Nederlandse Samenvatting

University of Groningen
Cell wall deformation and Staphylococcus aureus surface sensing
Harapanahalli, Akshay
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to
cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
2015
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Harapanahalli, A. (2015). Cell wall deformation and Staphylococcus aureus surface sensing [Groningen]:
University of Groningen
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the
author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately
and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the
number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Download date: 18-07-2017
Nederlandse Samenvatting
139
Nederlandse Samenvatting
Staphylococcus aureus is één van de belangrijkste bacteriën verantwoordelijk voor
implantaat gerelateerde infecties. Biomateriaal gerelateerde infecties beginnen met
reversibele hechting van bacteriën aan een implantaat, waarna de gehechte bacteriën
beginnen met de productie van een matrix van extracellulaire polymere substanties (EPS)
om over te gaan tot irreversibele hechting, gevolgd door biofilm groei. De EPS matrix
beschermd de bacteriën in een biofilm tegen biologische, mechanische en chemische stress,
zoals de immuun respons, vloeistof gerelateerde schuifkrachten en behandeling met
antibiotica. Al deze grootse veranderingen in S. aureus fysiologie vinden plaats vanwege
hechting en biofilm formatie, vandaar dat mechanische waarneming van oppervlakte
hechting een belangrijke eigenschap is voor aanpassing en overleving. Echter, er is slechts
weinig bekend over de mechanische sensitiviteit van S. aureus gedurende hechting aan
oppervlakken.
Hoofdstuk 1 geeft een overzicht van de verschillen tussen twee belangrijke
sensorische strategieën die bacteriën gebruiken om de omgeving waar te nemen, chemische
en
mechanisch
sensorische
perceptie.
Bacteriën
worden
aan
verschillende
omgevingscondities blootgesteld tijdens hun groei en hebben verschillende mechanismes
ontwikkeld om hun omgeving waar te nemen en overleving te vergemakkelijken. Bacteriën
communiceren met hun omgeving door het waarnemen van chemische signalen zoals pH,
ionische sterkte of het waarnemen van biologische moleculen, zoals door quorum sensing.
Bacteriën reageren echter niet alleen op hun omgeving door chemische waarnemingen, maar
ook door fysieke waarnemingsmechanismen. Bij hechting aan een oppervlak bijvoorbeeld,
kunnen bacteriën reageren door de excretie van EPS door een mechanisme dat
mechanosensing wordt genoemd. Dit stelt ze in staat om te groeien in de door hun
geprefereerde matrix beschermde biofilm.
Vandaar dat het doel van dit proefschrift was om de rol van hechtingskrachten in de
respons van bacteriën op hechting te onderzoeken. We hebben S. aureus gebruikt als model
pathogeen dat veelvuldig voorkomt bij biomateriaal gerelateerde infecties en vervolgens deze
stam en een aantal isogene mutanten onderzocht met behulp van atomische kracht
microscopie (AFM) en oppervlakte versterkte fluorescentie (SEF), om de hechtingskrachten
en celwand vervorming te bepalen. De bacteriële respons werd geëvalueerd in termen van
gen expressie en getest op verschillende biomaterialen die veelvuldig gebruikt worden in
orthopedische implantaten.
140
Nederlandse Samenvatting
Bacteriële hechting op oppervlakken wordt beheerst door een combinatie van
verschillende korte- en langeafstandskrachten. In Hoofdstuk 2 presenteren we een nieuwe
methode gebaseerd op AFM om de bacteriële hechtingskrachten die over lange afstand
werken te bepalen, aan de hand van de toegepaste kracht tijden het gebruik van AFM. We
hebben twee S. aureus stammen (S. aureus ATCC12600 en S. aureus NCTC 8325-4) en hun
isogene Δpbp4 mutanten gebruikt. De lange afstand hechtingskrachten van de S. aureus
stammen (0.5 en 0.8 nN) waren slechts een derde van de krachten die gemeten werden voor
de meer vervormbare Δpbp4 mutanten (2.7 en 1.6 nN), die niet in staat zijn om
peptidoglycan te crosslinken. De gemeten Lifshitz-Van der Waals hechtingskrachten die over
lange afstand domineren, gaven de aanleiding om een 40% elliptische vervorming van de
bacteriële celwand aan te nemen voor de Δpbp4 mutanten. Directe metingen van hechtende
stafylokokken gemaakt met behulp van AFM in de PeakForce-QNM mode bevestigden een
hoogte reductie door vervorming in de Δpbp4 mutanten van 100 – 200 nm. Onder natuurlijk
voorkomende bacteriële stammen variëren de langeafstandskrachten niet in dezelfde mate
als hier is waargenomen voor de Δpbp4 mutanten. Door deze resultaten te extrapoleren
kunnen we echter concluderen dat de langeafstandskrachten in bacteriële hechting niet
alleen bepaald worden door de samenstelling en de structuur van het bacteriële cel
oppervlak, maar ook door tot nu toe genegeerde kleine vervormingen van de bacteriële
celwand, die het contactoppervlak vergroten en daarmee ook de hechtingskrachten.
Celwand vervorming op de nanoschaal die plaats vindt tijdens de hechting van
bacteriën is moeilijk te meten, behalve bij Δpbp4 mutanten die niet in staat zijn om
peptidoglycan te cross linken. Hoofdstuk 3 behandelt een meer geavanceerde techniek om
celwand vervorming te kwantificeren gebaseerd op oppervlakte versterkte fluorescentie in
stafylokokken hechtend op goud oppervlakken. Hechting gerelateerde versterking van
fluorescentie hangt af van de afstand van de bacteriën tot het oppervlak en de hechtingstijd.
In dit hoofdstuk wordt een model aangedragen gebaseerd op de hechting gerelateerde
versterking van fluorescentie van groen-fluorescente microspheres, waarmee de afstand tot
het oppervlak en de celwand vervorming van gehechte bacteriën berekend kan worden,
gebaseerd op hun hechtingstijd afhankelijke versterking van fluorescentie. De afstanden
tussen hechtende bacteriën en een oppervlak, inclusief compressie van de EPS-laag, daalde
tot 60 min na hechting, gevolgd door vervorming van de celwand. Vervorming van de
celwand is onafhankelijk van de integriteit van de EPS-laag en verloopt het snelst voor een
Δpbp4 stam.
141
Nederlandse Samenvatting
Gebaseerd op de resultaten van hoofdstuk 2 en 3 kan er geconcludeerd worden dat
de celwand vervorming van zowel de moeder stam als de Δpbp4 mutanten optreedt na
hechting aan een oppervlak. Echter, wat de vervorming betekent voor de bacteriën in termen
van moleculaire respons in het moduleren van het fenotype van vrij bewegend naar het
groeien in een biofilm is niet bekend. In Hoofdstuk 4 hebben we onderzocht wat de invloed
is van hechtingskrachten met verschillende biomaterialen op icaA (reguleert productie van
EPS matrix componenten) en cidA (geassocieerd met cel lyse en extracellulair DNA
productie) gen expressie in S. aureus biofilms. Experimenten werden uitgevoerd met S.
aureus ATCC12600 en zijn isogene mutant S. aureus ATCC12600Δpbp4, die niet in staat is
om peptidoglycan te crosslinken. Het verwijderen van pbp4 leidde tot meer vervorming van
de celwand, terwijl groei, biofilm formatie, hydrofobiciteit van het cel oppervlak en zeta
potentialen van de stammen onveranderd bleven. De hechtingskrachten van S. aureus
ATCC12600 waren het sterkst op polyethyleen (4.9 ± 0.5 nN), het zwakst op roestvrij staal
(1.3 ± 0.2 nN) en hechtingskrachten op polymethylmethacrylaat (3.1 ± 0.7 nN) lagen tussen
die waarden in. De productie van poly-N-acetylglucosamine, aanwezigheid van eDNA en
expressie van icaA genen daalde met toenemende hechtingskrachten. Er werd echter geen
relatie gevonden tussen hechtingskrachten en cidA expressie. De hechtingskrachten van de
isogene mutant S. aureus ATCC12600Δpbp4 waren veel zwakker dan die van de
moederstam en toonden geen correlatie met de productie van poly-N-acetylglucosamine,
aanwezigheid van eDNA of expressie van de icaA en cidA genen. Dit suggereert dat
hechtingskrachten
de
productie
van
matrix
moleculen,
poly-N-acetylglucosamine,
aanwezigheid van eDNA en icaA gen expressie moduleren door het induceren van
vervorming van de celwand, waarbij waarneming van de hechtingskrachten
door
gecrosslinkte peptidoglycan lagen een grote rol speelt.
Hechting van bacteriën aan biomaterialen en de daarmee geassocieerde gevoeligheid
voor antibiotica is een belangrijke bedreiging voor de medische gemeenschap. Bacteriën
vormen niet alleen biofilms, maar ze worden ook tot 1000 keer meer resistent voor
antibiotica wanneer ze als biofilm groeien. Om het mechanisme dat deze sterke resistentie
veroorzaakt te onthullen, hebben we in Hoofdstuk 5 de regulatie van een recent ontdekt 2componenten systeem bestaande uit een met nisine geassocieerde gevoeligheidsrespons
regulator (NsaRS) en de bijbehorende transporter NsaAB in S. aureus onderzocht in de
aanwezigheid van chemische en mechanische stress. NsaRS is belangrijk voor hechting,
biofilm formatie en resistentie tegen chemische factoren in S. aureus. Het bestaat uit een in
142
Nederlandse Samenvatting
het membraam gelegen sensor NasS en een in het cytoplasma voorkomende respons
regulator NsaR, welke geactiveerd wordt wanneer het een fosfaat groep ontvangt van de
NsaS sensor. De aanwezigheid van de NsaS sensor in het membraam leidt tot onze
hypothese die stelt dat het NsaRS systeem niet alleen chemische, maar ook mechanische
stress kan waarnemen om zo de antibiotica resistentie via de NsaAB efflux pomp te
moduleren. Om deze hypothese te verifiëren vergeleken we de expressie van de NsaS sensor
en de NsaA efflux pomp in S. aureus SH1000 in de hechtende (“mechanische stress”) en de
planktonische toestand, terwijl de aanwezigheid van nisine werd gebruikt als chemische
stress. NsaS en NsaA expressie door S. aureus SH1000 was verhoogd onder mechanische
stress, in de gehechte toestand. Chemische stress verhoogde de gen expressie van NsaS en
NsaR ook. Gen expressie was het hoogst wanneer de bacteriën een combinatie van
chemische stress en een sterke mechanische stress ondergingen, in de huidige studie
gekwantificeerd als de hechtingskrachten die ontstaan door een substraat oppervlak en
gemeten met behulp van AFM. Dit bevestigd onze hypothese dat het NsaRS systeem zowel
chemische als mechanische stress kan waarnemen.
In Hoofdstuk 6 hebben we de verschillen besproken tussen het gebruik van AFM
en SEF in het kwantificeren van celwand vervorming. Daarnaast bespreken we ook de
moleculaire basis voor het waarnemen van oppervlakken in S. aureus in vergelijking met
andere bacteriën en eukaryote cellen. Tenslotte, met de resultaten van dit proefschrift,
bevelen we toekomstige studies aan om de rol van mechanische sensoren bij antibiotica
gevoeligheid te onderzoeken.
143
144