maximaal percentage van
slechts 6 % vastgesteld in de HD conditie op dag 29. Dit percentage lag veel lager t.o.v. de
eerste co-cultuur waar op dag 28 een maximaal percentage van 45% werd bereikt (Bijlage C).
Mature CD27+CD1- TCRαβ+ cellen werden eveneens veel minder efficiënt gevormd (Bijlage
27
D). Omdat de groei in celaantal gestaag afnam naarmate de co-cultuur vorderde werd deze cocultuur niet geschikt bevonden om conclusies te trekken over de optimale celdensiteit (Bijlage
E).
Globaal kon geconcludeerd worden dat de HD cellen een minder sterke celgroei vertoonden
dan de LD cellen tijdens de co-cultuur. Desondanks werden de grootste absolute en relatieve
celaantallen van DP, TCRαβ en mature αβT-cellen gegenereerd in de HD conditie.
3.2
Analyse van de auto- en alloreactiviteit van de in vitro gematureerde T-cellen
3.2.1 Aantonen van alloreactiviteit bij T-cellen uit PBMC
Om in vivo gematureerde thymocyten te testen op auto- en alloreactiviteit werd een stimulatie
assay opgezet, waarbij T-cel activatie werd nagegaan op basis van de expressie van de
activatiemerkers CD137, CD154 en CD69 op de cellen. Om de techniek op punt te zetten
werden deze testen voorafgaandelijk uitgevoerd op PBMC. Voorgaand onderzoek toonde
immers reeds aan dat deze cellen alloreactiviteit vertonen (75). Tevens werd onderzocht
welke van de drie geanalyseerde T-cel activatiemerkers de hoogste effectiviteit vertoonde.
Figuur 13. Expressie van de activatiemerkers op de PBMC 24 en 48 uur na stimulatie. Verse PBMC
werden gestimuleerd met de Bcel-lijnen SPS, JY en TE8. Activatie werd gemeten als het percentage van de
PBMC die CD137, CD154 en CD69 op hun celoppervlak tot expressie brengen. De donkerblauwe en rode
staven zijn representatief voor respectievelijk de CD8α+ en CD4+ cellen. Negatieve controle: niet gestimuleerd.
Positieve controle: conditie gestimuleerd met anti-CD3 antilichaam. Allo: allogeen.
Initieel werden verse niet-gesorteerde PBMC in bulk in contact gebracht met 3 verschillende
allogene B-cellijnen (BCL): SPS, JY en TE8. Aangezien geen autologe BCL voorhanden was
werden niet-gestimuleerde T-cellen in medium voorzien als negatieve controle. Deze werden
verwacht geen opregulatie van de activatiemerkers te vertonen. Bijkomend werd een conditie
opgezet met anti-CD3 (aCD3) antilichaam (AL) gestimuleerde cellen (positieve controle).
aCD3 zorgt voor crosslinking van het TCR-complex. Verwacht werd dat onder invloed van
28
deze sterke stimulus deze cellen een hoge alloreactiviteit zouden vertonen. 24 en 48 uur na
labeling van de PBMC met antilichamen specifiek voor CD137, CD154 en CD69 werd
nagegaan of deze cellen alloreactiviteit vertoonden.
CD154 kwam in alle condities slechts beperkt tot expressie (Figuur 13). Dit was mogelijk te
wijten aan het feit dat de uiterste gebruiksdatum van het antilichaam verstreken was. Ook de
conditie op aCD3 vertoonde lage waarden voor CD154, wat in lijn was met deze
veronderstelling. CD137 wordt normaal verwacht sterk tot expressie te komen op CD8+ Tcellen. Hier werd een lage expressie waargenomen van CD137 na contact met de allogene JY
BCL (Figuur 14). De expressie werd voornamelijk aangetoond op de CD8α+ cellen (12,1% na
48uur) en in mindere mate op de CD4+ celpopulatie (3,3% na 48uur). De PBMC vertoonden
duidelijk sterkere expressie van CD69 op het celoppervlak na stimulatie door alle drie de
BCL, en dit vooral na 48uur. Het sterkste effect werd evenwel opnieuw vastgesteld voor de
JY targets (18,7% CD69 expressie op de CD8α+ populatie). Hieruit kan geconcludeerd
worden dat een klein percentage van de PBMC geactiveerd worden door een allogene BCL.
Bovendien werd vastgesteld dat de effectiviteit van de activatiemerkers minder hoog was dan
verwacht. Van de drie geanalyseerde merkers bleek CD69 de best functionerend
activatiemerker te zijn. De CD137 merker gaf suboptimale resultaten. Voor CD154 waren de
resultaten niet interpreteerbaar.
Figuur 14. Fenotypische analyse van de expressie
van CD137, CD154 en CD69 op het celoppervlak
van PBMC na stimulatie met B-cellijn JY.
Expressie van de activatiemerkers werd nagegaan op
de CD8α+ en CD4+ cellen, zowel na 24 als na 48 uur,
en weergeven in percentages. Gatings werden
getoond in bijlage F.
Omdat in het eerste experiment zeer lage frequenties van het aantal geactiveerde cellen
werden vastgesteld, werden in een tweede experiment de PBMC, in drie verschillende
condities, in aanwezigheid van IL-2, aangerijkt voor de hiervoor gebruikte en vooraf
bestraalde BCL. 11 dagen later werden de verschillende condities opnieuw apart gestimuleerd
met elk van de 3 respectievelijke BCL en werd na 24 uur de expressie van de drie
activatiemerkers bestudeerd. Er werd verwacht dat deze cellen aangerijkt zouden zijn voor de
29
allogene BCL en dus een hoger percentage zou reageren met de respectievelijke BCL bij
tweede stimulatie.
Tabel 1. Expressie van de activatiemerkers op de PBMC 24 uur na 2 de stimulatie.
PBMC werden na eerste stimulatie met bestraalde allogene Bcel-lijnen SPS, JY en TE8 in kweek gezet met IL-2
en 11 dagen later opnieuw gestimuleerd met dezelfde BCL. Expressie van CD137, CD154 en CD69, zowel op de
CD8α+ als op de CD4+ cellen, werd gemeten na 24 uur en weergegeven als percentages in de tabellen. Negatieve
controle: geen eerste stimulatie maar wel een tweede stimulatie. Positieve controle: conditie gestimuleerd met
anti-CD3 antilichaam.
Na de tweede stimulatie werd een werkzaam antilichaam voor CD154 gebruikt. Dit
resulteerde in hogere levels van CD154 maar opnieuw werd enkel een uitgesproken
percentage nl. 19 % op de CD4+ PBMC waargenomen na herhaalde stimulatie met JY BCL
(Tabel 1). Opvallend was dat de cellen, die gedurende 11 dagen enkel in aanwezigheid van
medium gecultiveerd werden, de activatiemerkers ook tot expressie brachten. Deze cellen
werden niet aangerijkt maar in stand gehouden door toevoeging van IL-2 en de vastgestelde
expressieniveaus resulteerden uit de tweede stimulatie. CD137 en CD69 kwamen duidelijk tot
uiting op zowel de CD4+ als CD8+ cellen maar de celpercentages waren aanzienlijk hoger op
de CD8+ celpopulatie. De conditie op aCD3 beantwoordde niet aan de verwachtingen,
aangezien er geen grote verschillen in expressie waar te nemen was ten opzichte van de
overige condities. Dit resultaat was te wijten aan het gebruik van aCD3 in oplossing.
Aangezien monocyten en macrofagen afwezig waren, was binding van aCD3 aan hun Fcreceptor onmogelijk en waardoor er geen crosslinking van het TCR-complex plaatsvond (76).
Om dit te vermijden werd aCD3 in latere experimenten gecoat op de plaat. De cellen,
aangerijkt tegen de SPS BCL, vertoonden na de tweede stimulatie met SPS een hogere
expressie van CD137 in vergelijking met de cellen aangerijkt tegen de andere BCL JY en TE8
(47,5% ten opzichte van respectievelijk 31,3% en 37,2% op de CD8α+ cellen; figuur 15). Dit
leidde tot de conclusie dat het experiment wel alloresponsen kon genereren en dat er een trend
30
tot aanrijking aantoonbaar was. Tenslotte bleken CD137 en CD69 aanleiding te geven tot
vergelijkbare expressieniveaus.
Figuur 15. Analyse van CD137 expressie op de SPS-, JY- en TE8-aangerijkte PBMC na tweede stimulatie
met SPS BCL. Expressie van CD137, zowel op de CD8α als op de CD4 celpopulaties, werd uitgedrukt in
percentages en weergegeven in de plots. Gating werd getoond in bijlage G.
3.2.2 Aantonen van alloreactiviteit bij mature T-cellen uit PNT
Voorgaande experimenten op PBMC werden herhaald op mature thymocyten. Uit de PNT
werden tevens na MACS de CD34- cellen gecollecteerd uit de doorloop. Vervolgens werden
enkel de mature (CD1a-) T-cellen uitgesorteerd (bijlage H). Aangezien er tijdens het sorteren
geen AL tegen CD3, CD4 of CD8 meegenomen werden, kon er geen interferentie van de AL
met de verdere experimenten ontstaan. In deze setting werd de SPS BCL vervangen door een
autologe BCL verkregen uit dezelfde postnatale kinderthymus (PNT). Er werd verwacht van
de cellen die gestimuleerd werden met de autologe KT BCL dat ze geen autoreactiviteit
zouden vertonen. Thymocyten die reactief zijn tegen autologe cellen zouden er immers reeds
uit geselecteerd moeten zijn door negatieve selectie in de thymus. Als gevolg van positieve
selectiemechanismen zouden dan de cellen gestimuleerd met de twee overige allogene BCL
alloreactiviteit moeten vertonen.
Figuur 16. Expressie van de activatiemerkers op de mature thymocyten 24 uur na stimulatie. CD34- cellen
werden na sorteren op CD1a- gestimuleerd met zowel een autologe BCL (KT), gegenereerd uit de zelfde
kinderthymus en twee allogene BCL (JY en TE8). Boven: een eerste stimulatie assay waarbij de expressie van
CD137, CD154 en CD69 werd onderzocht en uitgedrukt in percentages. Onder: een tweede stimulatie assay.
Hierbij werd enkel aangekleurd voor CD137 en CD154. De donkerblauwe en rode staven zijn representatief voor
respectievelijk de CD8α+ en CD4+ cellen. Negatieve controle: niet gestimuleerd. Positieve controle: conditie op
aCD3 gecoate wells. Auto: autoloog; Allo: allogeen.
31
Bij een eerste stimulatie assay werd de conditie op aCD3 achterwege gelaten bij gebrek aan
voldoende cellen. Terwijl de CD137expressie na 24 uur zeer lage niveaus vertoonde voor alle
gestimuleerde condities, wees dit experiment wel op een duidelijke opregulatie van de CD69
merker na 24 uur (Figuur 16). Dit was wellicht te verklaren op grond van het feit dat CD69
reeds tot expressie kwam op de cellen in de fase voorafgaand aan de stimulatie (77). De
expressie was in het algemeen hoger op de CD4+ cellen dan op de CD8α+ cellen.
Deze assay werd vervolgens herhaald op CD34- cellen uit een andere ampulle van dezelfde
PNT na sortering op CD1- (Bijlage H). Hier werd enkel expressie van CD137 en CD154
gemeten na 24uur. Wat CD137 betreft, vertoonde de conditie gestimuleerd met JY BCL
opnieuw de hoogste waarden (Figuur 17: 13,5 % gemeten op de CD4+ celpopulatie). In beide
experimenten werd andermaal zeer lage expressie van CD154 aangetoond en was er geen
duidelijk onderscheid te maken tussen de condities gestimuleerd met autologe versus allogene
BCL. Samengevat kon gesteld worden dat slechts een klein percentage van de cellen
alloreactief was. Tegen de verwachting werd een bijna even grote respons waargenomen
tegen de autologe BCL als tegen de allogene BCL.
Figuur 17. Fenotypische weergave
van de mature thymocyten uit de
kinderthymus 24 uur na stimulatie
met auto KT, JY of TE8 BCL.
Weergave van het tweede stimulatie
experiment. Expressie van CD137
werd gemeten en weergegeven in
percentages voor de CD8α+ en CD4+
celpopulaties.
Niet-gestimuleerde
cellen: negatieve controle; stimulatie
met aCD3: positieve controle.
Gatings werden afgebeeld in bijlage I.
Omdat de mature thymocyten die in het eerste experiment rechtstreeks gestimuleerd werden,
vrij lage alloresponsen vertoonden, werden in een tweede fase de gesorteerde CD34-CD1thymocyten aangerijkt met een bestraalde BCL (Figuur 18). In deze setting werd echter geen
IL-2 toegevoegd. Aangezien IL-2 essentieel is voor de overleving en proliferatie van de Tcellen werden de niet-gestimuleerde cellen hier verwacht in apoptose te gaan. Dit moest
toelaten de resultaten van de experimenten beter te interpreteren (78). De TE8 BCL werd
vervangen door de SPS BCL. 13 dagen later volgde een tweede stimulatie met dezelfde
bestraalde BCL, waarvoor er eerder werd aangerijkt. Hierna werd opnieuw IL-2 toegevoegd
werd.
32
Figuur 18. Verloop van de experimenten op de mature thymocyten, na kweek met bestraalde BCL KT, JY
en SPS: illustratie voor de conditie aangerijkt tegen SPS BCL. De gesorteerde CD1a- thymocyten uit de
postnatale thymus werden apart aangerijkt tegen de drie BCL in afwezigheid van IL-2. 13 dagen later volgde een
tweede stimulatie met dezelfde bestraalde BCL, echter wel in aanwezigheid van IL-2. Op dag 26 werden de
cellen gesorteerd op TCRαβ+CD3+CD8α+ en op feeders gebracht. Na 14 dagen expansie werd een eerste
cytotoxiciteit assay ingezet. Dit experiment werd herhaald 9 dagen later, na een tweede expansie.
Zowel op dag 1 als dag 5 na de tweede stimulatie werden de cellen geteld aan de hand van
flowcytometrie (Tabel 2). Het resterend celaantal van de cellen, die 13 dagen in kweek
gestaan hadden met een allogene BCL, lag hoger dan deze die aangerijkt waren tegen de
autologe KT BCL (12060 cellen in de JY aangerijkte conditie versus 3780 cellen in de
conditie aangerijkt tegen autologe KT BCL). Dit suggereerde dat de mature thymocyten
sterker zouden reageren tegen de allogene BCL dan tegen de autologe BCL. Op dag 5 werd
echter in alle gestimuleerde condities een sterke reductie geobserveerd, in het bijzonder voor
de conditie met autologe KT BCL waar 96% van de cellen in apoptose gingen. Dit resultaat
is opmerkelijk: verwacht werd dat deze gestimuleerde cellen zouden gaan prolifereren in
aanwezigheid van IL-2 in plaats van in apoptose te gaan.
Tabel 2. Celaantallen van de mature
thymocyten na tweede stimulatie. 1 en
5 dagen na tweede stimulatie met de
KT, SPS of JY BCL werden de cellen
geteld a.d.h.v. flowcytometrie en
weergeven als absolute aantallen.
Figuur 19. Fenotypische weergave
van de mature thymocyten na de
tweede stimulatie. De expressie van
CD8α en CD4 werd nagegaan 5 dagen
na de tweede stimulatie met de KT, SPS
of JY BCL.
Gatings
werden
weergegeven in bijlage J.
Flowcytometrische analyse gaf bovendien aan dat de mature thymocyten overwegend CD4+
waren. Ze vertoonden nauwelijks expressie van CD8 (Figuur 19). 13 dagen na de 2de
stimulatie werden de cellen gesorteerd op TCRαβ+CD3+CD8α+ (bijlage K). Slechts zeer
weinig cellen werden gesorteerd nl. 9, 225 en 42 cellen voor respectievelijk de condities
gestimuleerd met KT, SPS en JY BCL. Deze cellen werden vervolgens op feeders gebracht
om te laten expanderen tot significante aantallen. De cytotoxiciteit experimenten, uitgevoerd
op deze cellen, werden verder beschreven in paragraaf 3.2.5.
33
3.2.3 Maturatie van immature in vitro gegenereerde T-cellen
In een volgende stap werd onderzocht of maturatie kon uitgelokt worden door zelf een
autologe of allogene BCL toe te voegen aan de in vitro gegenereerde immature T-cellen. Deze
BCL presenteren vele antigenen (AG) aan het polyclonaal TCR-repertoire van de T-cellen. In
dit experiment werd getest of polyclonale selectie kon uitgelokt worden (a.d.h.v. BCL in
plaats van aCD3-stimulatie).
Op dag 29 van de co-cultuur waren de meeste cellen nog DP+CD3+ en immatuur, maar een
minderheid van de cellen was wel reeds matuur (vooral γδT-cellen). Er werd een Cell trace
ingezet op de LD cellen om na te gaan door welke BCL de cellen matureerden en
prolifereerden (Figuur 20). Cell Trace Violet is een kleurstof die door de intacte celmembraan
kan diffunderen waarna intracellulaire esterasen de acetaatgroepen op de molecule klieven.
Als gevolg hiervan ontstaat fluorescentie en aangezien de kleurstof uit de originele cel zich
gelijk verdeelt over de twee dochtercellen zal bij elke celdeling de kleurintensiteit afnemen.
Analyse van fluorescentie laat toe om het aantal celdelingen te bepalen die de cel heeft
doorgemaakt na labeling.
Op dag 2 na stimulatie waren de αβT-cellen nog overwegend immatuur terwijl de γδT-cellen
reeds CD1a- waren. Vanaf dag 6 werd een graduele verschuiving waargenomen van de αβTcellen naar een matuur fenotype. De mature cellen vertoonden eveneens geleidelijk aan meer
proliferatie. In de conditie waar enkel medium werd toegevoegd aan de T-cellen werd naast
differentiatie ook proliferatie van deTCRαβ+ cellen waargenomen op dag 8. Proliferatie werd
vooral aangetoond tegenover de JY BCL (63 van de TCRαβ+ cellen op dag 6 ten opzichte van
slechts 9 cellen in de niet-gestimuleerde conditie). Op dag 8 was het verschil tussen beide
condities echter nog minimaal. Voor de anti-CD3 controle werden de cellen niet
voorafgaandelijk opgedeeld in respectievelijk TCRαβ+ en TCRγδ+ cellen. De maturatie en
proliferatie was hier minder sterk dan verwacht. De conditie op Colchemid vertoonde
volledige inhibitie van proliferatie. Colcemid depolymeriseert de microtubules waardoor de
celdeling stopt in de metafase en de cellen verhinderd worden om verder te ontwikkelen (79).
Aangezien bij aanvang van het experiment niet gesorteerd werd op immature cellen, kon niet
uitgesloten worden dat een gedeelte van de geobserveerde maturatie reeds was voltrokken bij
de start van het experiment. Op basis van deze resultaten werd aangetoond dat na toevoegen
van een BCL polyclonale selectie kon geïnduceerd worden maar dat de cellen niet significant
sterker matureerden dan de negatieve controle conditie waaraan geen BCL werd toegevoegd.
Bijkomende onderzoek is nodig om de specificiteit tegen de BCL na te gaan en om te bepalen
34
of de verkregen mature cellen verschillen van de spontaan gematureerde cellen in OP9-DL1
co-cultuur.
Figuur 20. Proliferatie van LD co-cultuurcellen a.d.h.v. Cell Trace. Boven: Op dag 29 werd een Cell trace
experiment ingezet op de nog immature CD1a + LD cellen. De gelabelde T-cellen werden gestimuleerd met
respectievelijk een bestraalde autologe BCL, verkregen uit de thymus van dezelfde patiënt, en twee bestraalde
allogene BCl (JY en een BCL verkregen uit een andere kinderthymus). + Medium; niet-gestimuleerd staal,
waarbij de T-cellen enkel in aanwezigheid van medium in cultuur gehouden worden. +aCD3/aCD28: positieve
controle. +aCD3/Colchemid: negatieve controle voor de niet-delende cellen. Alle condities werden enerzijds
enkel in aanwezigheid van cytokines IL-7 en IL-15 (hier weergegeven) en anderzijds op OP9-DL1-cellen samen
met IL-7, SCF en Flt3L getest. Onder: Celdeling en maturatie werden uitgedrukt in absolute celaantallen op dag
2, 6 en 8 na stimulatie. Cell trace werd uitgezet t.o.v. expressie van de maturatiemerker CD1a, telkens voor
zowel de αβ als γδ T-celpopulatie. Gatings werden getoond in bijlage L.
35
3.2.4 Aantonen van allo- en autoreactiviteit bij in vitro gematureerde T-cellen
3.2.4.1 T-cel activatie assay
Vervolgens werd autoreactiviteit van spontaan gematureerde cellen in co-cultuur bestudeerd
aan de hand van de activatiemerker CD137. Een eerste CD137 experiment werd ingezet op
dag 35 wanneer de cellen al TCRαβ+ CD27+CD1a- waren. Er vond geen sortering op CD1amature cellen plaats. Zowel de LD als HD cellen werden gebruikt in deze assay. In het
scenario van agonist selectie werd meer CD137 expressie verwacht bij toevoegen van
autologe BCL dan bij het toevoegen van een allogene BCL. De conditie op anti-CD3/antiCD28 was geslaagd aangezien 44% van de CD1-cellen CD137 positief waren (Figuur 21). In
tegenstelling hiermee werd noch op de niet-gestimuleerde noch op de gestimuleerde cellen
met autologe en allogene KT BCL CD137-expressie waargenomen op zowel de αβ- als γδ-Tcellen. Opnieuw werd een zeer licht verhoogde expressie gezien na stimulatie met allogene
JY BCL (4%). Zowel in aanwezigheid van OP9-DL1 als anti-CD28 werd minder dan 1% van
de cellen geactiveerd. In deze fase werd dus geen specifieke reactie geobserveerd tegen de
autologe of allogene BCL, en evenmin tegen de OP9-DL1 cellen in co-cultuur.
Figuur 21. Analyse van autoreactiviteit van in vitro gematureerde cellen in BULK aan de hand van een
CD137 assay. Boven: opnieuw werden zowel een niet-gestimuleerd staal als cellen gestimuleerd met een
autologe (KT) en 2 verschillende allogene BCL (KT en JY) en een identieke positieve controle meegenomen.
Verder werd een conditie voorzien waarbij uitsluitend CD28 aan de T-cellen toegevoegd werd om na te gaan of
full activatie kon uitgelokt worden. Dit had tot doel de spontane activatie na te gaan. Tevens werden de cellen in
aparte condities ofwel op enkel OP9-DL1 ofwel op OP9-DL1 met anti-CD28 ondergebracht. Op basis hiervan
werd nagegaan of de cellen geselecteerd worden op basis van componenten aanwezig in de co-cultuur of
onafhankelijk van antigenen. Enkel IL-7 werd toegevoegd aan alle condities. Onder: fenotypische analyse van de
CD137 merker op de T-cellen. De gates werden uitgezet op basis van de isotypes en weergegeven in bijlage M.
36
Op dag 35 werd tevens uit de in co-cultuur gedifferentieerd T-cellen de mature celfractie
TCRαβ+CD+CD27+CD1- gesorteerd met 98,5% zuiverheid. Parallel hieraan werden PBMC
gesorteerd op TCRαβ+CD3+CD8α+. Zowel de co-cultuur T-cellen als de PBMC werden
verder in bulk in 24-wells geëxpandeerd op feeders in aanwezigheid van IL-2 en IL-7. 9
dagen na sorteren (dag 43) werd de CD137 assay herhaald op een deel van de co-cultuur Tcellen. De resterende cellen, alsook de PBMCs in bulk werden ingevroren.
Er kon opnieuw geen autoreactiviteit van de T-cellen tegen de B-cellen aangetoond worden,
evenmin als alloreactiviteit (Figuur 22). Wanneer CD137 uitgezet werd tegenover CD4,
CD8α of CD8β konden geen verschillen waargenomen worden tussen de verschillende T-cel
subtypes (niet weergegeven). Omdat de anti-CD3/anti-CD28 stimulatie niet optimaal had
plaatsgevonden en er dus geen positieve controle was voor de T-cel activatie, konden geen
conclusies uit dit experiment getrokken worden.
Figuur 22. Analyse van CD137 expressie op de in vitro gematureerde T-cellen 9 dagen na expansie op
feeders. Boven: Mature cellen werden na sort op TCRαβ+CD3+CD27+CD1- in bulk op feeders gekweekt en 9
dagen later opnieuw gestimuleerd met een autologe KT BCL en twee allogene BCL (KT en JY). Na 24 uur werd
T-cel activatie onderzocht aan de hand van CD137. De overschot van de cellen werd nadien ingevroren. Het
opzet van de eerste assay werd behouden, met uitzondering van de condities op OP9-DL1 en deze op anti-CD28.
Gatings werden weergegeven in bijlage N.
Omdat het voorgaande experiment geen uitsluitsel kon geven werd het gerepliceerd. Een
ampulle van de gesorteerde co-cultuur T-cellen werd ontdooid samen met een ampulle van de
gesorteerde PBMC’s om hiermee een laatste CD137experiment op te starten. De PBMCs
werden aangewend als positieve controle (Figuur 23). Er werd hoge CD8β/CD8α expressie op
de cellen vastgesteld (Bijlage O). Zoals verwacht vertoonden gemiddeld 7,6 % van de
CD8α+/CD8β+ PBMCs CD137 expressie na stimulatie met allogene BCL. 88,9 % van de anti-
37
CD3-gestimuleerde co-cultuur T-cellen bracht CD137 tot expressie wat aangaf dat de
positieve controle goed gelukt was. Op grond van de drie T-cel activatie assays werd besloten
dat geen uitgesproken auto- of alloreactiviteit waargenomen werd voor de in vitro
gegenereerde T-cellen.
Figuur 23. Analyse van CD137 expressie op zowel gesorteerde PBMC als gesorteerde T-cellen
gegenereerd in co-cultuur. Boven: Een laatste CD137 experiment werd opgezet met zowel ontdooide
gesorteerde co-cultuur T-cellen als PBMC. Deze PBMC werden, gelijktijdig met de co-cultuurcellen, op dag 35
gesorteerd op TCRαβ+CD3+CD8α+CD8β+ en meegenomen als positieve controle. De condities hier waren
analoog aan deze in de tweede CD137 assay. Onder: Histogrammen van de CD137 expressie werden uitgezet
voor de verschillende condities m.b.v. FlowJo, al dan niet na stimulatie met een BCL of anti-CD3/anti-CD28.
De grijze grafiek was representatief voor het isotype staal en CD137expressie werd hiermee vergeleken zowel
voor de in vitro gegenereerde T-cellen als voor de PBMCs. Gating werd getoond in bijlage O.
3.2.4.2 Cytotoxiciteit assays
Aangezien op basis van de voorgaande experimenten geen sluitende conclusies konden
getrokken worden over de autoreactiviteit van de co-cultuur T-cellen, werd een cytotoxiciteitassay uitgevoerd op de in vitro ontwikkelde T-cellen, die op dag 37 gesorteerd werden op
TCRαβ+CD3+CD27+CD1a- (Bijlage K). In totaal werden slechts 679 cellen met dit fenotype
gesorteerd op feeders gebracht. Hiernaast werden in dit experiment ook de 3 verschillende
populaties geëxpandeerde TCRαβ+CD3+CD8α+ mature thymocyten (gesorteerd
op
TCRαβ+CD3+CD8α+) als effectoren aangewend (zie paragraaf 3.2.2). Nagegaan werd of de
co-cultuur T-cellen na 14 dagen expansie op feeders, in staat waren de BCL te doden. Voor
38
deze assay werden nogmaals dezelfde BCL (autologe KT, allogene SPS en JY) als mogelijke
targets ingezet.
Wanneer tijdens het eerste chroomexperiment de cellen gestimuleerd werden met de autologe
KT BCL werd er in alle condities lysis waargenomen (Bijlage P). Wat verder opgemerkt kon
worden is dat de cellen, die gestimuleerd werden door een bepaalde BCL, minder killing
vertoonden tegenover diezelfde BCL dan t.o.v. van andere BCL. Dit suggereert dat deze
cellen mogelijk tolerant geworden zijn voor deze BCL. Zo werd geobserveerd dat de mature
thymocyten, die eerder gestimuleerd werden met de SPS BCL, slechts een specifieke lysis van
2,7% veroorzaakten van de SPS cellen t.o.v. 8,7 en 8,9% van de JY en autologe KT B-cellen
respectievelijk.
Fenotype van de effectoren wees uit dat de mature thymocyten, gestimuleerd met KT en JY
BCL, een zeer laag percentage CD8β/CD8α vertoonden (1% en 5% respectievelijk) en dat
deze cellen dus vooral CD4+ waren (Bijlage Q). Deze gesorteerde cellen lagen zeer dicht bij
de gate en werden dus waarschijnlijk foutief beschouwd als CD8α+cellen (Bijlage K). De cocultuur T-cellen en de mature thymocyten, gestimuleerd met de SPS BCL waren wel positief
voor CD8 cellen (55% en 63% respectievelijk). In lijn met deze bevindingen werd eveneens
vastgesteld dat deze cellen hoger boven de grens lagen bij het sorteren. Het verschil tussen de
waarden in negatieve en positieve controle was te klein in dit experiment (optimaal 10 x
verschil) waardoor de waarden in de duplo-condities soms te ver uiteen lagen. Mogelijk was
de labeling niet goed gelukt omwille van de kwaliteit van het gebruikte chroom (deze was
reeds 6 weken oud). Voor dit experiment werden ook slechts 250 000 targets gelabeld in
plaats van de gebruikelijke 1 x 106, wat een suboptimaal aantal is.
De functionaliteit van de cellen werd daarom verder bestudeerd aan de hand van een tweede
chroom assay. Hiervoor werden dezelfde vier celpopulaties opnieuw 9 dagen geëxpandeerd
op feeders. De opzet van het eerste chroom experiment werd herhaald maar nu werden de
cellen echter uitgetitreerd aan effector:target ratio’s van 50:1, 25:1, 12,5:1, 6,25:1, 3,125/1;
1,56/1. De in vitro gematureerde T-cellen induceerden een substantieel sterkere lyse van de
autologe KT BCL dan de aangerijkte in vivo gematureerde T-cellen (Figuur 24; co-cultuur).
Dit wijst erop dat de cellen autoreactiviteit vertonen. Anderzijds zijn ze tevens reactief t.o.v.
de allogene BCL. In tegenstelling tot de verwachting vertoonden de in vivo gematureerde Tcellen lage alloresponsen.
39
Figuur 24. Chroom release assay. De in vitro gegenereerde T-cellen werden op dag 37 van de co-cultuur
gesorteerd en op feeders gebracht met IL2. De mature thomocyten die aangerijkt werden met SPS, JY en
autologe KT BCL (respectievelijk B;C;D) werden gesorteerd en eveneens na 14 dagen expansie op feeders
aangewend als effectoren in een cytotoxiciteit assay. De negatieve controle bestond enkel uit feeders en medium,
zonder de aanwezigheid van T-cellen. Verse PBMC werden meegenomen als positieve controle om na te gaan of
de feeders hun functie vervulden. De cellen werden verder geëxpandeerd en 9 dagen later werd de assay werd de
cytotoxiciteit assay herhaald. Een autologe KT BCL en twee allogene BCL JY en SPS werden aangewend als
targets. De cellen werden uitgetitreerd aan effector:target ratio’s van 50:1, 25:1, 12,5:1, 6,25:1, 3,125/1; 1,56/1.
Co; conditie.
3.3
Kloneringsexperiment
Bij het kloneren kan men ofwel manueel ofwel met de BD FACSAria III sorter te werk gaan.
Welke van beide methode de beste is werd in dit experiment onderzocht. Tevens werden
veschillende sera uitgetest, met het oog op optimale celexpansie. Zowel de verse als de
geactiveerde PBMC werden eerst gesorteerd op de subpopulatie CD3+TCRαβ+CD8α+CD8β+
T-cellen, waarna deze ofwel door de sorter ofwel met de hand aangelengd en uitverdeeld
werden op 96-well platen, voorzien van feeders. Het feeder cel mengsel was samengesteld uit
bestraalde perifere bloed mononuclaire cellen (PBMC) en bestraalde EBV-geïmmortaliseerde
JY cellen. Daarnaast werd ook PHA aan de feeders toegevoegd. PHA is een lectine dat de Tcellen aspecifiek activeert en aanzet tot celdeling (80). Wat de sera betreft, werden de
gesorteerde cellen in gesupplementeerd IMDM gebracht met zowel 10% FCS, 20% FCS als
10% Hyclone vooraleer ze uitverdeeld werden. De PBMC werden uitgesorteerd aan 1 cel per
well (c/w) in 24 wells, aan 10 c/w in 16 wells, aan 100 c/w in 4 wells en tenslotte aan 1000
c/w eveneens in 4 wells. Op dag 4 en 8 werd vers medium met IL2 toegevoegd aan de wells.
Als negatieve controle werden wells meegenomen met feeders waaraan enkel medium werd
toegevoegd. Tevens werden wells voorzien waarin 10 000 verse niet-gesorteerde PBMC
gebracht werden op feeders ter positieve controle. 13 dagen later werd de expansie van de
cellen geëvalueerd. Op basis hiervan werd gecontroleerd welke sorteringsmethode gepaard
40
ging met de kleinste afwijking. Omdat bij het uitsorteren met de hand de kans even groot is
dat zowel 0, 1 als 2 cellen opgezogen worden uit de gesorteerde celsuspensie en in de wells
terechtkomen, is hier de Poisson verdeling van toepassing. Aangezien de sorter consequent
precies 1 cel per well sorteert, werd verwacht dat hiermee meer betrouwbare resultaten
gegenereerd zouden worden (81). Tevens werd verondersteld dat PBMC, die vooraf
geactiveerd werden, in alle condities een sterkere proliferatie zouden vertonen.
Figuur 25 geeft een overzicht van de wells waarin expansie werd geobserveerd. In alle wells
waarin bij aanvang 100 of 1000 PBMC in aanraking gebracht werden met feeders kon
expansie waargenomen worden, ongeacht het soort cellen en serum. Bij 10 PBMC per well
werd een sterkere groei gezien wanneer de cellen uitverdeeld werden door de sorter (nl. 16
wells ten opzichte van 10 wells in de conditie geactiveerde PBMC in 10% FCS). Daarentegen
kwam hogere proliferatie tot stand uit de manueel uitverdeelde PBMC aan 1 cel per well (10
wells t.o.v. 6 wells in dezelfde conditie). Ondanks deze kleine verschillen kon geconcludeerd
worden dat beide methoden van sorteren leidden tot expansie en hiertussen geen sprake was
van grote afwijkingen.
A
B
C
D
E
F
Figuur 25. Algemene expansie van verse en geactiveerde PBMC op feeders. De proliferatie van zowel verse
als geactiveerde PBMC uitgesorteerd aan 1, 10, 100 of 1000 cellen per well (c/w) werd geanalyseerd en in de
tabel werd het aantal wells positief voor expansie weergegeven. Hiernaast werden de twee verschillende
sorteringswijzen onderling vergeleken nl. aan de hand van de sorter of manueel .
Proliferatie van de PBMC uitverdeeld m.b.v. de sorter werd vervolgens onderzocht aan de
hand van een limiting dilution assay (LDA). In figuur 26 werd de geschatte frequentie van
groeiende cellen in de wells (‘actieve cel frequentie’) weergegeven. Eveneens werden voor
elke conditie betrouwbaarheidsintervallen op het 95% niveau bepaald. Hieruit bleek dat zowel
de verse als geactiveerde PBMC, uitverdeeld m.b.v de sorter, in aanwezigheid van 20% FCS
meer prolifereerden in vergelijking met de verse PBMC in 10% FCS (p < 0,05). Er werd
evenwel geen significantie bekomen voor de conditie in 20% FCS ten opzichte van de 10%
41
Hyclone conditie. Daarentegen werd bij manueel sorteren van de cellen geobserveerd dat
zowel de verse PBMC in 20% FCS als in 10% Hyclone de beste resultaten gaven voor
celexpansie. Hoogste proliferatie werd hier aangetoond voor de verse PBMC en significante
verschillen werden enkel waargenomen ten opzichte van de geactiveerde condities.
Tegelijkertijd werd vastgesteld dat van alle geactiveerde PBMC-condities de cellen in 20%
FCS de sterkste expansie vertoonden. Geactiveerde PBMC in 10% Hyclone gaven de minst
optimale resultaten voor celgroei. Hieruit werd geconcludeerd dat in contrast met de
resultaten bekomen op basis van de sorter, waarbij geen significante verschillen tussen verse
en geactiveerde condities werden waargenomen, voor de manueel uitverdeelde cellen de verse
PBMC hogere proliferatie vertoonden.
Figuur 26. Limiting dilution assay. Verse en geactiveerde PBMC werden gesorteerd aan 1, 10, 100 en 1000
cellen per well en na expansie op feeders en PHA en in aanwezigheid van IL-2 na 13 dagen gescoord m.b.v.
lichtmicrocopie. Boven: Geschatte frequenties van de groeiende cellen werden samen met de 95%
betrouwbaarheidsintervallen getoond. Paarsgewijze verschillen in actieve cel frequentie werden gestest tussen de
condities en * geeft aan welk condities significant verschillend zijn op het 5% niveau. Onder: De plot is een
logaritimische weergave van de proliferatie en werd bekomen via het programma ELDA. Op de y-as werden de
cellen getoond die niet prolifereerden (logaritmisch) en op de x-as werd het aantal cellen waarmee het
experiment gestart werd, uitgezet. Ononderbroken trendlijnen zijn representatief voor de geschatte actieve cel
frequenties voor de verschillende condities op dag 13 na expansie. De betrouwbaarheidsintervallen werden
voorgesteld als stippellijnen. Zwart (A): verse PBMC in 10% FCS, rood (B): verse PBMC in 20%FCS, groen
(C): verse PBMC in 10% Hyclone, donkerblauw (D): geactiveerde PBMC in 10% FCS, lichtblauw (E):
geactiveerde PBMC in 20% FCS, roze (F): geactiveerde PBMC in 10% Hyclone.
42
Aangezien aan de hand van deze resultaten geen onderscheid kon gemaakt worden tussen
zwakke en sterke expansie werd vervolgens de groei van de cellen vergeleken met de
negatieve en positieve controles en op basis hiervan gescoord. Score 0 werd gegeven aan de
wells die in overeenstemming waren met de negatieve controle en dit betekent dat celdood is
opgetreden. Aan de cellen die lichte groei vertoonden werd score 1 toegewezen terwijl score 2
gekenmerkt werd door clustering van cellen in een groot aantal klompjes rond de homogene
populatie in het midden van de well. Score 3 werd toegekend aan de wells overeenkomstig de
positieve controles. Hier zaten de cellen zeer dens op elkaar, bijna volledig uitgestrekt over de
bodem van de well en werd dus massieve proliferatie vastgesteld (bijlage R). Op deze manier
werd nagegaan welke cellen (verse versus geactiveerde PBMC) en welke sera de beste
resultaten gaven.
V ers e P B MC s met s o rter
G eac tiv eerd e P B MC s met s o rter
Aantal pos itieve
wells
Aantal pos itieve
wells
20
20
15
15
10% F C S
10
20% F C S
5
10% Hy c lone
0
1
2
10
10% F C S
5
20% F C S
10% Hy c lone
0
1
3
2
S c ore s
S c ore s
V ers e P B MC s man u eel
G eac tiv eerd e P B MC s man u eel
20
20
15
10% F C S
10
20% F C S
5
10% Hy c lone
0
Aantal pos itieve
wells
Aantal pos itieve
wells
3
15
10% F C S
10
20% F C S
5
10% Hy c lone
0
1
2
3
S c ore s
1
2
3
S c ore s
Figuur 27. Analyse van de intensiteit van de celexpansie. Verse en geactiveerde PBMC werden gescoord 13
dagen na expansie op feeders. Scores van 1 tem 3 werden toegekend waarbij score 1 gegeven werd aan wells
waarin lichte groei geobserveerd werd, score 2 voor matig sterke groei en score 3 voor sterke groei (analoog aan
de positieve controles). Staafgrafieken tonen het aantal wells waarin expansie werd waargenomen
overeenkomstig de score die werd toegekend, per specifieke conditie en toegevoegd serum.
Het grootste aantal wells waar score 3 aan toegekend werd zijn deze die 20% FCS bevatten
(Figuur 27). Dit geldt voor alle condities. De met de sorter uitverdeelde geactiveerde PBMC
vertoonden hogere expansie intensiteit dan de verse PBMC. Voor de manueel gesorteerde
cellen gold evenwel het tegenovergestelde.
Er werd dus geconcludeerd dat de beste groei waargenomen werd voor de PBMC in
aanwezigheid van 20% FCS. Voor de condities uitverdeeld a.d.h.v de sorter in 10% FCS of
10% Hyclone echter werd een minder optimale expansie waargenomen en er kon niet
aangetoond worden dat met 10% Hyclone betere resultaten konden bekomen worden dan met
10% FCS. De analyse bevestigde eveneens de kwaliteit van het sorteerproces door de sorter.
43
4
Discussie
In deze masterproef werd nagegaan of de T-cellen, spontaan gegenereerd in vitro uit HSPC
verkregen uit PNT, autoreactiviteit vertoonden. Concreet werd auto- en alloreactiviteit
onderzocht op basis van de expressie van de activatiemerker CD137 en de cytotoxische
capaciteit van deze CD8+ SP cellen. Een eerste vaststelling op grond van het cytotoxiciteit
experiment is dat de cellen wel degelijk autoreactieve eigenschappen vertoonden.
Tegelijkertijd bleken de in co-cultuur gematureerde T-cellen tevens alloreactief. Deze
bevindingen zijn compatibel met verschillende hypothesen waar ik verder op inga.
Een eerste hypothese stelt dat deze cellen agonist selectie ondergingen na binding met een
ligand waarvoor ze hoge affiniteit vertoonden. Als dit het geval is, wordt de autoreactiviteit
van de spontaan gematureerde T-cellen toegeschreven aan kruispresentatie van lichaamseigen
Ag tussen de T-cel precursoren onderling, aangezien de cellen MHC klasse I expresseren op
het celoppervlak (53). Aangezien DP T-cel precursoren geen co-stimulatoire molecules
vertonen op hun celoppervlak zouden deze signalen dan niet vereist zijn voor maturatie (37).
Aanwezigheid van alloreactieve cellen kan dan mogelijk veroorzaakt worden door de
aanwezigheid van de OP9-DL1 cellen in de co-cultuur. In het onderzoek van Dervovic et al.
werd geconstateerd dat de maturatie van de DP cellen afhankelijk was van MHC klasse I
geëxpresseerd op de OP9-DL1 cellen (46). Verschillende onderzoekers brengen echter
argumenten aan die de rol van deze cellen in de in vitro selectieprocessen in twijfel doen
trekken. In eerste instantie werd gewezen op het feit dat de resultaten van Dervovic et al.
bekomen werden met CD8+ T-cellen, in vitro gegenereerd uit HSPC van murien beenmerg.
Het is echter weinig waarschijnlijk dat humane T-celprecursoren even goed zullen interageren
met de MHC klasse I molecules van deze muriene stromale cellen. Later onderzoek op
humane HSPC wees verder uit dat de OP9-DL1 cellen slechts lage levels van MHC klasse I
en geen MHC klasse II expresseren. Vancoppernolle et al. toonden verder aan dat OP9-DL1
cellen, getransduceerd met humane HLA-A1 of HLA-A2, evenmin leidden tot de generatie
van hoge aantallen mature T-cellen (52).
Een tweede mogelijke verklaring is dat in vitro positieve selectie plaatsvond maar geen
negatieve selectie. Hierbij zouden de T-celprecursoren dit selectieproces mediëren, eveneens
door middel van kruispresentatie. Als gevolg hiervan worden de T-cellen met een hoge
affiniteit voor zelf-Ag dus niet geëlimineerd, maar kunnen deze verder matureren. De cellen
met een lage affiniteit voor zelf-Ag zullen dan positief geselecteerd worden, wat verklaart dat
de cellen een alloreactief karakter vertonen.
44
Een derde hypothese stelt dat de cellen op basis van het TCR-signaal geselecteerd werden,
zonder binding aan een ligand. Mogelijk kregen dus enkel die cellen, die de hoogste TCRexpressie niveaus vertoonden, voldoende signalen om te matureren. Op deze manier worden
dan zowel auto- als alloresponsen gegenereerd aangezien maturatie doorgaat onafhankelijk
van hun specificiteit.
Als vierde mogelijkheid kunnen de T-cellen TCR-onafhankelijke maturatie ondergaan. Als
gevolg van het feit dat de gevormde T-cellen dan niet MHC-gerestricteerd zijn, kunnen zowel
auto- als alloreactieve cellen standhouden wat in lijn is met de resultaten verkregen in deze
masterproef. In de literatuur wordt hierbij gewezen op het belang van IL-7 signalisatie en
persistente Notch signaling in OP9-DL1 culturen (83). Tijdens positieve selectie wordt de
activiteit van de E-proteines onderdrukt in de immature DP cellen. Er werd aangetoond dat
Notch signalisatie de degradatie van E2A eiwitten kan induceren via ubiquitine-gemedieerde
proteolysis (84). Mogelijk kan dit ook resulteren in TCR-onafhankelijke selectieprocessen in
vitro.
Een vijfde en laatste mogelijke verklaring is dat de cellen wel degelijk TCR-afhankelijke
maturatie ondergaan maar er, gezien het NK-like karakter van de cellen, toch TCRonafhankelijke activatie optreedt door zowel de autologe als allogene BCL via NKreceptoren.
De resultaten bekomen in deze masterproef waren echter niet consistent over alle
experimenten heen. Zo konden noch auto- noch alloresponsen aangetoond worden van de in
vitro gegenereerde T-cellen op basis van de expressie van CD137. Gezien de resultaten van de
positieve controle condities op aCD3/aCD28, is het weinig waarschijnlijk dat het uitblijven
van de autoreactiviteit te wijten is aan het opzet van het experiment. Wel kan de oorzaak
gezocht worden in het feit dat voor beide experimenten de HSPC verkregen werden uit
verschillende donoren. Daardoor bestaat de mogelijkheid dat de cellen reactief waren tegen
andere Ag die niet gepresenteerd werden door de BCL.
Het is opmerkelijk dat de in vivo gematureerde thymocyten slechts beperkte alloreactiviteit
vertoonden. Op basis van de T-cel activatie assays uitgevoerd op PBMC werd enkel een
betekenisvol niveau van alloreactiviteit vastgesteld na stimulatie met de JY BCL. Mogelijk
presenteerde deze BCL een breder repertoire aan Ag en sterkere co-stimulatoire signalen in
vergelijking met de andere BCL. Na aanrijking met de BCL lag het percentage geactiveerde
cellen beduidend hoger. Deze experimenten herhaald op mature thymocyten, verkregen uit
dezelfde PNT als de HSPC, toonden een bijna even grote respons tegen de autologe BCL als
tegen de allogene BCL. Op basis van de chroomexperimenten echter werd geobserveerd dat
45
deze cellen geen autoreactiviteit vertoonden. Zoals verwacht werden deze autoreactieve cellen
wellicht geëlimineerd in de thymus door het negatieve selectieproces (14). Het was dan weer
wel opvallend dat de alloresponsen uitbleven tegen de BCL.
In deze masterproef werd additioneel onderzocht of door toevoegen van een BCL polyclonale
selectie kon geïnduceerd worden van de in vitro gegenereerde immature T-cellen. Wanneer de
cellen echter gestimuleerd werden met autologe en allogene BCL, die co-stimulatoire signalen
tot expressie brengen, konden geen duidelijke verschillen geobserveerd worden met de
spontaan gematureerde T-cellen. Deze resultaten waren in tegenstelling tot Snauwaert et al.
waarbij TCR-getransduceerde HSPC gestimuleerd werden met DC en agonist peptide i.p.v.
BCL (37). Om dit experiment te herhalen in de toekomst zou het interessant zijn om vooraf te
sorteren op de immature CD27-CD1a+ cellen, zodat kan uitgesloten worden of reeds
aanwezige mature cellen differentiatie induceren. Eveneens zou het relevant zijn om na te
gaan of de specificiteit, die tegen de BCL bekomen werd, ook behouden blijft. Herhaling van
deze experimenten met behulp van Flow Count beads zou een meer nauwkeurige analyse
toelaten.
Voorafgaand aan deze experimenten werd eveneens onderzocht welke de optimale densiteit
(LD versus HD) was van de cellen in de wells om de maximale celgroei te ondersteunen. In
beide co-culturen werd een hogere celgroei vastgesteld voor de LD. De HD conditie leidde
dan wel tot hogere populaties van DP, TCRαβ+ en mature TCRαβ+ cellen. Tijdens het verloop
van de tweede co-cultuur namen de celaantallen gestaag af, wat mogelijk te wijten is aan
donorafhankelijkheid.
5
Besluit
HSPC geïsoleerd uit de postnatale thymus differentieerden in een OP9-DL1 cultuursysteem
tot CD8+ Tcellen. De beste celexpansie werd geobserveerd in de low density conditie, maar in
de high density conditie werden er hogere aantallen DP, TCRαβ+ en mature TCRαβ+ cellen
verkregen. Het maturatieproces in de OP9-DL1 co-cultuur verloopt zich echter niet op de
meest efficiënte wijze. Na stimulatie met BCL werd geen significant betere maturatie van de
thymocyten bekomen, in vergelijking met de spontaan gematureerde T-cellen in co-cultuur.
Op basis van een chrome release assay werd zowel auto- als allo-reactiviteit van de cellen
vastgesteld na stimulatie met de verschillende BCL. Extra assays, zoals ELISA met het oog
op de bepaling van de cytokineproductie van de gematureerde T-cellen, is aangewezen. De
therapeutische meerwaarde van deze T-cellen zal verder afhankelijk zijn van de resultaten
verkregen op basis van in vivo muismodellen.
46
6
Referenties
1. Chaplin, D.D. Overview of the immune response. The Journal of Allergy and Clinical
Immunology.2010;125(2):S3-S23.
2. Delves, P.J. and Roitt, I.M. The immune system. First of two parts. New England Journal of Medicine.
2000;343(1):37-49.
3. Delves, P.J. and Roitt, I.M. The immune system. Second of two parts. New England Journal of
Medicine. 2000;343(2):108-117.
4. Banchereau, J. and Steinman, R.M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature.
1998;392(6673):245-252.
5. Fugmann, S.D. The origins of the Rag genes - From transposition to V (D) J recombination. Seminars in
Immunology. 2010; 22(1):10-16.
6. Spits, H. Development of αβ T cells in the human thymus. Nature Reviews Immunology.
2002;2(10):760-772.
7. Gogoi, D. and Chiplunkar, S.V. Targeting gamma delta T cells for cancer immunotherapy: bench to
bedside. Indian Journal of Medical Research. 2013;138(5):755-761.
8. Taghon, T., and Rothenberg, E.V. Molecular mechanisms that control mouse and human TCR-αβ and
TCR-γδ T cell development. Seminars in immunopathology. 2008;30(4):383-398.
9. Harlan, D.M. and Kirk, A.D. The future of organ and tissue transplantation: can T-cell costimulatory
pathway modifiers revolutionize the prevention of graft rejection? Journal of the American Medical
Association. 1999;282(11):1076-1082.
10. Lenschow, D.J., Walunas, T.L. and Bluestone, J.A. CD28/B7 system of T cell costimulation. Annual
Review of Immunology. 1996;14(1):233-258.
11. Hintzen, R.Q., Lens, S.M., Lammers, K., et al. Engagement of CD27 with its ligand CD70 provides a
second signal for T cell activation. The Journal of Immunology. 1995;154(6):2612-2623.
12. Lizée, G., Overwijk, W.W., Radvanyi, L., et al. Harnessing the power of the immune system to target
cancer. Annual Review of Medicine. 2003;64:71-90.
13. Vicente, R., Swainson, L., Marty-Grès, S., et al. Molecular and cellular basis of T cell lineage
commitment. Seminars in Immunology. 2010;22(5):270-275.
14. Starr, T.K., Jameson, S.C. and Hogquist, K.A. Positive and negative selection of T cells. Annual Review
of Immunology. 2003;21(1):139-176.
15. Zúñiga-Pflücker, J.C. T-cell development made simple. Nature Reviews Immunology. 2004;4(1):67-72.
16. Lehar, S.M. and Bevan, M.J. T cell development in culture. Immunity. 2002;17(6):689-692.
17. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., et al. Ag presentation in the thymus for positive selection
and central tolerance induction. Nature Reviews Immunology. 2009;9(12):833-844.
18. Plum, J., De Smedt, M., Leclercq, G., et al. Human intrathymic development: a selective approach.
Seminars in Immunopathology. 2008;30(4):411-423.
19. La Motte-Mohs, R.N., Herer, E., and Zúñiga-Pflücker, J.C. Induction of T-cell development from
human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 2005;105(4):1431-1439.
20. De Smedt, M., Hoebeke, I., and Plum, J. Human bone marrow CD34 + progenitor cells mature to T cells
on OP9-DL1 stromal cell line without thymus microenvironment. Blood Cells Molecules and Diseases.
2004;33(3):227-232.
21. Hao, Q.L., George, A.A., Zhu, J., et al. Human intrathymic lineage commitment is marked by
differential CD7 expression: identification of CD7− lympho-myeloid thymic progenitors. Blood.
2008;111(3):1318-1326.
22. Weerkamp, F., Baert, M.R., Brugman, M.H., et al. Human thymus contains multipotent progenitors
with T/B lymphoid, myeloid, and erythroid lineage potential. Blood. 2006;107(8):3131-3137.
23. Blom, B. and Spits, H. Development of human lymphoid cells. Annual Review of Immunology.
2006;24:287-320.
24. Pobezinsky, L.A., Angelov, G.S., Tai, X., et al. Clonal deletion and the fate of autoreactive thymocytes
that survive negative selection. Nature Immunology. 2012;13(6):569-578.
25. Radtke, F., Wilson, A., Ernst, B., et al. The role of Notch signaling during hematopoietic lineage
commitment. Immunological Reviews. 2002;187(1):65-74.
26. Palmer, E. Negative selection—clearing out the bad apples from the T-cell repertoire. Nature Reviews
Immunology. 2003;3(5):383-391.
27. Carpenter, A.C. and Bosselut, R. Decision checkpoints in the thymus. Nature Immunology.
2010;11(8):666-673.
28. Stritesky, G.L., Jameson, S.C. and Hogquist, K.A. Selection of self-reactive T cells in the thymus.
Annual review of immunology. 2012;30:95-114.
47
29. Gangadharan, D., Lambolez, F., Attinger, A., et al. Identification of Pre-and Postselection TCRαβ+
Intraepithelial Lymphocyte Precursors in the Thymus. Immunity. 2006;25(4):631-641.
30. Lambolez, F., Kronenberg, M. and Cheroutre, H. Thymic differentiation of TCRαβ+ CD8αα+ IELs.
Immunological Reviews. 2007;215(1):178-188.
31. Cheroutre, H., Lambolez, F. and Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial
lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 2011;11(7):445-456.
32. Brugnera, E., Bhandoola, A., Cibotti, R., et al. Coreceptor reversal in the thymus: signaled CD4 +8+
thymocytes initially terminate CD8 transcription even when differentiating into CD8+ T cells.
Immunity. 2000;13(1):59-71.
33. Singer, A., Adoro, S. and Park, J.H. Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of
CD4-versus CD8-lineage choice. Nature Reviews Immunology. 2008;8(10):788-801.
34. Vandekerckhove, B., Vanhee, S., Van Coppernolle, S., et al. In vitro generation of immune cells from
pluripotent stem cells. Frontiers in Bioscience. 2011;16:1488-1504.
35. Egawa, T. Runx and ThPOK: a balancing act to regulate thymocyte lineage commitment. Journal of
Cellular Biochemistry. 2009;107(6):1037-1045.
36. Vanhecke, D., Leclercq, G., Plum, J., et al. Characterization of distinct stages during the differentiation
of human CD69+ CD3+ thymocytes and identification of thymic emigrants. The Journal of
Immunology. 1995;155(4):1862-1872.
37. Snauwaert, S., Verstichel, G., Bonte, S., et al. In vitro generation of mature, naive Ag-specific CD8+ T
cells with a single T-cell receptor by agonist selection. Leukemia. 2013:1-12.
38. Brownlie, R.J., and Zamoyska, R. T cell receptor signalling networks: branched, diversified and
bounded. Nature Reviews Immunology. 2013;13(4):257-269.
39. Hebeisen, M., Rufer, N., Oberle S.G., et al. Signaling Mechanisms that Balance Anti-viral, Autoreactive, and Anti-tumor Potential of Low Affinity T cells. Journal of Clinical and Cellular
Immunology. 2012;12pp.
40. Seder, R.A. and Ahmed, R. Similarities and differences in CD4+ and CD8+ effector and memory T cell
generation. Nature immunology. 2003;4(9):835-842.
41. Schmitt, T.M., & Zúñiga-Pflücker, J.C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor
cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 2002;17(6):749-756.
42. De Smedt, M., Leclercq, G., Vandekerckhove, et al. T-lymphoid differentiation potential measured in
vitro is higher in CD34+ CD38−/lo hematopoietic stem cells from umbilical cord blood than from bone
marrow and is an intrinsic property of the cells. Haematologica. 2011;96(5):646-654.
43. Taghon, T., Van de Walle, I., De Smet, G., et al. Notch signaling is required for proliferation but not for
differentiation at a well-defined β-selection checkpoint during human T-cell development. Blood.
2009;113(14):3254-3263.
44. Bray, S.J. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular Cell
Biology. 2006;7(9):678-689.
45. Kreslavsky, T., Gleimer, M., Garbe, A. I., et al. αβ versus γδ fate choice: counting the T‐cell lineages at
the branch point. Immunological Reviews. 2010;238(1):169-181.
46. Dervović, D.D., Liang, H.C.Y., Cannons, J.L., et al. Cellular and Molecular Requirements for the
Selection of In vitro–Generated CD8 T Cells Reveal a Role for Notch. The Journal of Immunology.
2013;191(4):1704-1715.
47. van Lent, A.U., Nagasawa, M., van Loenen, M.M., et al. Functional human Ag-specific T cells
produced in vitro using retroviral T cell receptor transfer into hematopoietic progenitors. The Journal of
Immunology. 2007;179(8):4959-4968.
48. Cho, S.K., Webber, T.D., Carlyle, J.R., et al. Functional characterization of B lymphocytes generated in
vitro from embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1999;96(17):97979802.
49. Six, E.M., Benjelloun, F., Garrigue, A., et al. Cytokines and culture medium have a major impact on
human in vitro T-cell differentiation. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 2011;47(1):72-78.
50. Wang, H., Pierce, L.J. and Spangrude, G.J. Distinct roles of IL-7 and stem cell factor in the OP9-DL1
T-cell differentiation culture system. Experimental Haematology. 2006;34(12):1730-1740.
51. Awong, G., Herer, E., La Motte-Mohs, R.N. and Zúñiga-Pflücker, J.C. Human CD8 T cells generated in
vitro from hematopoietic stem cells are functionally mature. Immunology. 2012;12(1):22.
52. Van Coppernolle, S., Verstichel, G., Timmermans, F., et al. Functionally mature CD4 and CD8 TCRαβ
cells are generated in OP9-DL1 cultures from human CD34+ hematopoietic cells. The Journal of
Immunology. 2009;183(8):4859-4870.
53. de Pooter, R. and Zúñiga-Pflücker, J.C. T-cell potential and development in vitro: the OP9-DL1
approach. Current Opinion in Immunology. 2007;19(2):163-168.
48
54. Anderson, G., Owen, J.J., Moore, N.C., et al. Thymic epithelial cells provide unique signals for positive
selection of CD4+ CD8+ thymocytes in vitro. The Journal of experimental medicine. 1994;179(6), 20272031.
55. Gattinoni, L., Powell, D.J., Rosenberg, S.A., et al. Adoptive immunotherapy for cancer: building on
success. Nature Reviews Immunology. 2006;6(5):383-393.
56. Curiel, T.J. Chapter one: Historical perspectives and current trends in cancer immunotherapy. 2 Cancer
Immunotherapy : paradigms, practice and promise. 2013:3-16.
57. Buonaguro, L., Petrizzo, A., Tornesello, M.L., et al. Translating tumor Ags into cancer vaccines.
Clinical and Vaccine Immunology. 2011;18(1): 23-34.
58. Dougan, M. and Dranoff, G. Immunotherapy of cancer. Innate Immune Regulation and Cancer
Immunotherapy. 2012: 391-414.
59. Rosenberg, S.A., Yang, J.C., Sherry, R.M., et al. Durable complete responses in heavily pretreated
patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research.
2011;17(13):4550-4557.
60. Zhao, Y., Parkhurst, M.R., Zheng, Z., et al. Extrathymic generation of tumor-specific T cells from
genetically engineered human hematopoietic stem cells via Notch signaling. Cancer
Research. 2007;67(6):2425-2429.
61. Phan, G.Q. and Rosenberg, S.A. Adoptive cell transfer for patients with metastatic melanoma: the
potential and promise of cancer immunotherapy. Cancer Control. 2013;20(4):289-297.
62. Porter, D.L., Levine, B.L., Kalos, M., et al. Chimeric Ag receptor–modified T cells in chronic lymphoid
leukemia. New England Journal of Medicine. 2011;365(8):725-733.
63. Johnson, L.A., Morgan, R.A., Dudley, M.E., et al. Gene therapy with human and mouse T-cell
receptors mediates cancer regression and targets normal tissues expressing cognate Ag. Blood.
2009;114(3):535-546.
64. Robbins, P.F., Morgan, R.A., Feldman, S.A., et al. Tumor regression in patients with metastatic
synovial cell sarcoma and melanoma using genetically engineered lymphocytes reactive with NY-ESO1. Journal of Clinical Oncology. 2011;29(7):917-924.
65. Stärck, L., Popp, K., Pircher, H., et al. Immunotherapy with TCR-Redirected T Cells: Comparison of
TCR-Transduced and TCR-Engineered Hematopoietic Stem Cell–Derived T Cells. The Journal of
Immunology. 2014;192(1):206-213.
66. Savoldo, B., Ramos, C.A., Liu, E., et al. CD28 costimulation improves expansion and persistence of
chimeric Ag receptor–modified T cells in lymphoma patients. Journal of Clinical Investigation.
2011;121(5):1822-1826.
67. Shen, C.J., Yang, Y.X., Han, E.Q., et al. Chimeric Ag receptor containing ICOS signaling domain
mediates specific and efficient anti-tumor effect of T cells against EGFRvIII expressing
glioma. Journal of Hematology and Oncology. 2013;6(1):33.
68. Sadelain, M., Brentjens, R. and Rivière, I. The basic principles of chimeric Ag receptor design. Cancer
Discovery. 2013;3(4):388-398.
69. Kalos, M., Levine, B.L., Porter, D.L., et al. T cells with chimeric Ag receptors have potent anti-tumor
effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Science Translational
Medicine. 2011;3(95):1-21.
70. Louis, C.U., Savoldo, B., Dotti, G., et al. Anti-tumor activity and long-term fate of chimeric Ag
receptor–positive T cells in patients with neuroblastoma. Blood. 2011;118(23):6050-6056.
71. Lo, A.S., Ma, Q., Liu, D.L. et al. Anti-GD3 chimeric sFv-CD28/T-cell receptor ζ designer T cells for
treatment of metastatic melanoma and other neuroectodermal tumors. Clinical Cancer Research.
2010;16(10):2769-2780.
72. Brentjens, R., Yeh, R., Bernal, Y., et al. Treatment of chronic lymphocytic leukemia with genetically
targeted autologous T cells: case report of an unforeseen adverse event in a phase I clinical trial.
Molecular Therapy. 2010;18(4):666-668.
73. Morgan, R.A., Yang, J.C., Kitano, M., et al. Case report of a serious adverse event following the
administration of T cells transduced with a chimeric Ag receptor recognizing ERBB2. Molecular
Therapy. 2010;18(4):843-851.
74. Hu, Y. and Smyth, G.K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched
populations in stem cell and other assays. Journal of Immunological Methods. 2009;347(1): 70-78.
75. Nikolaeva, N., Uss, E., van Leeuwen, et al. Differentiation of human alloreactive CD4+ and CD8+ T
cells in vitro. Transplantation. 2004;78(6):815-824.
76. Jungi, T.W., Von Below, G., Lerch, P.G., et al. Modulation of human monocyte Fc receptor function by
surface-adsorbed IgG. Immunology. 1987;60(2):261.
49
77. Vanhecke, D., Leclercq, G., Plum, J., et al. Characterization of distinct stages during the differentiation
of human CD69+ CD3+ thymocytes and identification of thymic emigrants. The Journal of
Immunology. 1995;155(4):1862-1872.
78. Li, X.C., Demirci, G., Ferrari-Lacraz, S., et al. IL-15 and IL-2: a matter of life and death for T cells in
vivo. Nature medicine. 2001;7(1):114-118.
79. Rieder, C.L. and Palazzo, R. E. Colcemid and the mitotic cycle. Journal of Cell Science.
1992;102(3):387-392.
80. Ceuppens, J.L., Baroja, M.L., Lorre, K., et al. Human T cell activation with phytohemagglutinin. The
function of IL-6 as an accessory signal. The Journal of Immunology.1988;141(11):3868-3874.
81. Ibrahim, S.F. and van den Engh, G. Flow cytometry and cell sorting. Cell Separation. 2007;106:19-39.
82. Cannarile, M.A., Decanis, N., van Meerwijk, J.P., et al. The role of dendritic cells in selection of
classical and nonclassical CD8+ T cells in vivo. The Journal of Immunology. 2004;173(8): 4799-4805.
83. Dervović, D. and Zúñiga-Pflücker, J.C. Positive selection of T cells, an in vitro view. Seminars in
Immunology. 2010;22(5):276-286.
84. Nie, L., Xu, M., Vladimirova, A., et al. Notch‐induced E2A ubiquitination and degradation are
controlled by MAP kinase activities. The EMBO Journal. 2003;22(21):5780-579.
50
7
Bijlagen
Bijlage A
Antilichamen
Volgende anti-humane monoklonale antilichamen van BD Biosciences (Pharmingen,
Erembodegem, België) werden gebruikt: CD8α-APC-Cy7, CD4-Alexafluor V700, TCRγδphycoerythrin (PE), CD154-PE, CD8α-APC, CD1α-APC. De antilichamen die verkregen
werden van eBioscience (San Diego, Californië, USA) zijn: CD3-PacBlue, CD8β- PECy7,
CD3-PECy7, CD1a-PacBlue, CD27-APC-Cy7. Antilichamen besteld bij Miltenyi Biotec
(Leiden,
Nederland)
omvatten:
TCRαβ-allophycocyanin
(APC),
CD34-fluorescein
isothiocyanate (FITC), CD137-PE, CD69-PE, CD19-FITC, TCRαβ-PE, CD8α-FITC, CD3FITC, TCRγδ-PE. CD1-FITC is home made.
Cellen tellen
De cellen werden geteld met behulp van een Bürker telkamer (Superior Marienfield, Leuven,
België). De single-cell suspensie werd 1 op 2 verdund in Trypaanblauw (Gibco, Invitrogen,
Life TechnologiesTM, Carlsbad, Californië, USA). Dit mengsel werd eerst opgemengd en
vervolgens werd 10 µl op een Bürker telkamer gebracht onder een dekglaasje. De levende
cellen werden telkens geteld in 25 vakjes met behulp van een lichtmicroscoop waarbij enkel
de cellen gelegen in de vakjes en op de onder- en rechtergrens meegeteld werden. Aan de
hand van een formule (geteld aantal cellen x verdunningsfactor x 104) werd het aantal
cellen/ml celsuspensie berekend.
Invriezen van cellen
De cellen werden ingevroren om hiermee op later tijdstip nieuwe experimenten in te zetten.
De cellen werden hiervoor in FCS geresuspendeerd en overgebracht naar een vriesampulle
(Thermo Scientific, Nalgene, Cryogenic vials, Rochester, NY, USA). De cellen werden
vervolgens nagespoeld door eenzelfde volume van FCS/20% DMSO (Serva, Bio-Connect
Diagnostics BV, Huissen, Nederland) oplossing druppelgewijs toe te dienen. Deze suspensie
werd eveneens overgebracht in de vriesampulle zodat de cellen finaal ingevroren werden in
10% cryoprotectans DMSO. Eerst werden deze ampulles in een invriespot (Bio Freezing
Vessel, Bicell, Nihon freezer Co) in -80°C geschikt waardoor de temperatuur 1°C per minuut
daalt. Minimaal 1 dag en maximaal 5 dagen later werden de cellen overgebracht naar een
geschikte plaats in vloeibare stikstof.
I
Coating van 24- of 96-well plaat met anti-CD3 (aCD3) antilichaam
Als positieve controle voor de experimenten werd telkens een conditie op aCD3 AL (OKT3
moAB; 10µg/ml in PBS, home made) meegenomen. Deze polyclonale stimulus zorgt ervoor
dat de cellen beter matureren en vormt een controle voor de niet-geselecteerde cellen. aCD3
werd 1 op 100 verdund in PBS en hierna aan 100 µl uitverdeeld in 96-wells. De plaat werd
vervolgens overnacht bij 4° geplaatst. Wanneer de aCD3 coating gebeurde op de dag van het
experiment zelf werd het plaatje in parafilm gewikkeld en minstens 2 uur in de incubator
geplaatst bij 37°. Voorafgaand aan het experiment werd PBS verwijderd uit de wells. De
werden vervolgens nagespoeld met 150 µl/well gesupplementeerd IMDM vooraleer de T
cellen op de aCD3 plaat gebracht werden.
II
Bijlage B
Bijlage B. Fenotype van de T-cel precursoren op dag 6 en 10 in co-cultuur. Expressie van TCRγδ en CD3
bepaald op dag 6 en dag 10 en uitgedrukt in percentages (weergegeven in de plots). Binnen de γδT-cellen werd
de expressie van CD27 en CD1a nagegaan en werd het percentage mature CD27+CD1a- cellen aangegeven in het
kwadrant linksboven.
III
Bijlage C
Bijlage C. Expressie van TCRαβ en TCRγδ op de HSPC tijdens co-cultuur 2. Boven: Flowcytometrische
analyse van TCRαβ, TCRγδ en CD3 expressie tijdens de tweede co-cultuur, weergeven in percentages (%). Er
werd een onderscheid gemaakt tussen de lage densiteit (LD) en hoge densiteit (HD) condities qua
expressiepatroon.
IV
Bijlage D
Bijlage D. Expressie van de maturatiemerkers op de T-celprecursoren in de tweede OP9-DL1 co-cultuur.
Na gating op TCRαβ of TCRγδ cellen werd de expressie van CD27 en CD1a telkens nagegaan, en dit zowel
voor de lage densiteit (LD) als hoge densiteit (HD) conditie. Zowel de percentages van de nog relatief immature
(CD27+CD1a+) als van de reeds mature cellen (CD27+CD1a-) werden in de plots getoond.
V
Bijlage E
Bijlage E. Absolute celaantallen van niet-getransduceerde HSPC na co-cultuur op OP9-DL1. Links:
weergave van de absolute celaantallen op dag 1, 5 en 10 van de co-cultuur waarin de cellen aan lage densiteit
(LD; donkerblauw) werden gebracht. Rechts: Zowel voor de LD als hoge densiteit (HD; rood) werden de
celaantallen, genormaliseerd tegenover de beginwaarden op dag 10, tijdens het verdere verloop van de co-cultuur
uitgezet.
VI
Bijlage F
Bijlage F. Gating op basis van het isotype voor het bepalen van het fenotype van PBMC na stimulatie met
allogene B-cellijnen. De lymfocyten werden gegate op basis van side scatter (SSC) en forward scatter (FSC) en
de levende cellen werden gediscrimineerd op basis van het niet aankleuren met propidium jodide (PI). CD19 cellen werden vervolgens gevensterd om de toegevoegde BCL te elimineren. Expressie van CD137, CD154 en
CD69 werd nagegaan zowel op het CD8α+ als op het CD4+ T-cel subtype.
VII
Bijlage G
Bijlage G. Gating op basis van het isotype voor het bepalen van het fenotype van de aangerijkte PBMC na
2e stimulatie. De lymfocyten werden gegate op basis van SSC en FSC en PI- cellen. CD19- cellen werden
vervolgens gevensterd om de toegevoegde BCL te elimineren en doubletten (CD4+ cellen die zich vasthangen
aan CD8+ T-cellen) werden er tevens uitgehaald met FSC-H en FSC-W, zodat de DP cellen ook werkelijk het
fenotype CD4+CD8+ vertonen. De expressie van CD137, CD154 en CD69 werd nagegaan zowel op het CD8α +
als op het CD4+ T-cel subtype.
VIII
Bijlage H
Bijlage H. Sortering van de CD34- thymocyten op CD1a-. Drie maal werden CD34- thymocyten uit een
postnale kinderthymus geïsoleerd en vervolgens gesorteerd op CD1a -. Pre-sort toont het percentage gesorteerde
mature cellen. Post-sort geeft het percentage zuiverheid weer. Met de mature thymocyten verkregen uit A en B
werden T-cel activatie assays opgezet. De mature thymocyten verkregen uit C werden echter twee keer
gestimuleerd met 3 verschillende bestraalde B-cellijnen en vervolgens geëxpandeerd op feeders en nadieen
aangewend als effectoren in twee chroom assays.
IX
Bijlage I
Bijlage I. Gating op basis van het isotype voor het bepalen van het fenotype van de CD34 +CD1athymocyten na stimulatie met KT, JY en TE8 B-cellijnen. De lymfocyten werden gegate op basis van SSC en
FSC en de levende cellen werden gediscrimineerd op basis van het niet aankleuren met PI. CD19 - cellen werden
vervolgens gevensterd om de toegevoegde BCL te elimineren. Zowel op de CD8α + cellen als op de CD4+ cellen
werd expressie van CD137 en CD154 onderzocht.
X
Bijlage J
Bijlage J. Gatings voor het bepalen van het fenotype van de mature thymocyten 5 dagen na de tweede
stimulatie. De cellen werden gevensterd op SSC, FSC en PI- cellen. CD3+ cellen werden weerhouden zodat de
B-cellen niet werden meegenomen in de analyse. Vervolgens werd de expressie van CD8α + en CD4+ getoond.
XI
Bijlage K
A)
B)
Bijlage K. Gatings voor het sorteren op dag 37 van zowel de co-cultuurcellen als van de mature
thymocyten. A) Gatings van de co-cultuur cellen. Levende cellen werden gegate op FSC, SSC en het niet
aankleuren van PI. Vervolgens werden de doubletten eruit gevensterd m.b.v. FSC-A(area), FSC-W(width), SSCA en SSC-W. Hierop werden de TCRαβ+CD3+ cellen weerhouden, waarna de expressie van CD27 en CD1a
nagegaan werd. De post-sort (zuivering) werd eveneens weergegeven. B) Gatings van de mature CD1athymocyten zijn grotendeels gelijklopend met deze van de co-cultuur cellen behalve dat hier i.p.v. op de
maturatiemerkers echter op CD8α+ cellen gesorteerd werd. Het aantal gesorteerde cellen met het gewenste
fenotype werd telkens weergeven in de laatste gate.
XII
Bijlage L
Bijlage L. Gating van de LD cellen uit co-cultuur voor Cell trace assay op dag 8. Gatings werden hier
getoond voor de cellen gestimuleerd met allogene JY BCL op dag 8 na Cell Trace labeling. De cellen werden
zowel gegate op SSC en FSC als op levende cellen die PI negatief zijn. Verder werden zowel de TCRαβ als de
TCRγδ cellen weerhouden en werd binnen deze populaties telkens gegate op Cell trace + CD1a- cellen die
representatief zijn voor de mature cellen en op Cell trace - CD1a- cellen, representatief voor de cellen die
matureerden en prolifereerden.
XIII
Bijlage M
Bijlage M. Gating van de spontaan gematureerde T-cellen in co-cultuur voor CD137 assay 1. Dode cellen
werden uitgevensterd op basis van FSC, SSC en het aankleuren van PI. CD19 - B-cellen werden eveneens
geëxcludeerd uit de data. De cellen werden verder gegate op zowel TCRαβ als TCRγδ cellen. Binnen deze
celpopulatie apart werden de mature CD1- cellen weerhouden en op basis hiervan werd CD137 expressie
weergegeven. In de conditie met stimulatie op anti-CD3 werden de TCRαβ als TCRγδ cellen samen gegate
waarna opnieuw het aantal mature cellen die CD137 positief waren uitgezet werd.
XIV
Bijlage N
Bijlage N. Gating van de gesorteerde T-cellen, gegenereerd in co-cultuur, voor CD137 assay 2. Boven:
Levende cellen werden weerhouden door te gaten op FSC, SSC en PI negatieve cellen. Hiernaast werd
gevensterd op CD19-negatieve cellen om te vermijden dat B-cellen in de analyse meegenomen werden en
uitgaande van deze cellen werd CD137 expressie gemeten. In de plots werden TCRαβ + cellen getoond aangezien
hierop gesorteerd werd. Onder: Het fenotype van de niet-gestimuleerde cellen werd afgebeeld.
XV
Bijlage O
Bijlage O. Gating van de T-cellen, gegenereerd in co-cultuur, voor CD137 assay 3. De cellen werden gegate
op FSC, SSC, PI- en CD19-. Op basis hiervan werden de CD8β+/CD8α+ cellen weerhouden en het percentage
van deze cellen positief voor CD137 werd bepaald. Gatings werden gebaseerd op een isotype staal.
XVI
Bijlage P
Chroomexperiment 1
In vitro gematureerde T-cellen
In vivo gematureerde thymocyten aangerijkt tegen AUTO KT BCL
In vivo gematureerde thymocyten aangerijkt tegen JY BCL
In vivo gematureerde thymocyten aangerijkt tegen SPS BCL
Auto BCL
KT
9,2
2,6
6,3
8,9
JY
14,4
7,1
0,6
8,7
SPS
9,1
0
0
2,7
Bijlage P. Chroom release assay 1. Zowel de in vitro gematureerde als in vivo gematureerde cellen werden na
sort geëxpandeerd op feeders met IL-2 en 14 dagen later aangewend als effectoren in een chroom experiment.
Als targets werd een autologe BCL (KT) en twee allogene BCL (JY en SP) aangewend. Het gemiddeld
percentage specifieke lysis (%) van de duplo condities voor de effector/target ratio 20:1 werd weergegeven in de
tabel en visueel voorgesteld in de grafiek.
XVII
Bijlage Q
Bijlage Q. Gating en fenotype van de effectoren aangewend in de chroom release assay. Analyse van het
fenotype van zowel de gesorteerde co-cultuur T-cellen, als de gesorteerde mature thymocyten (gestimuleerd met de
KT, SPS of JY B-cellijn). Na gating op FSC, SSC en PI-negatieve cellen werd de expressie van de co-receptoren
CD8α+, CD8β+ en CD4+ nagegaan en het percentage CD8α+CD8β+ werd getoond.
XVII
I
Bijlage R
Bijlage R. Analyse van de expansie van PBMC 13 dagen na feeders. Groei van de PBMC werd geanalyseerd
op basis van de vergelijking met de groei van positieve en negatieve controles. A) Microscopisch beeld van een
negatieve controle 96-well met enkel feeders en medium, in afwezigheid van PBMC. B) Rechts wordt een well
getoond waarin 10 000 PBMC op feeders gebracht werden (positieve controle). C) Foto’s representatief voor de
score die werd toegekend aan de groei van de cellen worden getoond. Van links naar rechts worden de cellen
gescoord als 0, 1, 2 en 3.
XIX
Bijlage S
AIRE
autoimmune regulator
Ag
antigen
Al
antilichaam
APC
antigen-presenterende cellen
APC
allophycocyanin
BCR
B-cel receptor
BM
beenmerg
CAR
chimeric antigen receptor
CD
cluster of differentiation
CD4 ISP
CD4+ immature single positieve cellen
CD40L
CD40 ligand
Cpm
counts per minute
cTEC
corticale thymus epitheliale cellen
CTLA4
cytotoxic T lymphocyte-associated protein
DC
dendritische cellen
D
diversity
DL1
Delta-like ligand 1
DN
dubbel negatief
DP
dubbel positief
E/T
effector/target
EBV
Epstein-Barr virus
ELDA
Extreme limiting dilution analysis
ERK
MAPK-extracellular signal-regulated kinase
FACS
fluorescence-activated cell sorting
FITC
fluoresceïne isothiocyanaat
FCS
foetaal kalfsserum
FL
foetale lever
Flt3L
FMS-like tyrosine kinase 3 ligand
XX
FSC
forward scatter
FTOC
fetal thymic organ culture
HLA
human leukocyte antigen
HSPC
hematopoëtische stam/progenitorcellen
IEL
intra-epitheliale lymfocyten
iIEL
geïnduceerde intra-epitheliale lymfocyten
IL
interleukine
IMDM
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium
iNKT
invariante natural killer T-cellen
IS
immuunsysteem
ISP
immature single positieve cellen
ITAM
tyrosine-gebaseerde activatie motieven
J
joining
KT
kamertemperatuur
LAT
linker for activation of T-cells
Lin-
lineage specifieke merkers
LP
lymfoprep
MACS
magnetic-activated cell sorting
MamL1
mastermind-like protein 1
M-CSF
macrofaag colony stimulating factor
mDC
medullaire dendritische cellen
MEM
Minimum Essential Medium
MFI
mean fluorescence intensity
MHC
major histocompatibility complex
mTEC
medullaire epitheliale cellen
NF-κB
nuclear factor- κB
NK
natural killer cellen
nTh
natural T helper cellen
PBMC
perifeer bloed mononucleaire cellen
XXI
PBS
fosfaat buffer saline
PE
phycoerythrin
PHA
phytohaemagglutinine
PenStrep
penicilline/streptomycine
PNT
postnatale thymus
PI
propidium iodide
RAG
recombinase activerende genen
RBC
rode bloedcellen
Runx3
Runt-related transcription factor 3
scFv
monoclonaal tumor specifiek antilichaam
SCF
stam cel factor
SCZ
subcapsulaire zone
SFK
Src familie kinasen
SP
single positive
TACE
TNF a converting enzyme
TCR
T-cel receptor
TE
effector T-cellen
TCM
centrale memory T-cellen
TEM
effector memory T-cellen
Th
T- helper cellen
ThPOK
Th inducing POZ kruppel factor
TIL
Tumor-infiltrerende lymfocyten
Treg
T-regulatoire cellen
UZ
Universitair Ziekenhuis
V
variable
XXII