Voorkomen en endogene vorming van het synthetische

UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep: Veterinaire Volksgezondheid en Voedselveiligheid
Laboratorium Chemische Analyse - Merelbeke Ugent
Academiejaar 2009-2010
Voorkomen en endogene vorming van
het synthetische thyreostaticum,
thiouracil, in diverse biologische matrices
Nathalie DE CLERCQ
Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor
Dr. L. Vanhaecke
Copromotor
J. Vanden Bussche
Commissarissen
Prof. S. De Saeger
Dr. C. Van Poucke
AUTEURSRECHT
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar
te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de
beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting
uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”
21 mei 2010
Promotor
Dr. Lynn Vanhaecke
Auteur
Nathalie De Clercq
Dankwoord
Zonder enkele bijzondere mensen zou dit alles nooit gelukt zijn!
Hierbij wil ik eerst mijn promoter, Dr. Lynn Vanhaecke, bedanken om mij de
kans te geven aan het Labo van Chemische Analyse mijn masterproef te maken.
Ook mijn oprechte dank aan Julie Vanden Bussche! Wat had ik zonder u
gedaan? Bedankt voor alle tijd en geduld die je voor mij opgebracht hebt! Ik heb
ontzettend veel van je geleerd. Een heel dikke merci!
Bedankt ook aan alle mensen die mij in het labo tot vervelens toe alles
uitlegden!
En tot slot, maar zeker niet minder belangrijk, mama, papa en David voor het
meermaals nalezen van mijn schrijfwerk en de morele steun.
Dank u wel!
1. INLEIDING .............................................................................................................. 1
1.1.
THYREOSTATICA ........................................................................................... 1
1.1.1.
Xenobiotische thyreostatica ..................................................................... 2
1.1.2.
Natuurlijke thyreostatica ......................................................................... 3
1.1.3.
Anorganische moleculen .......................................................................... 5
1.2.
WETGEVING THYREOSTATICA .................................................................. 5
1.3.
DETECTIE THYREOSTATICA ....................................................................... 6
1.4.
XENOBIOTISCH OF ENDOGENE STATUS .................................................. 9
1.5.
BRASSICACEAE EN VEEVOEDER ............................................................. 10
1.6.
SIMULATIE VAN DE SPIJSVERTERING ................................................... 11
1.6.1.
Spijsvertering van varken en rund ....................................................... 11
1.6.2.
Digestiemodellen ..................................................................................... 14
1.7.
ANALYSEMETHODEN ................................................................................. 14
1.7.1.
Vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie ............ 14
2. OBJECTIEVEN ..................................................................................................... 16
2.1.
LC-MS2 ANALYSE ......................................................................................... 16
2.2.
DIGESTIEMODELLEN .................................................................................. 17
2.3.
ANALYSE VAN BRASSICEAE EN VEEVOEDERSTALEN ..................... 17
3. MATERIAAL EN METHODEN .......................................................................... 18
3.1.
MATERIAAL .................................................................................................. 18
3.1.1.
Algemeen ................................................................................................. 18
3.1.2.
Reagentia en chemicaliën....................................................................... 18
3.1.3.
Oplossingen ............................................................................................. 19
3.2.
METHODEN ................................................................................................... 20
3.2.1.
LC-MS2 analyse ...................................................................................... 20
3.2.1.1. Methode zonder derivatisatie ................................................................ 20
3.2.1.2. Methode met derivatisatie ..................................................................... 22
3.2.2.
Digestiemodellen ..................................................................................... 23
3.2.2.1. Maagdigestie ..................................................................................... 23
3.2.2.2. Dunne darmdigestie .......................................................................... 24
3.2.2.3. Dikke darmdigestie ........................................................................... 24
3.2.2.4. Pensdigestie ....................................................................................... 25
3.2.3.
Analyse van afgenomen digestiestalen.................................................. 26
3.2.4.
Veevoederanalyse ................................................................................... 27
3.2.4.1. Myrosinasebehandeling ........................................................................ 27
3.2.4.2. Proefopzet ............................................................................................. 27
4. RESULTATEN ....................................................................................................... 29
4.1.
ANALYSE VAN DIGESTIEMODELLEN..................................................... 29
4.1.1.
Maagsap .................................................................................................. 29
4.1.2.
Dunne darmsap ...................................................................................... 30
4.1.3.
Dikke darmsap........................................................................................ 30
4.1.4.
Pensvocht................................................................................................. 31
4.2.
VEEVOEDERANALYSE ............................................................................... 36
5. DISCUSSIE ............................................................................................................. 39
6. CONCLUSIE .......................................................................................................... 42
7. LITERATUURLIJST ............................................................................................ 43
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN
2D TLC: 2 dimensionele dunne laag chromatografie
3 IBBr: 3-iodobenzylbromide
5-VOT: L-5-vinyl-oxazolidine-2-thione
ANF: Antinutritionele factoren
APCI: Atmosferische druk chemische ionisatie
CRL: Communautair referentielaboratorium
DAD: Diode array detective
DTT: Dithiotreitol
EFSA: Europese autoriteit voor voedselveiligheid
ESI: Elektrospray ionisatie
GC: Gaschromatografie
HESI: Verwarmde elektrospray ionisatie
HLB: Hydrofiele lipofiele balans
HPLC: Hoge druk vloeistofchromatografie
HPTLC: Hoge druk dunne laag chromatografie
IARC: Internationaal agentschap voor kankeronderzoek
IP: Identificatiepunten
LC: Vloeistofchromatografie
LOD: Detectielimiet
MBI: Mercaptobenzimidazole
MRPL: Minimaal vereiste prestatielimiet
MS: Massaspectrometer
MTU: 6-methyl-2-thiouracil
NBD-Cl: 7-chloro-4-nitrobenzo-2-furanzan
OZT: Oxazolidine-2-thione
PhTU: Fenylthiouracil
PTU: 6-propyl-2-thiouracil
PTU-D5: 6-propyl-D5-2-thiouracil
RC: Aanbevolen concentratie
RPM: Aantal toeren per minuut
SHIME: Simulator van het menselijk intestinaal ecosysteem
Si: Silica
SPE: Vaste fase extractie
T3: Triiodothyronine
T4: Thyroxine
TAP: Tapazol, 1-methyl-2-mercapto-imidazole
TLC: Dunne laag chromatografie
TRF: Thyrotropine vrijstellingsfactor
TSH: Schildklierstimulerend hormoon
TU: Thiouracil
UV: Ultraviolet
WAX: Zwakke anion uitwisseling
1. INLEIDING
1.1.
THYREOSTATICA
Thyreostatica zijn een vrij complexe groep van stoffen die de normale werking van de
schildklier onderdrukken, waardoor een verlaagde concentratie aan thyroïdhormonen (Figuur
1.1), triiodothyronine (T3) en thyroxine (T4) in het bloed ontstaat (Courtheyn et al., 2002).
Het schildklierhormoon beïnvloedt in alle weefsels de eiwitsynthese en vervult zo een
regulerende functie in vele metabole processen.
O
I
I
HO
OH
NH2
O
I
Triidothyronine (T3)
I
HO
O
I
OH
NH2
I
O
I
Thyroxine (T4)
FIGUUR 1.1: CHEMISCHE STRUCTUUR VAN TRIIDOTHYRONINE EN THYROXINE
Het werkingsmechanisme van thyreostatica berust op de remming van de oxidatie van
iodide tot iodium. Het iodide uit de voeding komt na vertering in het bloed terecht en wordt er
door de schildklier opgenomen. In de follikelepitheelcellen wordt het iodide geoxideerd tot
iodium, wat ingebouwd wordt in de schildklierhormonen T3 en T4. De vrijstelling van T3 en
T4 wordt geregeld door een terugkoppelingssysteem (Figuur 1.2). Bij een lage concentratie
aan schildklierhormonen krijgt de hypothalamus een stimulerend signaal die de vrijstelling
van het thyrotropine vrijstellingsfactor (TRF) bevordert. TRF stimuleert op zijn beurt de
vrijstelling, in de adenohypofyse, van het schildklierstimulerend hormoon (TSH). TSH zorgt
ervoor dat de schildklier beter doorbloed wordt en zo meer iodide kan opnemen voor de
aanmaak van de schildklierhormonen (Reed Larsen et al., 1998; Wiersinga, 1999).
1
Hypothalamus
(-)
TRH
Adenohypofyse
(-)
TSH
Schildklier
T3 +T4
FIGUUR 1.2: HYPOTHALAMUS/ADENOHYPOFYSE SYSTEEM
De toediening van thyreostatica zorgt voor verlaagde concentratie aan T3 en T4.
Hierdoor wordt het hele productieproces gestart en meer TRH en TSH gevormd. Een
verhoogd TSH gehalte leidt tot een vergroting van de schildklier (Wiersinga, 1999).
Binnen de thyreostatica zijn 2 grote groepen te onderscheiden, namelijk de
xenobiotische, waartoe thiouracil behoort, en de natuurlijke thyreostatica. Beide relatief
polaire groepen zijn gekenmerkt door een laag moleculair gewicht en amfotere
thioamidegroepen (De Brabander et al., 2009). De thioamide sequentie (stikstof - koolstofzwavel) wordt verantwoordelijk gesteld voor de schildklier-inhiberende werking (Vanden
Bussche et al., 2009). Naast deze 2 groepen zijn er nog moleculen gekend met een thyroïdinhiberende werking, zoals de anorganische thyreostatica (Yamada & Jones, 1968; Lazarus,
2009).
1.1.1. Xenobiotische thyreostatica
Bij nutsdieren kunnen xenobiotische thyreostatica illegaal toegediend worden om een
gewichtstoename te bewerkstelligen. Deze gewichtstoename is zowel het gevolg van een
verhoogde vulling van het gastro-intestinaal kanaal als van een toegenomen retentie van water
in de weefsels. Dit heeft tot gevolg dat de kwaliteit van het vlees daalt, daar het een hoger
watergehalte bevat en omdat de thyreostaticaresiduen mogelijk carcinogeen en teratogeen
zijn. Het internationaal agentschap voor kankeronderzoek (IARC) beoordeelde dat bepaalde
thyreostatica, waaronder thiouracil, tot groep 2B behoren. Dit is de groep van moleculen die
mogelijk kankerverwekkend zijn voor de mens (IARC, 7-4-2010).
2
In deze groep van xenobiotische thyreostatica vinden we 4(6)-R-2-thiouracil (R groep
kan een waterstof, methyl-, propyl- of fenylgroep zijn), mercaptobenzimidazole (MBI) en 1methyl-2-mercapto-imidazole (tapazol, TAP) terug (De Brabander et al., 2009) (Figuur 1.3 ).
De belangrijkste, wegens hun schildklier-inhiberende werking, zijn 6-methyl-2-thiouracil
(MTU), 6-propyl-2-thiouracil (PTU) en tapazol (Pinel et al., 2006b).
CH3
R
N
SH
H
N
N
SH
N
SH
N
N
OH
4(6)-R-2-thiouracil
FIGUUR 1.3:
CHEMISCHE
Tapazol
STRUCTUUR
MERCAPTOBENZIMIDAZOLE (Courtheyn
VAN
Mercaptobenzimidazole
4(6)-R-2-THIOURACIL,
TAPAZOL
EN
et al., 2002).
1.1.2. Natuurlijke thyreostatica
Cyanides, thiocyanaten en oxazolidine-2-thiones (OZT’s) vallen onder de natuurlijke
thyreostatica. Deze worden door hydrolyse gevormd vanuit een precursormolecule, namelijk
de glucosinolaten, welke aanwezig zijn in de plantenfamilie Brassicaceae (Antonious et al.,
2009). De hydrolyse wordt gekatalyseerd door het planteigen enzym myrosinase, wat onder
normale omstandigheden fysiologisch gescheiden is van de glucosinolaten. Myrosinase zelf is
gelokaliseerd in myrosinase korrels (Hoglund et al., 1992), terwijl de glucosinolaten in een
vacuole zitten (Bones & Rossiter, 1996). In het geval van cellulaire schade, zoals bij
vermaling en vertering, komt het myrosinase in contact met de glucosinolaten en start de
hydrolyse met vorming van reactieproducten (Bones & Rossiter, 1996; Tripathi & Mishra,
2007). Deze producten en hun precursoren zijn in vele gevallen verantwoordelijk voor de
bittere smaak van onder meer spruiten, brocoli en radijzen (Antonious et al., 2009).
Het myrosinase-enzym katalyseert de afsplitsing van een D-glucose met vorming van
een onstabiel thiohydroximate-O-sulfonaat dat spontaan herschikt. Afhankelijk van de
zuurtegraad en de variabele zijgroep worden er verschillende reactieproducten gevormd
(Figuur 1.4). De belangrijkste reactieproducten zijn isothiocyanaat, OZT en cyanide.
Isothiocyanaat wordt gevormd bij neutrale pH en wordt verder omgezet tot thiocyanaat en
3
OZT, dit afhankelijk van de variabele zijketen. In het geval van OZT moet op positie 2 van
het isothiocyanaat een hydroxylgroep staan om spontane cyclisatie te krijgen tot OZT (Bones
& Rossiter, 1996; Vanden Bussche et al., 2009). Voor de vorming van thiocyanaat is er nood
aan een precursor die bestaat uit een allyl-, benzyl-, of 4-(methylthio)butylglucosinolaat. In
zure omstandigheden wordt een sulfaat afgesplitst met vorming van een nitril dat op zijn beurt
verder kan splitsen tot het een cyanide vormt (Bones & Rossiter, 1996).
Twee van de belangrijkste reactieproducten zijn OZT en thiocyanaat omdat deze beiden
interfereren met de werking van de schildklier. De meest gekende onder de oxazolidine-2thiones is goitrine of het L-5-vinyl-oxazolidine-2-thione (5-VOT). Dit is een sterk goitrogene
stof die de oxidatie van iodide tot iood verhindert. Hierdoor is er geen iodinatie van tyrosine
tijdens de biosynthese van T3 en T4 (Bones & Rossiter, 2006). Thiocyanaten zijn
verbindingen die door competitieve werking eveneens de oxidatie van iodide naar iood
inhiberen (Mabon et al., 2000). Voor cyanide is geen goitrogene activiteit beschreven
waardoor deze voor dit onderzoek als minder belangrijk wordt beschouwd.
glucose
S
R
SH
R
glucose
C
C
N
N
thioglucosidase
SO3-
O
O
SO3-
glucosinolaat
sulfaat
pH 5-9
N
R
C
pH 3-4
R
S
S
C
N +S
nitril
isothiocyanaat
R
C
NH
N
CN-
thiocyanaat
R
O
cyanide
S
oxazolidine-2-thione
FIGUUR 1.4:
ONDER
SCHEMATISCHE VOORSTELLING VAN DE OMZETTING VAN GLUCOSINOLATEN
INVLOED
VAN
HET
DEGRADATIEPRODUCTEN (Vanden
ENZYM
MYROSINASE
Bussche et al., 2009).
4
TOT
DE
VERSCHILLENDE
1.1.3. Anorganische moleculen
In bepaalde kleine anorganische moleculen kan ook een thyreostatische activiteit
vastgesteld worden. Dit kunnen zowel anionen als kationen zijn, maar met een verschillende
functionele activiteit ter hoogte van de schildklier. Anionen, zoals perchloraat en thiocyanaat,
zijn competitieve inhibitoren van de iodideconcentratie in de schildklier (Yamada & Jones,
1968). Hieruit blijkt dat thiocyanaat zowel bij natuurlijke als bij anorganische moleculen
ondergebracht kan worden. Kationen, zoals lithium, inhiberen de omzetting van iodotyrosines
tot iodothyronines. Daarbij wordt ook de secretie van thyroïdhormonen (T3 en T4)
geblokkeerd met een grotere renale secretie van iodide tot gevolg (Lazarus, 2009).
1.2.
WETGEVING THYREOSTATICA
Het vlees van dieren behandeld met thyreostatica is waterig en grauw. Hierdoor krijgt
de consument minderwaardig vlees op zijn bord. Bovendien zijn er sterke aanwijzingen dat
thyreostatica schadelijk zijn voor de volksgezondheid (IARC, 7-4-2010). De wetgevende
macht heeft op bovenstaande feiten gereageerd en sinds 1974 werd het gebruik van
thyreostatica in Belgïe verboden. Dit werd vastgelegd in “het Koninklijk Besluit van
12.04.1974 betreffende sommige verrichtingen in verband met stoffen met hormonale, antihormonale,
anabole,
beta-adrenergische,
anti-infectieuze,
anti-parasitaire
en
anti-
inflammatoire werking” (FAVV, 5-3-2010). Pas in 1981 werd hun gebruik in heel Europa
verboden (CD 81/602/EC, 1981).
Later werd in het wetsvoorstel 96/22/EC meer specifiek het verbod beschreven op het
gebruik van thyreostatische of hormonale middelen in veevoederbedrijven (CD 96/22/EC,
1996). Het wetsvoorstel 96/23/EC (CD 96/23/EC, 1996) beschrijft de voorschriften om het
gebruik van thyreostatica bij levende dieren en dierenproducten te bewaken en te controleren.
De annex van dit voorstel splitst de verschillende stoffen op in 2 groepen. De verboden
middelen zoals groeibevorderende stoffen die misbruikt worden in dierlijke vetmesting
bijvoorbeeld thyreostatica, behoren tot groep A. Groep B omvat andere gelimiteerde,
veterinaire geneesmiddelen en contaminanten (CR 2377/90, 1990).
Om de wet 96/23/EC grondig te kunnen toepassen werden criteria vastgelegd waaraan
testresultaten in de officiële controlelaboratoria moeten voldoen. Voor de verboden
substanties uit groep A moeten analytische methodes een opgelegde minimaal vereiste
prestatielimiet (MRPL) halen. Dit is de limiet die een analytische detectiemethode moet
5
kunnen detecteren en werd bepaald door de Europese Commissie. Voor thyreostatica ligt deze
waarde op 100 µg/L of µg/kg in matrices zoals urine en schildklierweefsel. In december 2007
werd door het communautaire referentielaboratorium (CRL) een aanbevolen concentratie
(RC) voorgesteld van 10 µg/L of µg/kg (RIVM, 23-3-2010). Dit document heeft geen
wettelijk karakter en dient als leidraad voor analytische controles van thyreostatica. Het
merendeel van de huidige detectietechnieken halen deze norm. In het communautair voorstel
2002/657/EC werd een systeem van identificatiepunten (IP’s) ingevoerd om de bekomen data
te interpreteren (CD 2002/657/EC, 2002). Voor detectie met vloeistof- of gaschromatografie
gekoppeld aan massaspectrometrie is voor de identificatie van groep A moleculen nood aan
een minimumscore van 4 IP’s, terwijl er voor groep B moleculen minimaal 3 IP’s vereist zijn.
De toekenning van IP is afhankelijk van de gebruikte techniek, in het geval van LC-MS/MS
telt precursor-ion voor 1 IP en een fragment-ion voor 1.5 IP’s (Tabel 1.1).
TABEL 1.1: TOEKENNING VAN IDENTIFICATIEPUNTEN
Detectie
Aantal ionen
IP
LC-MS
2+2
4
LC-MS/MS
1 precursor en 2
4
fragment-ion
LC-MS/MS
2 precursoren, elk met 1
5
fragment-ion
GC-MS
2+2
4
GC-MS/MS
1 precursor en 2
4
fragment-ionen
GC-MS/MS
2 precursoren, elk met 1
5
fragment-ion
1.3.
DETECTIE THYREOSTATICA
Een nauwkeurige detectie van thyreostatica is vereist zodat een correct beeld kan
gevormd worden over de aanwezige concentratie thyreostatica. In het bijzonder in het kader
van de wetgeving is dit van groot belang. Vroeger werden karkassen visueel geïnspecteerd op
thyreostatica-misbruik, zo werd gekeken naar vochtverlies en de kleur van het vlees.
Eveneens werd de omvang van de schildklier nagegaan. De massa van de schildklier werd
6
gravimetrisch bepaald en gaf een indicatie voor misbruik (Doganoc & Grebenc, 1998). Een
morfologisch onderzoek van de schildklier vormt op zichzelf onvoldoende bewijs om
thyreostaticamisbruik vast te stellen, daarvoor is een chemisch residu-onderzoek aangewezen.
De laatste jaren berust de detectie van thyreostatica vooral op chromatografische
scheidingsmethoden zoals gaschromatografie en vloeistofchromatografie gekoppeld aan een
massaspectrometer (MS) (De Brabander et al., 2009) (Figuur 1.5). Deze methodes voldoen
aan de opgelegde RC.
Alvorens de chemische analyse van een monster kan plaatsvinden is een
voorbehandeling absoluut aangewezen. Dit in de eerste plaats om interfererende stoffen te
verwijderen maar ook om de thyreostatica zo efficiënt mogelijk te extraheren uit het
biologische staal. Voor de extractie wordt meestal gebruik gemaakt van een solvent zoals
methanol (De Wasch et al., 2001; Abuin et al., 2008a, b), diëthylether (Pinel et al., 2005;
Lohmus et al., 2009) en ethylacetaat (Buick et al., 1998; Blanchflower et al., 1997). Voor de
opzuivering van de extracten wordt dikwijls gebruik gemaakt van vaste fase extractie (SPE).
Sillica SPE cartridges worden in de meeste gevallen als ideaal voor thyreostatica vermeld
(Buick
et
al.,
1998;
Pinel
et
al.,
2005),
maar
daarnaast
kunnen
ook
anionuitwisselingskolommen gebruikt worden (Yu et al.,1997). Voor verbetering van extractie
en analyse zijn veel methoden gebaseerd op derivatisatie. Dit heeft meerdere voordelen
namelijk het stabiliseert de thyreostatica in 1 tautomere vorm, wat de herhaalbaarheid en de
efficiëntie van de extractie doet stijgen. Anderzijds daalt de polariteit van de thyreostatica,
wat de retentie bevordert op een standaard C18 kolom. Daarbij stijgt het moleculair gewicht
wat een hogere gevoeligheid oplevert in MS detectie (Lohmus et al., 2009). Begin 1970 werd
de Van Waes methode geïntroduceerd. Dit was een colorimetrische methode met een zeer
hoge detectielimiet (LOD) in de orde van 1-10 mg/kg. Door deze hoge LOD kon de methode
niet worden toegepast voor screening van eetbare matrices van dierlijke oorsprong (Van
Waes, 1973). Later beschreven Gissel & Schaal (1974) de dunne laag chromatografie (TLC).
Dit is een meer specifieke methode waarbij thiouracil en analogen reeds werden gedetecteerd
bij 0.5-1.0 mg/kg in dierlijk weefsel en urine. De Brabander en Verbeke verfijnden deze
methode tot een LOD van 10 µg/kg (De Brabander & Verbeke, 1975). Ze werkten ook de 2
dimensionele dunne laag chromatografie (2D TLC) uit met het doel te bevestigen. Hierbij
werd een verbeterde scheiding bekomen. De Benelux en de EU hebben deze methode
overgenomen voor kwantitatieve analyse van thyreostatica. TLC werd opgevolgd door hoge
druk dunne laag chromatografie (HPTLC) en werd verder uitgebouwd tot 4x4 HPTLC. Sinds
7
1960 worden gas- en vloeistofchromatografie verkozen boven de andere technieken door hun
verhoogde specificiteit en selectiviteit. Door koppeling met MS werd voldaan aan de criteria
van de kwaliteitscontrole. Een lagere LOD werd bereikt door derivatisatie met benzylchloride,
pentafluorobenzylbromide of methylatie. Toch bleef de terugvinding van bepaalde
componenten zoals tapazol heel laag. De Brabander et al. (1992) ontwikkelden een
gecombineerde methode van HPTLC en gaschromatografie (GC) gekoppeld aan MS analyse
met een tweede derivatisatiestap. Buick et al. (1998) waren in staat om met hoge druk
vloeistof chromatografie (HPLC) een lagere LOD te bekomen dan 10 µg/kg. Voor de detectie
werd ultraviolet (UV)-, elektrochemische-, chemiluminescentie-, en diode array detectie
(DAD) vermeld. Blanchflower et al. (1997) introduceerden de eerste LC-MS/MS methode,
gebaseerd op atmosferische druk chemische ionisatie (APCI). Vijf thyreostatica (TU, MTU,
PTU, PhTU en TAP) werden zonder derivatisatie in een matrix van urine en
schildklierweefsel gedetecteerd in een concentratie van 25 µg/kg. Een hogere gevoeligheid en
specificiteit wordt bekomen bij LC-MS in combinatie met elektrospray ionisatie (ESI). Een
grote verscheidenheid aan matrices zoals urine, faeces, spieren, lever, veevoeder en haar
kunnen met deze techniek gescreend worden. Derivatisatie gebeurt nu best met 7-chloro-4nitrobenzo-2-furazan (NBD-Cl) (De Wasch et al., 2001) of 3-iodobenzylbromide (3-IBBr)
(Pinel et al., 2005) en dit om de gevoeligheid te verhogen tot 2.6-23.2 µg/L. Meer recent is
een nieuwe methode gepubliceerd waarbij geen derivatisatie wordt toegepast. Hierbij wordt
het risico op vals-positief resultaat vermeden. Deze methode verscherpt de gevoeligheid tot
1.7-7.5 µg/L (Vanden Bussche et al., 2010).
TLC
>1970
GC-ECD
LC-MSn
HPLC
2000
1990
1980
GC-MS
(SIM)
GC-MS
n
(MS )
LC-MS
UPLC
2010
UPLC-TOF
(QqQ)
FIGUUR 1.5: EVOLUTIE VAN DE DETECTIEMETHODES IN FUNCTIE VAN DE TIJD
(De Brabander et al., 2009)
8
1.4.
XENOBIOTISCH OF ENDOGENE STATUS
De term xenobiotisch slaat op lichaamsvreemde stoffen. Wanneer vroeger voor
gewichtstoename een xenobiotisch thyreostaticum illegaal toegediend werd, bleek een
standaardtoediening van 5 g per dier over 30 dagen noodzakelijk (Courtheyn et al., 2002). Als
de urine van een behandeld dier geanalyseerd werd, werden concentraties boven de 100 µg/L
waargenomen (De Brabander, 1984). Door de strenge wetgeving en de continue ontwikkeling
van de analysemethoden ligt de detectielimiet voor thyreostatica momenteel echter aanzienlijk
lager. Aan de hand van desbetreffende methodes wordt een groot aantal urinestalen van
onbehandelde dieren toch positief bevonden op thiouracil, concentraties tussen de 1 en 10
µg/L (Pinel et al., 2006b). Deze waarden komen niet overeen met het beeld van behandelde
dieren. Misschien maakt men in deze gevallen gebruik van cocktails die verschillende
groeibevorderende stoffen bevatten, maar in veel lagere concentraties. Of mogelijk moet er
een andere denkpiste gevolgd worden. Misschien is de plantenfamilie Brassicaceae
verantwoordelijk voor de gedetecteerde thiouracil, mogelijk een precursor die endogeen wordt
omgezet.
De eerste indicatie van de endogene status werd afgeleid uit experimenten van Pinel et
al. (2006b). Deze beschreven aan de hand van dierenexperimenten de link tussen een
Brassicaceae dieet en thiouracil in urine. In de eerste proef werd een vaars gevoederd met
verse kool gedurende 9 dagen en werd tweemaal daags de urine gecollecteerd. Uit de
resulaten bleek een duidelijk verband tussen een kooldieet en het thiouracilgehalte in de urine
te bestaan. Het tweede experiment beschreef een vaars die gedurende de eerste 7 dagen enkel
hooi kreeg, de volgende 4 dagen werd het dier gevoederd met koolzaadcake en gedurende de
laatste periode van 8 dagen kreeg het dier opnieuw hooi te eten. De resultaten toonden drie
duidelijke segmenten met in het begin en einde een negatieve blanco periode, en daartussen
een periode waar thiouracil-waarden tot 9 µg/L werden gedetecteerd. Deze 2 proeven toonden
een duidelijke link aan tussen Brassicaceae dieet en thiouracil in de urine (Pinel et al.,
2006a).
Om de oorspong van deze urinaire excretie te begrijpen is het dus noodzakelijk om de
samenstelling van Brassicaceae te kennen. Zo heeft men koolbladeren, stengels en koolzaden
geanalyseerd en werden glucosinolaten gedetecteerd (Antonious et al., 2009), maar de vrije
aanwezigheid van thiouracil kon niet worden bewezen (Pinel et al., 2006b). Pinel et al.
9
(2006a) stelden zich de vraag of een endogene vorming van thiouracil mogelijk is. Meer
onderzoek in dit verband is echter aangewezen. Kortom, men mag er bij detectie van
thyreostatica niet altijd van uit gaan dat deze waarden door middel van misbruik worden
bekomen, zeker niet als deze concentratie tussen 1 en 10 µg/L ligt. Vandaar dat een RC van
10 µg/L wordt aanbevolen door het CRL, maar dit is nog niet per wet verplicht.
1.5.
BRASSICACEAE EN VEEVOEDER
Verscheidene planten van de Brassicaceae familie zijn geliefd, zowel voor menselijke
consumptie als voor de veevoederindustrie. Een belangrijk voorbeeld is het koolzaad dat
grotendeels wordt geteeld voor de zaadolie, dat wordt bekomen na vermaling en persingvan
het zaad (Harlingerraap, 22-5-2010). Deze zaadolie heeft zijn toepassing voor menselijke
consumptie. Wat overblijft na de oliewinning is een goedkoop restproduct rijk aan eiwitten. In
de vorm van perskoek, schilfers en koolzaadschroot is dit heel interessant als
veevoedergrondstof. Het is wel zo dat koolzaad enkele natuurlijke antinutritionele factoren
(ANF) bevat zoals erucazuur en glucosinolaten. Erucazuur is niet in menselijke voeding
gewenst omdat het hart- en verteringsproblemen veroorzaakt, terwijl glucosinolaten bij
splitsing door het myrosinase aanleiding geeft tot thiocyanaten, OZT’s en nitriles. Daarom
werd een “00-variant” ontwikkeld die laag is aan erucazuur, ten hoogste een gehalte van 2 %
van het totaal gehalte aan vetzuren, en laag aan glucosinolaten, een gehalte van minder dan 25
µmol/gram (Verordening (EG) Nr. 1035/2003, 2003). Deze “00-variant” is geschikt voor de
winning van zaadolie die in de menselijke consumptie zijn toepassing heeft. Ook kan het
koolzaadschroot benut worden in de veevoederindustrie (publicaties.vlaanderen, 9-3-2010).
Toch wordt in het koolzaadschroot van de “00-variant” nog steeds een hoog gehalte aan
het glucosinolaat progoitrine, de precursor van 5-VOT, gevonden (Mabon et al., 2000). De
schroottolerantie bij verschillende diersoorten varieert aanzienlijk. Zo is de mortaliteit door
een hoge concentratie aan glucosinolaten bij varkens, ratten en konijnen groter. Verschillende
studies bij varkens toonden een link aan tussen een dieet rijk aan glucosinolaten en een
gewijzigde groei. Het onderzoek startte met voeding arm aan glucosinolaten (0.5-1.0 µmol/g)
en later werd de concentratie opgedreven tot men aan 10 µmol/g kwam (Tabel 1.2). Pas een
gehalte van 9 µmol/g induceerde lever- en schildklierhypertrofie. Ook werd een
iodinedeficiëntie en hypothyroïdie vastgesteld. Koeien zijn in vergelijking met andere dieren
meer tolerant voor glucosinolaten. De microflora in hun verteringstelsel induceren omzetting
10
van glucosinolaten en hun metabolieten. Toch werd op lange termijn goitrogeniciteit, een
verhoogd plasmaniveau aan thiocyanaat en een verlaagd thyroxineniveau in het plasma
vastgesteld (Tripathi & Mishra, 2007).
TABEL 1.2: BIOLOGISCHE EFFECTEN VAN GLUCOSINOLATEN IN DIEREN
Glucosinolaten
Dier
Effect op het dier
(µmol/g voeding)
0.16-0.78
Geen nadelige effecten
9
Lever- en schildklier-
Varken
hypertrofie
Runderen
1.2-2.4
Geen nadelige effecten
11
Iodine defeciëntie
Daarom wordt door de Europese Autoriteit voor Voedselveiligheid (EFSA) aanbevolen
om het totale glucosinolaatgehalte voor niet-herkauwers te beperken tot 1-1.5 mmol/kg
veevoeder en voor herkauwers op 11 mmol/kg (EFSA, 7-4-2010).
1.6.
SIMULATIE VAN DE SPIJSVERTERING
De rol van het spijsverteringsstelsel staat voor opname van voedingsstoffen en
geneesmiddelen en voor de uitscheiding van afvalstoffen en onverteerbare resten. Het
spijsverteringsstelsel loopt van de mond tot aan de anus als één kanaal met meerdere klieren
en verdikkingen. Onder de nutsdieren zijn zowel enkel- als meermagige dieren te
onderscheiden. Daar zowel voor het varken (Vanden Bussche et al., 2009), dat éénmagig is,
als voor het rund (Pinel et al., 2006a), dat een meermagig spijsverteringsstelsel heeft, data
bestaan van thiouracil in een concentratie tussen de 0 en 10 µg/L werd voor deze twee
diermodellen geopteerd.
1.6.1. Spijsvertering van varken en rund
Het éénmagig digestiemodel is gebaseerd op het model van een varken dat net als de
mens een éénmagige omnivoor is (Figuur 1.6). Het voedsel wordt eerst in de mond gekauwd
en vermalen. Na het slikken komt de voedselbrij in de maag terecht. Hier worden eiwitten
11
afgebroken onder invloed van het proteolytisch enzym pepsine dat optimaal functioneert bij
lage pH. Deze zure pH waarde van de maag (pH 1.5-2) wordt behaald dankzij de HCl secretie
van de pariëtaalcellen. Na de maag komt de voedselbrij in de dunne darm. De inhoud van de
dunne darm bestaat uit maagchyme en sappen die hier actief gesecreteerd worden, namelijk
het dunne darmsap, het pancreassap en het galvocht. Het dunne darmsap is isotoon en zorgt
voor een voldoende fluïditeit van de darminhoud. Het bevat ook mucus dat de dunne darm
beschermt tegen het zure maagsap. Het pancreassap bevat een hoge concentratie aan KCO3om het zure maagsap te neutraliseren. Dit is nodig voor de goede werking van de pancreasverteringsenzymen zoals proteasen, lipase, α-amylase, nucleasen. Het galvocht wordt
gevormd in de lever en wordt opgeslagen in de galblaas. Het bevat galzouten die een
belangrijke rol spelen in de vertering van de vetten. Na de dunne darm komt de dikke darm
waar er voornamelijk water wordt onttrokken (De Wijn & Hekkens, 1989; Frandson &
Spurgeon, 1992).
Pancreas
Lever
Dikke darm
Maag Dunne darm
Mond
Speekselklieren
FIGUUR 1.6: VERTERINGSSTELSEL BIJ HET VARKEN
Het rund eet enkel plantaardig materiaal, voornamelijk gras, wat moeilijk te verteren is
door onder meer het aanwezige cellulose. Voor het rund is dit echter geen probleem want de
maag bestaat uit 4 delen: de lebmaag welke de feitelijke maag is en die voorafgegaan wordt
door de pens, de netmaag en de boekmaag, dewelke instaan voor een betere vertering (Figuur
1.7). Deze voormagen zorgen ervoor dat runderen en andere herkauwers in staat zijn om
moeilijk verteerbare stoffen om te zetten tot eenvoudige moleculen die in het bloed kunnen
worden opgenomen.
12
FIGUUR 1.7: VERTERINGSSTELSEL BIJ DE KOE (du.delaval, 22-3-2010)
Het verteren van het gras gebeurt in verschillende fasen. De eerste maal wordt het gras
slechts een beetje vermalen en dan doorgeslikt. Het voedsel komt in de eerste en grootste
maag terecht, namelijk de pens. In de pens bevinden zich veel bacteriën en schimmels die
zorgen voor de vertering van cellulose. Als de pens vol is komt het voedsel terug in de mond
en begint de herkauwing. Tijdens het herkauwen wordt een enorme hoeveelheid speeksel
gevormd dat een bufferende functie heeft. Dit proces wordt meerdere malen herhaald tot het
voedsel fijn is.
Herkauwen is een belangrijk proces: het vergroot het oppervlak van het voedsel
waardoor de micro-organismen beter voedingsstoffen uit het voedsel kunnen halen. Het
herkauwde voedsel komt dan opnieuw in de pens terecht. Eigenlijk zijn de pens en de
netmaag één compartiment, maar elk met een verschillende functie. De netmaag bepaalt of de
voedselmassa verder schuift naar de boekmaag of dat het terug herkauwd wordt. In de
boekmaag wordt het vocht uit de voedselbrij gehaald. De rest gaat naar de lebmaag die sterk
lijkt op de menselijke maag. Maagsapklieren scheiden een maagsap af dat enzymen bevat die
voornamelijk de eiwitten zullen verteren. Na de lebmaag volgt de dunne darm. Hier worden
voedingstoffen verder afgebroken tot ze fijn genoeg zijn om geabsorbeerd te worden. Ook
worden aminozuren en water opgenomen via de darmwand. De functie van de dikke darm is
het absorberen van vertakte vetzuren (Frandson & Spurgeon, 1992; Cunningham & Klein,
2007).
13
1.6.2. Digestiemodellen
Er zijn verschillende types digestiemodellen die onder het dynamisch of een statisch
model kunnen ondergebracht worden. Het dynamisch digestiemodel sluit nauw aan bij de in
vivo situatie daar de gevormde verteringsproducten gedurende digestie,verwijderd worden
door absorptie (Wickham et al., 2009). Een veel gebruikt dynamisch model is de Simulator
van het Humaan Intestinal Microbieel Ecosysteem (SHIME) waar met pH gespeeld wordt.
Hierdoor bekomt men een microbieel systeem dat representatief is voor het humaan
spijsverteringsstelsel. Het is een systeem met 5 vaten waarbij in elk vat een deel van de
digestie wordt nagebootst (Molly et al., 1994). Een tweede voorbeeld van een dynamisch
model is het dynamisch gastrisch model (DGM) waarbij de fundus en het atrum van de maag
worden gesimuleerd (Golding & Wooster, 2010). Bij een statisch model worden de
verteringsproducten echter niet verwijderd. Deze modellen zijn nuttig om een bepaalde
verteringsstap te onderzoeken en zijn daarenboven vrij eenvoudig uit te voeren. Er is enkel
nood aan homogenisatie van het voedsel, pH instelling en toevoeging van de juiste media met
de aanwezige verteringsenzymen. Dit geheel blijft gedurende bepaalde periodes geïncubeerd
op temperatuur, onder anaerobe omstandigheden (Wickham et al., 2009). Het voordeel van dit
type model is het gemak in gebruik en de lage kostprijs.
1.7.
ANALYSEMETHODEN
1.7.1. Vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie
Scheidingstechnieken nemen in de moderne analytische chemie een belangrijke plaats
in. De meest gebruikte scheidingsmethode is chromatografie. Voor de analyse wordt gebruik
gemaakt van vloeistofchromatografie. Hier bevindt de stationaire fase zich in een buis
(kolom). Voor de scheiding wordt het mengsel (staal) via een mobiele fase langs de
stationaire fase geleid. Door hun verschillende affiniteit en interactie met deze stilstaande fase
zal elke component een andere (selectieve) vertraging vertonen (Lipschitz et al., 1999).
Als detector wordt gewerkt met een massaspectrometer. Hier worden de ionen
gescheiden volgens hun verhouding van massa tot lading en de relatieve hoeveelheid waarin
elk soort ion voorkomt. Dit wordt in een spectrum geregistreerd. Elk spectrum is
structuurspecifiek en kan gezien worden als de vingerafdruk van de molecule (Lipschitz et al.,
1999). Voor de componenten naar de massaspectrometer gaan, worden ze eerst geïoniseerd.
14
Dit kan zowel door atmosferische druk chemische ionisatie (APCI) als door (verwarmde)
elektrospray ionisatie ((H)ESI) (Figuur 1.8). Bij HESI worden niet vluchtige moleculen in het
HPLC effluent geïoniseerd. Het effluent wordt doorheen een capillair met een bepaalde
potentiaal gestuurd, waardoor het effluent gedispergeerd wordt in een spray van grote geladen
druppels met dezelfde polariteit. Door de hoge temperatuur die er heerst, verdampt het solvent
en wordt het verwijderd met N2 als drooggas (ionen-evaporatie), waardoor de druppels kleiner
worden en de ladingen dichter bij elkaar komen (Niessen, 1999). Dit verhoogt de
ladingsconcentratie aan het oppervlak. Door coulombse repulsiekrachten exploderen druppels
tot kleinere, minder geladen druppels. APCI is een analoge methode met het verschil dat hier
een corona ontladingsnaald aanwezig is. Deze bezit een hoge potentiaal die verantwoordelijk
is voor de vorming van ionen na verdamping (Lipschitz et al., 1999).
FIGUUR 1.8: ELEKTROSPRAY IONISATIE
Er bestaan verschillende soorten massaspectrometers. Voorbeelden zijn de ion trap en
de quadrupool technologie. In geval van ion trap ontstaat de massascheiding als volgt: de
ionen komen in het rf - en stroomspanningsveld waardoor ze een golfbeweging maken. Door
de rf spanning te verhogen worden de ionen met opeenvolgende m/z waarden onstabiel. Deze
ionen worden uit de ion trap gestoten en gedetecteerd. Dit in tegenstelling tot een quadrupool
filter, waar enkel de ionen die stabiel blijven in het spanningsveld gedetecteerd worden.
15
2. OBJECTIEVEN
In dit eindwerk wordt de mogelijke endogene status van het thyreostaticum, thiouracil,
bij nutsdieren en hun voeding onderzocht. Het gebruik van dit middel is bij wet verboden
omdat het vlees levert van minderwaardige kwaliteit met mogelijk carcinogene en teratogene
gevolgen (CD 81/602/EC, 1981).
De meeste detectiemethoden zijn gebaseerd op derivatisatie, wat mogelijk een vals
positief resultaat met zich meebrengt. Recent is een nieuwe detectiemethode zonder
derivatisatie gepubliceerd voor thyreostatica in urine (Vanden Bussche et al., 2010). Met deze
methode kan men er vanuit gaan dat, als thiouracil gedetecteerd wordt bij onbehandelde
dieren, het ook effectief om thiouracil gaat. Dit brengt natuurlijk de vraag over de oorsprong
van thiouracil met zich mee. Voeding lijkt een logische bron door de studie van Pinel et al.
(2006b). Of glucosinolaten uit Brassicaceae hierbij betrokken zijn valt nog af te wachten,
maar er zijn toch indicaties daar naar toe. Om deze reden zal deze studie enerzijds
digestiemodellen van rund en varken doorlopen, met Brassicaceae als voedingselement om zo
de vorming van thiouracil op te sporen. Al deze simulaties zullen aan de hand van een LCMS² methode geanalyseerd en geïnterpreteerd worden, met een voorafgaande ontwikkelde
opzuivering.
Anderzijds zal een nieuwe poging ondernomen worden om thiouracil in voeding zelf op
te sporen. Ook hiervoor wordt met een opzuivering gewerkt en wordt met behulp van een LCMS² methode geanalyseerd.
2.1.
LC-MS2 ANALYSE
Voor het merendeel van de digestiesappen en voederstalen is een voorbehandeling
absoluut aangewezen om de vervuilende en interfererende moleculen te verwijderen. Tijdens
de opzuiveringstesten worden verschillende parameters getest. Zo wordt geëxperimenteerd
met verschillende extractiesolventen zoals dichloromethaan, ethylacetaat en diëthylether. Ook
worden verschillende silica SPE kolommen getest op hun geschiktheid.
De LC-MS2 methode, gebaseerd op ion trap technologie, is reeds bestaand, hieraan
worden geen parameters gewijzigd.
16
2.2.
DIGESTIEMODELLEN
Natuurlijk voorkomende thyreostatica vinden we in de Brassicaceae onder de vorm van
een precursor, namelijk glucosinolaat, dewelke omgezet wordt door hydrolyse en/of digestie.
Daar thiouracil gevonden wordt in urine van onbehandelde dieren zoals van varken en rund,
maar voorlopig nog niet in voeder, zijn er vermoedens van endogene omzetting (Pinel et al.,
2006b). Om dit te achterhalen wordt met 2 verschillende diermodellen gewerkt. Voor het
varken gaan we in vitro de drie opeenvolgende stappen van vertering simuleren, namelijk
maag-, dunne darm-, en dikke darmdigestie (Boisen & Fernandez, 1997; Gawlik-Dziki et al.,
2009). Dit omdat niet met zekerheid geweten is waar de meeste omzetting plaatsvindt. Voor
het rund werken we eerder met pensvocht, hier worden de meeste voedingscomponenten
(Soliva et al., 2008), mogelijk ook glucosinolaten, verteerd Deze digestiestalen zullen eerst
een opzuivering ondergaan (zie 2.1.) en vervolgens geanalyseerd worden aan de hand van LCMS².
2.3.
ANALYSE VAN BRASSICEAE EN VEEVOEDERSTALEN
Ook hier is de ontwikkeling van een efficiënte en accurate analyse methode nodig voor
de bepaling van thiouracil. Daarom zal een extractiemethode ontwikkeld worden om
thiouracil uit Brassicaceae (voederkool en koolzaad) en voederderivaat (koolzaadschroot) te
halen op basis van een bestaande methode (Pinel et al., 2005; Vanden Bussche et al., 2010).
Er wordt eveneens geëxperimenteerd met enzymbehandelingen voor hydrolyse te
bewerkstelligen (De Brabander & Verbeke, 1982). Nadien zullen deze geëxtraheerde stalen
geanalyseerd worden op hun thiouracil inhoud aan de hand van LC-MS² analyse (zie 2.1).
17
3. MATERIAAL EN METHODEN
3.1.
MATERIAAL
3.1.1. Algemeen

Plastiek proefbuizen van 15 mL

Ultrasoonbad (Transsonic digital S, Elma)

Si Isolute (SPE Biotage, Uppsala, Zweden)

Oven (Memmert, Schwabach, Duitsland))

Centrifuge (Sorvall RC 5C plus, Connecticut, VS)

Stikstofindamper (Turbovap ® LV Evaporator, Zymark)

Spuiten (Terumo, Leuven, België)

Naalden (Terumo, Leuven, België)

0.22 µm filter (Millex, Cork, Ierland)

Filter (Whatman, Engeland)

Vortex (Labworld Yellowline IKA, Boutersem, België)

Incubator (Termaks, Heusden-Zolder, België)

Autoclaaf (Lequeux, Dourdan, Frankrijk)

Warmwaterbad ( GFL, Grossburgwedel, Duitsland)

LAF kast ( Kojair Tech Oy, Berkel-Enschot, Nederland)

Ultraturrax (Labworld Yellowline DI 18 basic, Boutersem, België)
3.1.2. Reagentia en chemicaliën
Digestie

KHCO3 (Merck, Darmstadt, Duitsland)

NaCl (Merck, Darmstadt, Duitsland)

Pepsine (Sigma-Aldrich, St. Louis, VS)

NaHCO3 (Merck, Darmstadt, Duitsland)

Oxgall (BD, Le pont de Claix, Frankrijk)

Pancreatine (Sigma-Aldrich, St. Louis, VS)

Arabinogalactaan (Sigma-Aldrich, St. Louis, VS)

Pectine (Sigma-Aldrich, St. Louis, VS)
18

Xylaan (Sigma-Aldrich, St. Louis, VS)

Zetmeel (Fluka, Steinheim, Duitsland)

Glucose (Merck, Darmstadt, Duitsland)

Gistextract (Applichem, Darmstadt, Duitsland)

Pepton (Oxoid, Hampshine, Engeland)

Mucine (Sigma-Aldrich, St. Louis, VS)

L-cysteïne (Safc, Steinheim, Duitsland)

K2HPO4 (Merck, Darmstadt, Duitsland)

KH2PO4 (Merck, Darmstadt, Duitsland)

Natriumthioglycolaat (Sigma-Aldrich, St. Louis, VS)
Opzuivering en analyse

2-thiouracil (Sigma-Aldrich, St. Louis, VS)

6-propyl-D5-2-thiouracil (PTU-D5) (Toronto Research Chemicals Inc., Toronto,
Canada)

Na2HPO4 (Merck, Darmstadt, Duitsland)

KH2PO4 (Merck, Darmstadt, Duitsland

Azijnzuur (Merck, Darmstadt, Duitsland)

Water HPLC (Fisher Scientific, Leicestershire, UK)

Dithiotreitol (DTT) (Sigma-Aldrich, St. Louis, VS)

3-iodobenzylbromide (3-IBBr) (Sigma Aldrich, St. Louis, VS)

Methanol, diëthylether, cyclohexaan, n-hexaan, ethylacetaat (Merck, Darmstadt,
Duitsland)
3.1.3. Oplossingen

Inwendige standaard PTU-D5 (1 ng/µL):
50 µL PTU-D5 (stockoplossing 200 ng/µL) in 9.95 mL MeOH

Spike oplossing thiouracil (1 ng/µL):
50 µL thiouracil (stockoplossing 200 ng/µL) in 9.95 mL MeOH

3-iodobenzylbromide oplossing (2 mg/ mL MeOH)

0.5 % azijnzuur in water:
- Voeg 2.5 mL azijnzuur bij 500 mL water (HPLC)
19

Buffer
Fosfaatbuffer pH 6.8/7:
- 44.55 gram Na2HPO4 oplossen in 500 mL ultrapuur water (opl. 1)
- 6.82 gram KH2PO4 oplossen in 100 mL ultrapuur water (opl. 2)
- Voeg 418 mL van oplossing 1 bij 82 mL van oplossing 2
- Controleer en wijzig tot pH 6.8 of 7
Fosfaatbuffer pH 8:
- 28.40 gram Na2HPO4 oplossen in 1000 mL ultrapuur water (opl. 1)
- 2.72 gram KH2PO4 oplossen in 100 mL ultrapuur water (opl. 2)
- Voeg 945 mL van oplossing 1 bij 55 mL van oplossing 2
- Controleer en wijzig tot pH 8
3.2.
METHODEN
3.2.1. LC-MS2 analyse
3.2.1.1.
Methode zonder derivatisatie
Door de relatief polaire eigenschappen van thiouracil moest een geschikte kolom
gekozen worden, wat gekoppeld werd op een HPLC systeem (Finnigan surveyor, Thermo
Electron, San Jose, USA). Daarom werd gewerkt met De NUCLEODOR sphinx RP (250 mm
x 4 mm ID, 5µm) (Macherey-Nagel, Düren, Duitsland). Deze bezit een bipolariteit doordat de
silicakolom gemodificeerd is met propylfenyl en C18 liganden. De propylfenylgroepen
zorgen voor een polair karakter terwijl de C18 ketens apolair zijn (Figuur 3.1). De
bifunctionele RP fase kan selectief scheiden door hydrofobe en π-π interacties. Dit is ideaal
om aromatische componenten, zoals thiouracil, te weerhouden.
FIGUUR 3.1: INTERACTIE EN SCHEIDINGSPRINCIPE VAN DE NUCLEODOR SPHINX RP
Voor de NUCLEODOR sphinx RP werd een prekolom geplaatst. Deze prekolom (8 mm
x 4 mm ID, 5 µm) (Macherey-Nagel, Düren, Duitsland) filterde het eluens, hield
20
onzuiverheden weg en verbeterde scheidingsefficiëntie. Het gebruik van een voorkolom
verlengde tevens de levensduur van de NUCLEODOR sphinx RP.
Van elk staal werd 10 µL geïnjecteerd en vermengd met solvent. De pomp (Finnigan
suveyor MS pomp, Thermo Scientific, Waltham, VS) zorgde ervoor dat een constant debiet
van 500 µL/min over de kolom stroomde. Tijdens de analyse wijzigde de samenstelling van
de mobiele fase (gradiëntelutie), waardoor een kortere analysetijd en een betere scheiding
bekomen werd. Het gradiëntprogramma is weergegeven in tabel 3.1:
TABEL
3.1: GRADIËNTPROGRAMMA VAN DE ANALYSE MET ALS SOLVENT A: 0.5 % HAc IN
H2O EN ALS SOLVENT B 100 % METHANOL
Tijd (min)
Flow (µL/min)
Solvent A (%)
Solvent B (%)
0.00
2.00
17.00
19.00
19.10
22.00
500
500
500
500
500
500
70
70
0
0
70
70
30
30
100
100
30
30
Voor de detectie werd gebruik gemaakt van een ion trap massaspectrometer (Finnigan
LTQ, Thermo Electron, San Jose, VS). De ionisatie vond plaats dankzij HESI (verwarmde
elektrospray ionisatie) in negatieve modus.
TABEL 3.2: IDENTIFICATIE
Analyt
Precursor-ion
Collision Energy (eV)
Product-ion
Thiouracil
PTU-D5
127
174
48
45
58
58 ; 140
Aan de hand van ion trap technologie is het in het protocol zonder derivatisatie niet
mogelijk om 2 product-ionen te geneneren voor thiouracil (Tabel 3.2). Voor de interne
standaard (PTU-D5) is dit geen probleem. Zo wordt voor thiouracil niet voldaan aan de
minimumscore van 4 identificatiepunten. Om deze reden zal enkel met de LTQ worden
bewerkt om de methode op punt te stellen, in latere fase zal overgegaan worden naar triple
quadrupool technologie, waar wel voldaan wordt aan de eisen van de product-ionen.
21
3.2.1.2.
Methode met derivatisatie
Door derivatisatie met 3-IBBr is thiouracil minder polair en kon de standaard C18
kolom (150 mm x 2.1 mm ID, 5 µm) (Symmetry C18 Column, Waters) worden gebruikt. Dit
is een niet gemodificeerde silica kolom met een apolaire affiniteit. De C18 ketens gaan
hydrofobe interacties aan onder de vorm van Van der Waals verbindingen (Figuur 3.2).
FIGUUR 3.2: INTERACTIE EN SCHEIDINGSPRINCIPE VAN DE SYMMETERY C18 COLUMN
Van elk staal werd 10 µL geïnjecteerd en vermengd met solvent dat dankzij de pomp
(Finnigan suveyor MS pomp plus, Thermo Scientific, Waltham, VS) aan een constante flow
van 300 µL/min over de kolom werd gebracht. Tijdens de analyse wijzigde de samenstelling
van de mobiele fase (gradiëntelutie). Hier werd eveneens met gradiëntelutie gewerkt zoals
weergegeven in tabel 3.3.
TABEL 3.3:
GRADIËNTPROGRAMMA VAN DE ANALYSE MET ALS SOLVENT A:
0.5 % HAc IN
H2O EN ALS SOLVENT B 100 % METHANOL
Tijd (min)
Fow (µL/min)
Solvent A (%)
Solvent B(%)
0.00
3.00
20.00
25.00
25.00
35.00
300
300
300
300
300
300
50
50
0
0
50
50
50
50
100
100
50
50
Voor de detectie werd gebruik gemaakt van een ion trap massaspectrometer (Finnigan
LTQ, Thermo Scientific, Waltham, VS). De ionisatie vond plaats dankzij HESI (heated
elektrospray ionisatie) in negatieve modus.
TABEL 3.4: IDENTIFICATIE
Analyt
Precursor-ion
Collision Energy (eV)
Product-ion
Thiouracil
PTU-D5
343
390
44
30
182 ; 215 ; 309
127 ; 262 ; 356
22
Aan de hand van ion trap technologie is het in het protocol met derivatisatie wel
mogelijk om 2 product-ionen te geneneren voor thiouracil (Tabel 3.4). Nu wordt voor
thiouracil wel voldaan aan de minimumscore van 4 identificatiepunten (CD 2002/657/EC,
2002).
3.2.2. Digestiemodellen
Als voeder of voedingselement werd in de digestiemodellen gekozen voor leden van de
plantenfamilie
Brassicaceae.
Er
werd
geopteerd
voor
koolzaadschroot
van
het
veevoederbedrijf Depre Voeders NV (Beernem, België) dat afkomstig is van een 00-variant
van koolzaad (Brassica napus). Voor de niet 00-varianten werd gewerkt met het zaad van
bladkool Napoleon (Brassica oleracea) (ILVO, Melle) en voederkool (Brassica oleracea)
(Frankrijk). Het zaad werd vooraf op drie manieren bewerkt. Een deel werd geplet, een
tweede deel werd geplet en het myrosinase werd geïnactiveerd door middel van koken (Van
Eylen et al., 2006) en bij het laatste deel bleef het zaad intact. Al deze voedertypes werden
vooraf gevriesdroogd om zo een homogene samenstelling te krijgen en de invloed van water
te beperken. Voor het varken werd de maag-, dunne darm- en dikke darmdigestie gesimuleerd
terwijl voor het rund de pensdigestie werd nagebootst.
3.2.2.1.
Maagdigestie
Om de digestie van de maag te simuleren, moest eerst het maagsap aangemaakt worden
(Tabel 3.5). De voornaamste functie van maagsap is het steriel houden van de maaginhoud en
het bovenste gedeelte van de dunne darm, dit wordt bewerkstelligd door de zure pH. Het
maagsap zelf moest dus ook steriel zijn, vandaar het autoclaveren voor gebruik. Aanzuren van
het maagsap tot een pH van 1.5, met behulp van HCl, gebeurde nadat we er onze
voedingstoffen in vermengd hadden (Gawlik-Dziki et al., 2009).
TABEL 3.5: SAMENSTELLING MAAGSAP
Componenten
Concentratie (mol/L)
KHCO3
NaCl
0.1
0.1
Voor de digestie werd 2 g van elk Brassicaceae staal geïncubeerd met 20 mL maagsap,
waarna dit op pH gebracht werd. In de maag worden de eiwitten afgebroken onder invloed
van de pepsine (32 mg/ 100 mL). Dit is een proteolytisch enzym dat zijn werkingsoptimum
23
heeft bij pH 1.8. De pepsine mocht niet geautoclaveerd worden want dan denatureerde het
enzym. Het werd via filtersterilisatie gezuiverd en bij het maagsap gebracht (625 µL/ 500 mL
maagsap). Het geheel werd grondig gemengd. Het staal verdeelden we in steriele flesjes van
50 mL en werd onder anaerobe condities geïncubeerd bij een temperatuur van 37°C,
gedurende 2 uur. Het creëren van een anaerobe omgeving gebeurde door middel van flushen.
Hierbij werd gedurende 30 min afwisselend 1 min lucht onttrokken en gedurende 1 min
stikstof toegevoegd. Na 2 uur in de incubator werd 1.5 mL staal genomen. Het staal werd
onmiddelijk ingevroren bij -20°C om de bacteriële processen stop te zetten.
3.2.2.2.
Dunne darmdigestie
Na de maag volgde de dunne darmdigestie, hiervoor werd gebruik gemaakt van
pancreassap (Tabel 3.6) (Gawlik-Dziki et al., 2009). Daar de steriliteit moest bewaard blijven
diende het sap vooraf geautoclaveerd te worden.
TABEL 3.6: SAMENSTELLING PANCREASSAP
Componenten
NaHCO3
Oxgall
pancreatine
Concentratie (g/L)
12.5
6
0.9
Aan de steriele flesjes voegden we 50 % pancreassap toe waarna het opnieuw in de
incubator ging bij 37°C, ditmaal gedurende 4 uur. Na 4 uur in de incubator werd 1.5 mL staal
genomen wat bij -20°C bewaard werd tot analyse.
3.2.2.3.
Dikke darmdigestie
Voor de dikke darmdigestie was nood aan bacteriëel darmflora. Vers fecaal materiaal
van het varken (ILVO, Melle) werd verzameld en gehomogeniseerd met een buffer, per 100
gram fecaal materiaal werd 500 mL buffer toegevoegd. De buffer was reeds geautoclaveerd
en bestond uit 8.8 g/L K2HPO4, 6.8 g/L KH2PO4 en 1 g/L natriumthioglycolaat.
Voor de dikke darmdigestie werd gebruik gemaakt van het SHIME (simulator van het
menselijk intestinaal ecosysteem) medium, als voedingsbodem voor darmbacteriën (Tabel
3.7) (Molly et al., 1994). Deze diende vooraf geautoclaveerd te worden daar enkel met de
bacteriën van de faeces wou gewerkt worden.
24
TABEL 3.7: SAMENSTELLING SHIME MEDIUM
Componenten
Arabinogalactaan
Pectine
Xylaan
Zetmeel
Glucose
Gistextract
Pepton
Mucine
L-cysteïne
Concentratie (g/L)
1
2
1
4
0.4
3
1
4
0.5
We voegden aan het SHIME medium het fecaal inoculum toe in een 9:1 verhouding.
Voor de uiteindelijke dikke darmdigestie namen we 10 mL van dit 9:1 mengsel en 10 mL
zuiver SHIME medium. Het werd toegevoegd aan het reeds geïncubeerde staal. Het staal
werd opnieuw onder een anaerobe atmosfeer gebracht aan de hand van flushing en
geïncubeerd bij 37°C. Op tijdstippen 0 u, 24 u, 48 u en 72 u werd 1.5 mL staal genomen dat
bij -20°C bewaard werd tot analyse.
3.2.2.4.
Pensdigestie
Het gebruikte pensvocht was afkomstig van 5 bokken (Proefhoeve Melle, Prof. V.
Fievez, vakgroep Dierlijke Productie, Ugent). Er werd niet met rund gewerkt daar enkel
lacterende koeien beschikbaar waren. Hun voeding variëert mee met de lactatieperiode wat
leidt tot variatie in het pensvocht. Dit vermijdde men liever vandaar dat men pens van een bok
verkoos.
Als voeder voor de pensdigestie werd geplet koolzaad, ongeplet koolzaad en
koolzaadschroot gebruikt. Bij 0.25 gram gevriesdroogd staal werd 20 mL fosfaatbuffer pH 6.8
toegevoegd. Het geheel werd 6 maal geflushed met CO2, dat in vivo ook in de pens aanwezig
is. Er werd 5 mL vers pensvocht toegevoegd (Boeckaert et al., 2007; Fievez et al., 2007). Als
interne standaard werd 1 mL ethaangas toegevoegd. Na 24 u in de incubator bij 39°C, werd
gecontroleerd of de digestie goed was verlopen. Dit door de pH en de gevormde korte
vetzuren te bepalen. Ook werden de geproduceerde gassen gemeten met behulp van GC
analyse. Na staalname werd de digestie gestopt door in te vriezen bij -20°C.
25
3.2.3. Analyse van afgenomen digestiestalen
Alle stalen van de incubatie experimenten werden ingevrozen om bacteriële groei te
stoppen. Voor het starten van de opzuivering en de LC-MS2 analyse van de incubatiestalen
werden 2 protocols toegepast en vergeleken (Tabel 3.8). Dit voor zowel maag-, dunne darm-,
dikke darm- en penssap.
TABEL 3.8: OPZUIVERINGSPROTOCOLS
Protocol zonder derivatisatie
Protocol met derivatisatie

(Vanden Bussche et al., 2010)
Centrifugeer 15 min bij 9000 rpm
(Pinel et al., 2005)
 Neem 1 mL staal

Neem 1 mL supernatans

Voeg 100 ng/L PTU-D5 toe als interne
standaard

Voeg 100 ng/L PTU-D5 toe als interne

Buffer met 5 mL fosfaatbuffer pH 8

Voeg 100 µL 3-IBBr toe (2 mg/ mL
standaard

Buffer met 1 mL fosfaatbuffer pH 7
gesatureerd met 1% DTT
MeOH)

1 min vortexen

1 min vortexen

Plaats 30 min in oven bij 65°C

Plaats 10 min in ultrasoonbad en 1 uur
in warmwaterbad bij 40°C

Vloeistof-vloeistof extractie met 2x5

Breng op pH 3.6
mL ethylacetaat

Centifugeer 5 min bij 6500 rpm

Vloeistof-vloeistof extractie met 3; 2; 2

Het bekomen extract droogdampen

mL diëthylether
Het
bekomen extract droogdampen
onder stikstof bij 60°C


onder stikstof bij 60°C

Residu heroplossen in 200 µL van een
Residu heroplossen in 100 µL CH2Cl2
0.5% Hac in water en 100% MeOH
en 300 µL cyclohexaan en breng over
mengsel (70/30,v/v)
SI SPE kolom

Filteren over 0.22 µm voor in LC-MS
vial te brengen
Het bekomen extract droogdampen
onder stikstof bij 60°C

Residu heroplossen in 120 µL van een
0.5% Hac in water en 100% MeOH
mengsel (50/50, v/v)
26
3.2.4. Veevoederanalyse
3.2.4.1.
Myrosinasebehandeling
Oplossingen

Natuurlijk myrosinase volgens protocol van Wrede (1941)
De myrosinase oplossing werd telkens vers bereid volgens het protocol van Wrede
(1941): 2.5 gram mosterdzaad (Brassica nigra) pletten met 15 mL ultrapuur water en
gedurende 30 min roeren. Dit mengsel wordt dan 10 min gecentrifugeerd op 10000 rpm. Mix
het supernatans met een gelijk volume 90% ethanoloplossing. Centrifugeer het mengsel
opnieuw op 10000 rpm gedurende 10 min en was het precipitaat met 5 mL 70%
ethanoloplossing. Centrifugeer opnieuw met dezelfde parameters. Verwijder de ethanol en los
het precipitaat op in 2.5 mL ultrapuur water.

Synthetisch myrosinase (Shaw et al., 2009)
Los 24 mg van het thioglucosidase op in 100 µL ultrapuur water. Deze myrosinase
oplossing kan bewaard worden bij -20°C.
3.2.4.2.
Proefopzet
Zonder derivatisatie
TABEL 3.9: BASISSAMENSTELLING VAN DE STALEN
Staal type 1
0.5 gram
koolzaadschroot
9.5 mL
fosfaatbuffer pH7
0.5 mL natuurlijk
myrosinaseoplossing
100 ng/L
PTU-D5
Staal type 2
0.5 gram
koolzaadschroot
19.5 mL
fosfaatbuffer pH7
0.5 mL natuurlijk
myrosinaseoplossing
100 ng/L
PTU-D5
Elk staal (Tabel 3.9) werd in tweevoud gemaakt. Na 4 uur in het verwarmd
ultrasoonbad (40°C) en overnacht in de oven bij 40°C werden de stalen gecentrifugeerd bij
10000 rpm gedurende 10 min en gefilterd. Met het filtraat werd verder gewerkt (De
Brabander & Verbeke, 1982).
De stalen ondergingen vloeistof-vloeistof extractie met 2 keer 8 mL ether. Het extract
werd drooggedampt bij 60°C onder stikstof en heropgelost in 200 µL van een mengsel van
27
100% MeOH en 0.5% azijnzuur in water (30/70, v/v). Na filtratie met een 0.22 µm filter
werden ze overgebracht in een LC-MS vial. Analyse gebeurde via LC-MS2 (zie 3.2.1.1.).
Met derivatisatie
TABEL 3.10: BASISSAMENSTELLING VAN DE STALEN
Staal type 1
0.5 gram
koolzaadschroot
9.5 mL
fosfaatbuffer pH7
0.5 mL natuurlijk
myrosinaseoplossing
100 ng/L
PTU-D5
Staal type 2
0.5 gram
koolzaadschroot
19.5 mL
fosfaatbuffer pH7
0.5 mL natuurlijk
myrosinaseoplossing
100 ng/L
PTU-D5
Elk staal (Tabel 3.10) werd in tweevoud gemaakt. Na 4 uur in een verwarmd
ultrasoonbad bij 40°C en overnacht in de oven (40°C) werden de stalen gecentrifugeerd bij
10000 rpm gedurende 10 min en gefilterd. Met het filtraat werd verder gewerkt (De
Brabander & Verbeke, 1982).
Aan staal type 1 werd 8 mL fosfaatbuffer pH 8 toegevoegd en 400 µL 3-IBBr, terwijl
aan staal type 2 12 mL fosfaatbuffer pH 8 en 800 µL 3-IBBr werd toegediend. Er werd
grondig gemengd met de vortex en 10 min in ultrasoonbad geplaatst. Nadien werden de stalen
gedurende 1 uur in een warmwaterbad geplaatst bij 40°C en op pH 3.6 gebracht. Er werd een
vloeistof-vloeistof extractie met diëthylether uitgevoerd. Voor staal type 1 extraheerde men 2
keer met 8 mL en voor staal type 2 twee keer met 10 mL diëthylether. Het extract werd
drooggedampt onder stikstof bij 60°C. Het residu werd heropgelost in 100 µL CH2Cl2 en 300
µL cyclohexaan. Voor een betere opzuivering werd gebruik gemaakt van SPE met SI
kolommen. Deze werden eerst geconditioneerd met 15 mL cyclohexaan en dan beladen met
de stalen. Nadien werden ze gewassen met 6 mL cyclohexaan en drooggetrokken. De
componenten werden geëlueerd met een mengsel van n-hexaan en ethylacetaat (40/60, v/v).
Het mengsel werd drooggedampt onder stikstof bij 60°C en heropgelost in 100% MeOH en
0.5% Hac in water (50/50,v/v). De stalen werden via LC-MS2 geanalyseerd ( zie 3.2.1.2.).
28
4. RESULTATEN
4.1.
ANALYSE VAN DIGESTIEMODELLEN
Voor alle type stalen is vertrokken van 2 verschillende protocols namelijk met
derivatisatie (Pinel et al., 2005) en zonder derivatisatie (Vanden Bussche et al., 2010). Voor
beide
protocols
zijn
parameters
van
de
opzuivering
geoptimaliseerd.
Daar
de
ongederivatiseerde methode enkel 4 IP’s behaalt met een massaspetrometer gebaseerd op de
quadrupool technologie (QqQ), zijn wegens de geringe beschikbaarheid van het toestel, enkel
de pensstalen op deze wijze geanalyseerd. De overige stalen zijn op de LTQ geanalyseerd
waar enkel de gederivatiseerde variant 4 IP’s behaalt. De simulatie van de spijsvertering is
met herhaling in de tijd uitgevoerd, dit om behaalde resultaten te bevestigen. Om een idee te
verkrijgen over de concentratie van de gedetecteerde thiouracil werd ook bij elk type staal
(maag-, dunne-, dikke darm en pens) een matrix-specifieke ijklijn meegenomen.
4.1.1. Maagsap
Bij de analyse is een ijklijn (0-2.5-5-10-25-50 µg/L) inbegrepen, gemaakt van blanco
maagsap, dewelke voor en na de verschillende digestiestalen geïnjecteerd werd. De ijklijn
(Figuur 4.1) toont de geschiktheid aan van het gekozen interval en helpt tevens voor het
berekenen van de gevonden concentraties aan thiouracil in de geanalyseerde stalen. Na LCMS2 analyse van de stalen, genomen 2 u na maagdigestie, blijken deze negatief te zijn voor
thiouracil.
Piekoppervlakteverhouding
Ijklijn maagdigestie
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
y = 0,0182x + 0,0059
R² = 0,9951
ijklijn
maagdigestie
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Concentratie thiouracil (µg/L)
FIGUUR 4.1: IJKLIJN PENSVOCHT MET THIOURACIL CONCENTRATIES VAN 0-2.5-5-10-25-50
µG/L
29
4.1.2. Dunne darmsap
De stalen, genomen na 4 u dunne darmdigestie, werden geanalyseerd volgens het
protocol van Pinel et al. (2005) (zie 3.2.3). De ijklijn (Figuur 4.2), gemaakt met blanco dunne
darmsap, heeft een R² die 1 sterk benadert. De ijklijn toont dat de gebruikte analysemethode
voldoende werkt voor het gekozen interval (0-2.5-5-10-25-50 µg/L). Uit de resultaten blijkt
dat voor geen enkel staal thiouracil kan teruggevonden worden.
Ijklijn dunne darmdigestie
Piekoppervlakteverhouding
1,000
y = 0,0188x - 0,0063
R² = 0,9991
0,900
0,800
0,700
0,600
ijklijn dunne
darmdigestie
0,500
0,400
0,300
0,200
0,100
0,000
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Concentratie thiouracil (µg/L)
FIGUUR 4.2: IJKLIJN PENSVOCHT MET THIOURACIL CONCENTRATIES VAN 0-2.5-5-10-25-50
µG/L
4.1.3. Dikke darmsap
Gedurende de dikke darm digestie werd op tijdstip 0 u - 24 u- 48 u- 72 u staalgenomen,
deze stalen werden geanalyseerd via het protocol van Pinel et al (2005) (zie 3.2.3). Na
controle van de bekomen ionenverhouding en de retentietijd blijkt dat in bepaalde stalen
thiouracil terug te vinden is. Deze positieve resultaten zijn zowel in de digestie van week 1 als
in week 2 terug te vinden. Hierbij is wel een duidelijk onderscheid te maken tussen de
verschillende voedertypes (Figuur 4.3). Zo wordt bij sommige voedertypes (kool en
koolzaadschroot) reeds vanaf tijdstip 0 een thiouracil gehalte gedetecteerd. Terwijl bij andere
voedertypes (geplet koolzaad en geplet koolzaad met geïnactiveerd myrosinase) pas na 24 u
een signaal voor thiouracil te zien is. Voor het evalueren van de resultaten wordt geen
rekening gehouden met de piekoppervlakte van de interne standaard (PTU-D5) daar deze te
30
sterk daalt naarmate de digestieduur stijgt. Daarom wordt enkel rekening gehouden met de
piekoppervlakte van thiouracil en dus niet met de piekoppervlakteverhouding.
Piekoppervlakte thiouracil
Tijdsverloop digestie dikke darm
9000
Koolzaadschroot
8000
7000
Koolzaad geplet inactief
6000
Koolzaad geplet
5000
Kool
4000
3000
2000
1000
0
T0
T24
T48
T72
Tijd (u)
FIGUUR 4.3: TIJDSVERLOOP GEMIDDELDE PIEKOPPERVLAKTE THIOURACIL VAN DE DIKKE DARM
DIGESTIE MET VERSCHILLENDE VOEDERTYPES
4.1.4. Pensvocht
Bij het stopzetten van de incubatie na 24 u bij 39°C (3.2.2.4.) werd de fermentatie van
het proces gecontroleerd, dit voor elk staal. Voor elk staal een GC analyse uitgevoerd op de
aanwezige gassen zoals waterstof, methaan en ethaan (interne standaard). Fermentatie is te
vergelijken met oxidatie maar dan in anaeroob milieu en heeft dus ook transfer van protonen
nodig. In aeroob milieu gebeurt dit met H2O productie tot gevolg, in anaeroob milieu is dat
via waterstofproductie. Dit proces is echter zeer energetisch ongunstig en kan enkel doorgaan
als de oppervlaktespanning van waterstof voldoende laag is. Dit wordt bekomen door continu
afvoer van waterstof te garanderen aan de hand van methaanproductie. De methaanproductie
geeft dus een indicatie over de efficiëntie van het fermentatieproces, in alle stalen wordt aan
de norm voldaan. Waterstofgas is in alle stalen nauwelijks aanwezig, wat kenmerkend is voor
een efficiënt fermentatieproces. Ook de pH wordt gecontroleerd. Deze mag na incubatie niet
onder pH 5.4 gedaald zijn want dan is geen enzymatische of bacteriële omzetting meer
mogelijk in de pens. De pH waarde na de pensdigestie ligt voor geen enkel staal onder pH 6,
dit geeft aan dat de digestie goed is verlopen. De laatste controle van het fermentatieproces is
de analyse van de gevormde vertakte korte vetzuren. De normale verhouding tussen azijnzuur,
31
propionzuur en boterzuur is 70/20/10 (Tabel 4.1). Bij run 1 is geen propionzuur gevormd, dit
wijst erop dat de fermentatie hier niet goed is verlopen, ook is de 70/20/10 verhouding niet
aanwezig. Bij run 2 is bij benadering de 70/20/10 verhouding wel terug te vinden.
TABEL 4.1: ANALYSE RESULTATEN VAN PENSDIGESTIE
Staalnummers
pH
Run 1 Run 2
Azijnzuur (%)
Run 1 Run 2
Propionzuur (%)
Run 1
Run 2
Boterzuur (%)
Run 1 Run 2
KZ myro IA a
6.53
6.50
54,4
64,4
0,0
24,9
5,0
7,4
a
6.65
6.62
57,7
55,9
0,0
31,1
4,3
7,7
KZ myro IA a
6.67
6.69
53,0
67,1
0,0
23,2
5,6
6,7
KZ b
6.71
6.70
61,8
67,1
0,0
18,7
3,8
6,5
KZ b
6.68
6.68
60,4
69,3
0,0
15,3
3,6
6,3
KZ b
Geplet KZ
myro IA c
Geplet KZ
myro IA c
Geplet KZ
myro IA c
Geplet KZ d
6.71
6.75
60,5
62,3
0,0
21,1
4,7
7,0
6.63
6.65
57,8
51,5
0,0
31,6
2,8
6,5
6.67
6.63
58,4
56,1
0,0
29,3
2,8
6,1
6.67
6.65
56,7
54,2
0,0
29,9
3,0
6,0
6.65
6.62
57,2
50,4
0,0
30,4
2,9
7,0
Geplet KZ
d
6.65
6.63
58,5
50,0
0,0
30,8
2,9
6,5
Geplet KZ
d
KZ myro IA
6.63
6.65
58,1
51,0
0,0
30,3
2,9
6,8
e
6.54
6.53
60,7
54,1
0,0
32,2
1,6
7,3
KZ schroot e
6.55
6.53
60,1
52,7
0,0
33,0
1,7
7,6
KZ schroot
KZ schroot e
6.54
6.55
60,1
53,7
0,0
32,2
1,7
7,8
a
b
c
: Koolzaad waarbij myrosinase is geïnactieveerd; : Koolzaad, ongeplet; : Geplet
koolzaad waarbij myrosinase is geïnactiveerd; d: Geplet koolzaad; e: Koolzaadschroot
Voor de start van de pensvochtanalyse was optimalisatie van de opzuivering
noodzakelijk, verschillende parameters werden hierbij getest en aangepast. Als startpunt werd
het bestaande protocol van Vanden Bussche et al (2010) genomen (zie 3.2.3.). Als eerste
parameter werden verschillende buffers met elkaar vergeleken, namelijk fosfaatbuffer pH 7,
fosfaatbuffer pH 7 gesatureerd met 1% DTT en natriumacetaatbuffer pH 5.2. Uit de resultaten
blijkt dat de fosfaatbuffer pH 7 gesatureerd met 1% DTT het beste resultaat geeft, gevolgd
door natriumacetaatbuffer pH 5.2 en dan fosfaatbuffer pH 7 (Figuur 4.4). Voor pensanalyse is
uiteindelijk gekozen voor de fosfaatbuffer pH 7 gesatureerd met 1 % DTT. De resultaten
tonen aan dat de additie van DTT een meerwaarde heeft voor de analyse.
32
A)
R
C)
B)
RT: 0.00 - 20.02 SM: 5G
RT: 0.00 - 20.02 SM: 5G
RT: 5.38
AA: 42194
SN: 731
100
90
RT: 5.38
P: 42194
RT: 5.37
P: 5976
90
80
80
70
70
RT: 0.00 - 20.03 SM: 5G
100
NL:
RT: 4.65E3
5.37
m/z=
57.50-58.50 F: ITMS - c
AA: 5976
ESI
Full ms2
SN:sid=10.00
76
[email protected] [
50.00-250.00] MS ICIS
100315s18
100
NL: 4.53E2
m/z= 57.50-58.50 F: ITMS - c
ESI sid=10.00 Full ms2
[email protected] [
50.00-250.00] MS ICIS
100315s20
NL: 2.47E3
m/z= 57.50-58.50 F
ESI sid=10.00 Full
[email protected] [
50.00-250.00] MS
100315s25
RT: 5.39
P: 28200
90
80
TU
50
40
60
40
60
50
TU
40
30
30
30
20
20
20
RT: 6.57
AA: 3442
SN: 15
10
10
0
0
RT: 11.15
AA: 287773
SN: 2048
100
NL: 4.05E4
m/z=
57.50-58.50+139.50-140.50
F: ITMS - c ESI sid=10.00
Full ms2 [email protected] [
50.00-250.00] MS ICIS
100315s18
100
90
90
RT:11.29
80
90
Relative Abundance
70
60
PTU-D5
50
40
80
RT: 11.32
80
70
0
100
RT: 11.32
AA: 305269
SN: 1615
60
PTU-D5
50
40
NL: 3.46E4
NL: 4.14E4
m/z=
57.50-58.50+139.50-140.50
F: ITMS - c ESI sid=10.00
Full ms2 [email protected] [
50.00-250.00] MS ICIS
100315s20
m/z=
57.50-58.50+139.5
F: ITMS - c ESI sid=
Full ms2 174.00@
50.00-250.00] MS
100315s25
RT: 11.28
70
Relative Abundance
10
Relative Abundance
TU
50
Relative Abundance
60
Relative Abundance
Relative Abundance
70
60
PTU-D5
50
40
30
30
30
20
20
RT: 12.62
AA: 7519
SN: 15
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Time (min)
12
13
14
20
RT: 15.46
RT: 1.88 RT: 2.57
10
AA: 1945AA: 4649 AA: 7484
SN: 11 SN: 10 SN: 12
0
15 0 16 1 17 2 18 3
10
0
19 4
20 5
6
7
8
9
10
11
Time (min)
12
13
14
0
15
1
16
2
17
3
18
4
19
5
20
6
7
8
9
10
11
Time (min)
12
13
14
15
RT: retentietijd; P: piekoppervlakte; TU: thiouracil
FIGUUR 4.4:
CHROMATOGRAM VAN BLANCO PENSVOCHT, GESPIKED MET THIOURACIL
(TU)
100
AAN
µG/L EN
INTERNE
STANDAARD,
PTU-D5
AAN
100
µG/L
(A)
FOSFAATBUFFER + 1%DTT (B) FOSFAATBUFFER PH 7 (C) NATRIUMACETAATBUFFER PH
5.2
Een tweede parameter is het gebruik van de oven. DTT is in staat om
disulfideverbindingen te verbreken en deze verbindingen bevinden zich niet altijd aan het
oppervlak. Daarom werd nagegaan of werken in denaturerende condities (65 °C, 30 min) een
voordeel met zich meebrengt, dit ten opzichte van stalen in het ultrasoonbad op
kamertemperatuur (30 min). Eveneens werden verscheidene extractiesolventen vergeleken
met name ethylacetaat, dichloromethaan en diëthylether. Algemeen uit de resultaten blijkt dat
de extractie efficiëntie voor thiouracil het hoogst ligt met ethylacetaat. Door de geringe
opzuivering van dit protocol (zie 3.2.3.) werd na het droogdampen en heroplossen twee extra
opzuiveringsstappen ingevoerd. Ten eerste werd het pensvocht voor de start van de analyse
gecentrifugeerd gedurende 15 min aan 9000 rpm, voor de analyse werd verder gewerkt met
het supernatans. Er werd voorafgaand getest of centrifugatie geen verlies van thiouracil
teweegbrengt, wat niet het geval was. Een tweede opzuiveringstap werd ingevoerd op het
einde van het protocol. Hierbij werd centrifugatie gedurende 14 min aan 13000 rpm
33
16
17
18
19
20
vergeleken met filtratie door 0.22 µm filters. Voor pensvocht met fosfaatbuffer pH 7
gesatureerd met 1 % DTT geven 0.22 µm filters de beste resultaten (Figuur 4.5).
A)
B)
RT: 0.00 - 20.02 SM: 5G
100
RT: 0.00 - 20.02 SM: 5G
100
RT: 5.38
P: 42194
90
80
80
70
Relative Abundance
Relative Abundance
NL: 2.07E3
m/z= 57.50-58.50 F: ITMS - c
ESI sid=10.00 Full ms2
[email protected] [
50.00-250.00] MS ICIS
100315s19
RT: 5.35
P: 27477
90
70
60
50
40
60
50
40
30
30
TU
20
TU
20
10
10
0
100
0
100
90
90
RT: 11.26
80
NL: 4.05E4
NL: 3.75E4
m/z=
57.50-58.50+139.50-140.50
F: ITMS - c ESI sid=10.00
Full ms2 [email protected] [
50.00-250.00] MS ICIS
100315s18
m/z=
57.50-58.50+139.50-140.50
F: ITMS - c ESI sid=10.00
Full ms2 [email protected] [
50.00-250.00] MS ICIS
100315s19
RT: 11.29
80
70
PTU-D5
60
50
40
Relative Abundance
70
Relative Abundance
NL: 4.65E3
m/z= 57.50-58.50 F: ITMS - c
ESI sid=10.00 Full ms2
[email protected] [
50.00-250.00] MS ICIS
100315s18
PTU-D5
60
50
40
30
30
20
20
10
10
0
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Time (min)
12
13
14
15
0 16
1 17
2 18
3 19
4 20
5
6
7
8
9
10
11
Time (min)
12
13
14
15
16
17
18
RT: retentietijd; P: piekoppervlakte; TU: thiouracil
FIGUUR 4.5: CHROMATOGRAM VAN BLANCO PENSVOCHT, GESPIKED MET THIOURACIL
(TU) AAN 100 µG/L EN INTERNE STANDAARD, PTU-D5 AAN 100 µG/L (A)
FOSFAATBUFFER PH 7 + 1% DTT MET 0.22 µM FILTER (B) FOSFAATBUFFER PH 7 + 1 %
DTT GECENTRIFUGEERD 14 MIN 13000 RPM
In het uiteindelijk protocol werd na ontdooien het staal gecentrifugeerd. Aan het
supernatans werd een fosfaatbuffer pH 7 gesatureerd met 1% DTT toegevoegd. Dit mengsel
werd gedurende 30 min in een oven bij 65° geplaatst en geëxtraheerd met ethylacetaat. Na
droogdampen en heroplossen werd het geheel door een 0.22 µm filter gebracht (Figuur 4.6).
34
19
20
Diëthylether
Natriumacetaat
pH 5.2
Ethylacetaat
Kamertemperatuur
Dichloromethaan
Fosfaatbuffer
pH 7
+ 1% DTT
Diëthylether
Oven bij
65°C
Filter
Ethylacetaat
Fosfaatbuffer pH 7
Centrifugeren
Dichloromethaan
FIGUUR 4.6 OVERZICHT VAN DE GETESTE PARAMETERS
Na het optimalisatieproces werden alle digestiestalen volgens dit protocol behandeld
voor LC-MS/MS analyse. Voor deze analyse hadden we éénmalig de massaspectrometer
gebaseerd op quadrupool technologie (QqQ) ter onze beschikking. Op dit toestel wordt wel
voldaan aan de wetgeving (CD 2002/657/EC, 2002) om 4 IP’s te behalen. Daar dit toestel
maar éénmalig werd gebruikt en daar de LC-MS/MS parameters zijn overgenomen van
Vanden Bussche et al. (2010), werden ze niet besproken in het hoofdstuk materiaal en
methoden. Bij de analyse zijn hier ook 2 ijklijnen (0-2.5-5-10-25-50 µg/L) inbegrepen (Figuur
4.7), gemaakt van blanco pensvocht van enerzijds week 1, anderzijds van week 2. Deze tonen
aan dat het interval van de analysemethode een juist bereik heeft voor deze analyse. Beide
ijklijnen, afkomstig van digestie week 1 en week 2, verschillen nauwelijks en halen beiden
een R2 van bijna 1. Na evaluatie van de LC-MS/MS analyse blijkt geen enkel staal thiouracil
te bevatten.
35
Ijklijn pensvocht
y = 0,0033x - 0,0005
R² = 0,9997
Piekoppervlakte verhouding
0,200
0,180
y = 0,0036x - 0,0017
R² = 0,9976
0,160
0,140
0,120
0,100
ijklijn week 1
0,080
ijklijn week 2
0,060
0,040
0,020
0,000
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Concentratie thiouracil (µg/L)
FIGUUR 4.7: IJKLIJN PENSVOCHT MET THIOURACIL CONCENTRATIES VAN 0-2.5-5-10-25-50
µG/L
4.2.
VEEVOEDERANALYSE
De eerste testen met koolzaadschroot werden met het protocol zonder derivatisatie
(Vanden Bussche et al., 2010) uitgevoerd. Het doel was voornamelijk om de opzuivering aan
te passen voor een veevoedermatrix, dit door verscheidene parameters te testen. Zo werd de
stap van vaste fase extractie meermaals getest, telkens met verschillende kolommen. Er werd
onderzocht welk type kolom het meeste aangewezen is om thiouracil op te zuiveren uit het
monster. Er werden 3 types kolommen uitgeprobeerd, namelijk de oasis HLB kolom, oasis
WAX kolom en SI 0.5 gram kolom. De resultaten van de verschillende types kolommen zijn
uiteenlopend. De beste resultaten zijn behaald met SI kolom, gevolgd door HLB kolom en
dan de WAX kolom. Een algemeen beeld na deze test is dat de stalen het toestel vervuilen.
Dit ziet men doordat de piekoppervlakte van de standaardinjectie van thiouracil en PTU-D5
daalt in tijd. Deze vervuiling wijst erop dat de opzuivering onvoldoende is, vandaar werd
besloten om te werken met het derivatisatieprotocol (Pinel et al., 2005) waar de
opzuiveringstap uigebreider is. Er werd gekozen om verschillende hoeveelheden fosfaatbuffer
pH 7 (10 of 20 mL) met elkaar te vergelijken en daarboven nog de keuze tussen de analyse
van de volledige hoeveelheid supernatans (10 of 20 mL) of slechts 2 mL van het supernatans
(De Brabander, 1984). De beste resultaten zijn bekomen met de volledige hoeveelheid
supernatans van 20 mL, gevolgd door deze van 10 mL en ten slotte het supernatans waar maar
36
2 mL is van geanalyseerd. Tijdens de uiteindelijke analyse werd gekozen om de stalen met het
volledige supernatans van 10 en 20 mL parallel te analyseren. Uit de ijklijnen (0-2-5-10-20-50
µg/L) gemaakt van veevoeder blijkt dat de detectiemethode in staat is om in het voor ons
vooropgestelde interval thiouracil te detecteren (Figuur 4.8). De ijklijn waar vertrokken is van
20 mL supernatans vertoont grote variaties daar gedurende vloeistof-vloeistof extractie verlies
van volume plaatsvond doordat de overvolle proefbuizen met diëthylether niet perfect sluiten.
Deze variatie reflecteert in de ijklijn. Vandaar primeert de keuze van 10 mL buffer en analyse
van het volledige 10 mL supernatans.
Piekoppervlakte verhouding
Ijklijn koolzaadschroot
0,500
y = 0,0078x + 0,0486
R² = 0,9959
0,450
0,400
y = 0,0059x + 0,0665
R² = 0,923
0,350
0,300
ijklijn 10 mL
buffer
ijklijn 20 mL
buffer
0,250
0,200
0,150
0,100
0,050
0,000
0
20
40
60
Concentratie thiouracil (µg/L)
FIGUUR 4.8: IJKLIJN KOOLZAADSCHROOT MET THIOURACIL CONCENTRATIES VAN 0-2-5-10-2050 µG/L
Na analyse van het koolzaadschroot dat gedurende 24 u een enzymatische behandeling
(3.2.4.2) onderging met myrosinase blijkt dat thiouracil in verschillende stalen aanwezig is
(Tabel 4.2). Van de stalen geanalyseerd op 26 april is slechts 2 mL supernatans geanalyseerd,
dit van oorspronkelijk 10 en 20 mL fosfaatbuffer pH 7. Uit deze resultaten blijkt dat het
thiouracil gehalte lager ligt dan in de stalen van 6 mei, waar wel het volledige supernatans is
geanalyseerd (Figuur 4.9). Om de werking van het natuurlijk myrosinase te controleren werd
een staal behandeld met het synthetisch myrosinase. Uit de resultaten blijkt dat het
thiouracilgehalte lager is dan na een behandeling met het natuurlijk enzym, geëxtraheerd aan
de hand van Wrede (zie 3.2.4.1.). Ook werd, ter controle, een staal zonder enzymatische
behandeling geanalyseerd om na te gaan of de oorsprong van het gedetecteerde thiouracil niet
37
afkomstig was van het myrosinase. Eveneens werd in dit staal een thiouracilgehalte
gedetecteerd.
TABEL 4.2: RESULTATEN KOOLZAADSCHROOT ANALYSE
Behandeld met myrosinase
Niet behandeld met myrosinase
2.5-7.4 µg/kg TU
4-4.3 µg/kg TU
Blanco stalen
8
Concentratie TU (µg/L)
7
26 apr: 2 mL (10 mL)
6
5
26 apr: 2 mL (20 mL)
4
6 mei
3
6 mei
2
6 mei zonder myro
1
0
0
5
2(10)
10
15
2(20)
20
Hoeveelheid fosfaatbuffer pH 7 (mL)
FIGUUR 4.9: RESULTATEN VAN BLANCO KOOLZAADSCHROOT STALEN IN VERSCHILLENDE
HOEVEELHEDEN FOSFAATBUFFER PH7
38
5. DISCUSSIE
Thiouracil behoort tot de synthetische thyreostatica toch werd deze recent gedetecteerd in de
urine van onbehandelde dieren (Pinel et al., 2006a; Vanden Bussche et al., 2009). De
oorsprong van dit thiouracil is tot nu nog altijd onbekend. Wel zijn er vermoedens naar een
endogene status daar Pinel et al. (2006b) een dierenexperiment met runderen uitvoerden die
gevoed werden met voederkool van de plantenfamilie Brassicaceae. Uit dit experiment was
een link vast te stellen tussen het Brassicaceae dieet en thiouracil in de urine. Het objectief
van deze thesis was om de mogelijk endogene status van thiouracil bij nutsdieren en
veevoerder na te gaan. Dit door simulatie van het spijsverteringsstelsel, zowel van het varken
als van het rund en door analyse van veevoeder, namelijk koolzaadschroot. Een groot
onderdeel van deze thesis bestond eruit de opzuivering voor LC-MS² analyse te optimaliseren.
Voor de simulatie van het spijsverteringstelsel van het varken werd gebruik gemaakt
van een bestaand protocol (Gawlik-Dziki et al., 2009). Hierbij werden geen Brassicaceae
verteerd maar het beschrijft wel een eenvoudig uit te voeren statisch digestiemodel. De
efficiëntie van het fermentatieproces bij het varken werd niet gecontroleerd daar de GCanalyse niet op punt stond in het laboratorium Chemische Analyse (Ugent, Merelbeke). Toch
blijkt uit de resultaten dat het model beschreven door Gawlik-Dziki et al. (2009) ook voor
deze thesis toepasbaar is. Na simulatie van de maag- en de dunne darmdigestie blijkt dat hier
geen thiouracil aanwezig is, dit in tegenstelling met de dikke darm waar wel thiouracil werd
gedetecteerd. Voor de omzetting van glucosinolaten werd in de literatuur enkel de dikke darm
aangehaald (Cheng et al., 2004). Doordat de in vitro digestie in tijd herhaald werd, blijkt dat
de positieve resultaten behaald voor de dikke darmdigestie niet op toeval berusten. Wel zijn
duidelijke verschillen waarneembaar tussen de diverse voedertypes. Zo valt reeds bij T0
thiouracil te detecteren in stalen met koolzaadschroot en daalt deze hoeveelheid na 24u. Een
echte verklaring voor de daling van thiouracil is niet te vinden in de literatuur. Wel is een
analoog fenomeen te zien in het experiment van Krul et al. (2002), dit beschreef de
degradatiekinetiek van een glucosinolaat namelijk sinigrin tot zijn hydrolyseproduct allylisothiocyanaat. Hierbij was een piek te zien van isothiocyanaat tussen 9 en 12 u na toevoeging
van sinigrin in het digestiemodel, waarna de aanwezige concentratie terug daalde. In de
digestiestalen met geplet koolzaad werd pas na 48 u de aanwezigheid van thiouracil
gedetecteerd. Hierbij is mogelijk sprake van thiouracilvorming gedurende het digestieproces.
Dit gelijkaardig fenomeen is wel reeds in de literatuur beschreven. Krul et al. (2002)
beschreven de omzetting van het glucosinolaat sinigrin tot allyl-isothiocyanaat in de dikke
39
darm door de aanwezige darmflora zonder de aanwezigheid van het enzym myrosinase. Zo
kunnen intacte glucosinolaten de dikke darm bereiken gedurende digestie waar bacteriën,
zoals Escherichea (Krul et al., 2002) en Bifidobacterium (Cheng et al., 2004) aanwezig zijn.
Deze bacteriën zijn in staat om, net zoals het myrosinase, de glucosinolaten om te zetten tot
bijvoorbeeld isothiocyanaten (Cheng et al., 2004). De resultaten uit deze test en zoals
beschreven in het experiment van Pinel et al. (2006b) geven meer en meer bewijs dat
thiouracil misschien ook volgens deze weg kan gevormd worden.
Voor de pensdigestie van het rund, uitgevoerd in de proefhoeve (Ugent, Melle), werd
een bestaand protocol overgenomen (Fievez et al., 2007). In de proefhoeve wordt eveneens
met dit protocol gewerkt. De ijklijnen gevormd met de blanco pensdigesten tonen geen
variatie in de tijd. Dit wijst op een constante samenstelling van de pens en dat wordt gewerkt
met een betrouwbare extractie en analysemethode. In de resultaten moet wel rekening
gehouden worden met het feit dat run 1 geen goede fermentatie heeft doorlopen. Uit de
resultaten blijkt dat alle stalen negatief zijn voor thiouracil. De bacteriën aanwezig in de dikke
darm van het varken verschillen sterk met deze in de pens (Tajima et al., 1999). Zo zijn de
bacteriën die, net zoals myrosinase, glucosinolaten kunnen omzetten niet aanwezig in de pens
van het rund. (Tajima et al., 1999). Dit kan een mogelijke verklaring geven waarom in de
pens geen thiouracil vorming heeft plaatsgevonden.
In veevoeder waren Pinel et al. (2006b) niet in staat om thiouracil in voeder zelf terug te
vinden, wel hebben ze een verband kunnen aantonen tussen thiouracil en de plantenfamilie
Brassicacea. In dit onderzoek hebben we nagegaan of het enzym myrosinase hierin een rol
speelt. Mogelijk is een precursor voor thiouracil in het veevoeder aanwezig dat door
myrosinasebehandeling tot thiouracil wordt omgezet. Daarom werd het koolzaadschroot
gedurende 24u onderworpen aan een myrosinasebehandeling (De Brabander & Verbeke,
1982). Hierna gebeurde de opzuivering volgens het geoptimaliseerde protocol van Pinel et al.
(2005). De resultaten bekomen na koolzaadschroot analyse beamen de voorgaande resultaten
van Pinel et al. (2006b) niet, integendeel, uit onze resultaten blijkt dat thiouracil in het
koolzaadschroot aanwezig is. Om na te gaan of de myrosinasebehandeling een invloed heeft
op de thiouracil concentratie werden ook stalen geanalyseerd die niet voorbehandeld waren
met myrosinase. Ook in deze stalen was tot onze verbazing thiouracil te detecteren. Dit kan
misschien verklaard worden door Tripathi & Mishra (2007). Zij beschreven reeds dat olieextractie een invloed heeft op het glucosinolaatgehalte. Mogelijk is de aanwezigheid van
thiouracil ook te verklaren door het productieproces van koolzaadschroot (harlingerraap, 2240
5-2010). Hierbij wordt het koolzaad eerst vermalen en komt het vrijgekomen myrosinase in
contact met de aanwezige glucosinolaten waardoor er reeds omzetting kan plaatsvinden. Pas
daarna ondergaat het vermalen koolzaad een hittebehandeling gedurende extractie en
denatureert het myrosinase. Dit kan verklaren waarom in koolzaadschroot zonder
myrosinasebehandeling reeds thiouracil aanwezig is en dat na myrosinasebehandeling het
thiouracil gehalte hoger ligt door verdere omzetting. Om de werking van het natuurlijk
geëxtraheerde myrosinase (Wrede, 1941) te controleren werd een éénmalige test met het
duurder synthetisch myrosinase gedaan. Na analyse blijkt dat het natuurlijke myrosinase
afkomstig uit mosterdzaad hogere concentraties heeft en daarom werd gedurende verdere
analyse hiervoor gekozen. Uit de resultaten voor opzuivering blijkt dat wanneer gewerkt
wordt met de volledige 20 mL supernatans beter resultaat voor thiouracil te detecteren is,
maar de ijklijn heeft een lagere R² (0.92). Deze afwijking is te verklaren doordat met dit
volume niet gemakkelijk te werken valt wegens verlies tijdens extractie met diëthylether. In
toekomstige analyses lijkt het beter om enkel de volledige 10 mL fosfaatbuffer pH 7 te
analyseren daar het verschil in thiouracilgehalte met 20 mL buffer klein is.
Als toekomstig onderzoek lijkt het opportuun om de pensdigestie te herhalen met vers
geplet koolzaad zodat het vrijgekomen myrosinase reeds zijn werking kan uitvoeren, net zoals
de in vivo situatie (kauwen). Ook zou een opzet die het darmstelsel van het rund simuleert aan
de hand van een statisch model een meerwaarde bieden. Eventueel zijn de hierin aanwezige
bacteriën wel in staat glucosinolaten om te vormen tot thiouracil. Daar Pinel et al. (2006b)
thiouracil konden terugvinden in de urine na een Brassicaceae dieet moet verder gezocht
worden naar de oorsprong van dit thiouracil. Verdere analyse van verschillende voedertypes
zelf lijkt zeker aangewezen zoals de analyse van voederkool en koolzaad. Daar
koolzaadschroot afkomstig is van koolzaad en positief werd bevonden op thiouracil zou dus
ook in koolzaad mits, enzymatische behandeling, thiouracil moeten terug te vinden zijn.
Indien zou blijken dat koolzaad geen thiouracil bevat zou dit kunnen aantonen dat er
gedurende olie-extractie thiouracil vorming plaatsvindt.
41
6.
CONCLUSIE
Na optimalisatie van de twee gebruikte protocols (Pinel et al., 2005; Vanden Bussche et
al., 2010) werden de digestiesappen, bekomen na de simulatie van het spijsverteringsstelsel
van het varken en het rund, gecontroleerd op thiouracil. Zowel voor het varken als het rund
werd met verschillende voedertypes gewerkt gedurende digestie. Er kunnen dus ook
verschillende besluiten getrokken worden afhankelijk van het voedertype. Zo zijn de stalen
met koolzaadschroot reeds op T0 van de dikke darm positief voor thiouracil. De hoeveelheid
thiouracil neemt af na 24 u terwijl voor geplet koolzaad pas na 24 u thiouracil waar te nemen
valt. Voor voederkool is enkel thiouracil te vinden op T0 van de dikke darm digestie.
Voor de pensdigestie kunnen we niet hetzelfde besluit nemen daar in geen enkel staal
thiouracil teruggevonden werd. Nochtans zijn de GC resultaten voor de gevormde vetzuren en
gassen wel goed. We kunnen dus besluiten voor run 2 dat de pensdigestie goed is verlopen
maar dat gedurende het verteringsproces geen thiouracil gevormd werd. Dit geldt niet voor
run 1 waar reeds uit de GC resultaten blijkt dat het fermentatieproces niet goed is verlopen.
Voor de analyse van veevoeder werd het koolzaadschroot behandeld met het enzym
myrosinase gedurende 24 u. Uit de resultaten blijkt dat thiouracil aanwezig is. De werking
van het natuurlijk myrosinase werd gecontroleerd door ook een staal met het synthetisch
myrosinase te behandelen. Het thiouracil gehalte dat hier werd teruggevonden is veel lager
dan na behandeling met de natuurlijke variant. Dit wijst erop dat het myrosinase dat we zelf
extraheren een goede enzymatische activiteit vertoont. Om na te gaan of het enzym essentieel
is werd ook koolzaadschroot dat niet behandeld werd met myrosinase geanalyseerd, ook hier
werd thiouracil gedetecteerd.
Door alle resultaten bekomen gedurende dit onderzoek wordt het vermoeden naar een
endogene status van thiouracil versterkt. Toch is verder onderzoek naar de eventuele
precursor van thiouracil aangewezen. Ook dient de mogelijk endogene synthese van thiouracil
verder geanalyseerd te worden.
42
7. LITERATUURLIJST
Abuin, S.; Centrich, F.; Rubies, A.; Companyo, R.; Prat, M. D. (2008a). Analysis of
thyreostatic drugs in thyroid samples by Ultra-Performance Liquid Chromatography
tandem mass spectrometry detection. Analytica Chimica Acta, 617, 184-191.
Abuin, S.; Companyo, R.; Centrich, F.; Rubies, A.; Prat, M. D. (2008b). Analysis of
thyreostatic drugs in thyroid samples by liquid chromatography tandem mass
spectrometry:
Comparison
of
two
sample
treatment
strategies.
Journal
of
Chromatography A, 1207, 17-23.
Antonious, G. F.; Bomford, M.; Vincelli, P. (2009). Screening Brassica species for
glucosinolate content. Journal of Environmental Science and Health Part B-Pesticides
Food Contaminants and Agricultural Wastes, 44, 311-316.
Blanchflower, W. J.; Hughes, P. J.; Cannavan, A.; McCoy, M. A.; Kennedy, D. G.
(1997). Determination of thyreostats in thyroid and urine using high-performance liquid
chromatography atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometry. Analyst,
122, 967-972.
Boeckaert, C.; Vlaeminck, B.; Mestdagh, J.; Fievez, V. (2007). In vitro examination of
DHA-edible micro algae 1. Effect on rumen lipolysis and biohydrogenation of linoleic
and linolenic acids. Animal Feed Science and Technology, 136, 63-79.
Boisen, S.; Fernandez, J. A. (1997). Prediction of the total tract digestibility of energy in
feedstuffs and pig diets by in vitro analyses. Animal Feed Science and Technology, 68,
277-286.
Bones, A. M.; Rossiter, J. T. (1996). The myrosinase-glucosinolate system, its
organisation and biochemistry. Physiologia Plantarum, 97, 194-208.
Bones, A. M.; Rossiter, J. T. (2006). The enzymic and chemically induced decomposition
of glucosinolates. Phytochemistry, 67, 1053-1067.
Buick, R. K.; Barry, C.; Traynor, I. M.; McCaughey, W. J.; Elliott, C. T. (1998).
Determination of thyreostat residues from bovine matrices using high-performance liquid
chromatography. Journal of Chromatography B, 720, 71-79.
43
Cheng, D. L.; Hashimoto, K.; Uda, Y. (2004). In vitro digestion of sinigrin and
glucotropaeolin by single strains of Bifidobacterium and identification of the digestive
products. Food and Chemical Toxicology, 42, 351-357.
Commission Regulation 2377/90. (1990). Official Journal of the European Communities
L, 224, 1-8.
Commission Regulation 2002/657/EC. (2002). Official Journal of the European
Communities L, 221, 8-36.
Council Directive 81/602/EC. (1981). Official Journal of the European Communities L,
222, 32-33.
Council Directive 96/22/EC. (1996). Official Journal of the European Communities L,
125, 3-9.
Council Directive 96/23/EC. (1996). Official Journal of the European Communities L,
125, 10-32.
Courtheyn, D.; Le Bizec, B.; Brambilla, G.; De Brabander, H. F.; Cobbaert, E.; de Wiele,
A. V.; Vercammen, J.; De Wasch, K. (2002). Recent developments in the use and abuse
of growth promoters. Analytica Chimica Acta, 473, 71-82.
Cunningham, J.G.; Klein, B.G. (2007). Textbook of Veterinary physiology 4e edition.
Saunders, Missouri, USA, Chapter 31.
De Brabander, H.F. (1984). Bepalingsmethode voor thyreostatica in biologisch materiaal.
Proefschrift voorgelegd aan de faculteit der wetenschappen voor het verkrijgen van de
graad van geaggregeerde voor het hogere onderwijs Universiteit Gent, België.
De Brabander, H.F.; Batjoens, P.; Van Hoof, J. (1992). HPTLC of thyreostatic drugs with
GC-MS confimation. Journal of Planar Chromatography, 5, 124-130.
De Brabander, H. F.; Noppe, H.; Verheyden, K.; Vanden Bussche, J.; Wille, K.;
Okerman, L.; Vanhaecke, L.; Reybroeck, W.; Ooghe, S.; Croubels, S. (2009). Residue
analysis: Future trends from a historical perspective. Journal of Chromatography A,
1216, 7964-7976.
44
De Brabander, H. F.; Verbeke, R. (1975). Detection of Antithyroid Residues in Meat and
Some Organs of Slaughtered Animals. Journal of Chromatography, 108, 141-151.
De Brabander, H.F.; Verbeke, R. (1982). Determination of oxazolidine 2-thiones in
biological fluids in the ppb range. Journal of Chromatography, 252, 225-239.
De Wasch, K.; De Brabander, H. F.; Impens, S.; Vandewiele, M.; Courtheyn, D. (2001).
Determination of mercaptobenzimidazol and other thyreostat residues in thyroid tissue
and meat using high-performance liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of
Chromatography A, 912, 311-317.
De Wijn, J.F.; Hekkens, W.Th.J.M. (1989). Fysiologie van de voeding, Bohn stafleur Van
Loghum, Houten.
Doganoc, D. Z.; Grebenc, S. (1998). Indirect determination of thiouracils in slaughter
cattle by measuring the mass of the thyroid gland. Veterinarski Arhiv, 68, 85-90.
Fievez, V.; Boeckaert, C.; Vlaeminck, B.; Mestdagh, J.; Demeyer, D. (2007). In vitro
examination of DHA-edible micro-algae 2. Effect on rumen methane production and
apparent degradability of hay. Animal Feed Science and Technology, 136, 80-95.
Frandson, R.D.; Spurgeon, T.L. (1992). Anatomy and physiology of farm animals 5th
edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, VS, Chapter 19.
Gawlik-Dziki, U.; Dziki, D.; Baraniak, B.; Lin, R. (2009). The effect of simulated
digestion in vitro on bioactivity of wheat bread with Tartary buckwheat flavones
addition. LWT- Food Science and Technology, 42, 137-143.
Gissel, C.; Schaal, M. (1974). Eine dünnschichtchromatografische untersuchungsmethode
zum nachweis von thiouracilderivaten in der schilddrüse schlachtbarer haustiere. Arch.
für Lebensmittelhyg., 1, 8-13.
Golding, M.; Wooster, T. J. (2010). The influence of emulsion structure and stability on
lipid digestion. Current Opinion in Colloid & Interface Science, 15, 90-101.
Hoglund, A. S.; Lenman, M.; Rask, L. (1992). Myrosinase Is Localized to the Interior of
Myrosin Grains and Is Not Associated to the Surrounding Tonoplast Membrane. Plant
Science, 85, 165-170.
45
Krul, C.; Humblot, C.; Philippe, C.; Vermeulen, M.; van Nuenen, M.; Havenaar, R.;
Rabot, S. (2002). Metabolism of sinigrin (2-propenyl glucosinolate) by the human
colonic microflora in a dynamic in vitro large-intestinal model. Carcinogenesis, 23,
1009-1016.
Lazarus, J. H. (2009). Lithium and thyroid. Best Practice & Research Clinical
Endocrinology & Metabolism, 23, 723-733.
Lipschitz, C.; Baars, B.; Van den Berg, J.; Janssen, H.G.; Schoenmakers, P.; Tijssen, R.;
Vonk, N. (1999). Chromatografie in de praktijk Vloeistofchromatografie, ten Hagen
Stam uitgevers, Den Haag, Nederland.
Lohmus, M.; Kallaste, K.; Le Bizec, B. (2009). Determination of thyreostats in urine and
thyroid gland by ultra high performance liquid chromatography tandem mass
spectrometry. Journal of Chromatography A, 1216, 8080-8089.
Mabon, N.; Mandiki, S. N. M.; Derycke, G.; Bister, J. L.; Wathelet, J. P.; Marlier, M.;
Paquay, R. (2000). Chemical changes and influences of rapeseed antinutritional factors
on lamb physiology and performance. 3. Antinutritional factors in plasma and organs.
Animal Feed Science and Technology, 85, 111-120.
Molly, K.; Vandewoestyne, M.; Desmet, I.; Verstraete, W. (1994). Validation of the
Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (Shime) Reactor Using
Microorganism-Associated Activities. Microbial Ecology in Health and Disease, 7, 191200.
Niessen, W. M. A. (1999). State-of-the-art in liquid chromatography-mass spectrometry.
Journal of Chromatography A, 856, 179-197.
Pinel, G.; Bichon, E.; Pouponneau, K.; Maume, D.; Andre, F.; Le Bizec, B. (2005).
Multi-residue method for the determination of thyreostats in urine samples using liquid
chromatography coupled to tandem mass spectrometry after derivatisation with 3iodobenzylbromide. Journal of Chromatography A, 1085, 247-252.
Pinel, G.; Maume, D.; Deceuninck, Y.; Andre, F.; Le Bizec, B. (2006a). Unambiguous
identification of thiouracil residue in urine collected in non-treated bovine by tandem and
high-resolution mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom, 20, 3183-7.
46
Pinel, G.; Mathieu, S.; Cesbron, N.; Maume, D.; De Brabander, H. F.; Andre, F.; Le
Bizec, B. (2006b). Evidence that urinary excretion of thiouracil in adult bovine submitted
to a cruciferous diet can give erroneous indications of the possible illegal use of
thyrostats in meat production. Food Additives and Contaminants, 23, 974-980.
Reed Larsen, P.; Davies, T.H.; Hay, I.D. (1998). The thyroid gland. In: Williams
Textbook of Endocrinology 9th edition, Wilson, J.D.; Foster, D.W.; Kronenberg, H.M.;
Larsen, P.R. (Eds.), WB Saunders Company Philadelphia, USA, pp. 389-515.
Shaw, E. J.; Fletcher, R. S.; Dosdall, L. L.; Kott, L. S. (2009). Biochemical markers for
cabbage seedpod weevil (Ceutorhynchus obstrictus (Marsham)) resistance in canola
(Brassica napus L.). Euphytica, 170, 297-308.
Soliva, C. R.; Zeleke, A. B.; Clement, C.; Hess, H. D.; Fievez, V.; Kreuzer, M. (2008). In
vitro screening of various tropical foliages, seeds, fruits and medicinal plants for low
methane and high ammonia generating potentials in the rumen. Animal Feed Science and
Technology, 147, 53-71.
Tajima, K.; Aminov, R. I.; Nagamine, T.; Ogata, K.; Nakamura, M.; Matsui, H.; Benno,
Y. (1999). Rumen bacterial diversity as determined by sequence analysis of 16S rDNA
libraries. Fems Microbiology Ecology, 29, 159-169.
Tripathi, M. K.; Mishra, A. S. (2007). Glucosinolates in animal nutrition: A review.
Animal Feed Science and Technology, 132, 1-27.
Vanden Bussche, J.; Noppe, H.; Verheyden, K.; Wille, K.; Pinel, G.; Le Bizec, B.; De
Brabander, H. F. (2009). Analysis of thyreostats: a history of 35 years. Anal Chim Acta,
637, 2-12.
Vanden Bussche, J.; Vanhaecke, L.; Deceuninck, Y.; Verheyden, K.; Wille, K.; Bekaert,
K.; Le Bizec, B.; De Brabander, H.F. (2010). Development and validation of an ultrahigh performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for
quantifying thyreostats in urine without derivatisation. Journal of Chromatography A,
published ahead-of-print as doi: 10.1016/j.chroma.2010.04.030
Van Eylen, D.; Indrawati; Hendrickx, M.; Van Loey, A. (2006). Temperature and
pressure stability of mustard seed (Sinapis alba L.) myrosinase. Food Chemistry, 97, 263271.
47
Van Waes, H. (1973). Bepaling van methylthiouracil in vlees. Landbouwtijdschrift, 2,
437-441.
Verordening (EG) Nr. 1035/2003 van de commissie (2003). Official Journal of the
European Communities L, 150, 24-25.
Wiersinga, W.M. (1999). Schildklierhormonen. In: Algemene farmacotherapie,
Wesseling, H.; Neef, C.; De Graeff, P. (Eds.), Bohn Stafleu Van Loghum,
Houten/Diegem, Belgïe, pp. 705-713.
Wickham, M.; Faulks, R.; Mills, C. (2009). In vitro digestion methods for assessing the
effect of food structure on allergen breakdown. Molecular Nutrition & Food Research,
53, 952-958.
Wrede, F. (1941). In: Die methoden der fermentforschung Band 2, Bamann, E.; Myrbäck,
K. (Eds.), Thieme, Germany, pp. 1835.
Yamada, T.; Jones, A. E. (1968). Effect of Thiocyanate Perchlorate and Other Anions on
Plasma Protein-Thyroid Hormone Interaction in Vitro. Endocrinology, 82, 47-53.
Yu, G. Y. F.; Murby, E. J.; Wells, R. J. (1997). Gas chromatographic determination of
residues of thyreostatic drugs in bovine muscle tissue using combined resin mediated
methylation and extraction. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the
Biomedical and Life Sciences, 703, 159-166.
Internet sites:
http://www.efsa.europa.eu/en/scdocs/scdoc/590.htm (7-4-2010)
http://www.favv.be/sp/pa-sa/doc/leg-vet/1974-04-12_ETD_KB.pdf (5-3-2010)
http://www.harlingerraap.nl/Downloads/Flyer%20Harlinger%20Raap.pdf (22-5-2010)
http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol79/mono79.pdf (7-4-2010)
http://publicaties.vlaanderen.be/docfolder/2607/Koolzaad_van_zaad_tot_olie_2005.pdf
(9-3-2010)
http://www.rivm.nl/bibliotheek/digitaaldepot/crlguidance2007.pdf (23-3-2010)
http://du.delaval.nl/Dairy_Knowledge/EfficientFeeding/Basic_Physiology.htm#Fysiologi
e%20van%20de%20koe (22-3-2010)
48