Antwoorden COIG-cursus Moleculaire biologie najaar 2015

Antwoorden COIG-cursus Moleculaire biologie najaar 2015
Vraag 1.1.a.
Een germ-line mutatie komt voor in alle cellen van het lichaam, en bloed (met witte bloedcellen met DNA
erin) is prima materiaal om de mutatie aan te tonen. Als alternatief kan bijvoorbeeld wangslijmvlies dienen.
Een somatische mutatie komt alleen in een bepaald weefsel voor - hier dus in de tumor - en om de mutatie
aan te tonen is dus tumormateriaal om het DNA te isoleren.
Vraag 1.1.b.
Op chromosoom 1
De chromosoomlocatie is gevonden m.b.v. koppelingsonderzoek (zie hoofdstuk 3).
Vraag 1.1.c.
531 aminozuren betekent een code van 1593 nucleotiden. Daarvoor zit de 5’ untranslated region behorende
bij exon 1, en aan het einde de 3’ untranslated region behorende bij het laatste exon. In het mRNA molecuul
zijn de intronen er al uit gespliced. In dit geval wordt het mRNA bedoeld en niet het RNA molecuul met nog
intronen erin; die worden er al uit geknipt terwijl het RNA molecuul nog in de kern zit.
Vraag 1.2.a.
Bij een mutatie die gevonden wordt in het tumor DNA is niet duidelijk of het om een aangeboren (germ-line)
mutatie gaat of een somatische mutatie in de tumor.
Bloed is het makkelijkst te krijgen, en de witte boedcellen worden meestal gebruikt als bron om germline DNA
uit te isoleren. Als er toevallig ander goed celmateriaal aanwezig is (spier in dit geval) kan dat natuurlijk ook.
Vraag 1.2.b.
Als er een mutatie in het tumor DNA gevonden wordt, dan wil men graag weten of het een somatische
mutatie is (dus in de tumor ontstaan) of een germ-line mutatie. Alleen in het laatste geval is de mutatie ook in
het DNA uit bloedcellen te vinden.
Vraag 1.3.a.
Promotergebied met daarin silencer, enhancer, promoter – transcriptie-initiatiesite – exon 1, met aan het
begin de 5’UTR en startcodon als begin van coderende gedeelte – GT splice site - intron1- AG splice siteexon2……exon17 met als onvertaalde laatste gedeelte na het stopcodon de 3’ UTR met aan het eind de
polyadenylatie site waarna de transcriptie eindigt.
Voorbeeld mutatie in splice site: splicing lukt niet meer, en intron blijft aanwezig in mRNA. Hoogst
waarschijnlijk zit hier wel ergens, na een kortere of langere serie triplets, wel een stopcodon. Mocht de
mutatie in de splice sites voor het laatste intron vallen, ontstaat waarschijnlijk een abnormaal en te kort eiwit,
met een het eind aan aantal verkeerde aminozuren. Indien in eerdere splice sites, gebeurt dit in principe ook,
alleen wordt dan door het mechanisme van “nonsense-mediated-decay” het mRNA vernietigd, waardoor
effectief geen eiwit gevormd wordt.
Vraag 1.3.b
Een RNA molecuul kan nog intronen bevatten en geen polyA-staart hebben: het is nog geen boodschapper
RNA molecuul. In de praktijk wordt de term RNA vaak gebruikt voor zowel onaf RNA als mRNA. Een mRNA
molecuul bevat alleen nog de exonen en heeft als belangrijk kenmerk een polyA-staart. Met behulp van deze
polyA-staart kan met een polyT primer (een groot aantal T’s op een rij) en het enzym transverse transcriptase
een mRNA-DNA duplex molecuul gemaakt worden. Na verwijderen van de mRNA streng kan de nieuwe DNA
streng met een PCR reactie dubbelstrengs gemaakt worden en vermenigvuldigd worden: cDNA (copyDNA of
complementary DNA). Je maakt cDNA dus van RNA en niet van DNA.
Vraag 1.3.c
De reden is dat de PCR primers de sequence reactie verstoren! Die gaat immers ook met primers.
pagina 1 van 13
Vraag 1.3.d.
Lees de onderstaande sequencing reactie.
Rood = T, zwart = G, groen = A, blauw = C.
Vraag 1.4.a.
Als er een mutatie in het tumor DNA gevonden wordt, dan wil men graag weten of het een somatische
mutatie is (dus in de tumor ontstaan) of een germ-line mutatie. Alleen in het laatste geval is de mutatie ook in
het DNA uit bloedcellen te vinden.
Vraag 2.1.a.
Door verlies of invoegen van een of meerdere nucleotiden kan het open reading frame van steeds drie
nucleotiden verstoord worden: frameshift. Dit soort veranderingen in het DNA worden in de vakliteratuur vaak
“indels” genoemd: inserties en deleties... Dit heeft altijd een effect op het eiwit! Het heeft meestal als
consequenctie dat er vroegtijdig een stopcodon ontstaat. Daarvoor kunnen natuurlijk al enige abnormale
codes voor aminozuren ontstaan zijn. Er ontstaat dus een abnormaal en te kort eiwit als de mutatie in het
laatste exon plaatsvindt, en waarschijnlijk geen eiwit als het in een eerder exon zit (door nonsense-mediated
decay).
Vraag 2.1.b.
Bij de PCR worden beide allelen geamplificeerd, waardoor een mengsel ontstaat van PCR product met de
normale hoeveelheid nucleotiden en PCR product met een nucleotide te weinig (deletie) of te veel (insertie).
Bij het direct sequencen worden beide PCR producten ook door elkaar gesequenced. Het begin is hetzelfde,
pas bij de mutatie gaan ze uit de pas lopen en ontstaat het dubbelpatroon.
Vraag 2.2.a.
Doordat een oplossing met een bepaalde plasmide erin (bevattende bv een PCR product), bij een overmaat
aan bacterieen gedaan wordt (die competent gemaakt zijn waardoor ze het DNA kunnen opnemen), wordt
maximaal 1 plasmide per bacterie opgenomen 9en in veel bacterieen niets). Als deze bacterie zich
vervolgens gaat vermenigvuldigen ontstaat een clone van bacterieen die allemaal hetzelfde DNA en
plasmide – met het stukje te cloneren DNA in de plasmide, de insert- bevatten: Het cloneren van het stukje
DNA.
Vraag 2.2.b.
Bij het transformeren van E.Coli neemt een E.Coli bacterie één plasmide met daarin 1 PCR molecuul op,
daar ontstaat een kolonie van. Zo kijkt u dan alleen maar naar één allel, als u vanuit het plasmide het PCR
product gaat sequencen.
pagina 2 van 13
Vraag 2.3.
Ze wilden weten of het hier ging om mutaties of om relatief frequent voorkomende polymorfismen (variaties).
In het laatste geval zou het voorkomen bij de patiënten waarschijnlijk weinig betekenis hebben. Exonen
waarin geen mutaties gevonden werden in de patiëntengroep waren dus niet relevant.
Vraag 2.4.a.
D1S542 ligt op 1q31.1 (centromere kant), HRPT op 1q31.2 en D1S413 op 1q.31.3 (telomere kant). Er zit dus
nog een flink stuk tussen de twee markers en het HRPT2 gen.
Vraag 2.4.b.
Twee dezelfde genen (bv voor BRCA1) op twee chromosomen (van de vader en van de moeder) zijn twee
allelen van dat gen.
Het verschil tussen een polymorfisme en een mutatie zit alleen in de frequentie van voorkomen. Een
polymorfisme is een nucleotidevariant die zich kan handhaven vanwege een weinig schadelijk fenotype,
soms gepaard gaande met een biologisch voordeel, en komt dus vaker voor dan een mutatie (soms wordt 2
of 5 % van de populatie als grens gesteld, dit is natuurlijk arbitrair). Op de plek van een polymorfisme kan bv,
een A staan of een G, men spreekt dan van een A-allel of een G-allel.
In het genoom komen om de paar honderd baseparen polymorfismen voor van een enkele nucleotide: single
nucleotide polymorphisms of SNPs genaamd.
Dinucleotide repeat: een sequentie waarin een volgorde van twee nucleotiden (bv GA) zich een aantal keren
herhaalt. Bij het verdubbelen van het DNA tijdens de celdeling “slipt” het DNA polymerase wel eens bij zich
herhalende sequenties, waardoor er bv een GA te veel of te weinig ontstaat. Daardoor variëren dinucleotide
repeats veelvuldig in lengte in de populatie, en zijn dus heel polymorf (variabel). De verschillende allelen zijn
dus ook makkelijk op lengte van elkaar te scheiden in het lab.
Vraag 2.4.c
Hoe verder weg, hoe makkelijker er een crossover plaats kan vinden tijdens de meiose waardoor de repeat
niet meer overerft samen met het gen waarvan je wil weten of het er nog is. Als dat gebeurt is, is de repat
niet meer informatief over de aanwezigheid of deletie van het gen.
Vraag 2.4.d.
Primers moeten:
Een unieke sequentie hebben, dat wil zeggen: komt maar 1x voor in het genoom
Ongeveer 20-30 nucleotiden lang zijn
Geen palindroom bevatten, dus bijv. aan de ene kant veel T’s en aan de andere kant veel A’s; dan wordt een
hairpin gevormd en kan de primer niet meer aan zijn targetsequentie binden.
De primers mogen geen te lange stukken complementaire nucleotiden bevatten: dan binden ze aan elkaar, in
plaats van aan het te amplificeren DNA.
De hoeveelheden purines (A,G) en pyrimidines (C,T) moeten ongeveer gelijk zijn in de twee primers, zodat
de temperatuur waarbij ze goed binden aan het DNA dan ongeveer gelijk is.
Vraag 2.4.e.
Forward primer:
Reverse primer:
5’ AGCTCCCACAATTGCATAAA 3’
5’ ACCATCAGACCACGATCAAT 3’
PCR Profile:
denature: 30 seconds at 94 degrees C
annealing: 75 seconds at 55 degrees C
extension: 15 seconds at 72 degrees C
PCR cycles: 27
extension: 6 minutes at 72 degress C
Vraag 2.4.f.
Het verlies van één marker allel in tumormateriaal is makkelijker aantoonbaar als er in het germline twee
dinuclotide-allelen van verschillende lengte voorkomen. Als ze dezelfde lengte hebben is het alleen een
quantitatief verschil als er één allel ontbreekt, en dat is moeilijk aan te tonen.
pagina 3 van 13
Vraag 3.1.a.
Bij een prematuur stopcodon is er een mutatie opgetreden in een codon voor een aminozuur, waardoor een
stopcodon is ontstaan. Dit heeft als gevolg dat door het ribosoom een te kort eiwit molecuul (laatste exon), of
geen eiwit (eerder exon) gemaakt wordt. Als het eiwit als een dimeer moet functioneren, is de eerste
mogelijkheid potentieel erg schadelijk:
a. als het te korte eiwit niet functioneel is maar wel kan dimeriseren, zal gemiddeld ¾ van de dimeren niet
functioneren
b. Als het te korte eiwit niet kan dimeriseren en verder niet schadelijk is, zal gemiddeld 50% van de dimeren
nog functioneel zijn, namelijk die moleculen die van de gezonde gencopie komen
c. Als het mRNA direct wordt afgebroken zal er ook nog 50% dimeren zijn, eveneens van de gezonde
gencopie.
Vraag 3.1.b.
Bij transport van het mRNA molecuul naar het cytoplasma gaan de splicing-eiwitcomplexen die nog aan het
RNA vast zitten mee. Ze worden er vervolgens “afgeritst” als het mRNA door het ribosoom gaat lopen. Bij
een stopcodon in het eerste exon worden deze eiwitcomplexen er niet afgehaald en dat zorgt ervoor dat het
mRNA molecuul snel afgebroken wordt: er zal dus geen abnormaal eiwit gemaakt worden. Bij een stopcodon
in het laatste exon werkt dit mechanisme niet omdat dan alle splicing-complexen er al af zijn, waardoor een
abnormaal, te kort, eiwit gemaakt wordt. Het is niet uitgesloten dat zo’n eiwit nog gedeeltelijk kan
functioneren. Als dat eiwit functioneert als onderdeel van een dimeer of trimeer, kan het ervoor zorgen dat
het hele eiwitcomplex niet meer werkt ondanks het feit dat het andere deel van het complex wel normaal is!
Vraag 3.1.c
In exon 1 vier nucleotiden verloren op positie 82 (nucleotide). Daardoor ontstaat een frameshift bij het
corresponderende aminozuur 28 (3x28=84, de code voor dit aminozuur bevindt zich dus op positie 82-84),
resulterend in een stopcodon bij de code voor aminozuur 35. Tussen aminozuur 28 en 35 is de code
veranderd in onzin-aminozuren.
Het gevolg van dit stopcodon is waarschijnlijk uiteindelijk een eiwit tekort, omdat het abnormale eiwit via
nonsense-mediated decay wordt afgebroken (omdat het in het eerste exon zit). Alleen in het laatste exon is
dit niet het geval, er ontstaat dan een abnormaal eiwit.
De tweede mutatie kunt u op vergelijkbare manier beschrijven.
Vraag 3.1.d.
1. Primary tumor 82del4 in exon 1 Somatic Frame shift at amino acid 28; stop codon at 35
No
732delT in exon 8 Somatic Frame shift at amino acid 244; stop codon at 256
Twee verschillende mutaties in het tumor DNA, daardoor zijn beide allelen van het HRPT gen niet meer
functioneel, en wordt er (waarschijnlijk) geen functioneel eiwit meer gemaakt waardoor de cel een
groeivoordeel heeft behaald.
8. Local recurrence 679insAG in exon 7 Germ line Frame shift at amino acid 227; stop codon at 257 No
162C>G in exon 2 Somatic Stop codon Y54X
Een al in het germ-line DNA aanwezige mutatie resulteert in het wegvallen van één HRPT2 allel, een tweede
loss-of-function mutatie in een tumorcel geeft die cel waarschijnlijk een voordeel boven zijn omgeving.
Mogelijk erfelijke predispositie voor deze tumor, in elk geval bij een deel van het nageslacht.
4. Local recurrence 39delC in exon 1 Somatic¶ Frame shift at amino acid 13; stop codon at 20 Yes¶
Een mutatie in de tumor samen met een deletie van het tweede HRPT2 allel in de tumor veroorzaken
waarschijnlijk een totaal verlies aan functioneel eiwit. Niet erfelijk.
Vraag 3.2.a.
Niet erfelijk, beide mutaties in de tumor ontstaan, in verschillende allelen waardoor beide allelen
geïnactiveerd werden.
pagina 4 van 13
Vraag 3.2.b.
De gemeten fluorescentie-activiteit is lager dan bij de germ-line sequencing reactie. Als beide sequencing
reacties tegelijkertijd met dezelfde fluorescerende labels (dus niet verschillend in fluorescentie-capaciteit)
gedaan zijn geeft het wel een indicatie, maar is natuurlijk niet bewijzend voor LOH.
Vraag 3.2.c.
Omdat er twee verschillende fluorescentiesignalen zijn die bijna even sterk zijn, namelijk van het normale
allel en van het gemuteerde allel. In dat geval wordt er geen keuze gemaakt maar een N aangegeven.
Vraag 3.2.d.
Er kan theoretisch ook een mutatie ontstaan zijn in de geslachtscellen van een van de ouders en die is dan
niet in het overige DNA aantoonbaar.
Vraag 3.3.
Om uit te sluiten dat het hier gaat om variaties (polymorfismen) die geen pathologische consequenties
hebben. Dit is met name zo belangrijk omdat geen experimenten zijn gedaan om aan te tonen dat de
gevonden veranderingen inderdaad functionele consequenties hebben voor het gecodeerde eiwit. Sommige
aminozuren kunnen ongestraft veranderen, zonder dat de functie van het eiwit verandert.
Vraag 3.4.a.
Er zou een mutatie in het andere allel kunnen zitten die met deze PCR reacties niet werd gevonden, maar die
wel consequenties heeft voor het eiwit. Bv een mutatie in het promotergebied in een response element of in
het promoterelement (bv TATAA) zelf, waardoor minder eiwit gemaakt wordt. Of in het 3’ UTR gedeelte
waardoor bv de polyA staart niet aan het RNA molecuul wordt gezet, en het RNA te snel wordt afgebroken.
Vraag 3.4.b.
Hot spots in het genoom zijn nucleotiden waar veel makkelijker en frequenter dan elders een mutatie plaats
vindt. Het gaat dan vaak om de verandering van een C naar een T. (en in de andere strand van een G naar
een A). Daarom komen dergelijk mutaties/variaties relatief veel voor, bv bij Factor V Leiden (G→A). C’s zijn
relatief vaak gemethyleerd als ze vooraf gaan aan een G. De gemethyleerde C gaat makkelijk over in een
base die op een T lijkt, en daar tijdens de replicatie voor wordt aangezien.
Vraag 4.1.
Er zijn vele mogelijkheden te vinden, hieronder een paar referenties. Belangrijkste is dat er een zogenaamde
“gain-of-function” mutatie in het gen plaatsvindt, waardoor de werking van het eiwit versterkt wordt, een goed
voorbeeld is de mutatie in het EGF receptor gen (o.a. bij longkanker) waardoor deze groeifactor receptor
continu actief is en niet meer op een normale manier geactiveerd hoeft te worden door een ligand. Zo’n
mutatie kan in het algemeen maar op een plek in het gen zitten.
Abl Oncogene Bypasses Normal Regulation of JAK/STAT Activation Cell Cycle. 2004 Dec 12;3(12)
Li C, Teng RH, Tsai YC, Ke HS, Huang JY, Chen CC, Kao YL, Kuo CC, Bell WR, Shieh B. H-Ras oncogene
counteracts the growth-inhibitory effect of genistein in T24 bladder carcinoma cells. Br J Cancer. 2004 Dec
21; [Epub ahead of print]
N, Senz J, Ferreira P, Masoudi H, Cox K, Nabais S, Lopes C, Machado JC, Seruca R, Carneiro F, Huntsman
DG.Genes Chromosomes Cancer. 2004 Dec 17; [Epub ahead of print]beta-Catenin (CTNNB1) gene
amplification: A new mechanism of protein overexpression in cancer. Suriano G, Vrcelj
Lui WO, Foukakis T, Liden J, Thoppe SR, Dwight T, Hoog A, Zedenius J, Wallin G, Reimers M, Larsson
C.Oncogene. 2004 Dec 20; Expression profiling reveals a distinct transcription signature in follicular thyroid
carcinomas with a PAX8-PPARgamma fusion oncogene.
pagina 5 van 13
Vraag 4.2.a.
Een construct werd gemaakt met daarin het coderende gedeelte van het oncogen met ervoor de promoter
van een gen dat specifiek tot expressie komt in een bepaald weefsel, bijvoorbeeld prostaat. In cellen van dat
weefseltype, maar bij voorkeur niet in andere weefsels, komen dus transcriptiefactoren tot expressie die deze
promoter aanzetten. Het construct werd stabiel geïntegreerd in het genoom van een muis waardoor de
promoter nu in het juiste weefsel (prostaat) ook dit oncogen zal aanzetten.
Als u geïnteresseerd bent kunt u details over het maken van een transgene muis op internet opzoeken (link:
books).
Vraag 4.2.b.
Een muis waarin alleen extra veel ras of alleen extra veel myc werd gemaakt in prostaat of mamma
ontwikkelde hyperplasie, maar geen maligniteit. Na kruising werd in het doelorgaan zowel Ras als Myc
gemaakt en ontwikkelden zich maligniteiten. Uit het artikel is op te maken dat dit op langere termijn pas
gebeurde, reden om aan te nemen dat tussentijds nog meer genen gemuteerd moesten raken om maligne
ontaarding te krijgen. Activiteit van beide genen samen is dus nodig om een maligniteit te ontwikkelen, maar
niet voldoende.
Vraag 4.5.
Het gedeelte van het chromosoom wat verloren is gegaan zou een of meerdere cruciale
tumorsuppressorgenen kunnen bevatten, en op het gedeelte dat erbij gekomen is zouden belangrijke protooncogenen kunnen liggen, bv een groeifactor. Een extra kopie kan in zo’n geval een teveel aan groeifactor
veroorzaken.
Vraag 4.6a.
P16ink4a-p15INK4B: tumor suppressor, loss-of-function, beide allelen
D-type cyclins : oncogene, gain-of-function in 1 allel (of loss-of-function in 2 allelen van een gen waarvan het
eiwit deze cyclins remt)
PRB: tumor suppressor, loss-of-function, beide allelen
E2F: (zie legend bij Fig.1). Transcriptiefactor, geactiveerd door pRB, dus kennelijk heeft E2F een remmende
werking op de progressie van de celcyclus. Het is dus een tumor-suppressorgen, dus loss-of-function, beide
allelen
Vraag 4.6b.
Telomeren zijn overhangende enkelstrengs stukken DNA aan de einden van het chromosoom, die bij elke
celdeling een stukje korter worden. Na een bepaald aantal celdelingen kan de cel zich niet meer goed delen
omdat de einden te kort zijn geworden; veroudering van de cel. Hierbij lukt de replicatie van de
chromosoomeinden niet goed meer, er ontstaan grove afwijkingen en dit resulteert meestal in apoptose van
de cel. Het telomerase kan de telomere einden op lengte houden, waardoor de cel meer celdelingen door
kan.
Een kankercel zorgt ervoor dat op een of andere manier de telomeren op lengte gehouden worden, of de cel
activeert weer de afschrijving van telomerase, waardoor dit hoger tot expressie komt, of er wordt een ander
mechanisme geactiveerd.
Vraag 4.6.c
U verwacht in het Ras gen een gain-of-function mutatie. Daarvan zal er naar verwachting een zeer beperkt
aantal zijn (itt loss-of-function mutaties, zie hoofdstuk 3 van het werkboek). U zou in de literatuur kunnen
kijken of deze mutaties beschreven zijn en of er een simpele PCR te doen is waarmee zonder sequencen is
vast te stellen of de mutatie aanwezig is. Makkelijk zou bv zijn als de plaats van de mutatie(s) deel uitmaakt
van een restrictiesite (zie hoofdstuk 2) die verloren gaat in aanwezigheid van de mutatie. Door het PCR
product te knippen met het juiste restrictie-enzym kan eenvoudig onderscheid gemaakt worden tussen
wel/geen mutatie. De PCR producten worden op een gel op grootte van elkaar gescheiden.
pagina 6 van 13
Vraag 5.1.
Mutaties in de noncoding gebieden van MLH1/MSH2 (bv promotergebied), of een epigenetische verandering
(dus abnormale CpG methylering) in het promotergebied van een mismatch repair (MMR) gen, hetgeen niet
met mutatiediagnostiek aan te tonen is. Daarnaast kunnen natuurlijk mutaties in de andere bekende, of nog
onbekende, mismatch repair (MMR) genen aanwezig zijn.
Vraag 5.2a.
Vb. van een mononucleotide marker: AAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Dinucleotide marker: AGAGAGAGAGAGAGAGAGAG
Een mononucleotide repeat in het coderende gedeelte van een gen kan bij mismatch repair deficiency
(MMR) leiden tot een frame-shift doordat bij celdeling een nucleotide teveel of te weinig in het DNA gezet
wordt. Dit leidt in het algemeen tot een prematuur stopcodon. In het eerste exon leidt dit tot “nonsensemediated decay” en dus zal geen eiwit gemaakt worden (wel natuurlijk van het andere normale allel, dus de
helft van het eiwit is in principe nog aanwezig); in het laatste exon wordt het abnormaal korte eiwit dan wel
gemaakt: dit kan wel of geen gevolgen hebben voor het functioneren van het eiwit, afhankelijk van de
afwijking.
In een intron hangt de consequentie af van de relevantie van het repeat-gedeelte voor bijvoorbeeld de
regulatie van de transcriptie van het gen (er zitten in het eerste intron vaak regulatoire elementen,
vergelijkbaar met die in een promoter gebied, mogelijk ook codes voor miRNAs). Maar vaak zal dit minder
ernstige functionele consequenties hebben.
Vraag 5.2b.
Figuur 2 laat zien dat bij vergelijking van germ-line DNA (bovenste deel) en tumor DNA (onderste deel) een
microsatelliet verschil zichtbaar wordt. Er zijn hier twee microsatelliet-markers gePCRed, Bat26 (een
mononucleotide repeat) en D2S123 (een dinucleotide repeat). In het germ-line DNA blijken ze op beide
chromosomen dezelfde lengte te hebben: homozygoot.
In het tumor DNA blijkt 1 BAT26 een afwijkende lengte te hebben, en beide D2S123 allelen, wat duidt op
microsatelliet-instabiliteit.
Vraag 5.3.
Omdat bij het I1307K polymorfisme in het APC gen een repeterende sequentie van een rij A’s ontstaat,
waarop het DNA polymerase bij de celdeling makkelijk “slipt” waardoor er in de dochtercel een A te weinig of
te veel voorkomt. En dat heeft wel desastreuze gevolgen!
Vraag 5.4.a
Kennelijk spelen MMR genen niet in alle celtypen dezelfde belangrijke rol, of omdat de cellen minder vaak
delen of omdat bv andere reparatie-enzymen daar tot expressie komen die dezelfde werking hebben. Of de
proto-oncogenen met microsatellieten in hun coderende gedeelte die na mutatie als oncogen een rol spelen
bij de groei van colorectaaltumoren geven alleen groeivoordeel aan bepaalde celtypen, maar niet aan
allemaal.
Het zou ook nog kunnen dat epigenetisceh veranderingen die het tweede MMR allel moeten uitschakelen
alleen voorkomen in bepaalde celtypen.
Vraag 5. 4.b.
Zie ook hoofdstuk 2 van het werkboek. Verandering van een aminozuur in een eiwit betekent niet
automatisch dat de functie van het eiwit verandert, zoals dat bij premature stopcodons in principe wel het
geval zal zijn.
Een ander aminozuur in een eiwit hoeft ook niet altijd een veranderde functie te veroorzaken – hangt
helemaal van de plaats en functie van het aminozuur binnen het eiwit af. Het is dus erg moeilijk/onmogelijk
om vanuit een onbekende missense mutatie een voorspelling te doen tav de (klinische) consequenties....
Om de oorzakelijk rol van een mutatie bij een aandoening vast te stellen moet eerst de functieverandering
aangetoond worden.
Het eenvoudigste is om dat in vitro te doen, in een cellijn. Men heeft hiervoor een plasmide (een
zogenaamde expressieplasmide) nodig met erin het coderend gedeelte van bv het MLH1 gen dat in dit geval
niet door de eigen promoter aangestuurd wordt, maar door een artificiele promoter (bv. uit het CMV virus) die
in het plasmide voor het coderend gedeelte is “geplakt”. De plasmide wordt gecloneerd (vermenigvuldigd) in
E. Coli en vervolgens getransfecteerd (zie hoofdstuk 2 van het werkboek) in een cellijn. De CMV promoter
zal, nu het plasmide in een cel zit, zorgen dat er continu MLH1 mRNA gemaakt wordt, en dus ook het MLH1
pagina 7 van 13
eiwit. Vervolgens kan een functietest ontworpen worden met behulp van de cel waarin het eiwit tot expressie
komt. Eventueel kan het eiwit ook uit de cel geïsoleerd worden voor een in vitro test op functionaliteit.
Met behulp van de site-directed mutagenesis techniek kan eenvoudig in het plasmide elke gewenste mutatie
aangebracht worden in het coderende gedeelte van het MLH1 gen, waarna ook dit plasmide gecloneerd
(vermenigvuldigd) en in een cellijn getransfecteerd wordt, dit keer met het doel om het abnormale eiwit tot
expressie te brengen. Dan kunnen beide eiwitten functioneel met elkaar vergeleken worden.
Vraag 5.4.c.
Het geïsoleerde DNA knipt u met een (of meer) restrictieenzymen in kleine stukjes. U kiest restrictie-enzymen
die knippen in het MSH2 gen (de plekken in het DNA sequentie waar een restrictieenzym knipt kunt u
opzoeken op de site: http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.html (indien gewijzigd, zoek met Google naar
Webcutter).
Het geknipte DNA denatureert u bij 1000C waardoor al het DNA enkelstrengs wordt. Met gelelectroforese
worden de fragmenten op grootte van elkaar gescheiden.
Het DNA op de gel wordt geblot. De blot wordt vervolgens geincubeerd met radioactief gelabelde DNA
probes (ook enkelstrengs gemaakt), die verschillende gedeelte van het MSH gen herkennen. Als probe
gebruikt u meestal cDNA dat gemaakt is van MSH2 RNA mbv reverse transcriptase, of gePCRred op
genomisch DNA. Daarna is het radioactief gelabeld. (zie hoofdstuk 2 van het werkboek). De probe herkent de
DNA fragmenten die de betreffende sequentie uit het MSH2 gen bevatten. Bedenk dat er in het DNA twee
allelen aanwezig zijn. Als er een knipsite in een allel van het MSH2 gen weggevallen is door een deletie (of
mutatie), dan is dat te zien op de blot doordat het fragment van het MSH2-gen dat gebonden wordt door de
radioactieve probe langer is dan normaal. Er ontstaat dan een tweede bandje op de blot (naast het bandje
van het normale allel) dat meer naar boven op de blot ligt.
Vraag 6.1.
Dat het gen niet meer wordt afgeschreven, dwz dat er geen mRNA meer van gemaakt wordt. Dit kan via
verschillende mechanismen, een ervan is promoter CpG methylering.
Vraag 6.2.a
CpG eialnden bevinden zich in het promotergebied van bepaalde genen, waarbij ze een rol spelen bij het
meer permanent aan- en afzetten (methylering van CpGs) van het gen. De Cs in deze gebieden zijn
waarschijnlijk niet gemuteerd tijdens de evolutie omdat ze een belangrijke functie hebben en dus niet mogen
verdwijnen.
Vraag 6.2.b.
¼ x ¼ x ¼ x ¼ = 1/16 = 1/256 Dus theoretisch ongeveer 250 nucleotiden lang. Waarschijnlijk langer omdat
relatief veel C’s gemuteerd zijn geraakt naar T’s, waarbij deze restrictieplaatsen verloren gingen.
¼ x ¼ x ¼ x ¼ x ¼ x ¼ =1/4096 Gemiddeld ongeveer 4000 nucleotiden lang.
Vraag 6.2.c.
Hot spots zijn gemethyleerde C’s die door de-aminering (verwijdering van kunnen veranderen in een T (dus
CG wordt TA).
(link: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=mga.figgrp.1027) .
Methylering van C’s gebeurt alleen bij de dinucleotide CpG. Die komen voor in het promotergedeelte en in
het coderende gedeelte van het gen. De promoter gebieden van genen zijn meestal niet CpG gemethyleerd,
de coderende gedeelten wel, transcriptie geeft er geen last van. Als we de CpGs zoeken dan vinden we:
CCGCCCTCCTCTCGCCCCAGGGACATATAAAGGCAGTTGTTGGCACACCCAGCCAGCAGACGCTCCCT
CAGCAAGGACAGCAGAGGACCAGCTAAGAGGGAGAGAAGCAACTACAGACCCCCCCTGAAACAACCCT
CAGACGCCACATCCCCTGACAAGCTGCCAGGCAGGTTCTCTTCCTCTCA
met ser thr glu ser met ile arg asp
val glu leu
CATACTGACCCACGGCTTCACCCTCTCTCCCCTGGAAAGGACACC ATG AGC ACT GAA AGC ATG ATC
CGG GAC GTG GAG CTG
Een mogelijk hot spot zou kunnen zijn: de C uit CGG (Arg) en de C uit GAC (Asp). De eerste mutatie heeft
als consequentie vervanging van Arg door Trp; de tweede is een neutrale mutatie waardoor geen aminozuur
verandert.
pagina 8 van 13
In celtypen waar het TNFα gen inactief is, zou het promotergebied wel gemethyleerd kunnen zijn, in dat
geval vormen de voorkomende CpGs ook mogelijke hot spots. In dat geval heeft vervanging door een T
alleen consequenties als daardoor de transcriptieregulatie beïnvloed wordt, bv in een response element of
doordat minder methylering kan plaatsvinden.
Vraag 6.3.a.
Ze binden speciale CpG-bindende eiwitten, die een rol spelen bij het minder toegankelijk maken van het DNA
voor transcriptiefactoren doordat histone-eiwitten uit het chromatine gedeacetyleerd worden (daardoor
worden deze eiwitten minder negatief geladen en binden steviger aan het DNA). Daarnaast interfereren
methylgroepen (en bindende eiwitten) mogelijk direct met binding van transcriptiefactoren aan hun response
element.
Vraag 6.3.b.
Bij de evolutionair geconserveerde CpG’s, mn ook die CpG’s die onderdeel uitmaken van een geconserveerd
response element.
Vraag 6.3.c.
Verlies van imprinting: dan functioneert het IGF2 gen als een oncogen en stimuleert celgroei.
Heterozygote loss-of-function mutatie: Als de mutatie op het ge-imprinte allel ligt gebeurt er niets, als het op
het actieve allel ligt resulteert het in een volledig verlies aan IGF in die cel. De keuze welk X-chromosoom
door imprinting geïnactiveerd zal worden gebeurt random, zodat een mozaïek zal ontstaan van cellen die wel
en cellen die geen IGF maken. In het algemeen zal er in een orgaan ongeveer de helft van de normale
hoeveelheid IGF geproduceerd worden.
Vraag 7.1.a.
Verschillende combinaties van een loss-of-function mutatie, deletie met LOH, en CpG methylering van de
MLH1 promoter. Hierdoor ontstaat volledig verlies van het MLH 1 tumorsuppressoreiwit, microsatellietinstabiliteit met als gevolge colon adenoom en carcinoom.
Vraag 7.1.b.
Het vinden van abnormaal gemethyleerde genen kan een aanwijzing zijn dat het om een maligne cel gaat,
het gemethyleerde gen zelf hoeft daarbij geen rol te spelen. De methylering op zich betekent dus niet
automatisch dat het verlies van HPRT2 functie een causale rol heeft gespeeld bij het ontstaan van dit
carcinoom. Misschien kwam dit gen in een niet-maligne colonepitheelcel wel helemaal niet tot expressie.
Een afwijkend methyleringsmechanisme, geassocieerd met een maligniteit, heeft vaak als gevolg dat
promotergedeelten van veel genen abnormaal gemethyleerd zullen worden. Bij de meeste heeft dat
waarschijnlijk geen ernstige consequenties.
Vraag 7.1.c.
Nee, de verminderde aanmaak van mRNA die te zien is op de microarray kan het gevolg zijn van een mutatie
in bv. het promotergebied van Hic-1 waardoor een belangrijke transcriptiefactor niet meer bindt, of in het
poly-adenylatiesignaal waardoor de polyA-staart niet goed gemaakt wordt, of er is een prematuur stopcodon
waardoor het RNA wordt afgebroken, maar ook methylering van de promoter kan een rol spelen, mits er een
CpG eiland in het promotergebied aanwezig is. Verder zou het natuurlijk ook een indirect gevolg kunnen zijn
van een epigetische of genetische afwijking in een ander gen dat belangrijk is voor de aanmaak van Hic-1.
Vraag 7.2.a.
Twee soorten: transcriptioneel actief euchromatine (hier kunnen dus genen afgeschreven worden en mRNA
gemaakt), en heterochromatine waarbinnen geen transcriptie kan plaatsvinden: silent chromatin.
Chromatine is opgebouwd uit histone-eiwitten. Verschillende post-translationele modificaties (acetylering,
phosphorylering, methylering van bepaalde amnozuren in de histone eiwitten) aan deze histone-eiwitten
bepalen de toegankelijkheid van het onderliggende DNA voor transcriptiefactoren, en dus de mogelijkheid het
DNA te gebruiken en genen af te schrijven.
Ze kunnen in elkaar overgaan, afhankelijk van het wel of niet plaats vinden van transcriptie op een gedeelte
van een chromosoom. Sommige stukken van het genoom zijn echter tijdens de differentiatie vrij permanent
geïnactiveerd door histon-eiwit veranderingen samen met DNA methylering die samen leiden tot
heterochromatine.
pagina 9 van 13
Vraag 7.2.b.
Door een mutatie in een transcriptiefactor-gen zou de veranderde transcriptiefactor DNMT1 kunnen binden
en meenemen naar de promoters van genen, die vervolgens gemethyleerd zouden kunnen worden. Als daar
tumorsuppressorgenen bij zijn worden die geïnactiveerd.
Vraag 7.2.c.
Nucleosomen bestaan uit een octameer van vier verschillende histone-eiwitten, waaromheem twee strengen
DNA gewikkeld zijn, samen ongeveer 140-150 nucleotiden. In niet actief afgeschreven DNA liggen de
nucleosomen op regelmatige afstanden als beads on a string.
Transcriptiefactoren kunnen niet bij het DNA van de nucleosomen komen om transcriptie te initiëren.
Daarvoor moet het nucleosoom zich eerste “ontrollen”.
Vraag 7.2.d.
Histone 3 (H3):
Histone 4 (H4)
Zonder veranderingen → silencing?
Methylering lysine 9 → silencing effect
Methylering lysine 4 → activering transcriptie
Acetylering lysine 14 → activering transcriptie
Fosforylering serine10 en 18 → celdeling
Fosforylering serine 10, methylering lysine 14: activering transcriptie
Zonder veranderingen → silencing?
Acetylering lysine 8 + 16 → activering transcriptie
Vraag 7.3.a
Bij een celdeling wordt het als cytosine geïncorporeerd in het nieuw gemaakte DNA, echter zit op de 5 positie
in de chemische ring een N in plaats van een C, waardoor er daar geen methyl (NH3) groep meer aangezet
kan worden. De delende cellen verliezen dus de CpG methylering.
Bijwerkingen kunnen potentieel ontstaan doordat normaal wel gemethyleerde genen nu gedemethyleerd
raken en transcriptioneel actief worden.
Vraag 7.3.b.
This phenomenon suggests that prolonged drug regimens will be necessary to maintain the inhibition of DNA
methylation and preserve transcriptionally repressive active chromatin.
Vraag 7.3.c.
Een verandering in methyleringspatroon zit steeds op dezelfde plek in de promoter van een gen en is dus
makkelijker met de juiste methyleringsgevoelige PCR (bisulphate-PCR) aan te tonen dan een loss-of-function
mutatie die overal in een gen kan zitten.
Vraag 7.3.d.
Omdat voor de bisulphite PCR voor het aantonen van gemethyleerde promoter andere primers zijn gekozen
waardoor het PCR product korter is. We weten overigens niet hoeveel korter, want datis van het plaatje niet
af te lezen. Er zijn verschillende mogelijkheden om een PCR te ontwerpen om CpG methylering aan te tonen.
In dit geval zijn de primers waarschijnlijk zo gekozen dat ze binden op een plek waar CpG sites zitten. Een
primer die daar G heeft staan zal alleen binden in geval van gemethyleerde CpG’s. Een primer die op die
plek een A heeft staan zal alleen binden in geval van ongemethyleerde CpG’s waarvan de C veranderd is in
een U. Door deze twee primers op iets verschillende plekken te kiezen ontstaan afhankelijk van de gebruikte
primer een langer of een korter PCR product.
Het PCR product wordt vervolgens gesequenced om eventuele tussenliggende CpG sites te karakteriseren
mbt methylering. Niet alle CpG sites binnen een CpG eiland hoeven gelijkelijk gemethyleerd te zijn.
AGACGATACGTTGAATGAATGCGGAG………ATGCCTGATAACGAGTCGAACGATGCCACGTGAACTATT
GCCCCG
TGCTATGCAACTTACTTACGCCT→ ←ACTATTGCTCAGCTTGCTACGGTGC
TCTACTATACAACTTACTTACG → ←TTACTACGGTACACTTGATAACGGG
pagina 10 van 13
Vraag 7.4.
Pathogenese: Abnormale methylering van de promoter van tumor-suppressorgenen leidt tot verlies van
tumor-suppressoreiwit. Verlies van promoter methylering (imprinting) kan een oncogen activeren. Verlies van
DNA methylering rond de centromeer van het chromosoom leidt tot genetische instabiliteit. Uiteindelijk kan dit
allemaal bijdragen tot het ontstaan van een maligniteit. Onderzoek naar de functie van gemethyleerde genen
geven inzicht in de tumorsuppressoreiwitten die een rol spelen bij het ontstaan van de maligniteit
Vroege diagnostiek: in sputum, urine lymfklieren etc. kan met behulp van de methylering gevoelige PCR
gemethyleerde genen aangetoond worden, mogelijk voordat de tumor maligne ontaard is.
Prognostisch: methylering van bepaalde genen kan een aanwijzing geven over de lange termijn prognose
Methylering van bepaalde DNA-reparatie eiwitten kan betekenen dat er een verhoogde gevoeligheid bestaat
voor bepaalde alkylerende cytostatica (omdat de schade niet meer gerepareerd kan worden in de tumorcel).
Vraag 8.1.
Verbeteren van de sensitiviteit van de fecale DNA test.
Toevoegen van meer markers aan het panel:
 Methyleringsgevoelige PCR om methylering van MLH1 promoter te detecteren
 Dinucleotide repeat marker D2S123
 Veel voorkomende mutaties in MLH1, MSH2, MSH6
Voor de toekomst zou het waarschijnlijk ook efficiënter zijn om de verschillende mutaties met behulp van een
microarray te detecteren. We komen op deze techniek in een latere opdracht terug.
Vraag 8.2
Deze verrijkingsstap is nodig omdat er voornamelijk bacterieel DNA in het sample zit. (En misschien ook nog
resten DNA uit de voeding)
Vraag 8.3
Volgens de theorie van Vogelstein zou je kunnen verwachten dat naarmate het adenoom evolueert, er naast
APC meer markers positief zouden worden. Dit lijkt mogelijk het geval te zijn voor p53, maar niet zozeer voor
K-ras
Opmerkelijk is ook dat bij patiënten zonder poliepen er toch positieve uitkomsten waren. De vraag is
natuurlijk of deze mensen t.z.t. poliepen ontwikkelen, die bijvoorbeeld bij de coloscopie nog gemist waren.
Opmerkelijk verder is dat bij High grade dysplasia zowel long DNA als K-ras vaak positief waren.
De microsatelliet marker geeft geen evidente informatie in het adenoomstadium.
Echter statistiek ontbreekt op deze tabel zodat de betekenis van de onderlinge verschillen niet duidelijk is.
Vraag 9.1
Er wordt bedoeld dat het eiwit PTEN (en het gen) sterk lijkt op het eiwit (gen) tensin.
Vraag 9.2
PTEN remt de deling en migratie van een cel (door sterkere adhesie van de cel aan de extracellulaire matrix,
hierdoor kan metastasering geremd worden) en speelt een rol in apoptose.
Vraag 9.3.
Overexpressie van ErbB2 (HER2) wordt meestal veroorzaakt worden door amplificatie van het gen voor
ErbB2 in het tumor genoom. Dat wordt nu aangetoond op eiwitniveau mbv immuunhistochemie op een
weefselcoupe waarbij meer dan normaal HER2-kleuring te zien is. Een andere manier is met FISH (zie
werkboek: technieken) direct het aantal genkopieën in de cellen van een weefselcoupe te bekijken.
In de toekomst kan dit waarschijnlijk ook goed (en veel nauwkeuriger) met DNA sequencing technieken.
Vraag 9.4
a. Indien niet gefosforyleerd, dus als de ErbB2 receptor niet geactiveerd is, remt PTEN het PI3K zodat PIP3
en Akt niet meer gefosforyleerd kunnen worden. PIP3 versterkt de kinase activiteit van PI3K, maar is zelf
geen kinase (en ook geen eiwit!).
b. Trastuzumab zorgt dat de ErbB2 receptor niet meer in contact komt met Src, waardoor het Src eiwit
geinactiveerd wordt, en PTEN niet langer gefosforyleerd wordt. PTEN kan nu PI3K remmen zodat Akt en
PIP3 niet gefosforyleerd worden.
pagina 11 van 13
c. De deactivering van Src met als gevolg remming van de PI3K–Akt stap door PTEN is kennelijk essentieel
voor het werkingsmechanisme van Trastuzumab. In afwezigheid van PTEN bindt Trastuzumab
waarschijnlijk nog wel aan ErbB2, en inactiveert Src, maar er kan geen PTEN geactiveerd worden, en een
remmend effect op het tumorigene signaal blijft achterwege: resistentie
Vraag 9.5
Mogelijk is er een deletie of mutatie in het gen voor PTEN, waardoor er onvoldoende eiwit in de cel gemaakt
wordt. In afwezigheid van PTEN bindt Trastuzumab waarschijnlijk nog wel aan ErbB2, en inactiveert Src,
maar er kan geen PTEN geactiveerd worden, en een remmend effect op het tumorigene signaal blijft
achterwege: resistentie. Om dit vermoeden te bevestigen kunt u met een simpele immunohistochemistry test
op een weefselcoupe kijken hoeveel PTEN nog aanwezig is. Andere nieuwere technieken zouden
aanvullende informatie kunnen geven over de hoeveelheid PTEN, bv een quantitatieve PCR op het mRNA
voor PTEN, of sequencing van het PTEN gen om een deletie of mutatie op te sporen
Andere oorzaken kunnen een overactiviteit van ErbB2 of PI3K eiwitten zijn, als gevolg van een gain-offunction mutatie of gen amplificatie. En soms is er nog geen oorzaak te vinden.
Vraag 9.6
Bij die patiënten wordt de helft van de normale hoeveelheid PTEN eiwit gemaakt, door het normale allel.
Kennelijk is bij het PTEN gen de helft al onvoldoende voor een “normale” functie van het eiwit (we noemen
dat haplo-insufficiëntie). Met een medicijn dat zou aangrijpen op bv. de promoter van het PTEN gen zou de
transcriptie, en eiwit-aanmaak, kunnen toenemen. Bijvoorbeeld een klein molecuul (kan makkelijk de cel in)
wat een remmende (“silencing”) transcriptiefactor zou kunnen blokkeren. Een medicijn zou echter ook
kunnen aangrijpen op de turnover van mRNA of PTEN-eiwit. Hiervoor is in het algemeen wel één normaal
functionerend gen nodig.
Vraag 10.1
De referentiegenen zouden in gelijke mate bij elk individu tot expressie moeten komen, ze geven dus aan of
de RNA isolatie en de RT-PCR reactie goed gegaan zijn
Vraag 10.2
Het patiëntenmateriaal bestaat nooit uit homogeen tumormateriaal, zonder andere celtypen. Andere celtypen
die aanwezig zijn in het tumor-sample kunnen de totale mRNA hoeveelheid van de 21 assay-genen (bv. een
oncogen als HER2) beïnvloeden waardoor de “recurrence score” niet meer goed werkt. Het gebruikte
criterium is dat minstens 5% van het preparaat uit tumorcellen moet bestaan, en bij minder dan 50%
tumorcellen worden de stukken zonder tumorcellen verwijderd.
Er lijkt nog een grote mate van variabiliteit toegestaan te zijn. Lees ook de ingezonden commentaar-brieven:
NEJM 2005, 352:1605-1607.
Vraag 10.3
De procedure heet FISH (Fluorescent In Situ Hybridization). Chromosomaal DNA in tumorweefselcoupes of
tumorchromosomen wordt gedenatureerd waardoor het DNA enkelstrengs wordt. Een stukje DNA (DNA
probe) waarvan de nucleotidenvolgorde identiek is aan een stuk sequentie in het ErbB2 gen in het
chromosomale DNA wordt fluorescerend of radioactief gemerkt. De probe wordt gedenatureerd tot
enkelstrengs DNA en de enkel-strengs DNA fragmenten zullen binden (hybridiseren) aan hun
complementaire sequenties op het chromosomale DNA. Het aantal plekken op de chromosomen waar
vervolgens een (radioactief of fluorescerend) signaal gevonden wordt, geeft aan hoeveel kopieën van de
gezochte sequentie (dus het gen) aanwezig waren in de tumorcel (de normale twee allelen, of meer of
minder dan twee).
Amplificatie betekent in dit geval dat er meer dan de normale twee kopieën gevonden worden. Als alle drie
allelen actief gebruikt worden om mRNA van te maken resulteert dat in overexpressie van ErbB2.
Misschien is de amplificatie veroorzaakt door chromosomale instabiliteit, misschien is al eerder een cel
ontstaan met deze genomische fout erin die een groot groeivoordeel gaf.
pagina 12 van 13
Vraag 10.4
Er zijn vele mogelijkheden te verzinnen:
 Selectie voor cellen met een mutatie in een onbekend gen (bv een tyrosine-kinase receptor voor een
groeifactor), of bv amplificatie van het HER2 oncogen, waardoor een signaaltransductiepad geactiveerd
wordt dat het negatieve signaal via Tamoxifen-oestrogeenreceptor teniet doet.
 Tamoxifen bereikt de maligne cellen onvoldoende, bv te snelle afbraak.
 Er is selectie opgetreden van een maligne cel met een mutatie in de oestrogeenreceptor waardoor die
geen Tamoxifen meer bindt.
Vraag 10.5
Voordelen 21-genen assay:
op paraffine/gefixeerd materiaal, goedkoper dan microarray, makkelijker reproduceerbare resultaten, en
eenvoudig te interpreteren. Dus ideaal voor (routine) klinische setting.
Nadelen:
bepaalde informatieve genen kunnen afwezig zijn in het samengestelde panel en wel aanwezig zijn in de
microarray. Dat is echter in een research setting (bv academisch ziekenhuis) belangrijker dan in een puur
klinisch diagnostische setting (perifeer ziekenhuis).
Door gebruik van beperkt aantal genen waarschijnlijk alleen bruikbaar voor specifieke situatie (in dit geval
niet bruikbaar zonder adjuvant-behandeling).
Vraag 10.6
Een aantal genen van het panel zijn zogenaamde oestrogeen-gevoelige genen, dus genen waarvan de
afschrijving omhoog gereguleerd wordt door oestrogenen via de oestrogeenreceptor in de cel. Dat betekent
dat deze genen verhoogd tot expressie komen bij tumoren waarbij de oestrogeen-receptor in de tumorcellen
aanwezig is. Als de bijbehorende eiwitten een oncogene werking hebben, en Tamoxifen via de
oestrogeenreceptor de expressie ervan zal verlagen, voorspelt de test dus eigenlijk de anti-tumorrespons op
Tamoxifen. Als geen adjuvant behandeling gegeven wordt, heeft de test dus geen waarde.
=*=*=
pagina 13 van 13