Erfelijke fouten herstellen met CRISPR-Cas

(Uit: Contact, magazine van Spierziekten Nederland, juni 2016)
Erfelijke fouten herstellen met CRISPR-Cas
Knippen en plakken in dna
Medisch-biologisch onderzoekers zijn opgetogen: ze hebben instrumenten in handen gekregen om
letters van de erfelijke code, neergelegd in het dna, te vervangen. De meest spraakmakende
methode voor genome editing op dit moment is CRISPR-Cas. Het wordt denkbaar om erfelijke
spierziekten, zoals de ziekte van Duchenne, de ziekte van Becker en facioscapulohumerale
dystrofie (FSHD), aan te pakken door de onderliggende fout in het dna te corrigeren. Zo ver is het
nog lang niet, maar onderzoekers verkennen de mogelijkheden.
Groot was de opwinding in de jaren tachtig toen het mogelijk werd om erfelijk materiaal in cellen in
te brengen. Nu zou het mogelijk zijn om erfelijke ziekten aan te pakken. De redenering is logisch: die
ziekten ontstaan door een fout in een gen, een stuk dna dat de code bevat voor een eiwit. Door de
fout maken cellen het eiwit niet of niet in de goede vorm. Breng dus een functionerend gen in en het
eiwit wordt alsnog geproduceerd. Probleem opgelost. Althans: in theorie.
In de praktijk bleek het toch niet zo eenvoudig. Het was lastig om een gen in te brengen zonder de
activiteit van andere genen te ontregelen en met een goed en duurzaam effect. De zogenoemde
gentherapie kwam moeizamer op gang dan gehoopt.
Voorzichtig
En nu is er sinds een paar jaar iets nieuws: CRISPR-Cas, een methode om een niet-functionerend gen
te herschrijven tot een goed exemplaar. ‘Patiënten vragen er nog niet om’, zegt neuroloog Jan
Verschuuren, hoogleraar aan het Leids Universitair Medisch Centrum (LUMC) en betrokken bij de
behandeling van patiënten met spierziekten. Maar gezien de juichende verhalen zal dat niet lang
meer duren. Verschuuren waarschuwt voor te hoge verwachtingen: ‘De geschiedenis kan zich
herhalen. Dan blijkt over tien jaar dat de praktijk toch weerbarstig is. We kunnen moeilijk voorspellen
wat de techniek voor patiënten met een erfelijke ziekte zal gaan betekenen.’
Onderzoekers Niels Geijsen (hoogleraar Regeneratieve Geneeskunde aan het Universitair Medisch
Centrum Utrecht en verbonden aan het Hubrecht Instituut, Utrecht), Manuel Gonçalves (LUMC,
Moleculaire Celbiologie) en Silvère van der Maarel (hoogleraar Humane Genetica, LUMC) delen die
voorzichtigheid; toepassing in de kliniek is voorlopig niet aan de orde. Maar ze zijn ook enthousiast.
Elegant en makkelijk
Genome editing, zoals met CRISPR-Cas, is echt iets anders dan klassieke gentherapie, benadrukt
Gonçalves. Eleganter omdat de ingreep veel kleiner is. ‘Je brengt geen extra gen in een cel, maar je
repareert het bestaande gen. Dat is een eenmalige ingreep zonder bijeffecten en met blijvend effect.
Doordat het gen op zijn plaats blijft, staat het onder de normale controle van andere genen die
bepalen wanneer en in welke mate het eiwit gemaakt wordt waarvoor het gen codeert. Als de cel
zich deelt, krijgen de dochtercellen elk de gerepareerde versie van het gen.’
Een andere reden voor het enthousiasme voor CRISPR-Cas is, dat het zo makkelijk te gebruiken is.
Van der Maarel: ‘Iedereen kan ermee werken. Toen wij CRISPR-Cas gingen toepassen om in
gekweekte spiercellen te onderzoeken hoe FSHD kan ontstaan, lukte dat al binnen een paar
maanden. Doorgaans kost het veel meer tijd om een techniek onder de knie te krijgen. Voor het
wetenschappelijk onderzoek is deze techniek echt een doorbraak.’
Schaar
CRISPR-Cas doet niets ingewikkelds. Het is een moleculaire schaar die dna kan doorknippen. Maar hij
knipt niet zomaar ergens. Het dna is een lange reeks van vier verschillende letters (A, C, G en T), en
de schaar knipt alleen in een stukje dat een bepaalde volgorde van ruim twintig letters heeft*. Er zit
een stukje rna (dat op dna lijkt) aan de schaar dat specifieke lettercombinatie aanwijst; het is als het
ware een ingebouwde gps. Door een goed aanwijs-rna te maken, laten onderzoekers de schaar
precies knippen op de plaats waar ze het dna willen veranderen.
Na een knip gaat de cel de breuk repareren. Meestal plakken de stukjes dna aan weerszijden van een
knip gewoon aan elkaar vast. Als dat foutloos gebeurt, blijft de lettervolgorde hetzelfde en knipt de
schaar opnieuw. Maar soms gaat er bij het aan elkaar plakken iets fout en verandert de
lettercombinatie. Het aanwijs-rna herkent de plek niet meer en de schaar valt stil. Het dna is
veranderd, maar onderzoekers hebben geen invloed op hoe het dna verandert.
Soms werkt een cel netter. De cel repareert het doorgeknipte dna dan naar voorbeeld van een ander
stuk. De chromosomen, waarin het dna is verpakt, zijn er in tweevoud, dus er is een model
beschikbaar. Onderzoekers kunnen echter ook zelf een model inbrengen door naast het aanwijs-rna
een stukje goed dna aan de schaar te hangen. De cel plakt de breuk niet zomaar, maar zet de letters
aaneen naar voorbeeld van het model. Zo is een fout in een gen echt te repareren.
Bijknippen
Wat kun je daar nu mee in de kliniek? Gonçalves denkt aan een therapie voor de ziekte van
Duchenne, een erfelijke spierziekte die vooral jongens treft. Bij patiënten ontbreekt het eiwit
dystrofine dat de spiercellen stevig maakt, met als gevolg dat de spieren geleidelijk verzwakken.
Boosdoener is een fout in het gen dat codeert voor dystrofine. Er komen verschillende fouten voor,
en bij al die fouten ontbreekt ergens een stukje dna. De letters vormen woorden van drie letters, die
elk coderen voor een aminozuur, bouwsteen van een eiwit. Ontbreekt er een stuk van een niet door
drie deelbaar aantal letters, dan ontstaan verkeerde of onzinnige woorden. De cel begint het eiwit te
maken, maar loopt vast en het gemaakte stuk eiwit gaat verloren.
In gekweekte voorlopercellen van spiercellen, afkomstig van patiënten, probeert Gonçalves daar met
de CRISPR-Cas schaar iets aan te doen. Hij vertrouwt daarbij op het slordige reparatiemechanisme,
omdat de cellen meestal dat mechanisme in werking stellen.
In een eerste benadering laat hij de schaar precies naast het weggevallen stuk dna knippen. In een
deel van de cellen zullen bij het aaneenplakken extra letters wegvallen, en wel zo, dat vervolgens
precies een aantal drieletterwoorden ontbreekt. Dan staan daarachter weer leesbare woorden. Deze
cellen kunnen dystrofine maken dat wat bouwstenen mist. Gonçalves : ‘De ziekte van Duchenne gaat
zo over in de ziekte van Becker, waarbij patiënten een te kort dystrofine-eiwit hebben. Dat geeft
mildere klachten.’
In een tweede benadering maakt hij twee scharen die aan weerskanten van een fout knippen. Dan
zet de cel de lange stukken dna aan elkaar en laat het tussenstukje weg. Als de twee stukjes aanwijsrna goed gekozen zijn, loopt de dna-tekst na reparatie netjes door. Ook dan codeert het gen voor een
eiwit dat iets korter is dan normaal.
Exon-skipping
De al wat oudere methode van exon-skipping heeft hetzelfde effect als het “bijknippen”. Er ontstaat
een wat korter dystrofine-eiwit, waardoor de ziekte van Duchenne overgaat in de ziekte van Becker.
Maar exon-skipping werkt anders en het effect is tijdelijk.
Voor de productie van een eiwit wordt het stuk dna dat daarvoor codeert eerst omgezet in
boodschapper-rna. Dat wordt vervolgens vertaald tot eiwit. Omdat bij de ziekte van Duchenne een
stuk ontbreekt in het dna dat voor dystrofine codeert, ontbreekt dat stuk ook bij het boodschapperrna.
Bij exon-skipping brengt men nu een stukje kunstmatig rna in de spieren dat een stukje van het
boodschapper-rna afplakt zodat het niet kan worden gelezen en vertaald. Dat gebeurt naast de
plaats waar het ontbrekende deel had moeten zitten. Het gat wordt daarmee wat groter, precies zo
dat vervolgens weer zinvolle drieletterwoorden ontstaan en een verkort dystrofine wordt gemaakt.
Bij exon-skipping herstelt men dus het rna. De fout in het dna blijft aanwezig en wordt steeds weer
doorgegeven aan het boodschapper-rna. ‘Afplakstukjes’ moeten daarom regelmatig worden
toegediend.
Ongevaarlijk virus
Mocht de opzet lukken, dan is het de bedoeling om voorlopers van spiercellen uit het lichaam van
patiënten te halen, het dna te repareren en de cellen waarbij dat is gelukt terug te geven. Die cellen
zullen gezonde spiercellen produceren.
Om CRISPR-Cas in de cellen te krijgen, heeft Gonçalves het gen dat codeert voor CRISPR-Cas, dat zelf
een eiwit is, in een adenovirus gezet, net als het aanwijs-rna. Wie het nette reparatiemechanisme wil
benutten, kan ook het model-dna erin stoppen. Het virus infecteert de cellen en levert zijn inhoud af,
de cellen zetten de schaar in elkaar en die doet zijn werk. Het adenovirus is een verkoudheidsvirus.
Gonçalves: ‘We hebben het zo aangepast dat het spiercellen infecteert en ongevaarlijk is. Het
aangepaste virus kan grootschalig geproduceerd worden.’
Het virus is geschikt voor zijn aanpak waarbij cellen buiten het lichaam worden behandeld. Er zijn ook
onderzoekers die mikken op behandeling van cellen in het lichaam. Voor hen is het virus een minder
geschikte leverancier, want het kan een afweerreactie opwekken die geïnfecteerde cellen opruimt en
zo de behandeling minder efficiënt maakt.
Gedwongen opname
In Utrecht heeft Geijsen per toeval een verrassend makkelijk alternatief ontdekt om CRISPR-Cas in
cellen af te leveren. Hij brengt de cellen in contact met een geconcentreerde keukenzoutoplossing
waarin het eiwit CRISPR-Cas is opgelost. De zoute oplossing zuigt het water uit de cellen. Die krimpen
en dreigen te sterven door vochttekort. Noodgedwongen slokken ze de zoutoplossing met CRISPRCas en al naar binnen. Een deel van de membraan neemt dan een hap van de vloeistof en gaat als
blaasje met inhoud de cel in. In de oplossing zit, naast zout, ook propaan-betaïne, dat ervoor zorgt
dat CRISPR-Cas uit het blaasje vrijkomt.
Hoewel de cellen op deze manier behoorlijk gepest worden, houden ze niets aan de behandeling
over; na een dag zijn ze weer helemaal de oude. En dan hebben ze CRISPR-Cas binnen. Geijsen: ‘De
methode is eenvoudig en heel efficiënt. Het CRISPR-Cas eiwit blijft hooguit enkele uren in de cel
aanwezig. Dat is een voordeel, want als de schaar eenmaal zijn werk heeft gedaan, is hij niet meer
nodig. Dan kan hij maar beter snel worden opgeruimd.’
De gedwongen opname is toepasbaar op cellen in een kweek, maar Geijsen is bezig de methode in
muizen verder te ontwikkelen om ook hele spieren te kunnen behandelen. Hij is optimistisch over de
eerste resultaten, maar ook voorzichtig: ‘Alle spieren behandelen zal met deze methode
waarschijnlijk niet haalbaar zijn, maar het herstel van slechts een aantal spieren zou de kwaliteit van
leven aanzienlijk kunnen verbeteren.’
Door Willy van Strien
*De letters van het dna zijn kleine chemische verbindingen: adenine, cytosine, guanine en thymine.
Rna heeft dezelfde letters behalve thymine; in plaats daarvan heeft het uracil.