Biotechnologie in de veehouderij - Wageningen UR E

Deze uitgave isgebaseerd op decolleges gegeven in de cursus 'Biotechnologie in
de veehouderij', georganiseerd door de Stichting Post-Hoger Landbouwonderwijs
(PHLO) in Wageningen in 1988,en geactualiseerd tot 1990.
Biotechnologie
in de veehouderij
Redactie:
E. Egberts
T. van der Lende
AJ. van der Zijpp
'S
<
PudocWageningen 1991
U . U . ' •>>*'
nW
'
BIBLIOTHEEK
CANDBOUWUNIVERSIIEli
WAGENINGEU
CIP-gegevens Koninklijke Bibliotheek, Den Haag
Biotechnologie
Biotechnologie in de veehouderij / red.: E. Egberts, T. van der Lende, A.J. van der Zijpp. Wageningen: Pudoc. 111.
Uitg. gebaseerd op colleges gegeven in de cursus 'Biotechnologie in de Veehouderij' georganiseerd door deStichting Landbouwonderwijs (PHLO) inWageningen in 1988,en geactualiseerd
tot 1990. - Met lit. opg., reg.
ISBN 90-220-1024-4
SISO 633 UDC 66.098:636.1/.4 NUGI 835
Trefw.: biotechnologie ; veeteelt.
ISBN 90-220-1024-4
NUGI 835
Omslagontwerp: Evert van der Molen, Doorwerth
© Pudoc, Centrum voor Landbouwpublikaties en Landbouwdocumentatie, Wageningen, 1991.
Niets uit deze uitgave, met uitzondering van titelbeschrijving en korte citaten ten behoeve van
eenboekbespreking, magwordengereproduceerd, opnieuw vastgelegd, vermenigvuldigd of uitgegeven door middelvandruk, fotokopie, microfilm, langselektronische of elektromagnetische
wegof op welke wijze ook zonder schriftelijke toestemming van de uitgever Pudoc, Postbus 4,
6700AA Wageningen. Voorallekwestiesinzakekopiëren uitdezeuitgave:Stichting Reprorecht,
Amstelveen.
Gedrukt in Nederland.
Korte inhoudsopgave en auteurs
1 Biotechnologie bijlandbouwhuisdieren
AJ. van der Zijpp enT.van der Lende, Vakgroep Veehouderij, Landbouwuniversiteit Wageningen
E. Egberts, Vakgroep Experimentele Diermorfologie en Celbiologie,
Landbouwuniversiteit Wageningen
1
2 Endocrinologie vandebronstcyclus endevroege dracht
EA. Helmond, Vakgroep Fysiologievan Mens enDier, Landbouwuniversiteit Wageningen
8
3 Ontwikkeling vansuperovulatietechnieken inrelatietot embryotransplantatie
S.J. Dieleman, Vakgroep Bedrijfsdiergeneeskunde en Voortplanting,
Faculteit Diergeneeskunde, Rijksuniversiteit Utrecht
18
4 Belang vanhet synchroon zijn vanembryo enuterus bijembryotransplantatie
T.van der Lende, Vakgroep Veehouderij, Landbouwuniversiteit Wageningen
28
5 Embryoproduktie invitro
Th.A.M. Kruip, Vakgroep Bedrijfsdiergeneeskunde en Voortplanting,
Faculteit Diergeneeskunde, Rijksuniversiteit Utrecht
6 Kwaliteitsbeoordeling vaneicellen enembryo's
P. de Boer enM.L. Boerjan, Vakgroep Erfelijksheidsleer, Landbouwuniversiteit Wageningen
33
40
7 Embryoproduktie enembryomanipulatie ineenfoktechnisch perspectief
J. Jansen, K.I.-Mid West V.O.F.,Lexmond
47
8 Fundamentele aspecten entoepassingsgebieden vande
hybridomatechniek
E. Egberts, A. Schots en W.B.van Muiswinkel, Vakgroep Experimentele
Diermorfologie en Celbiologie, Landbouwuniversiteit Wageningen
53
9 Monoklonale antistoffen en diagnostiek
D. van Zaane, Centraal Diergeneeskundig Instituut (CDI), Lelystad
10 Toepassing van monoklonale antistoffen in de voortplanting
P. Booman, Instituut voor Veeteeltkundig Onderzoek (IVO) 'Schoonoord', Zeist
11 Toepassing van monoklonale antistoffen bij het gebruik van biologische
Produkten in de geneeskunde
A.D.M.E. Osterhaus en P. de Vries, Bijzondere Afdeling Immunobiologie, Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieuhygiëne, Bilthoven
12 Van monoklonale antistoffen tot veterinaire farmaca
J.Th. Gielen, Pharmacological Research & Development Department,
Intervet International B.V., Boxmeer
70
77
85
91
13 Nucleïnezuren en genetische manipulatie
R.C. van den Bos en A. van Kammen, Vakgroep Moleculaire Biologie,
Landbouwuniversiteit Wageningen
14 RFLP in de fokkerij
P. Stam, Vakgroep Erfelijkheidsleer, Landbouwuniversiteit Wageningen
15 Nieuwe strategieën voor de ontwikkeling van veterinaire vaccins
A.L.J. Gielkens, Centraal Diergeneeskundig Instituut (CDI), Lelystad
16 Transgene landbouwhuisdieren
A.L. Archibald, AFRC Institute of Animal Physiology and Genetics
Research, Edinburgh Research Station, Midlothian, UK
98
120
126
132
17 Industriële ontwikkelingen van de recombinant-DNA-technologie voor de 144
veehouderij
J.P.M. Sanders, Gist-Brocades N.V., Research & Development, Delft
18 Ethiek en biotechnologie in de veehouderij
H. Verhoog, Instituut voor Theoretische Biologie, Rijksuniversiteit
Leiden
152
Literatuur
161
Uitgebreide inhoudsopgave
173
1 Biotechnologie bij landbouwhuisdieren
A.J. van der Zijpp, E. Egberts enT.van der Lende
1.1 Inleiding
Biotechnologieiseennieuwverzamelbegripindewetenschap,enkanopverschillende
manieren wordenuitgelegd. Eenalgemeen erkend kenmerk vandebiotechnologieis,
dat het zijn kennis ontleent aan verschillende wetenschappelijke terreinen en potentieel veeltoepassingsgebieden heeft. Dit geheelvan integratie van disciplines isaanschouwelijk weergegeven in het 'zandlopermodel' (fig. 1). Als we toch een poging
willen doen tot eenveelomvattende omschrijving vanhet begripbiotechnologie, dan
kunnenwestellendatdekernvanbiotechnologiebestaatuiteenfundamenteleingreep
inlevendmateriaalopmoleculair en/of cellulair niveau,gericht op(verbetering van)
de toepassingsmogelijkheden ervan.
Wezenlijknieuwisdusdemoleculaireencellulairebenadering dieindebiotechnologiecentraalstaat, endebeschikbaarheid vantechnieken omopdit schaalniveau in
processenintegrijpen. Biotechnologieomvatdusveelmeerdangenetische modificatie.Hetbiedtvooralnieuwemogelijkhedenomprocessentesturenopeenregelniveau
dat met de eerder beschikbare macrotechnieken niet bereikbaar was.
DISCIPUNÉSCHIJF
TOEPASSINGSSCHUF
Fig. 1. Zandlopermodel voor het geheel van integratie van disciplines in debiotechnologie.
2
A.J. VAN DER ZIJPP ET AL.
Biotechnologie voegt daarmee een nieuwe dimensie toe aan veel technologieën, die
eerder binnen de dierlijke produktie zijn ontwikkeld. Voor de veehouderij doen zich
dan op een aantal terreinen mogelijkheden voor om bij de huidige stand van onze
kennis langs biotechnologische weg kwalitatieve en/of kwantitatieve verbeteringen
aan te brengen, of nieuwe toepassingen te introduceren.
In deze uitgave worden met betrekking tot debiotechnologie in de veehouderij een
drietal terreinen met hun specifieke toepassingsmogelijkheden behandeld. Dit zijn
achtereenvolgens:
- embryoproduktie en -manipulatie, als onderdelen van de voortplantingstechnologie;
- produktie van monoklonale antilichamen met behulp van de hybridomatechniek
ten behoevevan de diagnostiek, maar ook ter manipulatie van bepaalde fysiologische
regelmechanismen in het dier; en
- derecombinant-DNA-technologie, diemet name gericht isop genetische manipulatievanhet dierzelf, of vanmicro-organismen diemet het dier ineenof andere fysiologische relatie staan.
In dezeinleiding iseen beknopt overzicht gegeven van een aantal recente ontwikkelingen in de dierlijke biotechnologie op de bovengenoemde drie terreinen, en wordt
kort ingegaan op detechnische en ethische consequenties ervan voor de samenleving.
Meer gedetailleerde informatie hierover, waarbij zoweldewetenschappelijke basis als
de diverse toepassingsgebieden uitgebreid aan bod komen, is te vinden in de overige
hoofdstukken van dit boek. Biotechnologische ontwikkelingen rond het gebruik van
enzymen indeveevoeding, enmet betrekking tot het milieu (mest/ammoniak) worden
in deze uitgave niet besproken.
1.2 Voortplantingstechnologie
Hiermee wordt een scala van nieuwe technieken aangeduid. Om te beginnen de reeds
traditionele KI, later aangevuld met embryotransplantatie. Meer recent zijn hieraan
toegevoegd de in-vitro fertilisatie, en het klieven of klonen van het embryo. Ook het
sexen van embryo's en sperma hoort tot dit werkterrein. Voordelen van deze technieken liggen bij de ziektepreventie (KI), scherpere selectie, hogere betrouwbaarheid van
de fokwaarde-schatting, verkleining van het generatie-interval, en het op zeer jonge
leeftijd (embryo) kiezen voor mannelijke (vleesproduktie) of vrouwelijke (leghennen,
melkkoeien) nakomelingen. In-vitro fertilisatie, maar ook embryotransplantatie vereisen bronstsynchronisatie en superovulatie, en soms operatieve ingrepen en
'gast'moeders (van een andere diersoort). In-vitro fertilisatie biedt perspectieven voor
genetische manipulatie en klonen op grotere schaal dan nu mogelijk is.
1.3 Hybridomatechniek
Onder hybridomatechniek verstaan we de produktie in vitro van monoklonale antilichamen door hybride cellen (hybridoma's). Deze hybride cellen zijn afkomstig van
BIOTECHNOLOGIE BIJ LANDBOUWHUISDIEREN
een celfusie tussen antilichaam producerende lymfocyten, en cellen van een lymfoïde
tumorcellijn (myeloma). De voordelen van deze techniek ten opzichte van de meer
klassieke wijze van antilichaambereiding (sérologie) berusten op de grotere specificiteit en constante kwaliteit van monoklonale antilichamen. Daarnaast kunnen deze
monoklonale antilichamen opgroteschaalviaindustriëlecelkweektechnieken worden
geproduceerd. Detoepassingsmogelijkheden liggen inhet onderzoek zelf (herkenning
van celtypen, hormonen, enzymen), therapie, de veterinaire diagnostiek, de fokkerij,
devoortplanting (antistoffen tegen hormonen) en bij het aantonen van minieme hoeveelheden van bepaalde stoffen, zoals drugs. Vooral door de combinatie met zeer gevoelige assays, zoals ELISA, zijn monoklonale antistoffen een waardevol middel geworden. De kans op het tot stand komen van een stabiele antilichaam producerende
hybridoma hangt af van de herkomst van de gebruikte cellen. Fusies tussen cellen afkomstigvandezelfde diersoort blijken meteenveelgroterematevansuccesteverlopen
dan wanneer de dierlijke oorsprong verschilt.
Aangezien bijna alle voor celfusie geschikte tumorcellijnen afkomstig zijn van de
muis, heeft de huidige generatie van monoklonale antilichamen ook meestal betrekking op deze diersoort. Dit gegeven beperkt met name de toepassingsmogelijkheden
invivo.Kortgeleden echter iseen techniek ontwikkeld waarmee muize-tumorcellijnen
tot eengeschikte celfusiepartner voor antilichaam producerende cellenvan een andere
diersoort kunnen worden gemodificeerd. Daarnaast kunnen tumorcellijnen ook door
middel van recombinant-DNA-technieken worden gemanipuleerd (transfectoma's)
voor de produktie van een qua specificiteit en herkomst gewenst antilichaam.
1.4 Recombinant-DNA-technologie
Het werkingsveld van deze technologie breidt zich met de ontwikkeling van nieuwe
technieken nog steeds uit, en lijkt in principe onbeperkt. In de eerste plaats kunnen
deze technieken behulpzaam zijn bij het verkrijgen van informatie over de fysiologische toestand van het dier. Daarnaast kan wat het dier zelf betreft met behulp van
dezetechnologie indirect of direct ingegrepen worden op elk niveau van de fysiologie.
Uit het brede scala van toepassingen willen we hier de volgende mogelijkheden kenschetsen:
Diagnostiek met DNA-probes. Bij ziekten kunnen verschillende, meer of minder
pathogène, virus- of bacteriestammen de problemen veroorzaken. Voor een doeltreffende therapie is het noodzakelijk de betreffende stam eenduidig te identificeren.
Daarnaast kan precieze identificatie van de ziekteverwekker aanleiding geven tot een
beter inzicht in de epidemiologie van de ziekte, en daarmee gepaard gaand mogelijkheden scheppen deziekteproblemen met klassieke hulpmiddelen tebeperken. Ook bij
de controle op contaminatie van dierlijke Produkten met voor de mens schadelijke
organismen zouden DNA-probes eenbelangrijke rolkunnen spelen.En ten slotte zouden DNA-probes ook gebruikt kunnen worden bij de identificatie van het dier zelf,
en deeruit voortgekomen nakomelingschap. Veelvan deze toepassingsmogelijkheden
3
4
A.J. VAN DER ZIJPP ET AL.
lijken inprincipe welaanwezig, maar economisch momenteel niet rendabel vanwege
dehogekostenen/of deervoorbenodigdebewerkelijketechnieken.Nieuwetechnische
ontwikkelingen zoals de 'polymerase chain reaction' (PCR), waarmee zelfs sporen
genetisch materiaal specifiek tot detecteerbare niveaus vermenigvuldigd kunnen
worden, zullen ongetwijfeld onze denkbeelden over een economisch verantwoorde
toepassing op diagnostisch niveau van de recombinant-DNA-technologie in deveehouderij blijven beïnvloeden.
Produktiemetbehulpvanmicro-organismenvanstoffendieindeveehouderijkunnen
wordentoegepast. Hiertoebehorenindeeersteplaatsvoedingsstoffen diemetbetrekkingtotdehuidigeveevoederszowelvanvervangendealsvanaanvullendeaardkunnen
zijn.Voorbeeldenhiervanzijnhet'singlecellprotein', endesamenstellingvansynthetische voeders uit de afzonderlijke aminozuurcomponenten. Dergelijke technieken
kunnenvoorzienineenbetereafstemmingvanhetvoederaanbod opdebehoeften van
hetdier,speciaalbijéénnmagigen.Vanwegedemest-enverzuringsproblematiek heeft
ditonderzoek veelaandacht gekregen,daar hetzou kunnen resulterenineenreductie
van deovermaat aan stikstof in het voer.
Veeleiwitprodukten dieeenfysiologische, immunologische of neurologische functiehebben kunnen, wanneerdeervoorcoderendegenengeïdentificeerd engeïsoleerd
zijn, opgroteschaalviamicro-organismen worden geproduceerd. Tot dezecategorie
behoren:
- hormonen, zoalsbSTenpST,voor verhoging vanmelkproduktie en/of groei,en
ß-agonisten of herverdelers waarvan detoepassing een betere vleeskwaliteit beoogt;
- enzymen, voor bij voorbeeld ontsluiting vanveevoeders (beschikbaar maken van
fosfaat door fytase; afbraak van antinutritionele factoren) of verwerking van mest;
- 'biological response modifiers' en antibiotica voor de ziektebestrijding.
Bij de toepassing staan de toedieningswijzen en de effecten (produktieverhoging
en/of weerstand tegen ziekten)ter discussie. Welbiedt het in grote hoeveelheden ter
beschikkingkomenvandezestoffen iniedergevaldemogelijkheid omviaonderzoek
toteenbeterinzichtinhuneffect(en) ophetdiertekomen. Ditinzichtkanbovendien
noginaanzienlijke matewordenverruimd doormiddels 'protein engineering'verkregen,gerichtemodificaties van debetrokken stoffen bij het onderzoek tebetrekken.
Manipulatievanendogene micro-organismenvanhetdier. Hierbij moet men onder
andere denken aan debijdrage van bacteriën aan devoedselvertering in het dierlijk
spijsverteringskanaal, metnameindepensbij herkauwers.Zulke fermentatieprocessenzijnvanbelangvoorhetvergrotenvandeefficiëntie vandeproduktievanhetdier
zelf. Wanneer men over voldoende inzicht beschikt over de aard en het verloop van
dieprocessen kunnen, afhankelijk vanhetaangeboden voer, deindepensaanwezige
micro-organismen zelfwordengemanipuleerd, ofdeonderlingeverhoudingen vande
aanwezigebacteriepopulatieswordengeoptimaliseerd.Anderzijds kandekennisover
de pensfermentatie ook worden toegepast bij het verbeteren van de afbraak van
ruwecelstof-bestanddelen inhetvoervoorafgaand aan devoedering.Watbetreft een
BIOTECHNOLOGIE BIJ LANDBOUWHUISDIEREN
anderecategorievan 'endogene'micro-organismen, depathogenen, bestaat demogelijkheid metbehulpvanrecombinant-DNA-technieken niet-infectieuze constructente
maken vanbacteriën of virussen, diedan alsvaccintoegediend inhet diereengoede
beschermingtegenziektentotstandkunnenbrengen.Eventueelkanmenookdenken
aan combinatievaccins, waarin de immunogene eigenschappen van diverse pathogenenwordengecombineerd. Specialevermeldingverdient destrategie omvaccinste
produceren die in diagnostisch onderzoek onderscheiden kunnen worden van het
wildtype-pathogeen. Een voorbeeld hiervan ishet door het Centraal Diergeneeskundig Instituut (CDI) ontwikkelde gl-negatieve Aujeszky-vaccin.
Veranderingen op genetisch niveau van het dier zelf met behulp van recombinantDNA-technieken. Dierenwaarvandegenetischesamenstellingdoordetoepassingvan
recombinant-DNA-technologie permanent is veranderd noemt men transgeen. Permanente verandering van het erfelijk materiaal van een dier kan men bereiken door
aanheteigengenoom,datwilzeggenalhetindecelkernaanwezigDNA,vreemdDNA
afkomstig vaneenanderindividuvandezelfde of eenanderesoortopzodanigewijze
toetevoegendat hetopstabielewijzeindatgenoomwordtgeïntegreerd. Hetspreekt
vanzelf dat men bij dergelijke procedures technisch gesproken dan pas succes heeft
geboekt wanneer dit vreemde DNA ook tot expressie komt.
Aandebasisvandevormingvantransgenedierenligthetopsporenenkarakteriseren van de voor de gewenste eigenschappen verantwoordelijke genen. In de juiste
samenstelling geïsoleerd vormen deze genen het uitgangsmateriaal waarmee genetische manipulatie kan plaatsvinden. Om van hieruit tot een transgeen individu te
komen moet dit materiaal naar de celkern worden overgebracht. Tevens moet deze
overdrachtvroegindeembryonaleontwikkelingplaatsvinden,omdekansopeenwerkelijktransgeenindividu,datwilzeggeneenindividudatinalzijnlichaamscellenover
deveranderde eigenschap beschikt, endezeook aan denakomelingschap doorgeeft,
zo groot mogelijk te maken. Momenteel wordt hierbij van twee verschillende technieken gebruik gemaakt, namelijk directe injectie in een voorkern van dezygote,of
behandeling vanembryo'smetinfectieuze DNA-virussen waarbij hetmateriaal inhet
virus-DNA isgeïncorporeerd. Als een interessant alternatief voor deze tweemethoden,dieiederhunspecifieke technischebeperkingen kennen, komtdelaatstetijd ook
het gebruik van embryonale stamcellen die in celkweek met 'vreemd' DNA kunnen
wordenbehandeld, indebelangstelling.Allehiergeschetstetechniekenechter kennen
als probleem dat momenteel niet of nauwelijks richting kan worden gegeven aan de
plaatswaar,endevormwaarin, hetvreemdeDNAuiteindelijk inhetgenoom vande
gastdiersoort wordt geïntegreerd.
Het zalna dezebeknopte uiteenzetting vanenkeletechnische aspecten duidelijk zijn
datgenetischemanipulatievaneendierlijk individu eenveelomvattend, interdisciplinaironderzoeksgebiedvormtwaarinalleendoor 'teamwork' ofzeerintensievesamenwerkingvanlaboratoriasuccessenkunnenwordengeboekt.Devoorgenetischemanipulatie benodigde disciplines zijn: biochemie; moleculaire biologie en moleculaire
5
6
A.J. VAN DER ZIJPP ET AL.
genetica;microbiologie;celbiologie;voortplantings-enontwikkelingsbiologie; fysiologie en immunologie. Voor de veehouderij zijn er twee beweegredenen te noemen
waarop hetonderzoek naar genetischemanipulatie vanlandbouwhuisdieren isgebaseerd:
- Het gebruik van transgene dieren alsmodel voor het bestuderen van biologische
processenoporganismaalniveau.Hierbij wordenmetnameveelknaagdiereningezet,
maar inbeperkte mate ook wellandbouwhuisdieren. Naast debijdrage diegegevens
uit zulk onderzoek leveren aan onze fundamentele kennis omtrent defysiologie van
het dier, ligthet ook voor dehand daar waar hetdier model kan staan voor demens
de resultaten ervan tegebruiken ter verbetering van de gezondheidszorg.
— Deontwikkelingviahetdiervannieuweproduktenen/ofverhogingvandehuidige
produktie-efficiëntie van het dier. Transgene dieren kunnen van belang zijn vooreigenschappen waarvoor de traditionele fokprogramma's binnen populaties geen of
slechts langzaam vooruitgang bieden. Voorbeelden hiervan zijn ziekteresistentie,
vleeskwaliteit envruchtbaarheid, maar transgene dieren kunnen ook worden ingezet
voor de produktie van soortvreemde eiwitten, die bij voorbeeld een belangrijke rol
spelenindemenselijke gezondheidszorg. Wanneer het debedoeling istransgenediereninbestaandepopulaties alsfokdier optenemenmoet daaraan eenfase vanintensief onderzoek opgenetische, fysiologische, ethologische, immunologische, pathologischeenveeteeltkundigeeigenschappenvoorafgaan. Elktransgeendierisuniek,omdatbijdehuidigestandvandetechniekhettoegevoegdevreemdeDNAopverschillendeplaatseninhetgenoomwordtopgenomen.Degevolgenhiervan,ookbijparingvan
verschillende transgene dieren, moeten bekend zijn voordat met deintroductie inde
praktische fokkerij kan worden begonnen.
Het onderzoek naar transgene dieren iskostbaar door debenodigde interdisciplinaireexpertise,deduretechniekenenfaciliteiten, endetijdsperiode waarinhetbasisonderzoek moet worden verricht. Er is dus grote behoefte om de mogelijkheden,
ontstaan doorderecombinant-DNA-technologie,aftewegentegende'klassieke'verwervingvankennis omhetzelfde doeltebereiken. Ditgeldt zowelvoor het bedrijfslevenalsvoor deoverheid. Duidelijkheid overdemogelijkheden tot patentering van
transgene dieren en DNA-sequenties, en octrooiëring van recombinant-DNA-technieken,isnodigomdebeslissinginvesteringeninditonderzoekteondersteunenmogelijktemaken.Naastdezedirecteafwegingvanonderzoeksmethoden staandegevolgen
op maatschappelijk, ethisch enjuridisch gebied. Het onderkennen van positieveen
negatieve kanten van toepassingen van dit onderdeel van het recombinant-DNAonderzoek, enhetnagaan of negatieveaspectentijdig kunnenwordenvoorkomen,is
van grote waarde voor de inschatting van demaatschappelijke betekenis.
Tot slot: het onderzoek gericht op transgene landbouwhuisdieren staat temidden
van medisch en biologisch recombinant-DNA-onderzoek waar de vorderingen veel
sneller zijn. Nietalleendewetenschappelijke effecten vandit onderzoek zijn belangrijk. Ook dedaaruit voortvloeiende ethische discussie over toepassing van bij voorbeeld gentherapie bij demensheeft eeneffect op datgene watmet dierenwelof niet
kan enmag.
BIOTECHNOLOGIE BIJ LANDBOUWHUISDIEREN
Bij de bespreking van het laatste onderdeel, detransgene landbouwhuisdieren, is
verder ingegaan op de maatschappelijke gevolgen van toepassing in de praktijk. In
feite zullen degenoemde afwegingen ook gelden voor andere biotechnologische toepassingenvanderecombinant-DNA-technologieindeveehouderij: deeffecten ophet
functioneren van het dier, enop economische, socialeenjuridische aspecten vanhet
dierlijkproduktieprocesmoetenwordenonderkend.Ditbetekent,datwenaastonderzoek naar de ontwikkeling van biotechnologische produkten en produktieprocessen
(of onderdelen ervan)ook nogveelonderzoek zullenmoeten doen naar dehierboven
genoemde effecten.
7
2 Endocrinologie van de bronstcyclus en de vroege dracht
F.A. Helmond
2.1 Inleiding
Hormonen spelen een essentiële rol in tal van processen die uiteindelijk in een goede
voortplanting behoren te resulteren. De werking van hormonen is vaak complex,
omdat deze bij voorbeeld afhangt van de uiteindelijke concentraties in het bloed en
van het tijdstip waarop het hormoon intern wordt afgegeven of extern wordt toegediend.
Een goede kennis van de endocrinologie is dan ook noodzakelijk om op de juiste
wijze tekunnen manipuleren met processen tijdens devoortplanting, zoalsde inductie
van de puberteit, regulatie van bronstcyclus, superovulatie en partus inductie. In dit
overzicht zal alleen aandacht geschonken worden aan het vrouwelijke dier en met
name de processen die de bronstcyclus en het eerste stadium van de dracht reguleren.
Dat wilzeggen dat devolgende onderwerpen behandeld zullen worden: de folliculaire
groei, het ontstaan van depreovulatoire LH-piek, het tijdstip van ovulatie, debetekenis van de daaropvolgende progesteronstijging en de maternale herkenning van de
dracht.Tevenszalenigeaandacht geschonken worden aandeontwikkelingvandeeicel
en de ontwikkeling van het embryo gedurende het eerste stadium van de dracht.
2.2 Bronstcyclus
2.2.1 Interactie tussen hypothalamus, hypofyse en ovarium
Een schematische weergavevandeinteractietussen hormoonconcentraties enhet ovarium staat weergegeven in figuur 2.
Tijdens de bronstperiode is er een LH- en FSH-piek meetbaar in het bloed. Deze
gonadotropine-piek wordt veroorzaakt door een positieve feedback van oestradiol,
het hormoon dat door de groeiende follikel gemaakt wordt. Vlak na de LH-piek
worden er in het ovarium weinig hormonen gesynthetiseerd. Opmerkelijk is dat de
hypofyse op hetzelfde moment een tweede FSH-piek afgeeft. Deze piek wordt waarschijnlijk veroorzaakt doordat FSH tijdelijk aan de negatieve invloed van inhibine
(een produkt van degranulosacel) ontsnapt. Deze FSH-piek iswaarschijnlijk betrokken bij de uitgroei van een nieuwe set preantrale follikels.
Tijdens de luteale fase wordt LH pulsatiel afgegeven. De frequentie en amplitudo
van deze pulsen hangt af van de aanwezigheid van progesteron en oestradiol. De
frequentie islaag en de amplitudo hoog onder progesterondominantie en de frequentieishoog endeamplitudo laag onder oestradioldominantie. Een adequate pulsatiele
T
ENDOCRINOLOGIE VAN BRONST EN DRACHT
Follikel groei
- 1 0
2
4
6
Dagen t.o.v. de LH piek
Fig. 2. De folliculaire en endocriene veranderingen vanaf het tijdstip van luteale regressie tot het tijdstip
waarop de luteale functie weer begint in runderen, schapen en varkens. De groei en regressie van de
oestradiol-afhankelijke follikels wordt weergegeven in het bovenste deel van dit figuur. Het aantal
oestrogeen-afhankelijke follikels en het aantal ovulaties is sterk soortafhankelijk. In de tekst wordt aangegeven waar de verschillende soorten afwijken van het algemene plaatje zoals dat in dit figuur is weergegeven. LH = luteïniserend hormoon, FSH = follikel-stimulerend hormoon.
afgifte vanLHisnodigvoorhetopstartenvandefolliculaire groei(Hansel&Convey,
1983).
2.2.2Folliculaire groei enontwikkeling
De Oogenese (nieuwvorming van eicellen) vindt alleen plaats tijdens de foetale
(schaap,rund)ensomsooknogtijdensdevroeg-postnatalefase(varken).Ditbetekent
dathetmaximaleaantaleicellenopditmomentvastligteneralleennogmaareicellen
kunnen verdwijnen door atresie of door ovulatie. Deeicellen ontwikkelen zicheerst
tot hetzogenaamde dictyaat stadium van deprofase vandeeerstemeiotischedeling.
In dit stadium worden ze ook welprimaire oöcyten genoemd. Zezijn dan omgeven
door een laag platte epitheelcellen en dit geheel wordt een primordiale follikel
genoemd.Dezeprimordialefollikels gaanuitgroeienzodradeepitheellaaggaatprolifereren en verschillende lagen granulosacellen gaat vormen. Deze proliferatie staat
waarschijnlijk niet onder invloed van LH en FSH. Als de follikel verder uitgroeit
ontstaat ervanuit hetomliggendebindweefsel eenthecainterna eneentheca externa
9
10 F.A.HELMOND
laag. Er ontstaan met vloeistof gevuldeholten indegroeiendefollikel diedaarna tot
een antrum vervloeien.
Tijdens decyclusvindtereencontinuprocesplaatsvanuitgroeieninregressiegaan
van follikels (fig. 3).Defollikels dieuiteindelijk gaan ovuleren zijn pas 48uur voor
deovulatieteidentificeren. Bijderegulatievandefolliculaire groeienatresiezijn tot
het antrale stadium vooral intra- en interovariële factoren betrokken. Bij primaten
(mensen, apen) isgevonden dat deovulaties alternerend over debeide ovariaplaatsvinden.Voorditfenomeen zijnoverigensbijmonotokelandbouwhuisdieren noggeen
aanwijzigingen gevonden. Bij polytoke dieren treedt mogelijk ook iets dergelijks op,
hetgeenzichuitineenverschilinaantalovulatiesinhetlinkerenhetrechterovarium.
Binnenhetovariumlijkengrotefollikels degroeivankleinereteremmen. Hierdoor
ontstaan op een gegeven moment een beperkt aantal Graafse follikels, die onder
invloedvaneenLH-piekgaanovuleren.Deremmendeinvloedvandegrootste follikel
vanmonotoke diereniswaarschijnlijk zosterk dat alleendezekanuitgroeienenovuleren. De follikels die verder uitgroeien kunnen biochemisch onderscheiden worden
vandegenedieinatresiegaan,doordatzeinstaatzijnomoestrogenentesynthetiseren.
Bij runderen zien wedat de eerste golf van folliculaire groei na de ovulatie leidt tot
eenactief oestrogeensynthetiserende follikel (dag3-7). Dezefollikelgaatvervolgens
weerinregressietussen dag 7en 13,enwordt vervangen door eenandere oestrogeen
synthetiserende follikel. Defollikels dieuiteindelijk gaan ovuleren ondergaan onder
invloed van de LH-piek een aantal veranderingen. Deeicel dieeerst tegen degranulosacellen aanlag, komt nu op een soort heuveltje te liggen (decumulus oöphorus);
Continue folliculaire
\ groei en atresie
Pool van niet -groeiende
follikels
Fig. 3. De follikels ontwikkelen zich continu uit een voorraad van onrijpe follikels. Demeeste vandeze
follikels wordenatretisch, maar alszedejuistegroottebereiken ophetmoment dathet hormonalemilieu
hiervoorgeschiktiswordenzegeredenkunnenvervolgenstotvolleomvangdoorgroeienendaarnaovuleren
omuiteindelijk corporaluteatevormen.Deinteractietussengonadotropinenenoestrogenendienoodzakelijk is om dit proces mogelijk temaken wordt ook in deze figuur weergegeven. NFBE2 = negatieve,en
PFBE2 = positieve feedback-effecten van oestrogenen.
ENDOCRINOLOGIE VAN BRONST EN DRACHT
daarna wordt ook deze verbinding verbroken en zweeft deeicel vrij in de follikel.
Menvermoedt dat erdoor degranulosacellen stoffen gemaakt worden dieverhinderen dat deoöcyt verdergaat metzijn méiose.Hierbij denkt men aan stoffen zoals
OMI (oocytemeiotic inhibitor) of cAMP.Ophet moment dat deverbinding tussen
deeicelen derest van defollikel verbroken wordt gaat deoöcyt dan ook verder met
zijnmeiotischedeling.Heteerstepoollichaampje wordtafgestoten endeoöcytwordt
nueensecondaireoöcytgenoemd.Depraktischeconsequentiehiervanisdatwanneer
eeneiceluit eengrote antrale follikel gehaald wordt omverder invitrotewordengekweekt,dezeonmiddellijk verderzalgaanmetzijnmeiotischedeling(Austin&Short,
1984).
2.2.3Folliculairesteroïdsynthese
De Graafse follikel produceert een aantal Steroiden waarvan de synthese van
oestradiol-17/3 de belangrijkste is, omdat dit hormoon er uiteindelijk voor moet
zorgendatereenpreovulatoireLH-piekontstaatdiedeovulatieinduceert.Desynthesevanoestradiol-17(3loopt volgenseentwee-celsysteem, waarbij zoweldetheca-als
degranulosacellenbetrokkenzijn.Dethecacellenzijngoeddoorbloed enhebbenLHiTHECA INTERNA
CELLEN
® /GRANULOSA
CELLEN
FSH r e c e p t o r e n
FOLLICULAIRE
VLOEISTOF
BASAAL MEMBRAAM
Fig. 4. De werking van gonadotropinen op de follikel en de synthese van oestrogenen. LH gaat een interactie met dereceptoren op dethecacellen aan (• )om deproduktie van androgenen en kleine hoeveelheden
oestrogenen te stimuleren. FSH activeert het aromatase-enzymsysteem in de granulosacellen door de
binding van FSH aan zijn receptor ( a ) . A = androsteendion, T = testosteron, LH = luteïniserend
hormoon, FSH = follikel-stimulerend hormoon, E 2 = oestradiol 17/3.
11
12
RA. HELMOND
BLOED
THECA CEL
GRANULOSA
FOLLIKEL
CEL
VLOEISTOF
ARTERIE
ACETAAT
LOL
CHOLESTEROL
• CHOLESTEROL
1
LH
VENE
ANDROSTEENDION
TESTOSTERON
]
PREGNEENOLON
*
ANDROSTEENDION
II
TESTOSTERON
1
ANDROS TEENDION
Î1
r
TEsros
£7?0« —
• ANDROSTEENDION
—1»
TESTOSTERON
«
— OESTRADIOL
/
OESTRADIOL
\
'
> OESTRADIOL
Fig. 5. Biosynthese van deSteroidendoor deGraafse follikel. LDL = lowdensity lipoprotein, LH = luteïniserend hormoon, FSH = follikel-stimulerend hormoon.
receptoren diena debindingvan LHervoor zorgen dat erindecelcholesterol wordt
omgezet in pregneenolon. Dit pregneenolon wordt verder omgezet tot androgenen,
voornamelijk androsteendion en testosteron. Voor de verdere omzetting van deze
androgenen naar oestrogenen ishetenzymaromatasenodig.Ditenzymontbreekt bij
de meeste soorten in de thecacellen (met uitzondering van het varken). Dit enzym
wordt in de granulosacellen aangemaakt onder invloed van het hormoon FSH. De
androgenenkunnengemakkelijk naardegranulosacellendiffunderen waarzedantot
oestrogenen worden omgezet (fig. 4en 5). Dit proces luistert heel nauw, omdat een
voortijdige of een te grote stimulering van de thecacellen leidt tot een overmatige
androgeenproduktie dieniet door degranulosacellen verwerkt kan worden, hetgeen
tot gevolg heeft dat de follikel in atresie gaat.
Follikelgroei kan gestimuleerd worden door zelf hormonen toe tedienen. Hiertoe
worden LH-enFSH-preparaten gebruikt ofeenhormoonpreparaat zoalsPMSG,dat
zowelLH-alsFSH-activiteit heeft. Gebeurtditopdejuistewijze, danwordthierdoor
het aantal follikels vergroot dat tot een Graafse follikel kan doorgroeien en zal ook
hetaantal ovulaties vergroot worden (Austin &Short, 1984).
ENDOCRINOLOGIE VANBRONST EN DRACHT
2.2.4Oestradiol-17ß, bronstgedrag, LH-piek en ovulatie
Deproduktie van grote hoeveelheden oestradiol door de Graafse follikel leidt enerzijds tot eenpreovulatoire LH-piek enanderzijds tot bronstgedrag. Depreovulatoire
LH-piekleidteenvastaantalurenlater(varken42uur, koeenschaap24uur)toteen
ovulatie.Indienhetbeginvanhetbronstgedrageenvasterelatiezouvertonenmethet
tijdstip vandeLH-piek, danzoudatbetekenendathetbronstgedrageenidealevoorspellerisvandeovulatie.Ditisechteroptweeniveausniethetgeval.Teneersteindie
situatieswaarbij erweloestrogeenproduktie plaatsvindt maar omverschillenderedenengeenLH-piek.Ditisbijvoorbeeldhetgevalbijrunderenwaarkortnadeovulatie,
zoweltijdens de cyclusals tijdens devroege dracht, een oestradiolproduktie plaatsvindt (par. 2.2.2), die enerzijds weltot eenbronstgedrag aanleiding kan geven maar
anderzijds niet tot een LH-piek vanwege de progesteronproduktie door het corpus
luteum dat dezepiekvorming blokkeert. Tentweede kan tijdens denormale bronstcyclushetbronstgedrag bij hetenediereerdertot expressiekomendanbij het andere
dier (Helmond et al., 1986).
/
Dezeasynchronie tussen LH-piek enbeginvan debronst (stareflex) kan erggroot
worden bij dieren met eengemiddeld lange bronstduur, zoals het varken. Het eerste
momentvanbronstkanvariërentussen24uurvoorof24uur nadeLH-piek. Gemiddeldvallendezetweezaken(LH-piekenbeginbronstgedrag)samen.Bijschapenvindt
deLH-piekmeestalenkeleurennahetbeginvandebronstplaats,maarkanookvariërentussen3uurvoortot8uurnahetbeginvandebronst.Dezeasynchroniekangroter
wordenindiendebronstcyclusopdeeenofanderemaniergereguleerdof geïnduceerd
wordt.Ook inrunderen vindt deLH-piek gemiddeld enkeleurennahetbeginvande
bronst plaats, maar ook hier wordt eenindividuele variatie gevonden van 8uur voor
tot9uurnahetbeginvandebronst.Dezeasynchroniewordtonderanderegroterdoor
de runderen op een laag niveau tevoeren.
2.2.5 Corpusluteumfunctie
Nadeovulatieontstaat uitiederefollikelrest eencorpusluteum.Decorpora luteazijn
deproducenten vanhet hormoon progesteron enzijn voor hun functioneren meestal
afhankelijk vanLH.Alleendecorporaluteavanhetvarkenkunnendeeerste12dagen
zonderondersteuning vanhypofysehormonen blijven functioneren. Decorpora lutea
blijven ongeveer 14-16 dagen functioneren voordat zein regressiegaan. Het signaal
dattotregressievandecorporalutealeidtisvermoedelijkeenProstaglandine(PGF2a)
dat door het endometrium van deuterus gemaakt wordt onder invloed van progesteron. Dit wordt bevestigd door een stijging van PGF2a in het bloed tijdens het in
regressiegaanvandecorporalutea,endoordatmetPGF2a-injectiesluteolysegeïnduceerd kan worden. PGF2cc verricht zijn luteolytische werkzaamheden doordat het
interfereert met debinding van de LH-receptor aan het adenylaatcyclase-systeem in
hetplasmamembraanvandecorpusluteumcellen.HierdoorkanLHdeomzettingvan
cholesterol naar pregneenolon en vervolgens tot progesteron niet meer bevorderen.
13
14
F.A. HELMOND
EILEIDER
UTERUS
OVARIUM
Prostaglandinen i
ovariele arterie
vernietigen cor
luteum
Ovariele a r t e r i e strak om de
interne vene heengekronkeld
Fig. 6. De route waarlangs PGF2a, dat door de met progesteron voorbehandelde uterus wordt geproduceerd, in staat is om de ovariele arterie te bereiken en zo het corpus luteum van het schaap in regressie
kan brengen.
Via welkeroute PGF2a het ovarium bereikt is nog niet helemaal duidelijk. PGF2a
wordt voor een groot deel in de longen geïnactiveerd, zodat de normale route via
uteriene venen, hart, longen en ovariele arterie niet waarschijnlijk is. Men vermoedt
dat PGF2a via diffusie uit de uteriene venen of de uteriene lymfevaten in de ovariele
arterievanhetovarium terecht kan komen (fig. 6)(Austin&Short, 1984).Bij runderen
en schapen (niet bij varkens) heeft men gevonden dat er door het corpus luteum ook
Oxytocine gemaakt kan worden. Aan het einde van de luteale fase ontstaan er Oxytocinereceptoren inhetendometrium vandeuterusdiena activatieeronder andere voor
zorgen dat er PGF2a afgegeven wordt uit het endometrium.
Tijdens de dracht is het essentieel dat deprogesteronproduktie gehandhaafd blijft.
Bij sommige diersoorten ishet nodig dat het corpus luteum gedurende de hele dracht
actief blijft, bij andere (bij voorbeeld schaap) neemt op een gegeven moment de
placenta de produktie van progesteron geheel of gedeeltelijk over. Progesteron zorgt
ermet namevoor dat ereengoed ontwikkeld endometrium ontstaat dat onder invloed
van progesteron in de zogenaamde secretiefase komt. Het endometrium gaat dan
onder invloed van progesteron talloze Produkten maken die onder andere van belang
zijn voor de voeding van het embryo. De ontwikkeling van het endometrium en die
van het embryo moeten echter goed op elkaar afgestemd zijn. Dit blijkt onder andere
uit embryotransplantatie-experimenten, waar gevonden is dat embryo en endometrium niet meer dan een dag uit fase mogen lopen. Interessant is dat de progesteronstijging aan het beginvandelutealefase endus ook aan het begin vandevroege dracht
nogal kan verschillen in de snelheid waarmee de maximale waarden worden bereikt.
Dit kan betekenen dat er door een veel te snelle of een veel te langzame progesteronstijging een asynchronie kan ontstaan tussen de secretiefase van het endometrium en
het ontwikkelingsstadium van het embryo (Wilmut et al., 1986).
ENDOCRINOLOGIE VAN BRONST EN DRACHT
2.3 Vroegedracht
2.3.1 Maternaleherkenningvande dracht
Voordehandhavingvandedrachtishetnodigdatdecorporaluteablijven functionerentijdens deheledracht (varken, koe)of het eerstegedeeltevan dedracht (schaap,
tot dag 50). Dit betekent dat het corpus luteum niet in regressie mag gaan. Dit kan
in principe op twee manieren gebeuren: het embryo maakt een stof die
- het corpus luteum stimuleert of die
- verhindert dat PGF2a werkt (Bazer et al., 1986).
Inheteerstgenoemdegevalishetembryonalesignaalluteotroop,inhettweedegeval
antiluteolytisch. Watditlaatstebetreft zijnvarkens,schapenenrunderengoedevoorbeelden.Menheeft bij varkensgevondendathetPGF2a-gehalteindeuterienevenen
lageristijdens devroegedrachtdantijdens decyclus.Deenegroeponderzoekersstelt
dathetPGF2anietmeerendocrien(richtingovarium)maarexocrien(richtinguteruslumen) wordt uitgescheiden onder invloed van een embryonaal signaal.'De andere
groeponderzoekerssteltdatdoordegroteredoorbloedingvandeuterusonderinvloed
van een embryonaal signaal de lokaal geproduceerde hoeveelheid PGF2a verdund
wordtendaaromnietmeerwerkzaamis.Hetembryonalesignaalwordtbijhetvarken
vermoedelijk gevormddooroestrogenendiedoorhetembryogemaaktworden,endie
plaatselijkeeffecten uitoefenen opdeendometriumwand enopdearteriëleenveneuze
uteriene bloedvaten. Onlangs heeft men gevonden dat het hier om een aparte klasse
van oestrogenen gaat, decatecholoestrogenen die de calciumopname van de gladde
spiercellen van de uteriene bloedvaten kunnen tegengaan waardoor ze tonisch wijd
openkomentestaan.Zeblijvenechterhunvermogenbehoudenomonderinvloedvan
stressprikkels te contraheren.
Detweedemogelijkheid omhetcorpusluteum tereddenisdeproduktietijdens de
vroegedrachtvaneenluteotrofe stof.Bij demensisditheelduidelijk hetgeval,want
daarproduceerthethumaneembryoalvoordeimplantatie(dag7)hethormoonhCG
dat een sterk stimulerend effect heeft op het corpus luteum. Bij de rat wordt deze
functie vervult door prolactine afkomstig uit de hypofyse. Bij landbouwhuisdieren
heeft mengeenhCG-achtigestof gevondendiedoorhetembryogeproduceerd wordt.
Bij het schaap heeft men echter tweeproteïneprodukten van detrofoblast gevonden
dievanbelangzijn bij deherkenningvandedracht enhethandhaven vanhet corpus
luteum. Dit is des te belangrijker omdat het schape-embryo waarschijnlijk geen
oestrogenen produceert, zodat de eerder beschreven theorie bij varkens niet opgaat
voor schapen. Het eersteeiwitdat alvanaf dag 10-12gemaakt wordt door detrofoblast,wordttrofoblastine (oTPl)genoemdenheeft eenmoleculairgewicht van70000
dalton (1 dalton = 1,66 x 10"27kg).Diteiwitveroorzaakt gelijksoortige effecten als
oestradiol. Het werkt antiluteolytisch door de excretie van PGF2a richting uteruslumen te vergroten waardoor de endocriene secretie verlaagd wordt. Runderblastocystenblijken ook eendergelijke stof (bTPl)teproduceren, dievia hetzelfde mechanismeantiluteolytisch werkt.Schapeblastocysten hebbenmogelijk eendirectstimule-
15
16
F.A. HELMOND
rend effect op het corpus luteum, maar of dit door trofoblastine veroorzaakt wordt
isdevraag.IntegenstellingtothCGenhetplacentairelactogeenresulteerteensystemische injectie niet, maar een intra-uteriene toediening weltot eenverlenging van het
functioneren van het corpus luteum. Tijdens de implantatieperiode (dag 16-18)
begintdetrofoblast methetproducerenvaneenprolactineachtigestof(placentairlactogeen, PL). Het PL blijkt ook het corpus luteum tekunnen stimuleren.
Het tijdstip van de herkenning van de dracht is uitgezocht door op bepaalde
momenten deembryo's uit deuterusteverwijderen. Het blijkt dat hetuitspoelenvan
embryo's voor dag 13in schapen en varkens en voor dag 16in koeien niet leidt tot
herkenningvandedrachtendebetreffende dierenkomendanopdenormaletijdweer
in bronst. Het signaal dat in deze periode wordt geproduceerd door het embryo
(varken:oestrogenen;schaap:trofoblastine) isechternietsterkgenoegomhetcorpus
luteum voorlangetijd teredden. Hetblijkt dat hetverwijderen vanhet embryovlak
na dag 12(schaap, varken)of dag 16 (koe)resulteert in eenverlengingvan decyclus
met ongeveer 5-6 dagen (Van der Meulen et al., 1988).
Tijdens de implantatie vindt er een tweede, sterker signaal plaats (varken en koe
oestrogenen, schaapplacentairlactogeen(oestrogenen?))dathetcorpusluteumgedurendeeenveellangeretijdinstandhoudt.Bijhetvarkenspeeltookhetaantalembryo's
endeplaats waar dezezichbevinden eenbelangrijke rol. Het blijkt dat ertenminste
4embryo'saanwezigmoetenzijn omeenvoldoendesterk eerstesignaal(oestrogenen)
Tabel 1. Verloop van de dracht bij verschillende diersoorten.
Dieren
Mens"
Rat"
Muis"
Konijn"
Caviab
Rhesus-aap"
Paard1'
Koe"
Schaap"
Varken"
Fret b
Nerts b
Kat"
Ontwikkelingsstadium bereikt op de onderstaande tijdstippen in uren (h) of in dagen (d)
2-cel
4-cel
16-cel
blastocyst
1,5 d
1-2 d
21-23 h
21-25 h
23-48 h
26-49 h
24 h
24 h
24 h
16-20 h
51-71 h
3d
40-50 h
2d
2-3 d
38-50 h
25-32 h
30-75 h
24-52 h
30-36 h
2-3 d
42 h
25-74 h
64-74 h
3d
3d
3d
4d
60-70 h
40-47 h
107 h
4-6 d
98-100 h
4d
3d
80-120 h
95-120 h
5-6 d
4d
4d
4,5 d
66-82 h
75-96 h
115h
7-8 d
6d
7-8 d
6-7 d
5-6 h
4,5-6 d
8-10 d
5-6d
a. Tijdstippen ten opzichte van de ovulatie.
b. Tijdstippen ten opzichte van de coïtus.
Aankomst
embryo
in de
uterus
(dagen)
Implantatie
(dagen)
Totale
duur
van de
dracht
(dagen)
2-3
3
3
2,5-4
3,5
3
4-5
3-4
2-4
2-2,5
5-6
8
4-8
8-13
5
4
7-8
6
9-11
28
30-35
•15-16
11
7-8
25
13-14
252-274
20-22
19-20
30-32
63-70
159-174
335-345
275-290
145-155
112-115
42
42-52
52-65
r
ENDOCRINOLOGIE VAN BRONST EN DRACHT
te produceren. Later in de dracht (na placentatie) kunnen ook minder embryo's de
drachthandhaven.Hetblijkt datvarkensembryo'szichooknietallemaalinéénhoorn
mogen bevinden omdat de andere hoorn dan nog zoveel PGF2a kan maken dat de
corpora lutea toch in regressie gaan.
2.3.2Embryonaleontwikkeling
Na debevruchting begint het embryozichte delen en komt het na eenaantal dagen
indeuterus aan (tabel 1).Bijvarkensisdit2dagenenbij runderen 3-4 dagen nade
ovulatie. Dedelingssnelheid van deembryo's ismeestal constant. Demeeste soorten
hebben echter vroegindeontwikkeling van het embryo eenzogenaamd celblok. Bij
varkensisdithet4-celligenhetrundhet8-celligstadium.Dedelingssnelheidisopdat
momentveellagerdanverwachtenhetblijkt datdezecelbloksvaakookeenstruikelblok zijn om embryo's volledig (dat wilzeggen van 1-celligtot blastocyst) invitrote
kweken. Aanvankelijk vinden dedelingen plaats binnen dezogenaamde zona pellucida. Dit ontwikkelingsstadium wordt het morula stadium genoemd. Later vindt er
holtevorming plaats enverdwijnt dezona pellucida. Nuishetembryo eenblastocyst
geworden.Hetprocesvanverwijdering vandezonapellucidawordtookwelhatching
genoemd.Bijlandbouwhuisdieren zienwedatdeblastocystdaneenperiodevanelongatie doormaakt voordat deimplantatie plaatsvindt. Bij varkens kan deze elongatie
ertoe leiden dat een kleine ronde (sferische) blastocyst eenlengtevan een meter kan
bereikenineenpaar dagentijd. Hettijdstipwaaropdeblastocystenimplanteren staat
weergegeven in tabel 1 (Austin &Short, 1982).
17
3 Ontwikkeling van superovulatietechnieken in relatie tot
embryotransplantatie
S.J. Dieleman
3.1 Inleiding
Embryotransplantatie (ET)wordt omverschillenderedenen toegepast bij landbouwhuisdieren. Voordat implantatie in het donordier plaatsvindt, worden embryo's via
(non)-chirurgische technieken verzameld (flushing) om vervolgens in recipiënten te
worden overgezet.
Bij het schaap wordt ET vooral toegepast om nieuw geïmporteerde rassen snelte
kunnenvermenigvuldigen.Bijdegeitheeft deoplevingvandeAngora-enCashmereindustrie de import gestimuleerd van grote aantallen diepgevroren embryo's uit
Nieuw-Zeeland in onder meer Engeland, maar ook in ontwikkelingslanden. Bij het
varken wordt ET vooralsnog voornamelijk gebruikt voor experimenteel onderzoek.
Tabel 2. Overzicht ET-handelingen bij runderen in 1986.
Land
Aantal flushings
Aantal transfers
Europa
14 000
35 000
België
Denemarken
Engeland
Frankrijk
Ierland
Italië
Nederland
Norwegen
West-Duitsland
Zwitserland
350
130
3 000
2 900
80
215
1 500
100
1 858
92
700
250
7 000
10000
200
865
4 500
185
7 600
413
Noord-Amerika
30 000
70 000
In Nederland wordt ET voor 90% verricht door de drie
regionaleET-stations, 5% inhet Land van Cuijk, 2% door
de Rijksuniversiteit Utrecht en 3% door lokale dierenartsen. Het relatieve belang van ET anno 1988 kan worden
afgeleid uit vergelijking met het aantal KI-verrichtingen per
jaar dat circa 1000 x hoger is. (Dit overzicht is opgesteld
volgensdemededelingen door devertegenwoordigers uit de
respectieve landen tijdens de 3rd Scientific Meeting van de
A.E.T.E. in Lyon 1987.)
18
SUPEROVULATIETECHNIEKEN ENEMBRYOTRANSPLANTATIE
Bij hetpaard isditookhetgeval;bijdezediersoort isdedrijfveer voor EThetverkrijgen vanmeer nakomelingen vanwaardevolle draf- enrenpaarden zonder datde
donoren voor desport worden uitgeschakeld tengevolgevandrachtig zijn.
Wereldwijd.gezienwordtEThetmeestbijhetrundinpraktijk toegepast (tabel2).
Naasthetverzijgenvanmeerdanhetnatuurlijke aantalnakomelingenvanhoogwaardige dieren zijn devolgende toepassingen vanETbijhetrund vanbelang:
- hetverkrijgen vankalveren van'infertiele' runderen,
- controle vanhetgeslacht vanhet kalf,
- hetlatengeborenwordenvankalverenvanimportrassenininlandserunderenom
zo immuniteit teverwerven tegen lokale ziekten,
- tweelinggeboorte envleeskalveren uit melkrassen,
- langetermijn opslag vandiepgevroren embryo's,
- testen vanrecessievegenen,
- produktie vanidentieke kalveren voor research-doeleinden.
Verschillende factoren beïnvloeden deresultaten van ET:
- desuperovulatietechniek,
,
dagen
Fig. 7. Follikelontwikkeling bij het rund tijdens denormale cyclus. P4 = progesteron, E2 = oestradiol,
LH = luteïniserend hormoon, PRL = prolactine.
19
20
S.J. DIELEMAN
embryo's
follikels
PMSG
PG
ANTI
N
FSH
i
2
21
LH
III
1
OVULATIE
Fig. 8. Superovulatie bij het rund. LH = luteïniserend hormoon, FSH = follikel-stimulerend hormoon,
PMSG = Pregnant Mare Serum Gonadotropin, PG = Prostaglandine F 2 a , ANTI = anti-PMSG.
- de vroegembryonale ontwikkeling in de donor,
- het flushen van de embryo's uit de donor,
- kwaliteitsbeoordeling van deembryo's,
- transplantatie, met name het synchroon zijn van embryo en baarmoeder vande
recipiënten,
- eventueel diepvries-en klievingstechnieken.
Aangezienbijhetrundtijdensdenormaleoestrischecyclusvancirca21 dagendoorgaans 1 ovariëlefollikeltotrijpingenovulatiekomt(fig.7),wordtde follikelpopulatie
gestimuleerd met exogene gonadotrope hormonen, bij voorbeeld Pregnant Mare
Serum Gonadotrophin (PMSG)of Follikel Stimulerend Hormoon (FSH;voornamelijk gewonnen uit varkenshypofysen). In het algemeen zijn bij een dergelijke zogenaamde superovulatiebehandeling tweeperioden te onderscheiden (fig. 8):
- eenperiode van 5dagen waarin follikelontwikkeling plaatsvindt tussen primaire
stimulatie en ovulatie, waarbij deeicellen vrij komen, en
- daaropvolgend eenperiodevancirca7dagenwaarinnabevruchtingvroegembryonale ontwikkeling optreedt.
Door de aanwezigheid van extra gonadotroop hormoon kunnen ontsporingen
optreden in iedere fase tijdens dezetwee perioden.
In dezebijdrage zullen achtereenvolgens devolgende onderwerpen worden behandeld:
- normale follikelontwikkeling,
- follikelontwikkeling na stimulatie met PMSG,
- embryo-opbrengst na verschillende superovulatietechnieken.
3.2 Normale follikelontwikkeling bijhetrund
Tijdensdeoestrischecyclusvanhetrundkomtdoorgaansééneiceltotrijping.Volledige rijping van de eicel vindt plaats in een preovulatoire follikel, waarvan het door
SUPEROVULATIETECHNIEKEN EN EMBRYOTRANSPLANTATIE
Fig. 9. De preovulatoire follikel bij het rund. Nadere uitleg staat in de tekst.
gonadotrope hormonen gereguleerde, steroidale micromilieu vangroot belangwordt
geachtvoorhetvermogenvandeeicelomnabevruchtingtekunnenuitgroeientoteen
normale blastocyst (embryo).
Depreovulatoire follikel bevindtzichopéénvandetweeovariadieviaeenoviduct
zijn verbonden met een baarmoederhoorn (fig. 9).
Dediameter van een dergelijke follikel is 15-20 mm, en zijn wand bestaat uit de
volgende cellagen: de theca externa (T.e.)en interna (T.i.) die door het basaalmembraan (b.m.) zijn gescheiden van de binnenste cellaag, en de membrana granulosa
(M.g.).Deeicel(O)isgenesteldindecumulusoöphorus(Co.)enwordtomgevendoor
de follikelvloeistof in de antrale holte (a.c), waarin zich verschillende hormonen
bevinden in variërende concentraties. De cellagen van de wand maken in nauwe
samenhangverschillendeSteroidhormonen:dethecainternaproduceertandrosteendiondatindemembranagranulosawordtgeconverteerd inoestradiol (het eindprodukt
vandefollikel). Deregulatie vandezeproduktie wordtverzorgd door de hypofysaire
(gonadotrope) hormonen LH en FSH.
Na ovulatie verdwijnt het cumulus-eicel-complex richting oviduct en ontwikkelt
zichhetcorpusluteumvandevolgendecyclus(dracht)uitdeachterblijvende cellagen
van de follikel. Grote antrale follikels kunnen tot ontwikkeling komen tijdens de
luteale fase van de cyclus (fig. 7), waarin het corpus luteum een hoge progesteronconcentratie veroorzaakt in het perifere bloed. Deze follikels secerneren echter een
geringehoeveelheidoestradiolenhunfollikelvloeistof vertoontlageconcentratiesaan
oestradiol en zijn precursors; zedegenereren en worden vervangen door een nieuwe
zichontwikkelende follikel tentijde vanderegressievanhetcorpus luteum. Dehiermeegepaardgaandetoenamevandeoestradiol-concentratieinhetperiferebloedgeeft
aandatdeontwikkelingvandepreovulatoirefollikelbegintrondhetbeginvandeluteolyse.Wanneerallefollikels <5 mmopdag 18 vandecycluswordenverwijderd, vindt
toch ovulatieplaats opdenormaletijd. Detoenemende oestradiolconcentratie sensibiliseertmogelijk dehypothalame-hypofysaire as,waardooreenlichtestijgingvanhet
LH-niveauwordtveroorzaakt,watuiteindelijk resulteertindeafgifte vandepreovula-
21
22
S.J. DIELEMAN
/imol/l
DHEA
tijdnaLHpiek
(uren)
n
10
7
4
4
3
4
4
6
3
3
2
2
5
Fig. 10. Steroïdconcentraties in het micromilieu van de rijpende eicel. DHEA = dehydroepiandrosteron,
A4 = androsteendion, T = testosteron, E, = oestron, E 2 = oestradiol.
toire LH-piek (fig. 7). De follikel is rijp voor de produktie van oestradiol wanneer
dieren voor het eerst staande oestrus vertonen, dat wil zeggen een stier accepteren.
NadeLH-piek zijn driefasen teonderscheiden opgrond vandeveranderingen in
desteroïdconcentraties indefollikelvloeistof enindemicromorfologie van dewand
van depreovulatoire follikel (fig. 10).
E2
Hu
invloeistof inbloed I4£pmol/l utnol/l
Aromatizerend
vermogen
Fig. 11. Oestradiolproduktie in preovulatoire runderfollikels.
SUPEROVULATIETECHNIEKEN EN EMBRYOTRANSPLANTATIE
Vóór de LH-piek (fase 0) is oestradiol het belangrijkste steroid. De biosynthese
verloopt van androsteendion via oestron naar oestradiol; testosteron is van ondergeschikt belang. Na deLH-piek worden deoestradiolproduktie en secretieinhet periferebloed gecontinueerd gedurende ongeveer 6uur (fase 1;fig. 10en 11).Daarna dalen
de oestradiolconcentraties in het perifere bloed en de follikelvloeistof gelijktijdig.
Hiermee valt op lichtmicroscopisch niveau de hervatting van de rijpingsdeling
(méiose) van de eicel samen. In vitro echter blijft de follikel in staat oestradiol te
synthetiseren tot circa 14uur na de LH-piek. Dit verschil tussen de waarnemingen in
vivo en in vitro moet waarschijnlijk worden geweten aan de acute afname van de
androsteendionproduktie na de LH-piek, zoals wordt weerspiegeld in de afname van
de concentratie van dit steroid in de follikelvloeistof (fig. 10). Hierdoor raakt het
aromatase in vivo verstoken van zijn substraat. Samenvallend met de afname van de
androgeenconcentratie indevloeistof isdetheca interna van de follikelwand tijdelijk
inbreedte toegenomen (fase 1).De LH-piek beëindigt waarschijnlijk direct de thecale
steroïdsynthese integenstelling tot desteroïdsynthese van demembrana granulosa. In
fase 2 van 6 tot 20 uur na de LH-piek is er tijdelijk een geringe activiteit van de
steroïdsynthese; differentiatie van de granulosacellen in luteïnecellen is dan nog in
ontwikkeling. Vanaf 20uur na de LH-piek tot ovulatie op circa 24uur (fase 3) neemt
de progesteronconcentratie in de follikelvloeistof snel toe (fig. 12), gepaard gaande
met een markante toename van de afmeting van de granulosacellen. Bovendien
vertoonthetprogesteron-synthetiserend vermogen eenforsetoename.Ditduidt opeen
gelijktijdige functionele en morfologische luteïnisatie (fig. 12).Detijdelijke toename
van deprogesteronconcentratie tijdens fase 1 kan worden toegeschreven aan het direct
optredendeeffect vandeLH-piek opdethecainterna.Tijdensdezelaatstefase 3blijkt
de eicel zijn rijping, gemeten aan het uittreden van het poollichaampje, te hebben
voltooid.
De niveaus van LH en in het bijzonder van FSH zijn hoger in de vloeistof van preovulatoire follikels dan van grote niet-atretische follikels tijdens deluteale fase van de
P4
MG
[LÏÏ1
Functionele
luteinisatie
invloeistol Morfologische "• k l
jjmol/l luleinisatie
ŒJ
m
2Ä
2B'
fase
Fig. 12. Luteïnisatie in preovulatoire runderfollikels. P4 = progesteron, MG = membrana granulosa.
23
24
S.J. DIELEMAN
tijd na LH piek
(uren)
Fig. 13. Gonadotrope hormonen in het micromilieu van de rijpende rundereicel. LH
hormoon, FSH = follikel-stimulerend hormoon, PRL = prolactine.
luteïniserend
cyclus.In defollikelvloeistof wordteenLH-piek gevonden ongeveer4uur nadepiek
inhetperiferebloed(fig. 13).Ditvertraagdverschijnen vanLHinde follikelvloeistof
ismogelijk tewijten aandebezettingvanvrije LH-receptorenindefollikelwand; LH
moet namelijk de avasculaire membrana granulosa passeren om de follikelholte te
bereikenvanuit dethecalebloedcapillairen. Gedurende deperiodevan7tot 20uuris
hetLH-niveauindefollikelvloeistof hogerdandatinhetbloed,datwilzeggentotdat
luteïnisatievandemembranagranulosaoptreedt. Hetna-ebbenvandeLH-piek inde
follikelvloeistof ismogelijk eengevolg van een geleidelijk vrijkomen van LH vanaf
dereceptoren in de follikelwand. Het FSH-niveau vertoont tevens eenmaximum op
ongeveer 4uur na de LH-piek in het perifere bloed (fig. 13).Tot 20uur neemt het
niveauvanFSHgeleidelijk af, waarnaeentoenameplaatsvindt. Hethogeniveauvan
dithormoon staatmogelijk inverband metdevoorFSHveronderstelde stimulerende
functie op ovulatoire processen. Het niveau van prolactine in de follikelvloeistof
vertoont geen significante veranderingen gedurende de preovulatoire ontwikkeling.
Prolactineheeft geenregulerendefunctie tijdens defollikelontwikkeling bijhetrund;
receptoren voor dit hormoon kunnen niet in derunderfollikel worden aangetoond.
Samenvattend blijkt dat het steroidale micromilieu van de rijpende rundereicel
omslaatvaneendooroestradiolgedomineerdmilieubijhetbeginvandeoestrusnaar
eenmilieuwaarinprogesteron overheerstkortvoor deovulatie.Ditgaatgepaardmet
veranderingen indemicromorfologie vandefollikelwand envan deeicel.Aangezien
dezestrikte chronologie vanveranderingen wordtgereguleerd door gonadotropinen,
SUPEROVULATIETECHNIEKEN EN EMBRYOTRANSPLANTATIE
kanwordenveronderstelddateensurplusaangonadotroop hormoon, zoals gebruikt
bij superovulatie, tot ontsporingen van het rijpingsproces leidt.
3.3 Follikelontwikkeling nastimulatie metPMSG
Deontwikkelingvanpreovulatoirefollikelsbijsuperovulatie,datwilzeggentoedienen
van exogeen gonadotropine, verloopt in drie fasen (fig. 8):
- fase I:primaire stimulatie gedurende 48uur na toedienen van PMSG op dag 10,
tijdens de luteale fase van decyclus;
- fase II: selectieengroei gedurende circa 42uur na toedienen van Prostaglandine
(PG) om regressie van het corpus luteum te bewerkstelligen;
- fase III:laatsterijpingsstadia gedurendecirca26uur nadeLH-piek totovulatie.
In alle drie de fasen blijken afwijkingen van het normale patroon van follikelontwikkeling optetreden. In fase Iisdeproduktie vanprogesteron met eenfactor 2
toegenomen. In fase II is het pulsatiele afgiftepatroon van endogeen FSH en LH
onderdrukt, daarnaast isdeduur vandezefase sterk verkort (65 %)enzeervariabel
(30tot 60uur). Bovendien wordt geen LH-piek waargenomen in 16% van devoor
superovulatie behandelde runderen, waardoor ovulatieuitblijft; dit blijkt niet tezijn
gecorreleerd met dePMSG-concentratie in het bloed noch met deendocriene status
op het tijdstip van toediening van PMSG. In fase III vertoont 65 % van de nietatretische grote follikels een abnormaal hoge concentratie van oestradiol kort voor
ovulatie;invitroblijkt ereencorrelatietebestaantussen deoestradiolconcentratiein
het cultuurmedium enabnormale spindelvorming tijdens deana- entelofase vande
hervatteméiosevandeeicel.Bijeengedeeltevandefollikelsisderijping morfologisch
enfunctioneel nognietvoltooidkortvoorovulatie;indergelijkefollikels heeft deeicel
deméioseniethervat. Deoorzaak voor dezeafwijkingen moetwordengezochtinde
aanwezigheid van extra gonadotroop hormoon; voor PMSG is de halfwaardetijd 5
dagen in het rund. Neutralisering van PMSG met een polyklonaal antiserum tegen
PMSG,toegediendtijdens faseIenII,doetdegestimuleerde follikelpopulatie regresseren;PMSGdientdusaanwezigtezijntotdatdefollikelsrijpzijnomfaseIIItedoorlopendatwilzeggentothetoptredenvandepreovulatoireLH-piek.Decentralehypothese voor het onderzoek naar deverbetering van superovulatietechnieken isdat de
aanwezigheid van extra gonadotropine tijdens de laatste rijpingsstadia het vaste
patroon van hormonale veranderingen doet ontsporen.
Om PMSG te kunnen neutraliseren direct na de LH-piek, wordt bij ieder voor
superovulatiebehandelddierdepreovulatoireLH-piekbepaaldmeteenspeciaaldaartoe ontwikkelde zogenaamde rapid LH radio-immunoassay (RIA) waarmee deLHconcentratie bekend is4uur na bloedafname; degebruikelijke RIA'sduren 5dagen.
AangeziendeLH-piekcirca8uurbreedis,kanzobijiederrundtijdighetanti-PMSG
wordentoegediend.VoordeneutraliseringvanPMSGwordtgebruikgemaaktvaneen
recentbiotechnologisch produkt:monoklonaalanti-PMSGontwikkeld door Intervet
International B.V.Het is het vermelden waard dat dit het eerste monoklonale antilichaam (MCA)isvoor parenteraletoedieninginlandbouwhuisdieren; hetisookhet
25
26
S.J. DIELEMAN
15-
2 10
1
3 5-
0J
I
m
I1
Ù
22
24
26
28
30
UrennaLH
Fig. 14. Superovulatie met PMSG in combinatie met anti-PMSG (gearceerd), en zonder anti-PMSG
(blanco).
eersteMCA dat wordtgebruikt om dewerkingvaneenander farmacon te controleren.
Toediening van dit anti-PMSG op 5uur na het maximum van de preovulatoire LHpiek blijkt de laatste rijpingsstadia van de opgewekte follikelpopulatie te synchroniseren en de periode van multipele ovulatie te verkorten (fig. 14). Bovendien neemt
het aantal ovulaties per koe met een factor 2 toe.
Het steroidale micromilieu met betrekking tot deoestradiolconcentratie vertoont in
slechts 9.7 % van de follikels een geringe afwijking kort voor ovulatie. Deze waarnemingen bevestigen de hypothese dat een surplus aan gonadotropine tijdens de
laatste folliculaire rijpingsstadia het verloop daarvan negatief beïnvloedt. Lichtmicroscopisch wordt echter geen verschil gevonden tussen de kernmaturatie van eicellen verkregen na superovulatie met en zonder anti-PMSG; ultrastructureel zijn er
aanwijzingen dat dit wel het geval is voor wat betreft de cytoplasmatische maturatie.
3.4 Embryo-opbrengst na verschillende superovulatietechnieken
Toepassing van bovengenoemde superovulatietechnieken voor embryoproduktie
maakt hetmogelijk meer nakomelingen vanhoogwaardige runderen teverkrijgen dan
met gangbare technieken (fig. 15).De methode met FSH isvooral in Noord-Amerika
in gebruik. Vergelijking toont aan dat superovulatie met PMSG in combinatie met
monoklonaal anti-PMSG resulteert in een verdubbeling van het aantal transplanteerbare embryo's, dat wilzeggen met een kwaliteit Grade Iof II (fig. 15).Uit het ontwikkelingsstadium vanembryo'sopdag6endag7kanworden afgeleid dat de embryonale
ontwikkeling zich sneller voltrekt en dat circa 2 keer zoveel embryo's het blastocyst-
SUPEROVULATIETECHNIEKEN EN EMBRYOTRANSPLANTATIE
AANTAL
EMBRYO'S/KOE
10
&
•b I I
OL K
t
GRADE +
II
I
III Deg Non+
fert
IV
I
+
II
III Deg Non+
fert
IV
PMSG
ANTI-PMSG
I
+
II
=^=l
III Deg Non+
fert
IV
FSH
Fig. 15. Embryo-opbrengst na verschillende superovulatiemethoden. Grade I + II = transplanteerbaar,
Grade III + IV = slechte kwaliteit, DEG = gedegenereerd, NON-FERT = onbevrucht, FSH = follikelstimulerend hormoon, PMSG = Pregnant Mare Serum Gonadotrophin.
stadium bereiken na PMSG-superovulatie met neutralisering van het PMSG bij het
begin van de laatste rijping van de eicel. Het kan echter niet worden uitgesloten dat
hetmilieu vandegenitaaltractus ook vaninvloed isopdevroegembryonale ontwikkeling; superovulatie zonder anti-PMSG veroorzaakt een hoge oestradiolconcentratie
na ovulatie, doordat nog aanwezig PMSG eentweede follikelgolf stimuleert na ovulatie.
3.5 Conclusie
Inzicht in de normale preovulatoire follikelontwikkeling heeft geleid tot een verbetering van bestaande superovulatietechnieken, waarbij gebruik wordt gemaakt van
nieuwe ontwikkelingen op het gebied van de dierlijke biotechnologie. Hiermee is
echter nog geen einde aan de mogelijkheden gekomen. Verder fundamenteel onderzoek naar regulatie van follikelontwikkeling en vroegembryonale ontwikkeling zal
nodigzijn om degrotevariatie inopbrengst aan embryo's teverstaan. Men kan hierbij
denken aan onder meer primaire stimulatie, factoren als inhibine enerzijds en onderzoek naar de invloed van de genitaal tractus op het embryo en het kortdurend in cultuur brengen van kwalitatief minder goede embryo's anderzijds.
27
4 Belang van het synchroon zijn van embryo en uterus bij
embryotransplantatie
T. van der Lende
4.1 Inleiding
Bij zoogdieren wordt deontwikkeling van het embryo gedurende depreïmplantatieperiode gekenmerkt door snelle veranderingen in een voortdurend veranderend
uterien milieu. De veranderingen in het uteriene milieu treden hoofdzakelijk op als
responsopendocrieneveranderingen.Hoeweldeembryonale ontwikkelingsprocessen
volgenseeninhetgenoomvastgelegdprogrammaverlopen,wordenzebeïnvloeddoor
hetmilieuwaarinhetembryozichbevindt.Omgekeerd kanhetembryoookzijneigen
milieu beïnvloeden, maar dit beperkt zich waarschijnlijk tot een aantal specifieke
tijdstippen tijdens devroege dracht. Naarmate er meer kennis komt over desamenstelling van het intra-uteriene milieu gedurende devroege dracht, defuncties vande
samenstellendecomponentenendeinteractiestussenembryo(ofembryo's)enuteruswand, wordt steeds duidelijker waarom het synchroon zijn van embryo enuterus bij
embryotransplantatie zo belangrijk isvoor het slagen van de transplantatie.
Inhetvolgendezalachtereenvolgens wordeningegaanophetuterienemilieugedurendedevroegedracht, deinvloed vaneenasynchroon uterien milieu opdeembryonale ontwikkeling en de vraag of embryo-recipient-synchronisatie betere resultaten
geeft dan donor-recipient-synchronisatie.
4.2 Uteriene milieu gedurende devroegedracht
Hetuterienemilieuwordtinbelangrijke matebepaald door uterieneeiwitten.Aitken
(1979)maakt onderscheid tussen driegroepen eiwitten:
1. Oestrogeen-geïnduceerde eiwitten die van belang zijn rondom het tijdstip van
ovulatie:zecreëreneenmilieuvoortransport,metabolismeencapacitatievanspermatozoïden en ze maken de uterus gereed voor de vroege dracht doordat ze invloed
hebben op de synthese van progesteronreceptoren.
2. Eiwittendiegedurende devroegedracht door hetendometrium worden afgegeven
aanhetuterienelumenomeenmilieutecreërendatgunstigisvoorgroeivandeblastocysten en voor implantatie.
3. Eiwitten diegedurende depost-implantatiefase van dedracht worden gesynthetiseerdenafgegeven door hetendometrium endievanbelangzijn voor devoedingvan
degroeiende conceptus.
Metnamedeonderpunt2genoemdeeiwittenzijn vanbelanginrelatietotembryotransplantatie. Ze worden door het endometrium afgegeven onder invloed van
28
EMBRYO-UTERUS-SYNCHRONIE
progesteron. Gedeeltelijk zijn dit serum-eiwitten, gedeeltelijk uterusspecifieke eiwitten. Deze laatsten worden niet alleen afgegeven, maar ook gesynthetiseerd onder
invloed van progesteron. Met name het tijdstip waarop de door het endometrium
geproduceerde eiwitten worden afgegeven aan het uteriene lumen, kan worden beïnvloeddoorhetembryo.Zoisbijhetvarkenbekenddatonderinvloedvanembryonale
oestrogenen rond dag 11 van dedracht deafgifte vanuteriene eiwitten gesynchroniseerdplaatsvindt, terwijl dezezelfdeeiwittenbij cyclischedierenovereenperiodevan
enkele dagen geleidelijk worden afgegeven (Geisert et al., 1982).
Naast een belangrijke nutritionele waarde, hebben deuteriene eiwitten gedurende
depreïmplantatie- en vroege implantatieperiode ook een functie bij:
- deimmunoregulatie, om afstoting van delichaamsvreemde (allogène) conceptus
te voorkomen,
- transport van hormonen, mineralen envitaminen (Ducsay et al., 1984)en
- stimulatieof inhibitievanembryonale enzymen, bij voorbeeld tijdens deimplantatie (Mullins et al., 1980;Fazleabas et al., 1983).
Een analyse van de kwalitatieve en kwantitatieve samenstelling van hét uteriene
eiwitsecreet laat zien dat gedurende devroege dracht van dagtot dag veranderingen
optreden.
Behalve door eiwitten wordt de (bio)chemische samenstelling van het uteriene
milieu ook bepaald door deaanwezigheid van aminozuren, peptiden, suikers,vetzuren, vitaminen, hormonen en verschillende anionen en kationen. Over de veranderingenindeconcentratiesvandezecomponentengedurendedepreïmplantatieperiode
isnauwelijks ietsbekend.Métdeeiwittenbepalenzeechterdefysische eigenschappen
vanhetuterienemilieu (bij voorbeeld osmolariteit enpH).Bij onderzoek met konijnenisgeblekendatdepHvanhetuterienemilieutussendag1 en7vandedrachtdaalt
van gemiddeld 7,8 naar gemiddeld 7,4 (Petzoldt, 1971,in: Beier, 1974).
4.3 Invloedvaneenasynchroonintra-uterienmilieuopdeembryonaleontwikkeling
Onderzoek naardeinvloedvaneenasynchroonintra-uterienmilieuopdeembryonale
ontwikkeling is verricht met het schaap als proefdier. Door embryo's volgens het
schema vantabel 3tweekeer met eeninterval van 3dagen tetransplanteren hebben
Wilmut &Sales (1981) aangetoond dat een asynchroon intra-uterien milieu fatale
gevolgenvoordeembryo'skanhebben.Ditbleekechterafhankelijk tezijnvandefase
van ontwikkeling waarin deembryo's zichbevinden bij deeerste transplantatie.
Vande6dagenoudeembryo'sdiebij dedonorenvangroep2(tabel3)werdenaangetroffen was78 %inhetmorula-stadiumen22 %inhetblastocyst-stadium.Bijhet
spoelenvandeeersterecipiënteningroep 1bwas80 %vandeteruggevonden eneveneens6dagen oudeembryo'sinhetmorula-stadium en20 %inhetvroegeblastocyststadium. In groep lc was dit echter respectievelijk 47 % en 53 %. Deze versnelde
ontwikkeling onder invloed van een milieu dat voor ligt op de ontwikkeling van de
embryo's, was in groep 2 nog duidelijker dan in groep 1. In groep 2b en 2c waren
respectievelijk 20 % en 0 % embryo's nog niet vrijgekomen uit de zona pellucida,
29
30
T. VAN DER LENDE
Tabel 3. Proefopzet vooronderzoek naardeinvloed vaneenasynchroon intrauterien milieu op de embryonale ontwikkeling (Wilmut & Sales, 1981).
Groep
Dag van cyclus
donor
Ie recipient
2e recipient
Leeftijd embro bij
2e transplantatie
(dagen)
la
lb
lc
3
3
3
6
3
6
6
6
6
6
2a
2b
2c
6
6
6
9
6
9
9
9
9
9
60 % en 19% kleine blastocysten zonder zona en20 % en 81%grote blastocysten
zonder zona. Hetverschiltussen groep2ben2cwasevenalshetverschiltussengroep
lb en lc significant (p <0,05). Detweede recipiënten zijn geslacht tussen dag 32en
41(groep 1)of tussen dag 51en58(groep2)na oestrus. Deresultaten van detweede
transplantaties zijn vermeld in tabel4.
Dekansop eensuccesvolletweedetransplantatie wasingroep2csignificant lager
dan ingroep lb, lcen2b (p <0,05,tabel 4).Vandefoeten diewerden aangetroffen
ingroep lben lchebben deonderzoekers dekop-romp-lengtebepaald. Gecorrigeerd
naar eendrachtigheidsstadiumvan37dagen, wasditrespectievelijk 20,7mmen29,0
mm.Opgrondvandegroeisnelheid vanongeveer 37dagenoudefoeten komt ditverschil overeen met een 'leeftijdsverschil' van 2,9 à 1,3 dagen.
Uit onderzoek vanLawson etal.(1983),eveneens verricht met schapen, blijkt ook
duidelijk dat asynchrone transplantatie vanembryo's invloed heeft op deontwikke-
Tabel 4. Embryonale overleving na de tweede transplantatie in het onderzoek van Wilmut & Sales (1981).
Groep
Aantal
ooien
Aantal
embryo's
Aantal
drachtige
ooien
Aantal
foeten"
la"
lb
lc
4
6
9
5
10
16
0
4
7
0
7
10
2ab
2b
2c
5
8
10
10
14
14
0
5
2
0
7
2
a. Teruggevonden na slachten.
b. Geen tweede transplantatie, zie tabel 1.
EMBRYO-UTERUS-SYNCHRONIE
lingssnelheid. Zo bleken embryo's die voorliepen op hun nieuwe milieu afgeremd te
worden inontwikkeling, terwijl embryo's dieeenachterstand hadden ten opzichte van
hun nieuwe milieu zich juist sneller gingen ontwikkelen. De snelle ontwikkeling van
embryo's dieachterliggen ophet milieu zetzichbij het schaap echter nietvoort na dag
12. Dit bleek uit een vergelijking van de grootte van asynchroon en synchroon
getransplanteerde embryo's. Hoewel de asynchroon getransplanteerde embryo's nog
wel groeiden tussen dag 12 en 14, was de groei van de synchroon getransplanteerde
embryo's velekerengroter. Deasynchroon getransplanteerde embryo's meteen achterstand ophet intra-uteriene milieuzijn nietinstaat maternale herkenning vande dracht
te bewerkstelligen, en worden gedurende de pro-oestrus van de eerstvolgende cyclus
waarschijnlijk afgestoten. Dat asynchroon getransplanteerde embryo's afsterven is
echter niet een gevolg van het feit dat maternale herkenning van de dracht niet
optreedt. Indien een embryo dat voorloopt op het intra-uteriene milieu zich bevindt
in een uterus waarin ook een synchroon getransplanteerd embryo aanwezig is, dan
treedt maternale herkenning van de dracht wel op, maar overleeft het asynchroon
getransplanteerde embryo toch niet (Wilmut & Sales, 1981;Lawson et ak, 1983).
4.4 Donor-recipiënt- of embryo-recipiënt-synchronisatie?
Embryo's die worden gespoeld uit een gesuperovuleerde koe kunnen sterk variëren in
ontwikkelingsstadium (Lindner &Wright, 1983;Donaldson, 1986). Volgens Lindner
& Wright (1983) is de geschatte leeftijd van morulae 5 dagen, compacte morulae 6
dagen, vroege blastocysten en blastocysten 7 dagen, geëxpandeerde blastocysten 8
dagen en blastocysten zonder zona pellucida 9 dagen. Bij het spoelen van 7 dagen
drachtige koeien kunnen embryo's worden aangetroffen die gezien het ontwikkelingsstadium eengeschatteleeftijd hebben van5tot9dagen. Ditisuiteraard eengevolg
van variatie binnen én tussen koeien. De verschillen in geschatte leeftijd van de
embryo's pergesuperovuleerde koekunnen 24tot 48uur bedragen (Lindner &Wright,
1983). Belangrijk is nu de vraag of de overlevingskans van een embryo na transplantatie wordt bepaald door het drachtigheidsstadium van de donor of door het ontwikkelingsstadium (geschatte leeftijd) van het embryo. Lindner &Wright (1983) vonden
geen relatie tussen de drachtigheidsresultaten na transplantatie en de mate van
synchronisatie tussen donor en recipiënt, waarbij de laatste de 2 dagen niet overschreed. Werd echter de mate van synchronisatie tussen embryo en recipiënt als criterium genomen, dan was het duidelijk dat de beste resultaten werden bereikt indien de
geschatte leeftijd van het embryo minder dan 1 dag afweek van het cyclusstadium van
de recipient.
Tegenover deze resultaten staan de resultaten van Donaldson (1985). De kans op
succesbij 13 663transplantaties waarbij zoveel mogelijk rekening werdgehouden met
het embryonale ontwikkelingsstadium bij het selecteren van de recipiënten, werd
geanalyseerd. Alle donoren werden gespoeld op dag 7 van de dracht. Vroege en late
morulae werden zoveel mogelijk getransplanteerd naar recipiënten die 12 of 24 uur
later dan de donoren in oestrus waren gekomen, terwijl late blastocysten en blasto-
31
32
T. VAN DER LENDE
cysten zonder zona pellucida zoveel mogelijk werden getransplanteerd naar recipiëntendie12of24uurvoordedonoreninoestruswarengeweest.Vroegeblastocysten
werdenzoveelmogelijksynchroon,datwilzeggennaardag7recipiënten,getransplanteerd. Uit dit onderzoek kon worden geconcludeerd dat selectie van vroege blastocysten voor synchronetransplantatie (oestri synchroon) envan vroegemorulae voor
transplantatie naar recipiënten die 12 of 24uur later inoestrus warengeweest dande
donoren,zinvolwas.Het bleekechter nietzinvolombij detransplantatie rekeningte
houdenmethetontwikkelingsstadium vandelatemorulae,lateblastocystenenblastocysten zonder zona pellucida.
Aangezien embryo's met een gelijk ontwikkelingsstadium kunnen worden aangetroffen indonoren diezichopverschillendetijdstippen na hetbeginvandeoestrus
bevinden, ishet eveneensvanbelangom teweten of de 'fitness' van een embryovan
eengegevenontwikkelingsstadium afhankelijk isvanhetdrachtigheidsstadium vande
koewaaruithetgespoeldis.Donaldson(1986)heeft ditonderzocht.Embryo'swerden
getransplanteerd naar recipiënten die niet meer dan 2dagen voor of na de donor in
oestruswarengeweest.Perontwikkelingsstadiumwasergeeneenduidigerelatietussen
hetdrachtigheidspercentagenatransplantatievanembryo'suit6tot8 dagendrachtige
donoren en de kans dat het betreffende ontwikkelingsstadium wordt aangetroffen,
beide uitgezet tegen het drachtigheidsstadium van de donoren. Behalve voor vroege
blastocysten komt uit dit onderzoek niet naar voren dat de 'fitness' van een embryo
hetgrootstisindienhetwordtgespoelduiteendonor diezichbevindtineendrachtigheidsstadium dat overeenkomt met degeschatte leeftijd van het embryo.
4.5 Conclusie
Met denu beschikbare gegevens ishet niet mogelijk om met zekerheid aan tegeven
of embryo-recipiënt-synchronisatie betere transplantatieresultaten zal geven dan
donor-recipiënt-synchronisatie. Evenals embryo's uit donoren die gelijktijdig in
oestruszijngeweestinontwikkelingsstadium kunnenverschillen,kanookdesecretiefase van het endometrium van recipiënten van hetzelfde cyclusstadium verschillen
doorverschillenindesnelheidwaarmeedeprogesteronconcentratieinhetbloedgedurende de eerste dagen na de ovulatie stijgt. Hiermee is tot op heden onvoldoende
rekening gehouden.
5 Embryoproduktie in vitro
Th.A.M. Kruip
5.1 Inleiding
De ontwikkeling van kunstmatige inseminatie (al of niet met diepvriessperma),
bronstsynchronisatie en embryotransplantatie in de afgelopen decennia heeft ertoe
geleid dat thans degenetische potentie van zowel mannelijke als vrouwelijke dieren
beterkanwordengeëxploiteerd ineensnelleuitvoeringvanspeciale fokprogramma's.
Hettempowordt alleennogbepaald door hetaantal embryo's datvaneenexcellente
vader en moeder kan worden verkregen.
Eicellenzijn inhetzoogdierovarium vanaf het foetale leveninhun rijping geblokkeerd. Pas bij het volwassen dier wordt deze blokkade kort vóór de ovulatie doorbroken en de rijpingsdeling voortgezet tot het stadium waarin de eicel kan worden
bevrucht. Het verloop van deze laatste rijpingsfase isvan essentieel belang voor de
bevruchting en embryonale ontwikkeling daarvan.
5.2 Eicelwinning bij hetrund
Bijhetrundkomterelke21 dagen(delengtevandetochtigheidscyclus)normaalmaar
ééneicelvrijbijdeovulatie.Tochzijneropalledagenvandecycluswel30tot 50follikelsmetelkééneicelindeeierstokkenaanwezig.Dezeeicellengaanviahetprocesvan
degeneratievangenoemdefollikels voortijdig tengronde.Geschatwordtdateropdie
manierelkecyclus80eicellenverlorengaanenermaaréénovuleertennabevruchting
uitkangroeientoteenembryo.Pogingenzijnderhalveondernomenomhetaantalfollikelsdatnormaaldegenereertviahormooninjecties zoveelmogelijktebehouden,hetgeen betekent dat meer follikels uiteindelijk kunnen overleven en ovuleren (superovulatie), en na bevruchting meer embryo's per cyclus worden verkregen.
Gemiddeld worden met debestevan denu gebruikte methoden 8-10 overzetbare
embryo's verkregen. Als we aannemen dat een dergelijke behandeling voor superovulatiebijééndierelketweemaandenherhaald kanworden,danzouditneerkomen
opcirca50goedeembryo'svanééndonorperjaar.Veelfundamenteelonderzoekblijft
geboden op dit gebied. Daarbij blijft overigens de vraag in hoeverre de bestaande
methodennogkunnenwordenverbeterd. Bijdeinductievansuperovulatieheeft men
immerstedoenmeteeneicel-donorwaarineenreeksvanhormonalebalansengemakkelijk verstoord kanraken,zodathettegenovergesteldewordtverkregenvanwatmen
beoogt. Daarom is ook geprobeerd grote aantallen eicellen die in het ovarium aanwezigzijn buiten hetlichaam tehalenvóórdat zeinhetprocesvan de follikeldegeneratie mede verloren gaan. Het moet mogelijk zijn per cyclus circa 30eicellen op die
33
34
TH.A.M. KRUIP
manier voor degeneratie te behoeden, hetgeen neerkomt op circa 450potentiële eicellen per jaar per donorkoe. Dit zijn dan nog wel onrijpe eicellen die buiten het
lichaam zodanig moeten worden behandeld dat zegoed rijpen ennabevruchting tot
eenembryoontwikkelen.Eenreëleschattinggeeft aandatcirca250embryo'sperjaar
per donor kunnen worden verkregen!
5.3 Vanonrijpe eicel tot embryo invitro
Deproduktie van embryo's uit onrijpe eicellen, samengevat onder detitel 'Embryoproduktie invitro' heeft niet alleen depotentiein zichomméér embryo's per ouderpaar perjaar televeren, hetbiedtbovendien mogelijkheden tot testenenmanipulatie
dieanders,zonietonmogelijk, dantochzeermoeilijkzoudenzijn,entotintensivering
van onderzoek naar een ongestoord verlopende embryogenese.
Embryoproduktie in vitro alsprogramma met elkaar opeenvolgende processenen
technieken betreft:
- het winnen en kwalificeren van onrijpe eicellen,
- de maturatie,
- de capacitatie van sperma,
- de bevruchting,
- de ontwikkeling van debevruchte eicel (zygote) tot overzetbare blastocyst,
- de kwaliteitsbeoordeling van embryo's en
- het niet-sexueelvermeerderen vanmorulae enblastocysten door middelvanklieven.
In het verlengde van deeicelmaturatie ligt demogelijkheid van:
- kloneren door middelvan kerntransplantatie viacelfusie vaneenblastomeer met
een kernloze rijpe eicel, en
- de genetische manipulatie (injectie van DNA-constructen in één van de twee
pronuclei van het zygotestadium).
Een dergelijk programma wint aan praktisch belang als het ten slotte kan terugvallen op mogelijkheden voor
- conserveren van gameten en embryo's in dediepvries.
5.3.1 Eicelwinning
Indeafgelopenjarenheeft menbij demensmetbetrekkingtot dein-vitro fertilisatie
(IVF; reageerbuis-baby's) de nodige ervaring opgedaan met het verzamelen van eicellen per punktie, aanvankelijk met behulp van laparoscopische technieken en onlangsonder echografische begeleidingvandezuignaald. Binnendebiotechnologiein
de dierlijke voortplanting is deze methode nog nauwelijks getest op zijn mogelijkheden. Bij het rund zal het neerkomen op het aanprikken van kleine follikels (4-8
mm)onderecho-begeleiding,viadevaginawand.Nagegaanwordthoevaakmendeze
manipulaties aan de eierstokken kan uitvoeren voordat er problemen ontstaan.
Gedacht kan worden aan adhesies rond de eierstokken ten gevolge van bloedingen
EMBRYOPRODUKTIE IN VITRO
waardoor punctie onmogelijk wordt of aan problemen van endocrinologische aard
waardoor de cyclus wordt verstoord.
5.3.2 Eicelrijping in vitro
Bij de eicelmaturatie in vitro, ongeacht of dit binnen de uitgeprepareerde follikels
geschiedt of daarbuiten, komt het erop aan dat aan de in-vivo geldende voorwaarden
wordt voldaan. Het onderzoek richt zich dus op:
- de selectie van follikels en/of cumulus-eicel complexen,
- het blijvend bijstellen van de kweekcondities,
- het vergaren van zoveel mogelijk parameters.
Doel is de hele procesgang zo nauwkeurig mogelijk te kunnen volgen, controleren
en zo nodig bij te sturen. Kwaliteitsbeoordeling van onrijpe en rijpe eicellen aan de
hand van morfologische, fysiologische en biochemische parameters is hierbij van
belang.
Uiteindelijk zullen de bevindingen vertaald moeten worden in een methode van
kwaliteitsbeoordeling dienietagressief magzijn voor deeicel.De 'goede' kwaliteit van
degerijpte eicel zal pas bewezen worden wanneer deze na bevruchting zich goed ontwikkelt tot een kalf. Recente resultaten elders (Lu et al, 1987;Xu et al., 1987; FayrerHosken etal., 1988)en degeboorte van kalfjes uit dein-vitrogematureerde en in-vitro
gefertiliseerde eicellen aan deFaculteit voor Diergeneeskunde teUtrecht (Kruip, 1988,
1989) geven aan dat embryoproduktie in vitro een reële alternatieve weg is binnen de
voortplanting van landbouwhuisdieren.
5.3.3 In-vitro capacitatie van sperma en in-vitro fertilisatie
Geëjaculeerd sperma isniet instaat eeneiceltebevruchten. Daartoe moet het sperma
een aantal veranderingen ondergaan, die samengevat worden onder de naam 'capacitatie'. Ofschoon de fundamenteel wetenschappelijke kennis omtrent dit proces nog
onvoldoendeisendusonderwerp vanveelonderzoek, zijn erinmiddels diverse 'praktische' methoden ontwikkeld om sperma zodanig te 'capaciteren' dat het in staat is tot
bevruchting invitro (Fulkaetal., 1982;Brackett et al., 1982;Bondioli &Wright, 1983;
Parrish et al., 1986). Uitgaande van in-vivo gerijpte en onlangs ook in-vitro gerijpte
eicellen zijn met deze 'praktische' methoden bevruchtingen verkregen die ook resulteerden in gezonde nakomelingen. Aan de hand van in-vitro gematureerde eicellen
moet het mogelijk zijn met deze capacitatiemethoden een homologe eicelpenetratietest op tezetten, waardoor gekeken kan worden naar derelatie tussen bepaalde zichtbare spermakenmerken en het bevruchtend vermogen van sperma van diverse herkomst en onder diverse omstandigheden. Spermapenetratie en vorming van een
mannelijke en vrouwelijke voorkern (pronucleus) kan daarbij als een positieve
bevruchtingstest worden geïnterpreteerd. Het percentage bevruchte eicellen in één test
iseen maat voor het bevruchtend vermogen van het sperma in dietest. Hoe groot het
aantal eicelleninééntest moet zijn omverschillen tussen dieren significant te kunnen
35
36
TH.A.M. KRUIP
aantonen, vormt een belangrijke vraag binnen een dergelijke test.
Bij dein-vitro maturatie en fertilisatie van eicellen moet men zich blijven realiseren
dat een beoordeling van beide deelaspecten bemoeilijkt wordt door de onwetendheid
welk aspect de zwakke schakel is voor het verkrijgen van het eindprodukt. Er is een
grootgevaarineenvicieuzecirkeltegeraken metdevragen of dekwaliteit vandeeicelrijping dan wel de kwaliteit van het gecapaciteerde sperma hieraan debet is. Wanneer
bij in-vitro fertilisatie geenresultaat wordt verkregen kan immers niet kortweg worden
gezegdof deeicelnietgoedgematureerd wasof dat hetspermanietgoed gecapaciteerd
was.En alserdan welbevruchting optreedt, maar geenverdereembryonale ontwikkeling, kan wederom aan de rijping van de eicel worden getwijfeld, maar ook aan de
kweekcondities waarin de bevruchte eicel als embryo moet groeien.
Op dit moment kan worden gesteld dat de eicelrijping en bevruchting buiten het
lichaam bij landbouwhuisdieren mogelijk is (Kruip &Van Beneden, 1987; Lu et al.,
1987; Goto et al., 1988). Het percentage eicellen dat na de kweek wordt bevrucht is
echter nog klein. Daarvan ontwikkelt zich in vitro ook maar een klein percentage tot
8-celligeembryo's.Deproblemen dieopgelost moeten worden, liggenindeselectievan
de eicellen (kwaliteitsbeoordeling) en in de kweekomstandigheden voor embryoontwikkeling.
5.3.4 Embryo-ontwikkeling tot het blastocyststadium
Voor een ongestoorde embryo-ontwikkeling in vitro moeten naar alle waarschijnlijkheid zeer specifieke factoren aan het medium worden toegevoegd. Deze factoren
worden in de eileider gesynthetiseerd, maar gebleken is dat ook trofoblastcellen van
13-14 dagen oude embryo's hiervoor kunnen zorgen. Het gaat om eiwitten met een
laag moleculairgewicht (hexapeptiden). Om te kunnen nagaan of een eenmaal gekozen medium de meest relevante factoren bezit, moet men er zeker van zijn dat de te
testen embryo's kunnen uitgroeien tot levensvatbare blastocysten. Dezevraag doetzich
ook voor wanneer een selectie moet worden gemaakt van de embryo's die bij de
superovulatie-inductie worden verkregen. In beide gevallen komt het neer op een
goede selectie van embryo's met behulp van een relevante kwaliteitsbeoordeling.
5.3.5 Kwaliteitsbeoordeling van embryo's
De praktijk van de embryotransplantatie heeft duidelijk laten zien dat na
superovulatie-inductie en na in-vitro maturatie en fertilisatie niet alle embryo's van
gelijke kwaliteit zijn. De testen diein het verleden zijn ontwikkeld voor de kwaliteitsbeoordeling vroegen om een lange kweektijd, hetgeen ten koste ging van de kwaliteit
van het embryo. Dit betekent overigens dat de kweekmedia niet optimaal zijn en
dringend vragen om nader onderzoek. Bedoelde langdurige testen zijn derhalve verlaten. Onlangs iseen ultramicrofluorescentie-methode ontwikkeld om te meten of en
hoeveel van een energiebron (bij voorbeeld pyruvaat of glucose) door een embryo
wordtgeconsumeerd (Leeseetal., 1986;Gardner &Leese, 1986).Ditwordt geïnterpre-
EMBRYOPRODUKTIE IN VITRO
teerd als een maat voor de levensvatbaarheid. Daarnaast zijn uit immunologisch
onderzoek aanwijzingen verkregen dat een goed embryo al heel vlug in staat is een
signaal af te geven dat moet zorgen voor een ongestoord verloop van haar ontwikkeling (O'Neill, 1985).Nagegaan moet worden wat deze nieuwe mogelijkheden en aanwijzingen voor de praktijk waard zijn.
5.3.6 Micromanipulaties
Wanneer hetuiteindelijk mogelijk isaan eenembryo het predicaat 'goed' tegeven, kan
het met veelsucces worden overgezet in de baarmoeder van een ontvangster. Wanneer
het echter een 'zeldzaam' embryo betreft kan reeds worden overwogen er meer
embryo's van te maken (klonen) door mechanisch klieven. Wanneer de afzonderlijke
delen in de kweek 4tot 6uur gelegenheid krijgen zichte herstellen van de 'operatie',
is de overlevingskans van halve embryo's bijna gelijkwaardig aan die van een intact
embryo.Dezemethode vergtvandeuitvoerder denodigetechnischevaardigheid. Deze
methode is ook duidelijk begrenst. Het is niet mogelijk om van één embryo er meer
dan vier te maken. Bij elke deling wordt de hoeveelheid (cel)materiaal gereduceerd.
Een achtste embryo heeft teweinig materiaal voor een ongestoord verlopende gastrulatie en Organogenese.
Een embryo klonen kan ook door middel van celfusie. Daarbij worden afzonderlijke blastomeren van de 'Inner CellMass' van het embryo gefuseerd met rijpe eicellen
diezich in het metafase-II-stadium bevinden. Vóór het inbrengen van een blastomeer
binnen de perivitelline-ruimte van de gerijpte eicel worden bij laatstgenoemde van
tevoren het eerste poollichaam en de achtergebleven metafaseplaat-chromosomen
verwijderd. Daarmee is het eigen DNA van de eicel weggenomen en kan het nieuwe
DNA afkomstig van een blastomeer van het te kloneren embryo in de eicel worden
gebracht via celfusie van blastomeer en eicel. Kernen van 8- en 16-cellige embryo's,
maar ook die van morulae, zijn met succes overgezet. Om te voorkomen dat de eicel
na de manipulatie (te beschouwen als activatie) alsnog een tweede rijpingsdeling wil
volvoeren, waardoor het DNA van de blastomeer gehalveerd zou worden, moet de
eicel gedurende één uur na de celfusie in contact blijven met een cytoskeletremmer.
Daarna treden normale klievingsdelingen of mitosen op. Onnodig te zeggen dat deze
technisch hoogstandjes voorlopig nog niet praktijkrijp zijn. In ieder geval laat deze
methode de hoeveelheid celmassa intact.
Micromanipulaties aan zygoten, dat wil zeggen aan bevruchte eicellen in het
pronucleus-stadium, kunnen bij voorbeeld ook inhouden dat vreemd DNA (vreemde
genen) aan het nieuwe individu wordt toegevoegd, meestal door injectie in de mannelijke pronucleus. Het lokaliseren van specifieke eigenschappen op het DNA, de isolatie, devermenigvuldiging enhet bestuderen van deexpressie na deinjectie inhet nieuwe individu is nog volop in onderzoek.
Wanneer embryo's gekliefd enweersamengevoegd kunnen worden, kan dit ook met
delenvandeverschillende embryo's vanééndiersoort entot opzekerehoogtezelfs van
verschillende diersoorten. Op deze wijze zijn reeds chimaeren van schaap/geit en
37
38
TH.A.M. KRUIP
geit/schaap gemaakt. De praktische betekenis mag dan vooralsnog onduidelijk zijn,
de wetenschappelijke implicaties zijn groot. Dit laatste geldt ook voor experimenten
waarbij door veranderingen inhetmilieu van derijpe eiceldezetot maagdelijke voortplanting wordt gedwongen, dat wilzeggen deling alshaploïde celzonder tussenkomst
van een spermatozoon (parthénogenèse), of na fusie met het eigen tweede poollichaamalshomozygoot diploid organisme.Bijdeviskunnen dergelijkeembryo'szich
ontwikkelen tot volwassen dieren. Bij zoogdieren ontwikkelen veel van dergelijke
embryo's zich tot blastocysten, slechts weinige komen tot het somietenstadium. Verdere ontwikkeling is nog niet waargenomen. Het is duidelijk dat deze nakomelingen
allemaal vrouwelijke dieren zijn (gynogenese). Bij zoogdieren is waarschijnlijk extra
genetisch paternaal materiaal nodig voor een ongestoord verlopende embryogenese.
5.3.7 Sexen en karyotyperen
Wanneer stukjes van een embryo kunnen worden verwijderd zonder dat dit nadelige
gevolgen heeft voor het embryo zelf, dan kunnen deze stukjes ook gebruikt worden
om, na celvermeerdering in kweek, de chromosomale samenstelling van het embryo
te bestuderen. Daarbij kan aan het licht komen of er chromosomale afwijkingen in
deveestapel voorkomen. Het spreekt vanzelf dat daarbij ook zichtbaar wordt wat het
geslacht is van het betreffende embryo. Ook door in-situ hybridisatie met Ychromosoom specifieke DNA-probes is het mogelijk op deze stukjes embryo, het
geslacht van het embryo zichtbaar te maken. Dezemethoden zijn echter niet geschikt
voor gebruik op het veebedrijf. Het isnodig een eenvoudiger test te ontwikkelen. Dit
wordt haalbaar geacht, omdat mannelijke embryo's zich onderscheiden van vrouwelijke embryo's door de aanwezigheid van het zogenaamde HY-antigeen op de celmembranen. Tegen dit HY-antigeen zijn antistoffen gemaakt, waarmee het gereedschap aanwezig is voor het uitvoeren van de test. In de praktijk blijkt deze test niet
optimaaltefunctioneren. Deproblemen worden veroorzaakt door aspecifieke binding
van de antilichamen aan het ei-kapsel van het betreffende embryo. Nader onderzoek
om deze randproblemen op te lossen blijft daarom geboden.
5.3.8 Diepvriezen van embryo's
Indien niet op het juiste moment draagmoeders beschikbaar zijn, of een te veel aan
embryo's wordt geproduceerd, moeten embryo's worden ingevroren enbewaard tot het
moment van transplantatie. Een stukje cryobiologisch onderzoek ter verbetering van
deinvriesprocedures voor embryo's, maar daarnaast ook van eicellen en spermacellen
is van wezenlijk belang. Als embryotransplantatie in de verre toekomst ooit een
volwaardige partner wil worden van de KI of deze zelfs wil vervangen, dan mag het
diepvriezen van embryo's geen risico voor verliesmeer inhouden. De meest praktische
methode voor deze doeleinden is het gebruik van diepvriezen in rietjes en geen nacontrole buiten het rietje. De controle op overleving na ontdooien van het embryo
geschiedt nog steeds. Daarvoor zijn twee redenen aan te geven:
EMBRYOPRODUKTIE IN VITRO
- door het embryo terug te brengen in schoon medium kan het bij het invriezen
gebruikte glycerine worden uitgewassen,
- deET-man heeft hierdoor ook demogelijke controle op de(morfologische) kwaliteit van het embryo.
Kennelijk zijn niet alle embryo's gelijkelijk geschikt voor invriezen! Eén en ander
houdt in dat er nog veel onderzoek moet worden verricht om de invriesmethoden te
verbeteren.
5.4 Conclusie
Samenvattend kan worden gesteld dat het programma 'Embryoproduktie in vitro'
langzaam vordert. Er isvoor de komendejaren nog veelonderzoek nodig ter verbetering van:
- het winnen, kwalificeren en tot rijping brengen van mannelijke en vrouwelijke
geslachtscellen buiten het lichaam ten dienste van de bevruchting in vitro,
- het kwalificeren van embryo's en ondersteunen van de embryonale ontwikkeling
in vitro tot aan het blastocyststadium,
- het klonen van embryo's,
- het uitvoeren van micromanipulaties voor de kwaliteitsverbetering van embryo's
(genetische manipulaties),
- het sexen van embryo's en/of spermacellen,
- het conserveren van gameten en embryo's.
Dit allesten dienstevaneenefficiënte voortplanting eneenzeer wendbare veefokkerij. Het spreekt vanzelf dat men ervoor moet zorgen eenzobreed mogelijk genetische
pool in de vorm van gameten en embryo's in de diepvries te bewaren. Met de hier
geschetste technieken en mogelijkheden kan 'genetische erosie' worden voorkomen.
39
6 Kwaliteitsbeoordeling van eicellen en embryo's
P. de Boer en M.L. Boerjan
6.1 Inleiding
Hetbegripembryokwaliteit kanmenvooraltegenkomen in(wetenschappelijke) literatuur over embryotransplantatie bij het rund en over in-vitro fertilisatie/embryotransplantatie bij de mens. Het woord is vooral ingegeven door de grote variatie in fenotypen van embryo's, die men bij beide soorten en procedures kan tegenkomen. De zo
op het uiterlijk bepaalde 'kwaliteit' blijkt welietste maken te hebben met het succes
van embryotransplantatie. Lindner & Wright (1983) vonden na het overzetten van
'excellente' embryo's 45 °/o drachtigheid (n = 292), van 'goede' embryo's 44 % (n =
292),van 'redelijke' embryo's27 % (n = 149)envan 'slechte' embryo's20 % drachtigheid (n = 50).Ook bij Markette et al. (1985)isiets dergelijks waar te nemen: 'slecht'
20 °/odrachtigheid (n = 19)en alle andere embryo's 67,4 % drachtigheid (n = 193).
Wat uit deze vrij grote series valt waar te nemen isdat uit 'slechte' embryo's kennelijk
toch nog kalveren geboren kunnen worden en dat in het boveneind van de kwaliteitsschaal morfologie en overlevingskansen niet meer correleren.
Inhet vervolgvan dithoofdstuk willen wij hetdaarom lieverhebben overdevariatie
in kenmerken tussen embryo's. Na elkaar zullen een aantal 'variatiebronnen' aan
beschrijvend of experimenteel onderzoek worden geïllustreerd. Hierdoor neemt het
begripvanwateenembryoistoe.Wezullenonszoveelmogelijk beperkentot een situatie van natuurlijke ovulatie en in-vivo bevruchting, en tot embryo's die nog omgeven
zijn door de zona pellucida, een laag van glycoproteïnen, die in de ovariële follikel
rond deeicelwordt aangelegd. Zowel demorula's (eenklompje van meer dan 8cellen)
en de jonge blastocysten (er is nu in het klompje cellen een holte gevormd), waaruit
het getransplanteerde materiaal, dat hierboven werd beschreven, bestond, zijn omgeven door een dergelijke zona.
In een situatie van natuurlijke ovulatie enin-vivobevruchting kan men debij zoogdieren, inclusief de mens, redelijk uniform optredende embryonale sterfte ook opvatten alseen uiting van de verschillen die er kennelijk tussen embryo's kunnen bestaan.
Schattingen van de omvang van de embryonale sterfte variëren van 25- 50 % bij de
mens,tot 2 0 - 4 0 % bij rund envarken, entot overwegend lagereniveaus( < 15 %) bij
delaboratoriumknagers (muis,rat, hamster, konijn). Natezijn ingegaan op mogelijke
oorzakenvandezevariatie,komeneenaantalaspectenvanembryo'swaaraan devariatiekanwordengemeten aan deorde.Tenslottewordt ereenblikgeworpen opdemogelijkheden van niet-destructieve methoden om embryo's te kunnen typeren.
40
KWALITEITSBEOORDELING VAN EICELLEN EN EMBRYO'S
6.2 Oorsprongvanvariatie
6.2.1 Eicelrijping en ovulatie
Hetisnietonlogischhierineenvariatiebrontenaanzienvandeoverlevingskansenvan
detoekomstigeconceptustezien.Deeiceldraagt aanzienlijk meerbij tot hetembryo
dan de zaadcel. De eicellen uit follikels met een holte (de rijpere follikels) zijn qua
diameter volgroeid en bevatten dooiermateriaal. Bij de muis is dit dooiermateriaal
doorzichtig.Bijrundenmensishetgranulairenbijhetvarkenkomtereenbelangrijke
hoeveelheid vetinvoor. Het procesvan follikelrijping, dat uiteindelijk leidt tot ovulatievanéénofmeerfollikels,gaatookgepaardmetfollikelselectie. Bijdemuisvindt
dezeselectietweedagenvoor deovulatieplaats.Doorsuperovulatiemethetbekende
PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotrophin) wordt er eigenlijk in deze selectieprocedure ingegrepen en groeien er ook meer follikels door.
De geselecteerde populatie (of de geselecteerde follikel bij soorten met eenlinggeboorten) wordt daarna gevoelig voor hoge concentraties van het gopadotrope
hormoon LH (luteïnisatiehormoon, de werking ervan kan worden nagebootst door
hCG,humaanchoriongonadotropineuiturinevandeactie'moedersvoormoeders').
Danveranderendefuncties vandeeicel,andereeiwittenwordengemaakt endekernwandverdwijnt. Deeerstemeiotischedelingwordtafgemaakt enaandetweedewordt
begonnen.Defollikel zelftoontvoorennadeLH-piek eenveranderingindesteroïdhormoonproduktie.
Vandeandrogeenproduktie, dieeerstbelangrijk was,verschuift hetaccent naarde
oestrogeenproduktie (uit de androgenen), terwijl er ten slotte (na de LH-piek)
progesterongemaaktgaatworden(defollikelgaatluteïniseren).Experimenteelisaangetoonddat veranderingeninhetpatroonvanfollikelgroei enfollikelfunctie effecten
hebben ophetbevruchtingsproces endeaansluitende embryonale ontwikkeling.Om
dezerelatietewaarderenishetnodiginteziendat eicelenfollikel afhankelijk vanelkaarzijn,alhoewelwebetergeïnformeerd zijnoverdeaardvandeafhankelijkheid van
deeicel (energie, bouwstenen, het stabiliseren van het ontwikkelingsstadium van de
kern)danvandeafhankelijkheid vandefollikel (welkesignalen geeft deeicelaf aan
z'n omgeving).
Mooretal.(1985)bestudeerden deSteroidhormonen endeeiwitsyntheseindeeicel
vanfollikels vanhet schaapdiewerdengestimuleerd metPMSG.Afhankelijk vande
dosisvandithormoonkon25- 30 %vandefollikels gaanafwijken waarbijveranderingen, dienormaal pasna deLH-piek indeeiceloptreden, tevroegwerdengeïnduceerd. Ook hadden deze follikels te hoge oestrogeengehalten. Bekend is dat de
embryonale sterfte na ovulatie van een door PMSG 'geselecteerde' follikelpopulatie
is verhoogd.
Eenandervoorbeeldkomtuitdehumanein-vitrofertilisatie-praktijk. IneenexperimentvanTempletonetal.(1986)werdenvrouwen(mettoestemming)ingespotenmet
clomifeencitraat om een superovulatierespons te induceren. Ovulatie werd ingeleid
door hCG.Dekansopeiceldelingnadebevruchtinghieldvooralverband metdever-
41
42
P. DE BOER EN M.L. BOERJAN
houding tussen androgenen en oestrogenen in de follikel waaruit de eicel operatief
werd gewonnen. Hoe minder oestrogenen, hoe 'onrijper' de follikel was,en hoe geringer de kans op deling na de bevruchting was, terwijl morfologisch de eicelrijping,
nodig voor de bevruchting, normaal was verlopen.
Deze voorbeelden dienen om te illustreren dat follikelrijping en de mogelijkheden
van een daarop volgende embryonale ontwikkeling met elkaar samenhangende
processen zijn.
6.2.2 Spermatozoa als een oorzaak van embryovariatie
Alhoewel oorspronkelijk de bijdrage van de mannelijke gameet aan de embryonale
sterfte isoverschat (Bishop, 1964),zijn erindeliteratuur welillustraties vandezeroute
voorhanden. Shaver & Yanagimachi (1978) verouderden spermatozoa van de goudhamster invitro, nadat alwasgevonden dat veroudering van spermatozoa inhet vrouwelijk geslachtsapparaat kon leiden tot verhoogde frequenties van bevruchtingsfouten, vertraagde embryonale ontwikkeling en verhoogde postimplantoire sterfte
(onderzoek bij voornamelijk het konijn). Ook dein-vitro veroudering van sperma van
degoudhamster leiddetotverhoogdesterfte nadebevruchting, vaakveroorzaakt door
afwijkingen in het chromosomental van het embryo.
De chromosomenset van spermatozoa draagt op een bijzondere manier bij aan de
embryonale ontwikkeling. Zonder 'mannelijke' chromosomen in het embryo kunnen
de embryonale membranen (het embryonale gedeelte van de placenta) zich niet goed
ontwikkelen. Tijdens de zaadcelvorming is er een set van genen, betrokken bij de
ontwikkeling van de embryonale membranen, die op een bijzondere manier in de
chromosomen wordt verpakt en op die manier hun functie kan volbrengen. Men kan
zichvoorstellen datwanneer dezegenennietgoedworden 'geprogrammeerd' zetijdens
de embryonale ontwikkeling 'niet goed werken', wat leidt tot embryonale sterfte.
6.2.3 Condities rond de bevruchting
Bij dezoogdieren moet hetvoortplantingsgedrag ervoor zorgen dat degameten elkaar
inoptimaleconditieontmoeten. Heelbekend is,datgeovuleerdeeicelleninhet oviduct
eeneindiglevenhebben. Hetvermogen ombevrucht teworden raakt laterverloren dan
het vermogen van de eicel een normale embryonale ontwikkeling te ondersteunen. Te
late bevruchting leidt altijd tot eenverhoogde embryonale sterfte (Marston &Chang,
1964; Hunter, 1967). Soms kan deze extra sterfte een genetische achtergrond hebben
doordat twee of meer spermatozoa de eicel konden bevruchten (Polyspermie).
6.2.4 Toestand van de maternale tractus
Het belang van de maternale tractus voor de ontwikkeling van preïmplantoire
embryo's is al gedemonstreerd aan de nauwe relatie die er tussen de positie van het
embryo binnen oviduct en uterus, en het ontwikkelingsstadium bestaat. Zowel uit
KWALITEITSBEOORDELING VAN EICELLEN EN EMBRYO'S
43
beschrijvend alsexperimenteel onderzoek isover debelangrijkste momenten vande
wisselwerkingtussenembryoenmaternaalmilieunognietzoveelinzichtbeschikbaar.
Datdematernaletractusdevariatietussenembryo'skanvergrotenmoetenwedaarom
hier ook meer als een principe aannemen.
6.3 Celbiologische kapstokken omdevariatie tussenembryo'saanop tehangen
6.3.1 Genotypevanhetembryo ende variatie in overlevingskans
Onder dezekopzullenweons nietbezighouden met kwantitatief genetische variatie
endekansen opoverleven,maar metdekwalitatievegenetischevariatie.Diekanook
geformuleerd worden als: hoeveel procent van de totale embryonale sterfte wordt
veroorzaaktdoordominantenrecessiefoverervendegenetischefactoren. Wanneerhet
gaat om de dominant overervende betreft het altijd genetische effecten die aan het
chromosoomaantal(eneenheelenkelekeerdechromosoomvorm)teconstaterenzijn.
Dezekunnen eventueel ook tijdens envlak na debevruchting ontstaan (par. 6.2.2en
6.2.3).Tabel 5geeft hiervan een overzicht. Het blijkt dat voor demeeste zoogdieren
defrequentie van chromosomale afwijkingen vlak na debevruchting niet echt hoog
is, alhoewel zewelconsequent bij allesoorten worden aangetroffen. Demens ishier
eenuitzondering:inongeveerdehelft vandespontaneabortussen(circa 15%vanhet
aantal 'herkende' zwangerschappen) wordt een 'chromosoomafwijking', weervooral
het aantal betreffende, gevonden.
Tabel 5. Chromosoomafwijkingen in een aantal embryo's van verschillende zoogdiersoorten (De Boer et
al., 1986).
Soort
Muis
Chinese hamster
Konijn
Schaap
Rund
Varken'1
Mens0
a.
b.
c.
d.
e.
Stadium
1-cellig
4-8 cellen
blastocyst (5 dagen)
2-8 cellen
blastocyst (12-15 dagen)
morula, jonge blastocyst
(ca. 50 cellen)
geïnduceerde abortussen
(4-14 weken)
Aantal
embryo's
Aneuploïdie"
ploidie1
Poly-
(%)
(Vo)
840
226
463
89
159
1,4
0,9
0,9
4,7
1,8 (n =
3,1
1,7
—
—
82
728
Mixoplo'idie'
0,6
1,3
1,1
1,2
3,2
4,0
3,9
5,8
1,8
—
1,2
1,2
2,4
1,8
1,0
—
2,8
Embryo's hebben één of enkele chromosomen te veel of te weinig
Embryo's hebben één of meerdere chromosoomtest (genomen) te veel
In een deel van de cellen van het embryo is er sprake van Polyploidie
Resultaten van Van der Hoeven et al., 1985
De frequentie hangt sterk af van het embryonale stadium: hoe eerder hoe hoger.
228) —
Totaal
(%)
—
44
P. DE BOER EN M.L. BOERJAN
Recessief letale factoren zijn veelzeldzamer. Bij demuis neemt men aan dat 5%
van de populatie drager is van een recessieve mutatie, die, wanneer homozygoot,
embryonale sterfte veroorzaakt. Aangezien er veel genen moeten zijn, die op die
manier recessief kunnen muteren, en beide partners de mutatie op hetzelfde gen
moeten hebben (dan iser25 % embryonale sterfte), draagt dit maar heelweinig bij
tot detotale embryonale sterfte.
6.3.2 Variatie incelaantal tijdensde vroeg-embryonale ontwikkeling
Het ligt voor dehand hieraan deontwikkelingspotentie van demeercellige embryo's
temeten.Gekgenoegiserweinigtelwerkaancelaantallenvanpopulatiespreïmplantoireembryo'sverricht.Bijdemuis(3dagenoudeembryo's)enbijderat(4dagenoude
embryo's)isdevariatieincelaantalaanzienlijk. Devariatieiszoweltussenalsbinnen
moeders tevinden. Bij demuis bedroeg het aantal cellen 39 ± 12,5met een variatie
van 21-67 cellen (89embryo's). Bij derat waren dezegetallen 34 ± 10cellen eneen
variatievan 14-55cellen(95 embryo's,onderzoekvandewerkgroep 'VroegeDracht',
LUW). Bij deinterpretatie van deze gegevens moet men welbedenken dat, vertaald
inuren (of deduur van decelcyclus), dit wat dramatischer lijkt dan het is, omdat in
dezejongeembryo's decellennogvoornamelijk insynchroniemetelkaar delen.Tussenbijvoorbeeld8en32cellen(of 16en64cellen)hoeft nietveelmeerverschiltezitten
dan de duur van 1 celcyclus.
Overigensishetniveauvandeembryonalesterftebijlaboratoriumdieren, envooral
dehiergebruikterattestam,laag(muis15 %;rat7,5-10 %).Bijhetvarkeniseenminder groot materiaal bekeken en hier viel vooral de tussen-dier variatie op. Decelaantallenwerdenbepaaldnaeendagkwekeninvitroinaanwezigheidvaneenhelelage
concentratie van een stof die deceldelingen remt. Debij spoelen 3dagen oude embryo's hadden gemiddeld 40,5 ± 26,8cellen (56embryo's) en debij spoelen 4dagen
oude embryo's hadden gemiddeld 58,0 ± 29,3cellen (41embryo's; Van der Hoeven
etal., 1985). Grotevariatiedus,ookbinnendeworpen.Interessantzijn deheelrecente
gegevensvandrs.M.Dorland vandevakgroepFunctioneleMorfologie, Faculteitder
Diergeneeskunde,RUU.Hijdeelde7dagenouderunderembryo'sinvolgensdemorfologie criteria van Lindner &Wright (1983), waarvan detransplantatieresultaten per
'morfologiescore' inparagraaf6.1 staanvermeld.Deceltellingenvertoondenongeveer
dezelfde trend als zichtbaar in de transplantatie-experimenten. De 'excellente' en
'goede' embryo's verschilden niet veel en telden ongeveer 120cellen. De 'redelijke'
embryo's warenmetcirca95cellenwatminder verontwikkeld, terwijl deslechteembryo'sgemiddeld slechts50cellentelden.Dezegetallentonenaandaterweleenpositievecorrelatie moet zijn tussen depreïmplantoire groei van het embryo en de kans
opoverleven,maardataandeanderekanteenontwikkelingsachterstand opdag7een
verdereembryonaleontwikkelingnietuitsluit.Ookuitdemuize-enrattegegevenskon
deze conclusie al getrokken worden.
KWALITEITSBEOORDELING VAN EICELLEN EN EMBRYO'S
6.3.3 Functionelevariatie binnengroepen embryo's,anders dan tot uitdrukking
komend inhet celaantal
Microtechniekenindeembryologiezijnnuzoverontwikkelddatfunctionele aspecten
vanembryo'szoalsdestofwisseling endeeiwitsyntheseperindividu gemeten kunnen
worden.Bijhetbekijkenvandestofwisseling maaktmengebruikvanradioactiefgelabeld melkzuur en glucose als voedingsstoffen en meet men het dan ook radioactief
wordende afvalprodukt C0 2 vanieder embryo afzonderlijk. Ook ishet mogelijk de
afname vanpyruvaatenglucoseinmicrodruppelskweekmediumtebepalen,zodatde
consumptieperindividueelembryovandezetweeenergiedragersgemetenkanworden
(Gardner&Leese,1986). Alshetgaatomdeeiwitsynthese,wordenembryo's(ingroepjes)opgekweektinmediumdateenradioactief gelabeldaminozuurbevat.Dieeiwitten
waarinditradioactief gelabeldeaminozuurwordtingebouwdkunnenna elektroforese
doordetectievandestralingopeenfotografische film zichtbaar wordengemaakt.De
techniekiszogevoelig,datditperindividueel embryokan,enisdezelfde alsgebruikt
voor het karakteriseren van eicellen uit follikels in verschillende stadia (Moor etal.,
1985,inparagraaf 6.2.1).Een kwantitatieve toepassing van dezetechnieken inproefsituatiesdieveelenweinigembryonalesterfte opleverenisdeauteursnietbekend.De
standaardafwijkingen van de pyruvaat- en glucoseconsumptie (6 embryo's per stadium)vandejongeklievingsstadia (2-,4-en8-celligemuizeëmbryo's) zijn niet groot.
Destandaardafwijking vandeglucoseconsumptievanmuizeblastocysten (8 embryo's)
lijkt ietsgroter.Ditisonderzoek datzichindebeginfase bevindt,zodatdewaardeervan als vitaliteitsparameter nog niet kan worden geschat.
Hetisnietmoeilijkintezien,daternogveelmeercellulaireparametersteverzinnen
zijn, waaraan het functioneren van embryo's en devariatie tussen embryo's teillustreren is.Tedenken valt aan soliditeit van decelwand en demembraanstructuren in
decellenzelf (bijvoorbeeld demitochondriën), of kenmerken alsdecellulairepHen
hetglutathion-metabolisme. Metbetrekking tot hetbelangvanvariatieindezeparametersvoor deontwikkelingskansen van het embryo staat deembryologie nog inde
kinderschoenen.
6.4 Non-agressieve kleurmethoden omembryokwaliteit tevoorspellen
Een oude kleurmethode diedeintegriteit van decelwand meet, isde trypaanblauwexclusietest. Wanneer decelwand beschadigd is,zoalsbij verkeerd uitgevoerdecryopreservatie,kantrypaanblauw decellenvanhetembryobinnendringenenwordtkleuringverkregen. Op eenzelfde principe berust kleuring met de fluorescerende DNAkleurstof DAPI. Wanneer hiermee kleuring van runderembryo's werd verkregen,
konden na in-vitro kweek geen celdelingen meer worden waargenomen (Schilling et
al., 1979). ZowelderesultatenvankleuringenmettrypaanblauwalsmetDAPIcorreleren met de resultaten van kleuringen met fluoresceïnediacetaat (FDA). De kleuring
metdezestofberustoptweeprincipes.FDAkandecelwandpasseren,waarnahetdoor
inhet cytoplasma aanwezige esteraseswordt gesplitst in fluoresceïne enacetaat. Het
L
45
46
P. DE BOER EN M.L. BOERJAN
fluoresceïne verlaat gezonde cellen maar langzaam en isaan te tonen met de fluorescentiemicroscoop. Voor het verkrijgen vanfluorescentieis het dus nodig, dat het
cytoplasma esteraseactiviteit heeft endat decelwand intact is,zodat de fluorescentie
nietkanontsnappen.VandeFDA-methodeisbekend,datopdezemanieraangekleurde muizeëmbryo's na transplantatie in draagmoeders uit konden groeien tot foeten.
Eveneensisbekenddat,althansbijdemuis,defluorescentienogalkanvariëren(Mohr
&Trounson, 1980).Renardetal.(1982)kleurden 846-7 dagenouderunderembryo's
metdezemethodeenverkregengeenbetereschattingvande'kwaliteit' dan morfologisch.
6.5 Conclusies
I
Variatietussenembryo'sheeftveelfacetten,zowelquaoorsprongalsquauitingsvorm.
In dit hoofdstuk isgeprobeerd er hiervan een aantal te belichten. Op celbiologischgenetischniveauishetinzichtinderelatietussenuitingenvanvariatieenoverlevingskansen van het embryo nog niet ergver ontwikkeld.
Experimenten, ontworpenomhiereenbeterinzichtinteverkrijgen, zijn nauwelijks
indeliteratuurvoorhanden.Hetisechterverheugendomteconstaterendatditonderzoeksgebied welin beweging is,vooral door deopkomst van micromethoden, waardooraanindividueleeicellenenembryo'smetingenverrichtkunnenworden.Wewillen
echter waarschuwen voor een altemathematische benadering vandezematerie.Uiteindelijkgaathetomdevraagwatindevroegsteembryonalestadia,envlakdaarvoor,
leven is en waarom leven in stand blijft.
7 Embryoproduktie en embryomanipulatie in een foktechnisch
perspectief
J. Jansen
7.1 Inleiding
In de huidige situatie is de belangrijkste toepassing van embryotransplantatie (ET)
momenteel gelegen in de import van diepvriesembryo's uit vooral de USA. Dit is de
laatste jaren vooral sterk geïntensifeerd, toen bleek dat het vrouwelijk topmateriaal
uit West-Europa nog niet kon concurreren met de stiermoeders uit de USA. Behoudens een enkele uitschieter bleven en blijven de in West-Europa gefokte stieren te ver
achter bij de top in de USA.
Ook deinNederland enWest-Duitsland gefokte stieren komen merendeelsvoort uit
ET.Evenals in de USA gaat het daarbij niet om zoveel mogelijk stiertjes uit een stiermoeder te verkrijgen (maximale benutting), maar om één (en niet meer) stier uit een
stiermoeder in te zetten in KI-verband. Andere organisaties kunnen natuurlijk hun
oog ook op de betreffende stiermoeder laten vallen, zodat van de beste stiermoeders
toch vaak enkele stieren worden getest.
Ook uit pinken en eerste-kalfs-dieren geboren stieren worden getest. ET is hierbij
geen regel. Bij pinken is alleen een afstammingsindex bekend en verder niets, zodat
er al genoeg risico's genomen worden. Bij vaarzen streven we ernaar dat ze eerst een
normale lijst realiseren, zodat dekwaliteit van de berekende koe-index zo goed mogelijk is. Bij de selectie van de stiermoeders is de afstammingindex (0,5 x fokwaarde
vader + 0,25 x fokwaarde grootvader aan moederskant + eventueel 0,125 x fokwaarde overgrootvader moederskant) van groot belang geworden. Gebleken is dat de
voorspellende waarde van de afstammingsindex even groot is als van de koe-index.
Aan beide worden nu hoge eisen gesteld. Door de eisen ten aanzien van de produktie
verder op tevoeren wordt het potentieel steeds kleiner, waardoor ET automatisch een
noodzaak is. Anderzijds maakt ET het ook mogelijk deze eisen verder op te voeren.
Op ditmoment zittenweaan debovengrens van onzemogelijkheden. Er zijn teweinig
stiermoeders met een kwalitatief goede afstammingsindex. Verder worden we gehinderddoortechnischebeperkingen. Teveelgoedestiermoederszijn ongeschikt voor ET
of leveren geen of slechts één embryo (ongeveer een derde deel).
Tweebelangrijke redenen dienen zich aan om het huidige systeem te heroverwegen.
Het eerste betreft de wellicht toenemende onzuiverheid van fokwaardeschatting bij
potentiële stiermoeders door voorkeursbehandeling. Potentiële stiermoeders zijn zelf
ook vaak uit ET voortgekomen en/of uit deUSA geïmporteerd, waarvoor nogal eens
een forse investering nodig was. Dit brengt alleen rendement op als er voldoende fok47
48 J. JANSEN
materiaal van deze beesten verkocht kan worden, met name aan collega's. Vanzelfsprekendwordterdanookextraverzorgingaangewendomeengoedeopfok, produktieenexterieur bij dezedierenveiligtestellen.Hierdoor wordt dewaardevan devergelijking met tijdgenoten aangetast. Het al dan niet legaal aanwenden van BSTzou
deonzuiverheid innogsterkerematebeïnvloeden. Hettestenvanstiermoeders onder
gestandaardiseerde omstandigheden zou dit probleem kunnen oplossen.
Eentweedefactor betreft deopafzienbaretermijnteverwachtendoorbraken ophet
gebied van embryoproduktie en -manipulatie, zodat er in een periode van enkele
maandeneen50tot 100embryo'sperkoetewinnenzijn. Ditzalkunnenleidentoteen
verregaandeveranderingindeopzetvan fokprogramma's, analoog aan desituatiein
devarkensfokkerij. Zou ookhet sexenvanembryo'sdaarbij gemeengoed zijngeworden,danzaltevensdestructuur vandemelk-envleesproduktiedrastisch veranderen.
Voordatweingaan opeenmogelijkeuitwerking,zullenweeerstingaan opdeconsequenties van ET voor de fokwaardeschatting.
7.2 Waardetoegevoegde informatie
Met ET kan men debeschikking krijgen over groepen van vollezusters. Toepassing
van splitsen of klonen levert volledig identieke individuen op. Benutting van deze
informatie kandebetrouwbaarheidvanfokwaardeschatting verhogenenwellichtook
dezuiverheidbevorderen. Intabel6zijn enkelealternatieven voor melkproduktie bij
koeien aangegeven. Telkens is de vader- en moedersvader-informatie benut en de
verwanten hebben telkens op verschillende bedrijven geproduceerd omgeenmilieucorrelatietekrijgen.Deeigenlijstvanhetbeestisnietmeegenomen.Deerfelijkheidsgraad isop0,25gesteld (tabel6).Uitdecijfers volgtdathetgebruik vanvolle-zusterinformatie debetrouwbaarheidmaarbetrekkelijk verhoogt.Toevoegingvaninformatievan volle-zuster-nakomelingen, wat bij oudere koeien een mogelijkheid is,levert
meerop.Echterhetmeestinteressantishetschattenvandefokwaardemetbehulpvan
eenkloon.Danbereikenweeenniveaudatookbijstierenbereiktwordt.Hetbenutten
van deinformatie van een kloon isvergelijkbaar met een aantal lijsten van het dier
Tabel 6. Toename betrouwbaarheid fokwaardes koeien bij benutting sibinformatie.
Aantal sibs
Volle zusters
Zowel volle zusters en
volle zuster nakomelingen'"
Kloon
0
510
25
0,23
0,31
0,36
0,41
0,23
0,41
0,49
0,57
0,23
0,53
0,77
0,89
a. Hettotaleaantalistweemaalhetaantalpergroep.Bij5 bijvoorbeeld zijn
er zowel 5volle zusters als 5vollezuster nakomelingen.
EMBRYOPRODUKTIE EN EMBRYOMANIPULATIE
Tabel 7. Betrouwbaarheid fokwaardes stieren.
Aantal sibs
Volle zusters en
volle zuster nakomelingen*
0
5
10
25
50
100
0,23
0,41
0,49
0,57
—
—
Half zuster nakomelingen
0,23
0,30
0,43
0,66
0,78
0,87
a. Zie tabel 6.
zelf.Dezuiverheidzalechtergroterzijn, daarpermanentemilieueffecten veelminder
eenrolkunnenspelen.Wedienenoverigenstebedenkendathetverkrijgenvan25volle
zustersaleengigantischehoeveelheidembryo'sperkoevraagt.Slechtsdehelft isvrouwelijk, enwehebbendrachtigheids-enopfokverliezen. Een vermenigvuldigingsfactor
van 5is een goede vuistregel.
Bij destieren gelden dezelfde resultaten wat betreft debenutting vanvolle-zusterinformatie, maar klonen levert natuurlijk niets op. Nakomelingenonderzoek met
halfzuster-groepen blijft daar geboden om hogebetrouwbaarheden te realiseren, en
isookveelefficiënter danvolle-zuster-nakomelingengroepen(tabel7).Ditkomtdoordatiederenieuwevollezuster relatief weinignieuweinformatie toevoegt (sterkgecorreleerdaan deoorspronkelijkeinformatie). Bijhalf sibsisditniethetgeval(tabel7).
7.3 Alternatieve fokprogramma's
Verschillende onderzoekers hebben aangegeven dat benutting van ET in de huidige
fokprogramma's de genetische vooruitgang zou kunnen versnellen met ongeveer
10-15 % (Christensen & Liboriussen, 1986).Door Nicholas & Smith (1983)isvoorgestelddestructuurvandehuidigefokprogramma's drastischtewijzigen, zodanigdat
er aanmerkelijk kortere generatie-intervallen gerealiseerd worden. In demeest optimalesituatiezoudenalleenpinkeneneerste-lactatiedierenbenutworden,ennakomelingenonderzoek bij stieren zouvervallen. Het fokprogramma van Premier Breeders
inGrootBrittanniëheeft dezeopzet.Eendergelijk programma zou 30 %meervooruitgang opleveren dan op dit moment het gevalis.
Er zijn zowel theoretische alsook praktische bezwaren tegen een dergelijke opzet
aantevoeren.Heteerstebetreft dewaardevandeeigeninformatie verzameldaanhet
dierzelf.Ditisaleerderaandeordegeweest.Verderishetdevraagof dedeterministische modellen waarmee dergelijke programma's worden doorgerekend, wel toereikendzijn (deterministisch: deformule vanRendel&Robertson, 1950).Erzijn drie
oorzaken waarom devooruitgang altijd minder isdan met dezemodellen voorspeld
wordt.
49
50 J. JANSEN
I
- Wehebbenmetkleineaantallentemaken,waardoordewettenvannormaliteitniet
meer opgaan. Met benaderingsformules isdit probleem echter nog welte omzeilen.
- Dereductieingenetischevariatielaatzichdestehardergeldennaarmateersterker
geselecteerd wordt.
- Strenge selectie brengt een familiestructuur met zich mee, zodat de wetten van
normaliteit niet meer gelden.
Delaatstetweeoorzakenzijnnietmeermetdeterministischemodellenoptelossen.
Daarvoormoethetfokprogramma echtopdierniveaugesimuleerdworden.Eenstudie
vanGroot (1984),waarin dit welgeschiedde, lietzien dat deversnelling door toepassingvanETrelatiefwelindeordevan3-13 °7oligt,maarabsoluutopeenlagerniveau.
Verderbleekhet korte-generatieinterval-programmaalsvoorgesteld door Nicholas &
Smith(1983)minderopteleverendanwanneergewoondebestestiermoedersgebruikt
werden ongeacht leeftijd. Daarmee komen wedirect op het praktische probleem. In
depraktijk werkenwemetgeschattefokwaarden. Wedienendebestetegebruikenals
ouderdier, ongeacht leeftijd enbetrouwbaarheid (!).Naarmatedegenetischevooruitganggroter iszullen er relatief meerjongedieren bij zitten, maar erzijn nog steeds
ouderestierenenkoeiendieeenconcurrerendefokwaarde hebben.Dateenaantaldan
nietmeergebruiktwordt,heeft meertemakenmethetfeitdateralgenoegzonenvan
deze combinaties ingezet zijn, dan dat het generatie-interval te lang zou worden.
Een ander praktisch punt is dat we een voldoende hoge betrouwbaarheid nodig
hebbenomdebestetekunnenontdekken.Omdezeredenzullenstierengetestviavolle
zusters en volle-zuster-nakomelingengroepen nooit kunnen concurreren met dehuidigetopstieren. Derhalve kunnen zenietverkocht wordenof wordenzeniet gebruikt
door deveehouder. Natuurlijk zitten er onder destieren enkele dieren diebeter zijn
dan debestediewenuhebben, maarwewetennietwelke.Afzet vansperma lukt pas
alshet nucleusbedrijf eenvoorsprong heeft weten optebouwen ten opzichte vande
beste ouderdieren in derest van depopulatie. Dat devorming van nucleusbedrijven
indevarkens-enpluimveehouderij welgeluktis,komtenerzijdsdoordat fokbedrijven
dezevoorsprong welhebben weten optebouwen, enanderzijds waser de noodzaak
tot integratie in de keten vanwegeziekte-insleep en kruising. Een opzet van nucleusvermeerderaar-producent kon derhalve veel eenvoudiger gerealiseerd worden. Ten
slotte is dereproduktiecapaciteit van deindividuele beer of haan niet te vergelijken
met die vande stier. Met toepassing van verssperma zijn 60000eerste inseminaties
alleszinsredelijk terealiseren. Inzo'ngevalishetnietalleennoodzakelijk dat mende
bestegebruikt, maar evenzeerishet nodigtegenvallers zoveelmogelijk te vermijden.
Voor dat laatste is een zekere betrouwbaarheid van belang.
7.4 Toetsbedrijven
Gezien het voorgaande is het de vraag of de vorming van nucleusbedrijven op dit
momenttoteensterkeregenetischevooruitgangleidt.Tochkanhetnodigzijnopkorte
termijnovertegaantothetopzettenvantoetsbedrijven dietezijnertijd wellichtzouden
kunnenuitgroeientotnucleusbedrijven. DeKI-organisatiesinNederland beschikken
EMBRYOPRODUKTIE EN EMBRYOMANIPULATIE
met de import van embryo's uit de USA namelijk over het beste potentieel, ook aan
de vrouwelijke kant, maar verkopen de vaarskalveren tot nu toe. Dit is echter wel de
groep waaruit verreweg de meeste stiermoeders zullen komen. De aanleiding tot de
vorming van toetsbedrijven is dan ook meer gelegen in de problematiek van de voorkeursbehandeling van deze potentiële stiermoeders, al dan niet in combinatie met het
gebruik van BST, dan in het bereiken van een grotere vooruitgang. Dat laatste wordt
wellicht als neveneffect bereikt. Het isechter geen logisch gevolg. Weliswaar wordt de
kwaliteit vandefokwaardeschatting beterwanneer deeventuelestiermoeders meer onder uniforme omstandigheden opgroeien en produceren, maar het blijft de vraag of
de rangorde onder praktijkomstandigheden exact dezelfde zou zijn. Genotypemilieuinteractie kan hier aardig de zaak vertroebelen. Dit kan beperkt worden door
niet één maar verschillende bedrijven met het testen van stiermoeders te belasten. In
feite doet zichdezelfde problematiek voor bij hettestenvanstierenop contractbedrijven.
7.5 Sexen van embryo's
Het effect van het sexen van embryo's op de genetische vooruitgang dient evenals dat
van klonen en ET, in het algemeen bezien teworden inhet licht van de selectieproblematiek van stiermoeders. Hoewel door Foote &Miller (1971,in: Van Vleck, 1986)een
grote versnelling van de genetische vooruitgang voorzien werd, kan verwacht worden
dat dit verwaarloosbaar is. Sexen van embryo's leidt momenteel niet tot een sterkere
selectie bij de stiermoeders. Sexen in combinatie met in-vitro fertilisatie leidt echter
tot een grote verandering in de opzet van de vervanging van melkvee. In een gedeelte
van de veestapel zullen vrouwelijke 'melk' embryo's geïmplanteerd worden, in het
overige deel (70 %) zullen 'vlees' embryo's ingezet worden. Enerzijds kan men dus
beschikken over zuiver vleesvee voor de vleesproduktie in plaats van kruisingsdieren,
anderzijds kan een veel groter deel van de geboren kalveren bestaan uit vleesvee. De
meerwaarde vanvleesembryo's tenopzichtevankruisingskalveren ligtongeveer tussen
deƒ 350,- totƒ 500,- , terwijl de kostprijs ligt op ongeveer ƒ 500,- . Economisch
is de produktie van vleesembryo's dus nog niet haalbaar, daar er twee embryo's per
dracht nodig zijn.
De meerwaarde van melkembryo's ten opzichte van sperma isgemiddeld veel lager
dan ƒ 500,- . Het is zelfs de vraag of deze ligt tussen de/ 250,- enƒ 350,- , zoals
berekend in een onlangs verrichte haalbaarheidsstudie naar toepassing van embryotransplantatie in de Nederlandse rundveehouderij. Alleen in combinatie met sexen
wordt dit wellicht gerealiseerd in bedrijfsverband.
Een aldus beschreven opzet zal alleen haalbaar zijn als enerzijds de nieuwe technieken redelijk goedkoop binnen tehalen zijn enanderzijds dearbeidskosten gedrukt
kunnen worden. Voor het laatste ishet nodig dat deresultaten van superovulatie aanmerkelijk beter worden.
51
52 J. JANSEN
7.6 Klonen
Het grote voordeel van klonen zal tezijnertijd liggen in de betrouwbare fokwaardeschatting van koeien. Pas bij een hoge betrouwbaarheid wordt het verantwoord stiermoeders intensiever tegebruiken dan thans geschiedt, en alleen dan zal de genetische
vooruitgang versneld worden. Het maximale gebruik van stiermoeders wordt dan
bepaald door inteeltbeperkingen. VanVleck (1986)meldt dat devooruitgang met een
factor 2vergroot kanworden. Ongetwijfeld zalhetoperationeelmakenvankloneneen
aanzienlijke investeringmetzichmeebrengen diealleendoor groteorganisaties opgebracht kan worden. In de fokkerij zal er dan definitief een scheiding komen tussen
nucleusbedrijven met fokdieren in eigendom bij KI- of Embryo-organisaties, en
afnemer-veehouderijbedrijven. Voor de praktische veehouder heeft het gebruik van
gekloonde embryo's het voordeel dat daarmee de variatie in produktiecapaciteit van
devervangende vaarzen met 25- 30 % beperkt kan worden. Dit zaltot gevolg hebben
dat erminder vervanging nodigisendat eengroter deelvoor vleesembryo's benut kan
worden. De toegevoegde waarde van deze kleinere spreiding zal echter beperkt zijn.
7.7 Conclusie
Een succesvolleenroutinematige in-vitroproduktieenmanipulatie vanembryo's heeft
wellicht nog grotere foktechnische gevolgen bij melkvee dan de toepassing van de
kunstmatige inseminatie. Zo zijn er mogelijkheden tot versnelling van de genetische
vooruitgang vanwege een betere benutting van vrouwelijke dieren.
Hetzichmeerenmeerbeperken totenkelefokdieren zowelaan mannelijke alsvrouwelijke zijde leidt tot een verhoogde kans op inteelt: een toenemende verwantschap
tussen de dieren onderling. Enerzijds leidt dit tot een beperking van de genetische
variatie, waardoor toekomstige selectie-mogelijkheden verminderd zouden kunnen
worden. Anderzijds kan de fitness afnemen door fixatie van bepaalde ongewenste
genen. Door DeRoo(1988)ishet effect vanparingssystemen opinteeltindetail bestudeerd. Daarbij bleek temeer dat bij gebruik van voldoende beren enzeugen per generatie en vermijding van inteelt één en ander onder controle gehouden kon worden. In
depraktijk komt het erop neer dat gestreefd moet worden naar het gebruik van minimaal 100vrouwelijke dieren en 20 mannelijke dieren per generatie, terwijl het langdurig gebruik van bepaalde ouders vermeden moet worden.
Daarnaast echter zal het sexen en klonen van embryo's kunnen leiden tot een drastischewijziging vandestructuur vandemelk-envleesproduktie, waarbij de problematiek van de dubbeldoelfokkerij definitief tot het verleden behoort.
8 Fundamentele aspecten en toepassingsgebieden van de
hybridomatechniek
E. Egberts, A. Schots en W.B. van Muiswinkel
8.1 Inleiding
Gewervelde dieren beschikken over het vermogen om een infectie met een pathogeen
of anderelichaamsvreemde elemententebestrijden door deproduktie vaneiwitten die
de 'indringer' onschadelijk kunnen maken. Elke stof die aanleiding kan geven tot de
vorming van zulkeeiwitten wordt antigeen genoemd. De eiwitten zelf, aangeduid met
antilichamen of immunoglobulines, kenmerken zich door een grote specificiteit; ze
reageren alleen met het element waartegen ze in het lichaam zijn opgewekt. Tijdens
een afweerreactie met antilichamen 'leert' het lichaam ook van de geleverde prestatie;
eentweedecontact methetzelfde antigeen resulteert ineensnellere,engrotere produktievanantigeen-specifieke antilichamen. Het lichaam beschermt zichdustegen herhaling van de infectie, het wordt immuun.
Deze reactie van het lichaam moet al aan de oude Chinezen bekend geweest zijn:
zij brachten kinderen opzettelijk in contact met verpoederde korsten van menselijke
pokken om zo bij hen een bescherming tegen deze ziekte op te bouwen. In de Westeuropese wereld echter ontwikkelde deze vorm van ziektepreventie zich pas nadat de
Schotse arts Edward Jenner in 1798 proefondervindelijk bij een jeugdige patiënt
demonstreerde dat een opzettelijke infectie met een lage dosis pokkenpus aanleiding
gaf tot bescherming tegen hernieuwde pokkeninfecties. Daarna duurde het nog een
eeuwvoordat men eniginzicht kreeg in deachtergrond van dezereactie. Verschillende
onderzoekers lieten toen zien dat in het serum van geïnfecteerde dieren stoffen voorkwamen die met het infectieuze agens reageerden. Bovendien werd duidelijk dat deze
stoffen gevormd konden worden tegen elk willekeurig aan het lichaam onbekend
element, en daarvoor een hoge mate van specificiteit bezaten. Al spoedig realiseerde
men zich de potentie van deze antilichaamspecificiteit, en daarmee ontstond een
geheel nieuwe wetenschappelijke discipline, de serologic
8.2 Serologie
De Serologie is een tak van wetenschap die voor het aantonen van een bepaalde stof
gebruik maakt vaneenspecifieke reactiedaarvan meteenertegen gericht antilichaam.
Zo'n antilichaam ontstaat door proefdieren met de betreffende stof als antigeen in te
spuiten, en maakt deel uit van de serumfractie in het bloed waarin zich naast andere
eiwitten ook veel antilichamen met grotendeels onbekende specificiteit bevinden.
Maar zelfs tegen een enkel antigeen blijkt niet één antilichaam maar een verzameling
53
54
E. EGBERTS ET AL.
van antilichamen gevormd te worden. Deze antilichamen verschillen in affiniteit en
specificiteit voorhetantigeen,eninhunvermogenbijtedragenaandie afweerreacties
vanhetlichaamwelkevandevormingvancomplexentussenantigeen enantilichaam
afhankelijk zijn. Aangezien antilichamen niet of nauwelijks te scheiden zijn, moet
menindeklassiekesérologievolstaanmethetgebruikvanserum,ofdedaaruitgedeeltelijkgezuiverdeantilichaamfractie, verkregen uiteenmetantigeen behandeld proefdier. Zo'n preparaat wordt een antiserum genoemd.
Dekarakteristieken vaneenantiserum diederesultantezijn vandeeigenschappen
van de erin aanwezige heterogene antilichamen, blijken zowel tijds- als individuafhankelijk te zijn, met andere woorden, elk antiserum is uniek. Dit bemoeilijkt in
sterkematedevergelijking vanresultatenbehaald metverschillende antiserumpreparaten,enscheptproblemen bij deantiserumvoorziening voor debepalingvan stoffen
diematigofslechtalsantigeenfunctioneren. Ookkanhetverschijnselvankruisreactiviteit problemen scheppen: antigenen die naast verschillende ook overeenkomstige
structuren bevatten zullen, op grond van de aanwezigheid in een met zo'n antigeen
opgewekt antiserum van antilichamen welke met die overeenkomstige structuren
reageren,serologischnietonderscheidenkunnenworden.Wanneerdaarnaasthetantigeen,zoalsvaak hetgeval,nietinzuiverevormbeschikbaar isvoor deproduktievan
antiserum, bestaat tevens het risico dat het geproduceerde reagens serologisch een
brederereactiviteitvertoontdanvoorhetantigeenalleen.Opgrondvandezemoeilijkheden,samentevatten alseenniettevoorspellenresultaat enherhaalbaarheid vande
procedure, met 'batch-to-batch' variatie in de heterogeniteit en reactiviteit van het
produkt, lijkt de sérologie soms meer een kunst dan een kunde.
8.3 Principe vanantilichaamvorming
Antilichamen (immunoglobulines) zijn het produkt van een gespecialiseerde klasse
van lichaamscellen, deB-lymfocyten, dietot zogenaamde plasmacellen zijn gedifferentieerd. Onderzoek van delaatstejaren heeft duidelijk gemaakt dat antilichamen
zijn opgebouwd uitongelijkeeiwitketens, diezwareenlichteketenworden genoemd,
endoor middel vandisulfidebruggen met elkaar verbonden zijn (Poljak, 1975).Elke
keten bevat qua aminozuursamenstelling een variabel en een constant gebied. Het
onderscheidinspecificiteit tussenantilichamenisterugtevoerenopverschillentussen
devariabelegebieden.DelichteendezwareketenzijnzodanigmetelkaartoteenheterodimeergeassocieerddatdebeideN-terminalevariabelegebiedenééngeheelvormen.
Dealdusgevormdestructuurblijktinstaattezijnantigeentebinden,enwordtdeantigeenbindingsplaats genoemd.
Eenantilichaambestaatuitéénofmeerparenvanidentiekeheterodimeren,enbevat
dusaltijdtweeantigeenbindingsplaatsen, ofeenveelvouddaarvan.In3-dimensionaal
opzicht vormen deheterodimeerparen een karakteristieke Y-vormige structuur waarbij deantigeenbindingsplaatsen zichbevinden op debeideuiteinden (fig. 16).Zowel
de zware als de lichte keten van de immunoglobulinemolecule nemen door interne
disulfidebruggen eendomeinstructuur aan. Elk domein beslaat ongeveer 110 amino-
DE HYBRIDOMATECHNIEK
NX
FaM
v
*"
\
CH
rcHo>
papaine
pepsine
OH*
'
CHO
Complement bindingsplaats
Fc \
CH3
CH3
COOH
COOH
^Bindingsplaats met
maorofaag Fc-receptor
Fig. 16. Schema van de structuur en eigenschappen van een immunoglobulinemolecule. H ='zware keten,
L = lichte keten, V = variabel gebied, D = diversity gebied, J = joining gebied, C = constant gedeelte,
NH 2 = aminoterminaal uiteinde, COOH = carboxyterminaal uiteinde, CHO = glycosylerings site, -SS= disulfidebrug, F a b = antigeen-bindend fragment ontstaan na enzymatische splitsing met pepsine op de
door een stippellijn aangegeven plaatsen, F c = kristalliseerbaar fragment, idem t.g.v. splitsing met papaïne.
zuren. Naast het variabele gebied, dat opzichzelf een domein vormt, bevat delichte
ketennogéén,endezwareketennogdrie(ofvier)domeinen,aangeduidmetrespectievelijk CL, en CH1, CH2, CH3 (CH4). In het genoom blijken deelementen die coderen
voor de variabele (V-genen) en voor de constante delen (C-genen) van een keten
gescheidenvoortekomen.Bovendienzijn ervoorhetvariabeledeelvaneenketenéén
of meer groepen van onderling verschillende genen (V-gen-families) voorhanden
(Tonegawa, 1983).
Tijdens deontwikkeling van eenB-lymfocyt wordt door recombinatie een lidvan
deV-gen-familie opDNA-niveaudichtbij hetinenkelvoudophetzelfde chromosoom
aanwezigeC-gengebracht. Bijdezesamenvoeging spelenook noganderekleinevoor
aminozuren coderende gensequenties (J- en D-gebieden) een rol. Door de samenvoegingwordt eenstructuur verkregen diein staat iseenmRNAtevormen vooreen
keten van de immunoglobulinemolecule (fig. 17). Wanneer dit recombinatieproces
voor zoweldelichtealsdezwareimmunoglobulineketen isvoltooid komt deresulterendeimmunoglobulinemolecule op decelmembraan van degerijpte B-lymfocyt tot
uiting.Hoewelper B-lymfocyt slechtséénsoort immunoglobulinemolecule ontstaat,
ishetaantalmogelijkevariatiesindesamenvoegingzeergroot:bijdemuisschatmen
dat er minimaal 108 verschillende antigeenbindingsplaatsen gevormd kunnen worden. Aangezien echter het aantal tot ontwikkeling gekomen B-lymfocyten in het
lichaam nog veelgroter is,zal elkedoor hetgenoom mogelijk gemaakte combinatie
waarschijnlijk ook diversemalen vóórkomen. Wanneer eenantigeen in het lichaam
55
56
E. EGBERTS ET AL.
VH
D (1-20)
L (200-300) '
'
Kiemlijn
DNA
JH<1-4)
'
si
r?
*3
"^fH^HHHKHS-M- 3 '
5'
Herschikking (VDJ Joining)
L
VHDJ
DNA
Gedifferentieerde B - c e l
hnRNA
'
I »I
j2
»3
Transcriptie
poly A
cap_
mRNA Splicing
Messenger RNA
m.
WkWÉBIr^ A
cap_|
Translatie
Cytoplasma
NH2— Ü * [ ; « S 1 S - - C 0 0 H
'H
I
U
H
Fig. 17. Herschikking, transcriptie en expressie van de elementen die coderen voor de zware keten van een
immunoglobulinemolecule. Eén van de VH-genen wordt door middel van recombinatie samengevoegd met
een D-en een J-element. Denieuw ontstane structuur wordt vervolgens gekoppeld met één van de voor het
constante deel van de zware keten coderende eenheden, hier die voor de Y-keten. De sequentie L codeert
voor een zogenaamd leaderpeptide, dat betrokken isbij het intracellulaire transport tijdens de biosynthese
van de immunoglobulineketens, maar geen onderdeel vormt van het uiteindelijke produkt. De uit deze
recombinatieprocessen resulterende genetische eenheid wordt getranscribeerd in een hnRNA-molecule
(heteronucleair RNA),engemodificeerd via 'capping' en koppeling met polyA,waarna deniet voor aminozuren coderende segmenten (introns) door 'splicing' worden verwijderd. Het produkt hiervan wordt als
mRNA naar het cytoplasma getransporteerd. Translatievindt plaats ophet ruw endoplasmatisch reticulum,
waarbij de gevormde polypeptide-keten in het lumen van de cisternae terecht komt. Assemblage van de
lichte en zware ketens tot een immunoglobulinemolecule, en een deel van de glycosylatie, vindt plaats in
de cisternae van het endoplasmatisch reticulum. De glycosylatie wordt voltooid in het Golgi-apparaat,
waarna het eindprodukt via secretorische vesikels naar de celmembraan wordt getransporteerd.
wordt geïntroduceerd, reageert het met die B-lymfocyten waarvan de membraangebonden immunoglobulinemolecule een binding met het antigeen kan aangaan. Via
een aantal intercellulaire reacties brengen deze B-lymfocyten vervolgens tal van identieke nakomelingen voort (B-lymfocyt-kloon). Deze differentiëren zich daarna tot
plasmacellen diehet tot dan toe op decelmembraan aanwezige immunoglobuline aan
hun omgeving gaan afgeven.
8.4 Monoklonale antilichamen
Elke humorale respons is de resultante van verschillende door antigeen, vanuit een
genetisch en fysiologisch bepaald potentieel, geselecteerde B-lymfocyten, die elk met
een bepaalde affiniteit kunnen reageren met één van de structuren van dat antigeen.
Dezeheterogeniteit ligtaan debasisvandebij desérologiebehandelde problemen met
betrekkingtot devariabiliteit vanhet reagens alsprodukt van deimmuunrespons. Een
mogelijke uitweg uit deze problematiek zou worden geboden indien men de beschikking zou kunnen hebben over één enkele antigeen-specifieke B-cel-kloon. Afgezien
DE HYBRIDOMATECHNIEK
van de moeilijkheidsgraad van de hiervoor benodigde isolatietechnieken hebben
plasmacellen in vitro, maar ook invivo,in het algemeen echter een beperktelevensduur, en dus produktiecapaciteit (Klinman et al., 1976). Een uitzondering hierop
vormen plasmaceltumoren, of myeloma's, waarbij eenplasmacel inhet lichaamzich
ongebreideld blijft vermeerderen, entot eengroteproduktievaneenimmunoglobulinemolecule aanleiding geeft (monoklonale gammopathie) (Potter, 1975). Over het
ontstaansmechanisme van dergelijke tumoren bestaat nog weinig kennis, en meestal
isookdeantigenespecificiteit vanhetbetreffende Immunoglobulineonbekend,waarmeeditverschijnsel inserologisch opzicht nietvoor manipulatie toegankelijk is. Wel
blijkt hieruit dat het in principe mogelijk isplasmacellen te immortaliseren zonder
verlies van de capaciteit tot synthese van antigeen-specifieke antilichamen.
8.5 Hybridomatechnologie
InhetkadervaneenstudienaarderegulatievandeantilichaamsynthesehieldenKöhler en Milstein zich in het midden van dejaren zeventig bezig met de ontwikkeling
vanuiteenmyelomavaneencellijndieeenantilichaammeteengedefinieerde specificiteitproduceerde.Uiteerdereexperimenten wasgebleken datbij fusie tussentweeverschillende myelomacellen de hybride cel de immunoglobulinemoleculen van beide
ouderlijkecellengelijktijdig totexpressielietkomen(codominantie) (Marguliesetal.,
1977; Cotton &Milstein, 1973). Door celfusie (somatische celhybridisatie) van een
muize-myelomacel met een B-lymfocyt afkomstig van een met schape-rode-bloedcellen(SRBC)gestimuleerdemuisverkregenzijinderdaad naselectievoor dehybride
cellenstabielecellijnen welketegenSRBCgerichteantilichamenuitscheidden (Köhler
&Milstein, 1975). Dezecellijnen werdendoordeontdekkershybridoma'sgedoopt,en
het produkt kreeg denaam monoklonaal antilichaam. Het produkt van de cellijnen
bleek echter tevensantilichamen van demyelomacel-fusiepartner tebevatten, enalle
mogelijkeanderecombinatiestussendedoordecellengesynthetiseerdezwareenlichte
immunoglobulineketens.
Mede ook door detoenmalige met celfusies verbonden technische moeilijkheden
werddepotentievandegevolgdeprocedureaanvankelijkonderschat, maaralspoedig
slaagdemenerindoorintroductievanpolyethyleenglycol (PEG)alsfusieagens (Lane,
1985)),endoor gebruik temakenvanmyelomacellen waarbij het eigenvermogentot
immunoglobulinesynthese ontbrak (Shulman etal., 1978),detechniek aanzienlijk te
vereenvoudigen. Bovendienbleek datinprincipetegenelkantigeenwaaropeenmuis
reageert met de vorming van antilichamen, ook via de hybridomatechniek monoklonaleantilichamenbereidkondenworden.Eenplezierigebijkomstigheidwasdatde
frequentie waarmeezulkehybridoma'sgevormdwerdentenminsteeenfactor 10hoger
bleek te zijn dan verondersteld werd op grond van het relatieve vóórkomen van
antigeen-specifieke B-cellenindetotaleB-lymfocyt-populatie.Blijkbaardienenonder
deomstandighedenvandehybridomatechniek vooraldekortdaarvoor doorantigeen
gestimuleerde B-lymfocyten als fusiepartner voor de myelomacellen (Stähli et al,
1983).Daardoorontstondvanaf 1980eenwareexplosieinhetgebruikvandehybrido-
57
58
E. EGBERTS ET AL.
Immunisatie met antigeen
1x108 miltcellen
\y
Fusie in PEG
Screenen en selecteren
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
1xl0 5 cellen/putje in medium
selectief voor groei hybridoma's
1x107 myelomacellen
^
\s
Injectie hybridomacellen
in Balb/c muis
Opkweken positieve hybridomaklonen
Monoclonaal antilichaam
in ascites
Monoclonaal antilichaam
in kweek supernatant
Fig. 18. Schema van de werkwijze voor het verkrijgen van hybridoma's.
matechniek, niet alleen in de fundamentele maar ook in de toegepaste wetenschap.
In de hybridomatechniek kunnen de volgende elementen onderscheiden worden
(fig. 18):
- conditionering van een donor voor het verkrijgen van met antigeen gestimuleerde
lymfocyten;
- het fusieproces;
- screening en selectie van hybridoma's;
- produktie van monoklonale antilichamen;
- toepassing van monoklonale antilichamen; en
- modificatie van monoklonale antilichamen.
In hetgeen volgt wordt achtereenvolgens op elk van deze onderdelen nader ingegaan.
8.6 Conditionering van de donor
Zoalsuithetvoorafgaande isgeblekenbestaat erqua antigenespecificiteit veelvariatie
tussen de B-lymfocyten. Voor een hybridoma-celfusie zijn echter alleen die Blymfocyten van belang die het vermogen hebben te reageren met het antigeen waar-
DE HYBRIDOMATECHNIEK
tegenmenantilichamen wilbereiden, endietegelijkertijd geschikt materiaal vormen
voor decelhybridisatietechniek. Recentdoor antigeengestimuleerde B-lymfocytenin
hun proliferatieve fase voldoen aan dezevoorwaarden. Demeest gebruikelijke bron
vandezecellenvormtdemiltvanin-vivogeïmmuniseerdedieren,metnamevanmuizen(videinfra), maarookanderelymfoïde organenkunnengebruiktworden.Gezien
dereedsbijdesérologiebesprokenvariabiliteitvanantigenen,endeerdooropgewekte
immuunrespons, bestaat er geen consensus over hét optimale immunisatieprotocol.
Doordat erwelcondities zijn aan tewijzen dieeenredelijke mate van succes garanderenheeft het opgrond vaneen kosten-baten-analyseinhet algemeen weinigzinin
extensoaandachttebestedenaaneenoptimalisatievandeimmunisatieprocedure.De
meeste immunisatieprotocollen gaan uit van diverse injecties met een antigeen, met
tussenpozen vanenkeleweken. Isolatievanlymfocyten vindt dan eenpaar dagen na
delaatste immunisatie plaats.
Celoppervlakte-antigenen blijken sterk immunogeen te zijn wanneer ze zich op
intacte cellenbevinden. Goederesultaten worden verkregen met een intraperitoneale
dosisvan2 x 107cellen, waarbij delaatsteinjectie naverkiezing langs dezelfdeweg,
of intraveneus toegediend kan worden. Eiwitten inwaterige oplossing blijken echter
vaakveelminderimmunogeentezijn,envereisenhetgebruikvanadjuvantia vooreen
acceptabel resultaat. Een redelijk goed werkend immunisatieregiem wordt gevormd
door enkele subcutane of intraperitoneale injecties met 10—50 p.g eiwitantigeen in
emulsiemetFreund'sCompleteAdjuvans, ofgecomplexeerd metaluin,gevolgddoor
eenlaatsteintraveneuzetoedieningvanhetantigeeninwaterigeoplossing.Verbetering
vandeimmuunresponstegenzwakimmunogenestoffen kansomsookbereiktworden
dooreraggregatenvantebereiden,zetekoppelenmeteensterkimmunogene 'drager'
(Hudson &Hay, 1980),op te nemen in liposomen, of te complexeren met glycoside
Quil A tot zogenaamde ISCOMS (immuno-stimulating complexes) (Morein et al.,
1984).Eeninteressanterecentbeschrevenmethodeisdaarnaast nogdekoppelingvan
het antigeen met een hapteen, en dedaaropvolgende immunisatie van dit conjugaat
incombinatie met anti-hapteen-antilichamen (Bahr et al., 1985).Indien blijkt dater
weliswaareenimmuunresponstegenhetantigeentotstand komt,maar dat diegeheel
of grotendeels gericht istegen één of enkele determinanten van het antigeen waarin
mennietisgeïnteresseerd, dan staat nogdemogelijkheid open deresponstegendeze
dominante epitopen te onderdrukken door toevoeging van hiertegen gerichte antilichamen (Talhammer & Freund, 1985),of door immunisatie inaanwezigheid vancyclofosfamide (Matthew&Patterson, 1983). Ookkanindezeomstandigheden reïnjectie van met antigeen gestimuleerde miltcellen in bestraalde muizen, samen met het
antigeen,eenoplossingbieden.Daarnaast kanvoorantigeenwaarovermenslechtsin
geringemate beschikt adsorptie aan nitrocellulose, endaaropvolgende verpulvering,
eengeschikt uitgangsmateriaal leveren(Knudsen, 1985).Tenslottestaat voorgeringe
hoeveelheden antigeen nogdemogelijkheid open vanlokaleinjectie daar inhet dier
waar men in een later stadium degestimuleerde B-lymfocyten wilisoleren, bij voorbeeld in de milt (Spitz et al, 1984;Gearing et al., 1985).
Alletotnutoegenoemdeprocedureshebbengemeendatzeviahetlevendeindividu
59
60
E. EGBERTS ET AL.
verlopen (in-vivoimmunisaties). Inpraktisch en/of ethisch opzicht ishetaantal diersoorten waarmee immunisaties naar believen kunnen worden uitgevoerd echter
beperkt. Eenuitweguitditdilemmabiedtdetechniekvanin-vitroimmunisatie,waarbij stimulatie met antigeen plaatsvindt in celkweken van lymfoïde organen (Boss,
1984;VanNessetal., 1984).Nadeelisechter datdit systeemdoor zijn hogeeisenaan
de expertise van de gebruiker moeilijker toegankelijk is (Reading, 1982).
Hetuiteindelijk resultaat vandeimmunisatieprocedure valtaftelezenaan hetaantaluiteencelfusie ontstanehybridoma'sdieeenantigeen-specifiek antilichaamproduceren. Gezien de lange weg die afgelegd moet worden voordat uitsluitsel hierover
verkregen kan worden zou het gunstig zijn indien men zou kunnen beschikken over
parameters die het mogelijk maken de kans die individuele immunisaties bieden op
het slagen van dehybridomatechniek teschatten. Vaakwordt hiervoor weldeineen
proefdier tengevolge van de immunisatieprocedure opgewekte antigeen-specifieke
antilichaamtiter gebruikt. Hoeweldezealseenplezierigsteuntje inderugkangelden
moet men er zich echter niet op blind staren, aangezien bij goede antilichaamtiters
somsweinig of geen hybridoma's geïsoleerd worden, en omgekeerd. Welkan gesteld
wordendatmennietmeermagverwachtendanhetdierzelfkan,metanderewoorden,
nietaanwezigeantigeen-specifieke B-lymfocytenkunnenookmetdebesteprotocollen
voor de hybridomatechniek geen aanleiding geven tot het ontstaan van antigeenspecifieke hybridoma's.
8.7 Fusieproces
HetgebruikinhetoorspronkelijkdoorKöhlerenMilsteingevolgdefusieprotocol van
geïnactiveerd Sendai-virus is nu, op grond van een betere hanteerbaarheid, vrijwel
totaalvervangendoor detoepassingvanpolyethyleenglycol (PEG).Indehybridomatechniek moet een celfusiepartner voor de gestimuleerde B-lymfocyten aan devolgende voorwaarden voldoen: onbeperkte proliferatie invitro, goede fusiefrequentie,
bezit van een eigenschap diealsselectiemiddel gebruikt kan worden, en behoud van
dedoor delymfocyt aan het celfusieprodukt bijgedragen specifieke antilichaamsynthese.Er zijn momenteel slechts eenbeperkt aantal cellijnen bekend diein staat zijn
al deze voorwaarden te vervullen; alle zijn ze terug te voeren op plasmacytoma's
afkomstig vanmuizenofratten.Indeafgelopenjarenzijnhieruiteenaantalvarianten
geïsoleerd met voor dehybridomatechniek bij uitstek gunstige eigenschappen. Maar
ook voor deze varianten blijft de regel gelden dat alleen bij intraspecies-fusie voldoendestabielehybridenverkregenkunnenwordenwaarindespecifieke antilichaamsynthese behouden blijft. Aangezien het potentieel van monoklonale antilichamen
hiermee beperkt blijft tot immunoglobulineklassen van demuis of de rat, wordt er
langs verschillende wegen gezocht naar mogelijkheden toch monoklonale antilichamen van andere diersoorten teverkrijgen. Een in dit opzicht interessant perspectief
wordtgebodendoordebevindingdatbijgebruikvaninterspecies-fusieprodukten zelf
als celfusiepartner ('hybrid myeloma') een grotere stabiliteit van de specifieke antilichaamsynthese indaaropvolgende celhybriden optreedt (Tucker et al., 1987).Daar-
DE HYBRIDOMATECHNIEK
naast behoort ook directe transformatie van antigeen-specifieke plasmacellen via
behandelingmettransformerende virussen(Steinitzetal., 1977),of doordeintroductie van oncogen-sequenties, tot de mogelijkheden voor het verkrijgen van monoklonale antilichamen van andere diersoorten dan muis of rat.
Indehybridomatechniek wordtcelfusie metbehulpvanpolyethyleenglycolmeestal
insuspensie uitgevoerd. VooralPEGmeteenmoleculairgewicht tussen 1500en4000
blijktgoederesultatentegeven.DegebruikteconcentratiePEGiseenoptimumtussen
enerzijds goede fusiefrequentie, en anderzijds een, op grond van detoxische eigenschappenvanPEGvoordierlijkecellen,goedeoverleving.Aangeziendietoxiciteitvan
batch tot batch nogal kan variëren, verdient het aanbeveling individuele batches op
toxiciteit te controleren. Ook depH van dePEG-oplossing isvan invloed; optimale
resultatenwordenverkregenbij neutraleof licht alkalischepH.Eentypisch protocol
gaat uit van een suspensie van 108lymfocyten, en evenveel tot 10x minder muizemyelomacellen, die gemengd afgecentrifugeerd worden, waarna de celpellet gedurende 1 minuut wordt geresuspendeerd in 50 % PEG en 5 % dimethylsulfoxide
(DMSO) in kweekmedium. Vervolgens wordt gedurende enkele minuten de celsuspensie langzaam met warm medium 20-50x uitverdund. Hierna kan de celsuspensie, eventueel na centrifugatie en opname van de cellen in vers medium, in
microtiterkweekplaten wordenuitgezet.Hetdoelhiervanisdegevormdehybridoma's
reeds in een vroeg stadium gescheiden op te kweken. Belangrijk daarbij is zodanige
omstandigheden uit te kiezen dat de kans dat een tot ontwikkeling gekomen
hybridoma-celculture inderdaad van één enkele cel afkomstig is zo groot mogelijk
wordt(Hadas&Theilen, 1987).Indemicrotiterkweekplaat wordttevensdegroeivan
andere cellen dan hybridoma's onderdrukt, enerzijds omdat lymfocyten zelf het
vermogentotin-vitroproliferatie overlangeretijdmissen,anderzijds doordatgeselecteerdwordttegenindemyelomacel-partner aanwezigemutatiesdieindehybridomacelwordengecomplementeerd.Hetonderdezecelkweekcondities(lageceldichtheden)
aanslaanvandehybridoma'skanwordengestimuleerddoorhettoevoegenvan 'feeder'
cellenzoalsmacrofagen (Kennett, 1979),ofacellulairemediumfracties afkomstig van
kwekenvanbepaaldeceltypen(Astaldietal., 1980; Sugasawaraetal., 1985). Wanneer
eenhybridoma-celkweek eenmaal eendichtheid van 105cellen per ml of meer heeft
bereikt, kan de kweek volgens de bekende kweekprocedures worden opgeschaald,
waarbij deceldichtheid bij voorkeur tussen 2en 5 x 105cellenper ml gehandhaafd
moet blijven. Onder goede omstandigheden blijken enige duizenden hybridomaklonen uit één zo'n celfusie te resulteren.
Indehiervoorbeschrevenfusieprocedure wordthetaanhettoevalovergelatenwelke
cellen met elkaar hybridiseren, en worden door selectie achteraf de gewenste fusieprodukten inzuiverevormverkregen.Er bestaan echter methodes diereedsopvoorhandhetaandeelvandegewenstehybridoma'sinhetfusiemengsel aanzienlijkverhogen.Eén daarvan isdeelektrofusie, waarbij onder invloed vaneenelektrisch veldde
te fuseren cellen nagenoeg individueel met elkaar in contact gebracht, en gefuseerd
worden (Bischoff et al., 1982).Nadeelvandezemethodeisechter dat slechtsmetgeringehoeveelheden cellengewerktkanworden.Eenanderemogelijkheid istijdensof
61
62
I
E. EGBERTS ET AL.
na celfusie voor specifieke hybridoma's te selecteren met behulp van het betrokken
antigeen.Tweehiervoor beschreventechnieken berusten ophetvermogen van het antigeen om aan cellen te binden. In de 'antigen-focused' fusietechniek wordt gebruik
gemaakt van myelomacellen die met het antigeen waartegen men specifieke hybridoma's wilisoleren, zijn bedekt (Bankert etal., 1980;Loetal., 1984).Door hun affiniteit voor dit antigeen zullen bij voorkeur die lymfocyten van een geïmmuniseerde
donor dieeen specificiteit voor dit antigeen bezitten, met dezegemodificeerde myelomacellen aggregeren, en vervolgens fuseren. Daarnaast is een selectieve isolatie van
antigeen-specifieke celfusieprodukten beschreven op basis van hun rozettering met
erythrocyten diemet antigeen zijn beladen (Brocades-Zaalberg &Lubbe, 1984). Hierbij moet men wel bedenken dat alleen die hybridoma's geselecteerd worden die het
monoklonaal antilichaam (ook) in celmembraangebonden vorm synthetiseren.
In somatische celhybridisatie vindt fusie plaats tussen cellen met verschillende
groeisnelheden. De hieruit resulterende heterokaryons kunnen dus kernen in alle
mogelijkecombinaties van fasen vandecelcyclus(Gl, S,G2,enmitose)bevatten. Voor
vermeerdering van een heterokaryon is echter synchronisatie van de fasen van beide
kernen essentieel. Demeestehybridomaprotocollen laten dit aan hettoevalover, maar
erzijn aanwijzingen dat deopbrengst aan antigeen-specifieke hybridoma's uit eencelfusie verhoogd kan worden door gebruik te maken van myeloma-celcultures waarin
veel cellen zich in de delingsfase bevinden (Miyahara et al., 1984).
8.8 Screening en selectie van hybridoma's
Zelfs wanneer men met behulp van de hierboven beschreven methoden een aanzienlijke verrijking heeft verkregen van het aantal specifieke hybridomaklonen, blijft
screening van celfusieprodukten op synthese van antigeen-specifieke monoklonale
antilichamen eenessentieel onderdeelvandehybridomatechniek. Dithoudt medeverband met de fysieke en technische grenzen aan de aantallen hybridomacultures die
gedurende een langere periode in stand gehouden kunnen worden. Een goede screeningstest moet aan de volgende voorwaarden voldoen:
- duidelijk onderscheid tussen positieve en negatieve reacties;
- voldoende gevoeligheid, ook bij lage concentraties antilichaam;
- snel resultaat;
- uitvoerbaar met grote aantallen monsters.
Alleen onder deze omstandigheden is het mogelijk in een vroeg stadium het aantal
te vermeerderen hybridomaklonen aanzienlijk te verminderen, en de aandacht volledig op diegene te richten die van wezenlijk belang zijn.
Potentieel zijn er een aantal immunologische detectiesystemen die aan deze eisen
tegemoet komen, en daarom ook veelvuldig worden toegepast, zoals de RIA (radioimmuno assay), ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), en 'dot-blot'methode. In de praktijk blijkt het echter tevens van belang te zijn dat het testsysteem
de situatie waarin het monoklonaal antilichaam gebruikt gaat worden zogoed mogelijk benadert, aangezien monoklonale antilichamen, in tegenstelling tot antisera, een
DE HYBRIDOMATECHNIEK
sterk testafhankelijke reactiviteit vertonen. Zodoende kan het van essentieel belang
zijn om hybridomaklonen die hun toepassing gaan vinden in de histologie, te selecteren op grond van hun immunohistochemisch reactiepatroon, ondanks de daarmee
gepaard gaande grote hoeveelheid werk.
Bij screening blijkt een monoklonaal antilichaam soms een onverwachte kruisreactiviteit tussen tweeogenschijnlijk verschillende antigenen tevertonen (Fox&Siraganian, 1986). Zoals reeds besproken kan de achtergrond hiervan een gedeeltelijke
overeenkomst in epitopen tussen debeide antigenen zijn. Het verschijnsel kan echter
ook berusten op een irrelevante interactie van het antilichaam met éénvan beide antigenen (Lane&Koprowski, 1982).Demeerderheid van kruisreacties met monoklonale
antilichamen lijken tot de laatstgenoemde categorie te behoren (Ghosh & Campbell,
1986).Eenmogelijke verklaring kanzijn dat het betreffende kruisreagerende antigeen
een hoge dichtheid van één epitoop bezit, en het antilichaam multivalent is, zodat er
een binding met lage affiniteit ontstaat door lokale concentratie-effecten. Een andere
mogelijkheid is dat zowel antilichaam als (flexibel) antigeen elkaar zodanig beïnvloeden, dat ze een voor binding optimale configuratie aannemen.
/
8.9 Produktie van monoklonale antilichamen
Onder de gebruikelijke kleinschalige celkweekcondities kan met een stationaire culture van hybridomacellen circa 100 /ig monoklonaal antilichaam per ml medium
worden geproduceerd. Indien men over grotere hoeveelheden monoklonaal antilichaam wenst te beschikken, moet men dientengevolge de cultures tot grotere Volumina opschalen. Een andere mogelijkheid echter wordt gegeven door het feit dat de
hybridoma's niet alleen het vermogen van de myeloma-oudercel hebben geërfd om in
vitro te prolifereren, maar zich ook in vivo kunnen vermeerderen. Wanneer hybridomacellen in een muis subcutaan of intraperitoneaal worden geïnjiceerd ontwikkelt
zich een tumor, en komt het betreffende monoklonale antilichaam in het serum,
respectievelijk de buikvloeistof, terecht. Voorwaarde hierbij is dat er geen histocompatibiliteits-barrières bestaan tussen dehybridomacellen, en debetreffende muis.
Mocht dit wel het geval zijn, dan kan het gebruik van muizen die door bestraling, of
door behandeling met cyclofosfamide, immmuno-incompetent zijn geworden, uitkomst bieden. Voordelen van deze methode zijn de hoge concentraties antilichaam
(1-10 mg/ml) die zodoende kunnen worden verkregen, en de relatieve eenvoud van
de procedure. Nadelen zijn anderzijds devoor het proefdier onaangename pathologische effecten van de tumor, de verontreinigingen van het preparaat met 'natuurlijke'
indemuis aanwezige antilichamen of andere eiwitten, endeper dier beperkte produktiecapaciteit van één tot enkeletientallen ml. Delaatstejaren staat daarom de opschaling van de produktie van monoklonale antilichamen op basis van in-vitro celkweekmethodieken in versterkte mate in de belangstelling.
Het meest gehanteerde systeem is dat van batchgewijze (Reuveny et al., 1986), of
continu uitgevoerde (Fazekas de St. Groth, 1983),suspensiekweken van decellen. Eén
van de hierbij optredende problemen, namelijk de shearkrachten die tengevolge van
63
64
E. EGBERTS ET AL.
denoodzakelijkemengingvandecultureopdecellenwordenuitgeoefend, kanworden
opgevangendoor decellenoptesluitenineencapsulemeteensemipermeabelemembraan (encapsulatie) (Duff, 1985).Wanneer deze membraan naast devoor decellen
noodzakelijke nutriënten,enschadelijke afvalstoffen, ooknoghetmonoklonaleantilichaam doorlaat, kanindekweekhetspecifieke produkt doorlopendgescheidenvan
decellenuit het verbruikte medium wordenopgewerkt. Opditzelfde principe berust
het gebruik van 'hollow fiber'-systemen, waarmee door het grote membraanoppervlak, enrelatief geringe diffusie-weglengte, zeer hoge celdichtheden indeextracapillaireruimtetebereikenzijn (Sjögren-Janson &Jeansson, 1985;Altshuler etal.,1986).
Hoewel detechnologie zeker nognietvolmaakt is,schept grootschalige produktiein
vitro weldemogelijkheid demediumsamenstelling zodanig temanipuleren dat deze
zoweinigmogelijkinterfereert metdeeropvolgendeopwerkingvanhetgeproduceerde
antilichaam (Chang et al., 1980).
Indiegevallenwaarinmenwilbeschikkenovereenzozuivermogelijkprodukt, kan
men niet volstaan met een ruw uit in-vivo of in-vitro kweken afkomstig preparaat.
Voor een eerste opwerking blijkt zuivering van het monoklonaal antilichaam via
natriumsulfaat-precipitatie inhetalgemeentotbevredigenderesultatenteleiden.Voor
verdergaandezuiveringwordtveelgebruik gemaakt vanaffiniteitschromatografie op
basisvanproteïneA(Eyetal.,1978).Ditmateriaal heeft hetvermogen ombij pH 8.2
muize-IgG-antilichamentebinden. Deverschillende IgG-subklassen kunnen vervolgensstapsgewijs bij pHwaardentussen 6en3 geëlueerd worden. Indepraktijk blijkt
debinding vanmetnamemuize-IgGl aan dit materiaal bij licht alkalischepH echter
maarmatigtevoldoen.OokantilichamenvanhetIgM-typekunnen,opgrondvaneen
sterkeinteractie met Concanavaline A, volgens ditzelfde principe worden gezuiverd.
Eenmeerbewerkelijke, maarwelbetrouwbare,envoorzuiveringopgroteschaalbeter
geschikte procedure berust op een combinatie van ionwisselings- en gelfiltratiechromatografie (Parham et al., 1982). De beste resultaten verkrijgt men uiteraard
wanneermendezuiveringkanuitvoeren opbasisvandebindingvanhet antilichaam
met het betreffende antigeen.
8.10 Toepassing vanmonoklonale antilichamen
Monoklonale antilichamen worden in toenemende mate gebruikt op die terreinen
waartot nu toemet conventionele antisera werdgewerkt, zoals dein-vitro immunodiagnostiek, en andere serologische detectiemethodieken (Ziegler, 1980). Maar op
grond van debijzondere eigenschappen van monoklonale antilichamen hebbenzich
ooknieuwetoepassingsgebieden geopenbaard. Omdat dezeinuitgebreidevorminde
volgende hoofdstukken aan deordeworden gesteld, zal er hier slechts kort melding
van worden gemaakt.
Doordespecificiteit vanmonoklonaleantilichamen,incombinatiemetdeopgrond
vanhunzuiverheidgoedemogelijkhedentotchemischemodificatie, kandelokalisatie
ervan in principe ook in vivo worden gevolgd ('imaging'), en zodoende waardevolle
diagnostische gegevens over het betrokken antigeen opleveren (Order, 1982). Maar
DE HYBRIDOMATECHNIEK
ookintherapeutischopzichtbiedtdezereactieperspectieven:indienhetmonoklonaal
antilichaam gekoppeld wordt met eentoxische substantie, kan dit leidentotvernietigingvan het herkende antigeen endaarmee samenhangende structuren ('target-drug
therapy' of 'guided-missile technique') (Lord et al., 1985).Hetzelfde resultaat wordt
bereikt indien het monoklonaal antilichaam in staat is de antilichaam-afhankelijke
immunologische effectormechanismen van de gastheer te activeren. Voordat echter
grootschaligetoepassingvandezetechniekenwerkelijkheidwordtzijnveelmeerklinischegegevens nodig dan ons nu ter beschikking staan.
Eén van de opmerkelijke aspecten van een immuunreactie in het lichaam is dat
introductie van een antigeen niet alleen resulteert in de synthese van een daartegen
gerichtantilichaam,maardatditantilichaamopzichzelfookweeralsantigeen functioneert, en dus 'anti-antilichamen' induceert (Urbain et al., 1977).Hieronder zullen
ook antilichamen zijn waarvan deantigeenbindingsplaats complementair isaan die
vanheteersteantilichaam, endezevormendaarominzekerezineenafspiegeling van
het oorspronkelijke lichaamsvreemde antigeen (anti-idiotype-antilichamen). In die
gevallenwaarvaccinatiewordtbemoeilijkt doorongewensteeffecten vanhetantigeen
in vaccinvorm, kan overwogen worden monoklonale anti-idiotype-antilichamen van
ditantigeenteproduceren. Dezezulleninpreventief opzichtdezelfde werkinghebben
alshetantigeen-vaccinzelf,maaruitfysiologisch oogpuntopgrondvanhetlichaamseigen karakter geen schadelijke bijwerking laten zien (anti-idiotype-vaccins, hoofdstuk 11).
Intechnischopzicht ookinteressant isdemogelijkheid diemonoklonale antilichamentheoretisch, opgrond vanhun specifieke maar reversibelebinding metantigeen,
bieden voor toepassing in biosensoren (North, 1985).Het onderzoek hiernaar staat
echter nogindekinderschoenen. Tenslottekunnen monoklonale antilichamen door
covalente koppeling aan een vaste drager de opwerking van een stof via affiniteitschromatografieaanzienlijkversnellenenvereenvoudigen,inhetbijzonder indiendeze
stof in geringe hoeveelheden voorkomt in een complex mengsel. Voor grootschalig
gebruik vandezemethodeisdanwelvereistdatdragermaterialen beschikbaar komen
dieeenhogebezettingsgraadmetmonoklonaalantilichaamkoppelenaangoedechromatografische stromingseigenschappen.
8.11 Modificatie vanmonoklonaleantilichamen
Zoalsuit hetvoorgaandeblijkt heeft dehybridomatechniek opgrond van de bijzondereeigenschappenvanmonoklonaleantilichameneengrotevluchtgenomen,enzijn
veel voor de sérologievoorheen moeilijke of onmogelijke toepassingsgebieden ontsloten. Voor goed-immunogene antigenen voldoet detechniek in het algemeen naar
verwachting,maarerisnogeenberoepopeenonontgonnenpotentieelaantechnische
innovatiesnodigwanneerbijzondere eisengesteldwordenaan despecificiteit, affiniteit, of immunoglobuline(sub)klasse vanhettegebruiken monoklonale antilichaam.
Zonder twijfel zullendekomendejaren nogdenodigeverbeteringen vandetechniek
te zien geven. Er staan ons echter ook nu al een aantal wegen ter beschikking om
65
66
E. EGBERTS ET AL.
monoklonale antilichamen op maat te snijden voor degewenste toepassing ('tailoring').
Naar analogie van B-lymfocyten die in vivo op een bepaald moment van hun
rijpingsproces de(sub)klasse vanhetgeproduceerde antigeen-specifieke antilichaam
kunnenveranderen('heavy-chain switch'),blijken ookinhybridomacultures metzeer
lage frequentie cellen te ontstaan dieantilichaam produceren met eenzelfde monoklonalespecificiteit, maarmeteenveranderde(sub)klasse.Naastdievan 'heavy-chain
switch'-variantenkomtinculturesvanhybridomaklonennogeenanderecategorievan
mutaties voor dieop B-lymfocyt-specifieke differentiatieprocessen gebaseerd is.Het
totaleantigeenreactiviteitsspectrum vanimmunoglobulines isnamelijk niet doorhet
resultaat vanderecombinatieprocessen opDNA-niveau tussendeverschillende,voor
onderdelen van immunoglobulineketens coderende, genetische eenheden definitief
vastgelegd, maarblijkt ook beïnvloedtewordendoor somatischemutaties diehierna
nog met relatief hoge frequentie in de voor de antigeenbindingsplaats coderende
sequentiesoptreden(Tonegawa, 1983).Fenotypischuitendezemutatieszichdooreen
veranderdespecificiteit en/of affiniteit vanhetgesynthetiseerde antilichaam voorde
betreffende antigenen (Rodwell et al., 1983;Diamond &Scharff, 1984). Indien de
toepassing van een monoklonaal antilichaam stringente eisen stelt aan specificiteit,
affiniteit of (sub)klasse, dan kan het lonen om via 'sib'-selectie protocollen, of met
een 'cell sorter', zulke varianten teisoleren uit een hybridomaculture dieeenmonoklonaalantilichaammetmatigegebruikseigenschappen produceert (Dangl&Herzenberg, 1982;Müller &Rajewski, 1983;Spira et al., 1984).
Somatische mutaties vinden ook plaats in andere delen van de immunoglobulinemolecule,hoewelmeteengeringere frequentie. Interessant indit opzichtzijn deleties
vaneendomein uit hetconstante deelvandezwareketen.Zokunnen tengevolgevan
eendeletievanhet C-terminaleCH-domeindetweeH-ketens vaneen immunoglobulinemoleculenietmeermetelkaar associëren, hetgeenresulteert indeproduktie door
decelvan zogenaamde HL-half-moleculen, waarvan deeigenschappen vergelijkbaar
zijn met Fab-fragmenten die via chemische procedures verkregen kunnen worden
(Yelton&Scharff, 1982).Mutaties inandereconstantedomeinen kunnen uitmonden
inhetverliesvanbepaaldeeffectorfuncties, zoalscomplement-fixatie eninductievan
cytotoxische reacties. Daarentegen kunnen unieke combinaties van effectorfuncties
ontstaan door het optreden van 'unequal crossing-over' tussen de beide homologe
chromosomen diedeinformatie voor het CH-deelvan deimmunoglobulinemolecule
bevatten,metalsgevolgdeproduktievaneenantilichaamwaarinconstantedomeinen
vandezwareimmunoglobulineketens vantweeverschillendesubklassenzijngecombineerd (Tilley et al., 1983).
Ook decombinatie vantweeverschillende antigeenbindingsplaatsen inéén immunoglobulinemolecule behoort tot demogelijkheden. Invitrokandit langschemische
wegtot stand gebracht worden door twee verschillende antilichamen tot half-moleculentedissociërenwaarbijreoxidatievandevrijkomendethiolgroepenwordtverhinderd.Omzettingvandethiolgroepenvanéénvandetweehalf-moleculen toteenreactieve verbinding bevordert vervolgens een gerichte reassociatie waaruit hybride bi-
DE HYBRIDOMATECHNIEK
(& (GK)
A0
(^ (a^
(KG) (GK\
0 A©
0A
AA
Fig. 19. Varianten vanimmunoglobulinemoleculen diedoor eenhybride hybridoma kunnen worden geproduceerd. L en H duiden op de respectievelijke lichte en zware keten van het immunoglobuline met de ene
antigene specificiteit, en bijgedragen door de ene ouderlijke myelomacel; K en G staan voor de overeenkomstige ketensvan het immunoglobuline met de andere antigene specificiteit, en afkomstig van de andere
myelomacel-fusiepartner. Slechts één van de tien mogelijke combinaties (aangeduid met een pijl) is een
werkelijk bispecifiek antilichaam.
specifieke immunoglobulinemoleculen ontstaan (Brennan et al., 1985). Hetzelfde
resultaat kan verkregen worden door twee hybridoma's, die ieder een monoklonaal
antilichaam met een gedefinieerde specificiteit produceren, met elkaar te fuseren
(Milstein&Cuello, 1984). Indefusieprodukten, dezogenaamdehybridehybridoma's,
komendeimmunoglobulineketens vanbeideouderlijke cellencodominanttotexpressie, enworden immunoglobulines gesynthetiseerd dieuit alle mogelijke combinaties
tussen de respectievelijke lichte en zware ketens bestaan (fig. 19).
Hieronder bevindenzichook antilichaammoleculen dieeendimeer vormenvande
combinaties tussen lichteenzwareimmunoglobulineketens dieworden aangetroffen
in elk vanbeide ouderlijke monoklonale antilichamen, endiezodoende beschikken
over twee verschillende antigeenbindingsplaatsen in één en dezelfde molecule. Deze
categorie vanbispecifieke antilichamen kan dan door zuiveringsmethodieken vande
andere ketencombinaties gescheiden worden.
Door recente ontwikkelingen in derecombinant-DNA-technologie kan het potentieel aan gemodificeerde immunoglobulinemoleculen nog verder worden vergroot.
Het feit dat dedomeinen van dezwareenlichte ketens elk in devorm van een apart
exoninhetgenoomzijn gecodeerdmaakt hetmogelijk dezenaar believentot nieuwe
structuren aaneenterijgen ('exonshuffling'), eninvectorennaar geschiktemyelomacellen over te brengen (fig. 20) (Morrison, 1985). De daaruit resulterende transfectoma'sblijkenzichidentiekaanhybridoma'stegedragen,enproducereninvitrozowel
als in vivo grote hoeveelheden van het gemodificeerde immunoglobuline. De
recombinant-DNA-technologie biedt ook de mogelijkheid een antigeenbindingsplaats van een immunoglobulinemolecule te koppelen met niet-immunoglobulinestructuren, waardoor 'antilichamen' met geheel nieuwe functionele eigenschappen
ontstaan (Neuberger et al., 1984).Ten slotte kan ook nog veel verwacht worden van
de toepassing van 'site-directed' mutagenesetechnieken, maar momenteel is onze
kennis van de 3-dimensionale structuur van de immunoglobulinemolecule, en de
67
68
E. EGBERTS ET AL.
Gen
Gen Construct Gen
Gen
Gen Construct Gen
VDJ
VDJ
CH1
Hinge [
CHI
Hinge
C
H2|
C
C
H3
CHS
H2
MensH-keten
Muis H-keten
Eiwit
Eiwit
Eiwit
Eiwit /
VJ
VJ
I
II
MuisL-keten
Mens L-keten
Muis-Mens
Chimeer
H-keten gen
I
Mens-Muis
chimeer antilichaam
Fig. 20. Constructie van transfectoma's. Via 'exon-shuffling' kan het exon voor het variabele gebied van
een zware keten van het muize-immunoglobuline gekoppeld worden met de exons die coderen voor het
constante deelvandezwareimmunoglobulineketen van demens. Dezechimaerestructuur wordt vervolgens
met behulp van een vector overgebracht in een niet-producerende myelomacel. Wanneer zoals in dit voorbeeld, gelijktijdig sequenties coderend voor de humane lichte immunoglobulineketen getransfecteerd
worden, kan integratie van beide elementen in het cellulaire genoom van de myelomacel resulteren in de
produktie van een chimaer mens-muis-immunoglobuline. Voor verklaring van de afkortingen, zie figuren
16en 17.
DE HYBRIDOMATECHNIEK
implicatieservanvoordeinteractiemetantigeenenhettot stand komenvan effectorfuncties, nog te gering voor een optimaal gebruik.
8.12 Conclusies
Monoklonaleantilichamen hebbeninkortetijd eenbelangrijkepositieveroverdinde
wereld van demedische en natuurwetenschappen, en dedaarop geëntetoepassingsgebieden. Heteindevandeontwikkelingen isechter nognietinzicht. Vergrotingvan
onze kennis omtrent de interactie van antigeen met antilichaam, en antilichaamafhankelijke fysiologische effectormechanismen, samen met een toenemend inzicht
indegenetischeregulatiemechanismen vandeantilichaamsynthese, vormenhetarsenaalwaaruit metmoleculair-biologische encelbiologischetechniekennieuwemodificaties en daarbijbehorende toepassingen van antilichamen ontwikkeld kunnen
worden.
69
9 Monoklonale antistoffen en diagnostiek
D. van Zaane
9.1 Inleiding
Bij de diergeneeskundige begeleiding in de veehouderij neemt de laboratoriumdiagnostiek van infectieziekten een belangrijke plaats in. Vaak is deze essentieel om een
voorlopigediagnoseopbasisvanklinischegegevenstebevestigen, of inzicht teverkrijgen in de verspreiding van infectieziekten voor bij voorbeeld ziektebestrijding of
export-certificering. Dergelijke testen zijn meestal gebaseerd op de zeer specifieke
reactie tussen antigenen afkomstig van de ziekteverwekker en daartegen gerichte
antistoffen, en worden gebruikt om de aanwezigheid van een bepaalde ziekteverwekker of daartegen gerichte antistoffen in een testmonster te onderzoeken. De antigeenantilichaam-reactie kan op zeer uiteenlopende wijzen zichtbaar gemaakt worden
(Roitt et al., 1985). De hiervoor gebruikte antilichaampreparaten werden tot voor
enkele jaren meestal verkregen door immunisatie van konijnen of andere dieren.
Deze op conventionele wijze bereide antisera bestaan door hun polyklonale oorsprong uit een zeer heterogeen mengsel van enerzijds antistoffen diedoor de immunisatie tegen verschillende antigenen van een micro-organisme opgewekt zijn, en anderzijds antistoffen die vóór de immunisatie al in het bloed aanwezig waren. Naast
antistoffen diemeteenbepaaldeziekteverwekker specifiek reageren zullenervaak ook
zogenaamde kruisreagerende antistoffen in deze reagentia voorkomen die verwante,
soms niet relevante, micro-organismen herkennen. Met moeizame absorptieprocedures zijn dergelijke antisera vaak, maar niet altijd, monospecifiek te maken.
Zowel de bereiding als de verdere bewerking van antisera zijn nauwelijks reproduceerbaar. Hierdoor zullen verschillende antiserum-batches vaak uiteenlopende reactiekarakteristieken hebben, waardoor ongewenste variaties in testuitslagen kunnen
optreden. Daarnaast isdevraag naar meer enverderverfijnde diagnostische techieken
deafgelopen jaren steeds toegenomen, onder andere door het vóórkomen van nieuwe
ziekten, deontdekking van nieuwevarianten van ziekteverwekkers, en de toegenomen
kennisvanhet ontstaan vaninfectieziekten, waaronder multifactorenziekten. Deeisen
dieaandetegebruiken immunologische reagentia gesteld wordenzijn daardoor steeds
zwaarder geworden.
In hoofdstuk 8wordt uiteengezet dat monoklonale antistoffen (MCA's) met slechts
één determinant van een antigeen reageren en daardoor zeer specifiek zijn. Dit maakt
MCA's tot zeer geschikte en waardevolle reagentia voor tal van bestaande en nieuwe
diagnostische testen. Verder zijn MCA's steeds reproduceerbaar en in hoge titer te
bereiden. Het gebruik van MCA's biedt verder de mogelijkheid om zo nodig een
(inter)nationale standaardisatie van diagnostische testen te realiseren. In dit hoofd70
MONOKLONALE ANTISTOFFEN EN DIAGNOSTIEK
71
stuk zal detoepassing van MCA's op dezegebieden nader toegelicht worden, waarbij
een onderscheid gemaakt wordt tussen de detectie van de ziekteverwekker zelf, en de
detectie van antistoffen die tengevolge van de infectie zijn onstaan (NRLO-Studierapport 14h, 1985; Van Zaane, 1984, 1987).
9.2 Antigeendetectie
Een aantal ziekteverwekkers vermeerderen zich tijdens de infectie zo sterk dat zij
rechtstreeks in het geïnfecteerde materiaal aantoonbaar zijn (bij voorbeeld varkenspestvirus in tonsillen, en tal van enteropathogene bacteriën en virussen in faeces). De
reactiemet specifieke antistoffen kanzichtbaar gemaakt worden met 'klasssieke' technieken zoals complementbinding, immunofluorescentie, immunohistochemie en
agglutinatie, of modernere technieken, zoals de 'enzyme-linked immunosorbent
assay' (ELISA) in verschillende uitvoeringen, en immuno-goudlabeling van preparaten voor elektronenmicroskopie (Roitt et al., 1985). In andere gevallen dient de
ziekteverwekker eerst geïsoleerd en in speciale voedingsmedia vermeerderd;te worden
voordat eerder genoemde technieken toegepast kunnen worden.
Detegebruiken antistoffen kunnen zowelpolyklonaal alsmonoklonaal van origine
zijn. Door het gebruik van MCA's met hun in de inleiding vermelde algemene voordelen, wordt echter in het algemeen een meer betrouwbaar en reproduceerbaar resultaat verkregen en treden vrijwel geen kruisreacties met andere micro-organismen op.
Veelbelangrijker isechter devooruitgang dieisgeboekt bij de differentieeldiagnostiek
van nauw verwante micro-organismen door het gebruik van stam-specifieke MCA's.
Nauw verwante micro-organismen bezitten naast veel geheel of gedeeltelijk gemeenschappelijke antigene determinanten, antigene determinanten die type- of stamspecifiek zijn. MCA's tegen deze specifieke determinanten kunnen geselecteerd
worden door deMCA's tetesten ten opzichte vanverschillendeverwante stammen. Na
een dergelijke karakterisering kan eenpanel van MCA's samengesteld worden dat met
elke stam een kenmerkend reactiepatroon oplevert; dit patroon kan als een soort
vingerafdruk beschouwd worden (tabel 8).Op deze wijze kan in het laboratorium bij
voorbeeld zeer snel en betrouwbaar onderscheid gemaakt worden tussen ziekteverwekkende (wildtype) varkenspestvirussen, vaccinvirussen en het antigeenverwante, maar veel onschuldiger, bovine-virus diarreevirus dat ook bij varkens voorkomt (Wensvoort et al., 1986). Voor de bestrijding van varkenspest is dat van groot
belang. Deze methode wordt eveneens toegepast voor de differentieeldiagnostiek van
rabiesvirus (Lafon et al., 1983)en poliovirus (Osterhaus et al., 1983).Tevenszijn door
deze methode nieuwe inzichten in de epidemiologie van een aantal infectieziekten
verkregen, en is de selectie van op maat gesneden vaccins tegen lokaal voorkomende
variantstammen mogelijk.
Een panel MCA's zoals vermeld in tabel 8 kan in allerlei technieken gebruikt
worden. Een elegante toepassing is een 'double antibody sandwich' ELISA (fig. 21)
waarbij elkeMCA uit het panel gekoppeld wordt aan een microtitercupje. Na dereactie met het testmonster en een wasstap, wordt een antilichaam-enzym-conjugaat toe-
72
D. VAN ZAANE
%-<• }
^
'A
drager MCAI
• enzymGîi;
virus MCA2
kleur
Fig. 21. Double antibody sandwich ELISA.
Tabel 8. Voorbeeld van differentieeldiagnostiek van pathogeenisolaten met verschillende type- of stamspecifieke monoklonale antilichamen.
Isolaat
MCA
/
A
B
C
D
E
F
G
test
+
+
+
+
+
+
+
+
2
+
+
+
+
+
+
+
+
3
4
5
6
+
+
+
+ • +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
7
+
8
+
+
+
+
-
+
-
9
+
10
+
+
+
-
11
+
+
12
+
-
-
+
13
14
-
-
15
16
-
17
-
18
-
-
-
+
-
-
- - + +
- - - +
- - _
+
- + +
+
- -
De MCA's 1,2en 3herkennen inbovenstaand voorbeeld alle stammen; zereageren blijkbaar met een conservatieve antigene determinant. MCA's 4 tot en met 9 herkennen sommige stammen maar andere niet;
deze stammen vormen een groep of type. De reactie met MCA's 10tot en met 18tenslotte is kenmerkend
voor één bepaalde stam. De weergegeven analyse geeft aan dat het testmonster stam E bevat.
gevoegddatmetallestammenkanreageren(bijvoorbeeldeenpolyklonaal antiserum,
ofMCA's1t/m 3).Tenslottekandebindingvanconjugaat zichtbaargemaaktworden
door deomzetting van eenchromogeen, hetgeen resulteert in een kleurontwikkeling
die met het blote oog of een ELISA-reader beoordeeld kan worden.
VeelalzaleeneerstetestnietuitgevoerdwordenmeteenpanelvanMCA's,maarmet
eenalgemenescreeningstest.Bijgebruikvaneentype-ofstam-specifieke MCA(4t/m
18intabel8)alscoatinginzo'ndiagnostischetestbestaatdekansdatdezetespecifiek
is en bepaalde stammen niet zal aantonen. Een goede karakterisatie van de te
gebruiken MCA's is dus een essentiële voorwaarde voor de ontwikkeling van een
betrouwbaretest.Dekansopontsnappenvanbepaaldestammenofnieuwevarianten
wordtverdersterkverminderddoorgebruiktemakenvanmengselsvangoedgekarakteriseerde MCA's, dietegen verschillende antigene determinanten gericht zijn.
9.3 Antilichaamdetectie
Tijdens eeninfectieziekte wordendoorhetafweersysteem antistoffen tegendeziekteverwekker gevormd. Hiervan wordt bij de diagnostiek van infectieziekten vaak
MONOKLONALE ANTISTOFFEN EN DIAGNOSTIEK
M
3]—
73
y—enzy™e,^
/A
drager antigeen antistof conjugaat
kleur
Fig. 22. Indirecte ELISA voor antistof-detectie.
gebruik gemaakt. Deaanwezigheid vanantistoffen tegen eenbepaalde ziekteverwekkerinhetbloedbetekent echter nietaltijd dat hetdier ook werkelijk eeninfectie met
deze ziekteverwekker heeft doorgemaakt. Immers, de antistoffen kunnen opgewekt
zijn dooreenvaccinatie,dooreencontact metkruisreagerende micro-organismen,of
kunnen bij jonge individuen afkomstig zijn van het moederdier. Als echter een
betrouwbareenspecifieke testbeschikbaar is,geenvaccinatiewordttoegepast, ende
aanwezigheid van maternale antistoffen uitgesloten is, duidt de aanwezigheid van
antistoffen opeendoorgemaakte infectie. Dezekanallanger geledenhebbenplaatsgevonden. Recenteinfecties toont menvaak aan door onderzoek van gepaarde sera,
die met een interval van ten minste twee weken zijn verzameld. Een vier- of meervoudige titerstijging wijst op een recente infectie. Daarnaast bestaat bij sommige
infectieziekten demogelijkheid door detectievan IgM-antistoffen, die voornamelijk
gevormdwordenbijeeneerstecontactmeteenantigeen,eenaanwijzing teverkrijgen
vooreenrecenteinfectie.Voorantilichaamdetectiemaaktmengebruikvaninhetlaboratorium bereide antigeenpreparaten, afkomstig van een ziekteverwekker; hiermee
onderzoektmenineerdergenoemdetechniekenofinhetteonderzoeken serumspecifieke antistoffen aanwezig zijn. Bij veeltesten, zoals indirecte immunofluorescentie
enELISA's,wordtdebindingvanantistoffen zichtbaar gemaakt dooreenreactiemet
eentweede antistof diereageert met deimmunoglobulines van deonderzochte diersoort (bij voorbeeld konijne-anti-varkensimmunoglobuline-antilichamen) engekoppeld is aan een fluorochroom, enzym, isotoop of aan gouddeeltjes (fig. 22). Het
gebruik van MCA's alstweede antistof biedt het voordeel dat steeds over een zelfde
goed gekarakteriseerd reagens met hoge titer beschikt kan worden. Met immunoglobulineklasse-specifieke MCA's kunnen ook zeer gevoelige ELISA-testen ontwikkeld worden voor de detectie van IgM-antistoffen. Polyclonale klassespecifieke reagentia zijn voor deze gevoelige testen vaak onvoldoende specifiek (Van Zaane &
IJzerman, 1984).
MCA's kunnen ook gebruikt worden voor de zuivering van micro-organismen of
hun antigenen door middel van affiniteitschromatografie. Hierbij worden deMCA's
aan een vaste drager gekoppeld, waarna het ruwe antigeenpreparaat over de drager
geleid wordt. Na wassen ishet mogelijk om een zuivere of sterk verrijkte antigeenfractie vandedragerteelueren.Hetaldusverkregenpreparaatkanvervolgensindiagnostischetestengebruiktworden.VanditprincipemaaktmenookgebruikbijdeontwikkelingvanELISA's.Deantistoffen wordendaarbij gekoppeld aaneenmicrotiterplaatje datalsvastedragerdient.Zokanuiteenruwantigeenpreparaat een specifieke
fractie direct aan hetplaatje gezuiverdworden.Vervolgenskaneenreactiemetspeci-
74 D.VAN ZAANE
M
enzyme"*'•
drager MCA antigeen antistof conjugaat kleur
Fig. 23. Indirecte double antibody sandwich ELISA.
fieke antistoffen plaatsvinden, diedoor debinding met een conjugaat eneen kleurreactie zichtbaar gemaakt wordt (fig. 23). Door selectie van goed gekarakteriseerde
MCA's is het zelfs mogelijk om het antigeen zo te binden dat voor de diagnostiek
belangrijke antigene determinanten optimaal geëxposeerd worden. Op dezewijze is
door Brücketal.(1982)eenELISAontwikkeldvoordedetectievanantistoffen tegen
hetbovineleukosevirusdiebijeennatuurlijkeinfectiehetsnelstenindehoogstetiter
gevormd worden.
Eengrootprobleembijhetgebruikvananti-immunoglobulinereagentiainindirecte
testen (fig. 22) is, dat elk aspecifiek gebonden Immunoglobuline uit het te onderzoekentestserum evengoedgedetecteerd wordtalsdeantigeen-specifieke antistoffen.
Hierdoorkunnenbijdezeindirectetestenvals-positieveuitslagenvoorkomen.Ditprobleem kan omzeild worden door gebruik temaken van eenblokking-of competitieopstelling. Dergelijke testen zijn gebaseerd ophetprincipedat specifieke antistoffen
inhettestmonsterinstaatzijndereactietussenantigeenengeconjugeerde antistoffen
teremmen. Bij deeenvoudigsteELISA-opstellingwordt antigeen aaneen microtiterplaatje gekoppeld; na incubatie met het testmonster wordt het antigeen-specifieke
conjugaat toegevoegd.Alsinhettestmonster specifieke antistoffen aanwezigzijnzal
de kleurontwikkeling geremd worden. Het gebruik van een monoklonaal-antistofconjugaat maakt dezuiveringvanhetantigeeninprincipeoverbodig. De specificiteit
vandereactiewordt immersvolledig bepaald door degebruikte MCA. Hierdoor zal
echtervrijgemakkelijk eenvariant,diedevoordetestessentiëleantigenedeterminant
mist, ontsnappen aan detectie. Door het antigeen via een andere MCA indirect aan
hetmicrotiterplaatjetebindenwordtdekansopontsnapping kleiner,aangeziendaarvoor veranderingen van twee verschillende antigene determinanten nodig zijn. Het
gebruik van MCA's tegen conservatieve determinanten, of mengsels van MCA's,
maakt de kans op ontsnappen van varianten vrijwel verwaarloosbaar.
Het laatstgenoemde typetest isenkelejaren geleden ontwikkeld door Houwers&
Schaake (1986) voor de detectie van antistoffen tegen zwoegerziekte bij het schaap
(fig. 24).Met behulp van dezeverbeterde test kunnen thans metgrote betrouwbaarheidgeïnfecteerde dierenopgespoord enuitdekoppelverwijderd worden. Doordeze
bestrijdingzijnindeafgelopenjarenveelkoppelsvrijgemaakt vanzwoegerziekte. Een
zelfde type test is ontwikkeld voor de bestrijding van de ziekte van Aujeszky bij
varkens (Van Oirschot et al., 1986). Deze virusziekte is wijd verspreid in de Nederlandse varkensstapel, en veroorzaakt veel schade. De ziekte wordt bestreden door
vaccinatie; deze leidt slechts tot een gedeeltelijke bescherming tegen de ziektever-
MONOKLONALE ANTISTOFFEN EN DIAGNOSTIEK
75
<
>
enzyme
enzyme
drager MCA1 antigeen MCA2
drager MCA1 antigeen MCA2
antigeen niet geblokkeerd door antistoffen
antigeen geblokkeerd door antistoffen
Fig. 24. Competitie-ELISA met negatief serum (links) en positief serum (rechts).
schijnselen, maar voorkomt niet de infectie met het virulente wildtype-virus. Met
behulp vanMCA'stegen glycoproteïneglvan het Aujeszky's diseasevirus ishet, op
eenvergelijkbarewijzealsvoorzwoegerziekte,mogelijk omantistoffen tegenditeiwit
aan te tonen. Hierdoor kan door middel van serumonderzoek een onderscheid
gemaakt worden tussen varkens die een infectie met wildtype-virus hebben doorgemaakt, endierendiegevaccineerd zijn metzogenaamdegl-negatievevaccins.Deze
laatstezullengeenantistoffen tegenglvormenwaardoorhunserum,ondanksdeaanwezigheid van andere antistoffen tegen het wildtype-virus, in een competitietest een
negatieveuitslagzalgeven(fig. 24A).Zokunnen zelfsineengevaccineerde populatie
(datwilzeggendierenmetantistoffen tegenhetAujeszky's diseasevirus)varkensdie
metwildtype-virus geïnfecteerd zijn endit nogkunnen uitscheiden, opgespoord (fig.
24B)enverwijderd worden.Ditmaakt indeNederlandse situatiemeteenhogevaccinatiegraadvoorheteerstdeuitvoeringvaneenbestrijdingsprogrammavandezeziekte
mogelijk. Zonder detoepassingvanMCA'swaseendergelijke test nauwelijks mogelijk geweest.
9.4 Overige diagnostische toepassingen
IndehumanegeneeskundewordenMCA'sthansookveelgebruikt voordeopsporing
enidentificatie vantumoren. Hierbij worden MCA'sgebruikt diespecifiek bepaalde
type tumoren herkennen, zoals melanomen en verschillende typen leukemieën. Met
dezeMCA'skunnentumorcellen inweefselpreparaten opgespoord en geïdentificeerd
worden.Ookishetmogelijk omradioactief gelabeldeMCA'sindebloedbaantebrengen,waarnadeophopingvanradioactiviteit intumorenmetbehulpvaneenröntgenscannerzichtbaargemaakt kanworden('immuno-imaging'). Dezemethoden zijneen
belangrijke hulp bij dediagnostiek van kanker, op geleide waarvan therapie ingezet
enhetverloopervangevolgdkanworden.Opdezelfdewijzekunnenookandere differentiatiestoornissen, bij voorbeeld van het immuunsysteem (immuundeficiënties),
gekarakteriseerd worden.DeselectieenkarakteriseringvanMCA'svoorditdoelvergt
een uitgebreide studie. De routinematige toepassing van deze technieken bij landbouwhuisdierenlijktonwaarschijnlijk, onderandereomdatopsporingentherapievan
tumorziekten en differentiatiestoornissen bij deze dieren niet rendabel is.
76
D. VAN ZAANE
De toepassing van MCA's bij de diagnostiek van biologisch belangrijke stoffen,
zoals hormonen, wordt in hoofdstuk 10behandeld.
9.5 Epiloog
De toepassing van MCA's bij de diagnostiek heeft geleid tot de verbetering van
bestaande,endeontwikkelingvannieuwetesten.Hierdooriseenbelangrijke vooruitgang bij deziektebestrijding geboekt. In het voorafgaande zijn devoordelen vande
toepassingvanMCA'sweergegeven,maarisookgewezenopenkeleproblemen diebij
hetgebruikvanMCA'skunnenoptreden(bijvoorbeeldhetontsnappenvanvarianten
aan een diagnostische test). In sommige gevallen kunnen MCA's ook kruisreacties
vertonen met antigenen diebiologisch gezien niet verwant zijn.
VerderisgeblekendatMCA'sdieineenbepaaldetechniekuitstekendreageren,voor
anderetechnieken nietgeschiktzijn. BijdeselectievanMCA'sdient daarom alrekeninggehoudentewordenmetdetechniekwaarinzetoegepastzullenworden.Debeste
resultaten worden bereikt door bij selectie dezelfde of een vergelijkbare techniek te
gebruiken als waarvoor de MCA's bedoeld zijn (Haaijman et al., 1984). Rekening
houdend met deze beperkingen isdetoekomst voor detoepassing van MCA's in de
diagnostiek voor deveehouderij rooskleurig.
10 Toepassing van monoklonale antistoffen in de voortplanting
P. Booman
10.1 Inleiding
Op het terrein van devoortplanting bij landbouwhuisdieren kunnen de volgende toepassingsgebieden van monoklonale antistoffen worden onderscheiden:
- de diagnostiek,
- de beïnvloeding van fysiologische processen door middel van passieve immunisatie,
- het fundamentele onderzoek.
In dit hoofdstuk worden enkelevoorbeelden hiervan besproken, waarbij-met name
getracht wordt aan te geven waarom monoklonale antistoffen (MCA's) bij de betreffende toepassing de voorkeur verdienen boven polyklonale antisera. Voor een uitgebreider overzicht van toepassingsmogelijkheden wordt verwezen naar Booman
(1988).
10.2 Diagnostiek
Met behulp vanMCA's kunnen immunologische bepalingen worden ontwikkeld voor
de kwalitatieve en/of kwantitatieve detectie van bij voorbeeld hormonen, anabolica,
residuen en genetische markers. Door de specificiteit van MCA's is het mogelijk de
antigenen aan tetonen in complexe mengsels. Bovendien laat het gebruik van MCA's
onderscheid toetussen zeer verwante stoffen. Specifieke antistoffen kunnen geproduceerd worden tegen onzuivere antigenen of zelfs tegen onbekende antigenen, wat bij
voorbeeld van belang is voor het onderzoek naar celoppervlakte-antigenen. De
constante kwaliteit en de vrijwel onbeperkte beschikbaarheid van MCA's maken
immunologische routinebepalingen in grote aantallen, en met een absolute herhaalbaarheid in de tijd, mogelijk. Bovendien kunnen met behulp van MCA's bepalingen
van hormonen en andere stoffen van dierlijke oorsprong internationaal gestandaardiseerd worden. Onderzoekresultaten zijn hierdoor beter onderling vergelijkbaar.
Een voor de veehouderij typisch voorbeeld van een diagnostische test betreft de
melkprogesterontest bij runderen. Langetussenkalftijden bij hetrund kunnen veroorzaakt worden door hetnietof foutief waarnemen vandetochtigheid. Viabepaling van
hetprogesterongehalte ineenmelkmonster, genomen ophetmoment van inseminatie,
kan dit worden gecontroleerd. Het progesterongehalte dient bij tochtigheid laag te
zijn. Tevensishet mogelijk 3weken na inseminatie vast te stellen of het dier drachtig
is. Bij drachtige dieren blijft het progesterongehalte hoog, in tegenstelling tot het
niveau bij niet-drachtige dieren. Op het Instituut voor Veeteeltkundig Onderzoek
77
78
P. BOOMAN
'Schoonoord' (IVO) is een gevoelige en eenvoudig uit te voeren microtiterplaatenzymimmunoassay ontwikkeld (Van deWiel&Koops, 1986),dieroutinematig door
de Gezondheidsdiensten voor Dieren wordt gebruikt. De resultaten kunnen zowel
spectrofotometrisch alsmethetbloteoogworden vastgesteld. Bijde melkprogesterontest gaat het om grote aantallen monsters, en voor een juiste interpretatie van de gemeten gehalten dient de test goed gestandaardiseerd te zijn. Het gebruik van MCA's
ligt dan ook voor de hand.
Voor de produktie van monoklonale antistoffen wordt het progesteron gekoppeld
aan eenvoor demuis lichaamsvreemd dragereiwit, waardoor het progesteron als antigene determinant of hapteen gaat fungeren. Progesteron is immers een steroïdhormoon, niet-soortspecifiek en daardoor voor de muis niet-immunogeen. Tegen de
verwachting in blijken de geproduceerde MCA's vaak aanzienlijke kruisreacties te
vertonen met verwante Steroiden, waarbij de plaats van binding van progesteron aan
het dragereiwit bepalend is(Booman etal., 1984a).Vanbelang hierbij isof dezekruisreagerende stoffen aanwezig zijn in het medium waarin progesteron bepaald moet
worden, in dit geval melk of plasma. Tevens blijkt dat de affiniteit (de mate van
binding van de antistof met het antigeen) van deMCA's erg varieert, en meestal lager
is dan van polyklonale antistoffen. De karakterisering van dergelijke monoklonale
antistoffen vergt veel tijd, en veelal zullen diverse fusies uitgevoerd moeten worden
voordat een monoklonale antistof gevonden wordt met zowel een goede specificiteit
als affiniteit in een bepaald testsysteem. Voor de melkprogesterontest is een polyklonaal antiserum beschikbaar dat zekerzogoed isalsdebestemonoklonale antistof.
Methet oogopdebeschikbaarheid vaneengoedebepalingsmethode oplange termijn,
of uit oogpunt van commercialisatie, wordt echter ondanks genoemde bezwaren de
voorkeur gegeven aan monoklonale antistoffen.
Inmiddels isopbasisvaneendoor hetIVOontwikkelde monoklonale antistof tegen
progesteron ook een 'cow-side' test ontwikkeld (fig. 25). De microtiterplaat-enzymimmunoassay heeft als nadeel dat het melkmonster eerst opgestuurd moet worden
naar een laboratorium, waarna de boer bericht moet krijgen over de uitslag. Eén en
ander kost 2 tot 3 dagen. De 'cow-side'-test kan de boer zelf uitvoeren en binnen 5
minuten weet hij de uitslag, zodat de dieren direct opnieuw geïnsemineerd kunnen
worden. Ook voor varkens wordt gewerkt aan een test voor een vroege-drachtigheidsdiagnose. In het bloed van drachtige varkens neemt tussen de 16e en 40e dag het
gehalte aan oestronsulfaat sterk toe (met een maximum op dag 28), terwijl het niveau
bij een cyclisch dier vrijwel constant blijft. MCA's bieden in dit geval niet alleen het
voordeel vanstandaardisatie; deMCA's kunnen tevensgeselecteerd worden op specificiteit voor oestronsulfaat. Polyclonale antisera zijn veelalgericht tegen oestron, waardoor eenextrahydrolyse-stapvereistis.Een bijkomend probleem voor eensnelledoehet-zelf test is dat geen melk beschikbaar is zoals bij koeien. Onderzocht wordt of
oestronsulfaat in de mest bepaald kan worden in plaats van in een bloedmonster.
Een laatstevoorbeeld vantoepassingvanmonoklonale antistoffen inde diagnostiek
betreft het sexen van runderembryo's, voorafgaand aan de transplantatie, met behulp
van antistoffen tegen het H-Y-antigeen. Van topkoeien uit de populatie wil men graag
MONOKLONALE ANTISTOFFEN EN VOORTPLANTING
Fig. 25. Met de 'cow-side' melkprogesterontest kan de boer zelf het juiste moment van inseminatie en
drachtigheid vaststellen.
zoveel en zo snel mogelijk nakomelingen verkrijgen. Daartoe worden deze koeien
gesuperovuleerd waardoor meereicellenvrijkomen, envervolgensgeïnsemineerd.De
bevruchte eicellenworden6tot 8dagen ernauit debaarmoeder gespoeld engetransplanteerd naar koeien die als draagmoeder fungeren. De veehouders willen graag
vrouwelijkenakomelingenvoorvervangingvandemelkveestapel.DeKI-verenigingen
willen inieder gevaleenmannelijke nakomeling, enbij vleesrassen wilmen bij voorbeeldgraagstierkalveren voordemesterij. Het sexenvanembryo'szoumogelijk zijn
metbehulp vanantistoffen tegenhet H-Y-antigeen, een histocompatibiliteitsantigeen
datuitsluitend opdeoppervlaktemembraan vanmannelijke cellenvoorkomt (Anderson, 1987; Booman, 1986). MCA's tegen het H-Y-antigeen worden verkregen door
vrouwtjes van een muize-inteeltstam met miltcellen van mannetjes van dezelfde
inteeltstam teimmuniseren (Boomanetal., 1989a).Algemeenwordtaangenomen dat
hetH-Y-antigeenniet-soortspecifiek is,zodatantistoffen tegenhetmuizeH-Y-antigeen
zullen kruisreageren met het H-Y-antigeen van bij voorbeeld runderen. Voor eentest
voorhetsexenvanembryo'szijnMCA'seenvereiste,aangezienhetH-Y-antigeenzwak
immunogeen isen immunisatie zodoende meestal resulteert in antisera met een lage
titer en affiniteit. De beschikbaarheid van goed polyklonaal antiserum is dan ook
uiterst beperkt. Getracht wordt op basis van de MCA's tegen het H-Y-antigeen een
fluorescentietest te ontwikkelen voor de geslachtsbepaling van 6tot 8dagen oude
runderembryo's (Booman et al., 1989b). De embryo's worden daarvoor volgens de
normale procedure voor embryotransplantatie gespoeld en gewassen. Vervolgens
79
/*
80 P.BOOMAN
Embryo's inkweekmedium
, A N = mannelijke specifiek
antigeenophet
celoppervlak
Inciibinatle van de embryo's mat de
^y
monoclonal« antistoffen
I
= monoclonal* antistof mat
£
san fluorescantiamarker
Wassenvande embryo's
omniet-gebonden antistoffen
teverwijderen
Alleen mannelijke
embryo's fluoresceren
Fig.26. Methode voor het bepalen vanhet geslacht van runderembryo's.
wordenzegeïncubeerdmetdeMCA'swaaraaneenfluorescentiemarkerisgekoppeld.
Ophetmannelijke embryobindendezeantistoffen aanhetH-Y-antigeen.Debinding
kan worden waargenomen met een fluorescentiemicroscoop (fig. 26).
De test kan op de boerderij worden uitgevoerd en zal in haar uiteindelijke vorm
slechtsanderhalf uurinbeslagnemen.Voorzovernubekend,wordtdelevensvatbaarheid van deembryo's niet nadelig beïnvloed.
10.3 Beïnvloeding vanfysiologische processen
De specifieke herkenning van een antigeen door MCA's kan gebruikt worden om
bepaalde fysiologische processen in vivo te beïnvloeden door middel van passieve
immunisatie. Aan onder meer devolgende toepassingen kan gedacht worden:
- PMSG(Pregnant MareSerumGonadotrophin) iseenhormoonpreparaat datveel
MONOKLONALE ANTISTOFFEN EN VOORTPLANTING
wordt gebruikt voor superovulatie van de donorkoe bij embryotransplantatie; toedieningvanMCA'stegenPMSGdirectnainseminatie kanhetteveelaan PMSGneutraliseren, waardoor het aantal winbare embryo's van goede kwaliteit kan toenemen
(Bouters et al., 1983);
- bij schapen zoutoediening vanMCA'stegenSteroidhormonen, zoals androsteendionentestosteron, hetaantalovulatiesendaarmeehetaantallammerenpermoederdier verhogen door een toename in de afgifte van gonadotrope hormonen (fig. 27)
(Webb et al., 1984); ook bij runderen zou van dergelijke MCA's gebruik gemaakt
kunnen worden.
Een toename van het aantal lammeren per moederdier kan ook door actieve in
plaats van passieveimmunisatie bewerkstelligd worden. In het algemeen isimmunoneutralisatie door actieveimmunisatie echter slecht reproduceerbaar. Desnelheiden
matevandeimmuunresponsverschillennietalleenaanzienlijk binnendesoort, maar
zelfs ook binnen rassen. Alleen bij diedieren die een antiserum van voldoende titer
opbouwen, resulteert de behandeling in het beoogde effect. Passieve immunisatie
daarentegenisinprincipegoedreproduceerbaar, enheeft integenstellingtot detrage
immuunresponsbijactieveimmunisatieeenonmiddellijkeneutralisatietotgevolg.Bij
voorbeeld in het geval van PMSG kunnen de antistoffen op een exact te bepalen
moment hun werkinggaan uitoefenen.
Aangezienvoorpassieveimmunisatierelatief grotehoeveelhedenantistoffen benodigdzijn, hebbenMCA'stenopzichtevanpolyklonaleantiserahetvoordeeldatzijin
praktischonbeperktehoeveelhedenteproducerenzijn.Deeerstecommerciëletoepassingvanin-vivotoedieningvanMCA'swaseenpreparaat gerichttegenK99,deadhehypofyse
CONTROLE OOI
GEÏMMUNISEERDE OOI
g e ï n a c t i v e e r d door a n t i s t o f f e n
Fig. 27. Door toediening vanmonoklonale antistoffen tegenonder meertestosteron neemt het aantalgeboren lammeren per moederdier toe.
81
82
P. BOOMAN
siefactor vanE. coli. Diarree bij pasgeboren kalveren ten gevolge van E. co//-infectie
kan daarmee behandeld worden. Kort daarna volgde op het terrein van de voortplanting decommerciëleintroductie vaneenpreparaat tegenPMSG. Erzalechter nog
geruime tijd overheen gaan voordat alle mogelijkheden die MCA's bieden volledig
benut zijn. Enkele beperkende factoren doen zichnamelijk voor bij passieve immunisatie. In de eerste plaats zijn, ondanks verbeterde celkweeksystemen, de produktiekosten van MCA's nog erg hoog, waardoor een aantal interessante toepassingsmogelijkheden nog niet rendabel zijn. Een tweede beperkende factor is dat het dier, na
ingespoten te zijn met MCA's, tracht de fysiologische processen in zijn lichaam zo
constant mogelijk te houden. Bij voorbeeld, na toediening van anti-steroïd-MCA's
probeert het dier zijn hormoonniveaus te herstellen via compensatoire produktie,
verschuiving van evenwichtsreacties, en mobilisatie van de betreffende hormonen uit
\etdepots (Booman et al., 1984b). Een laatste beperkende factor kan zijn de muizeof ratteorigine van MCA's bij toediening aan landbouwhuisdieren. Nadat de MCA's
zijn herkend als lichaamsvreemd, zouden antistoffen tegen demuize-MCA's gevormd
kunnen worden waardoor verdere toediening minder effectief is. Bovendien komen
volgensNose&Wigzell(1983)opimmunoglobulinesspecies-specifieke suikergroepen
voor, die van belang zijn voor bepaalde antistof-effectorfuncties. Hoewel de huidige
commercieel verkrijgbare anti-PMSG monoklonale antistoffen van muizeorigine
zijn, worden deze met succes gebruikt om PMSG te neutraliseren. Het is echter niet
bekend of herhaalde toediening in de tijd effectief blijft. Bij varkens resulteerde
herhaalde toediening van muize-MCA's in een duidelijke immuunrespons (Booman
et al., in voorbereiding). Vanuit het humane onderzoek is al langer bekend dat toediening van muize-MCA's aan patiënten in bijna alle gevallen een anti-muis-reactie
veroorzaakt, waardoor het therapeutisch effect wordt geneutraliseerd (Cole et al.,
1985).Deimmuunrespons isgedeeltelijk gericht tegen het constant gedeelte (isotype),
deels tegen het variabel, antigeen-bindend gedeelte (idiotype) van de immunoglobulinemolecule van de muis (Levy et al., 1984). Dat laatste heeft mogelijk consequenties
voor het gebruik van homologe MCA's voor passieve immunisatie. Homologe MCA's
zouden eveneens een anti-idiotype-respons kunnen opwekken.
Ondanks deze mogelijke complicaties zouden homologe MCA's met name voor
meervoudige passieve immunisatie voordelen kunnen bieden ten opzichte van muizeMCA's. In principe kunnen homologe MCA's worden geproduceerd via interspeciesfusies tussen bij voorbeeld runderlymfocyten en muize-myelomacellen, of door
gebruik temaken vaneencellijn vansoorteigen myelomacellen. Bij interspecies-fusies
zijn echter de meeste hybride cellen niet stabiel. De chromosomen van de minst stabiele oudercel worden in de loop der tijd uitgestoten, en de hybridoma's verliezen
meestal de eigenschap van antistofproduktie. Ondanks pogingen het systeem van
interspecies-fusies te optimaliseren, bleek deze benadering dan ook niet praktisch
bruikbaar.
De bron voor de isolatie van soorteigen myelomacellen wordt gevormd door
plasmaceltumoren. Defrequentie vanvoorkomen daarvan isechter bij demeeste landbouwhuisdieren, afgezien van pluimvee, zeer laag. Bovendien garandeert isolatie van
MONOKLONALE ANTISTOFFEN EN VOORTPLANTING
dergelijkecellennietdatzeookinkweektebrengenzijn,endatzegekloneerdengefuseerd kunnen worden.Tenslotte moeten demyelomacellen deantistofproduktie van
dete fuseren lymfocyten kunnen ondersteunen. In samenwerking met de vakgroep
Functionele Morfologie van de Veterinaire Faculteit Utrecht, en het Centraal Diergeneeskundig InstituutteLelystad(CDI),isgetrachteentussenwegtebewandelen.In
muize-myelomacellenzijn doormiddelvanfusies zoveelmogelijk eigenschappenvan
prolifererende lymfocyten afkomstig van een andere diersoort ingebouwd. Met de
aldusontstanerund-muis-heteromyelomacellenzijnvervolgenslymfocyten vangeïmmuniseerderunderen gefuseerd ommeerstabielehybridoma's teverkrijgen. Opdeze
wijze zijn reeds runder-MCA's ontwikkeld tegen rotavirus, een virus dat diarree bij
onderanderekalverenveroorzaakt, entegenPMSG(Boomanetal., 1990c).Momenteelwordt eenvergelijkend onderzoek uitgevoerd naar dekinetiek enhet neutraliserend vermogen van runder-MCA's ten opzichte van muize-MCA's tegen PMSG na
herhaalde toediening, in relatie tot de immunologische respons bij runderen.
10.4 Fundamenteel onderzoek
BijtoepassingvanMCA'sinhetfundamentele voortplantingsonderzoek isdewaarde
vaneenmonoklonaleantistof meestalgelegenindeuniekespecificiteit. Eenvoorbeeld
hiervanishetonderzoeknaardefactoren diedevoorbevruchtingvaneeneicelnoodzakelijke veranderingen aan despermatozoa bewerkstelligen. Dit veranderingsproces
wordt capacitatie genoemd. Capacitatie van despermacellen iseenvoorwaarde voor
in-vitrobevruchtingvaneicellenvanonderanderelandbouwhuisdieren. MCA'stegen
celoppervlakte-antigenen die alleen in gecapaciteerd sperma tot expressie komen,
kunnenindit onderzoek eenessentiële rolspelen(Mengeetal., 1983).Naast demeer
algemene toepassingsmogelijkheden van MCA's, zoals de zuivering van biologisch
actieve stoffen uit complexe mengsels, endebestudering van werkingsmechanismen
van bij voorbeeld receptoren en enzymen, kunnen MCA's aldus in uiteenlopende
onderzoekthema's behulpzaam zijn.
10.5 Conclusie
Met behulp van de hybridomatechniek is het mogelijk antistoffen met de grootst
mogelijke specificiteit in praktisch onbeperkte hoeveelheden te produceren. Een
belangrijk toepassingsgebied vanmonoklonaleantistoffen (MCA's)ophetterreinvan
devoortplanting isdediagnostiek. Enkelevoorbeelden hiervan zijn deontwikkeling
vanMCA'svoordrachtigheidstestenbijrunderenenvarkens,enhetsexenvanrunderembryo's voor transplantatie. Daarnaast kunnen MCA's aangewend worden voor
beïnvloeding van bepaalde fysiologische processen invivo door middel van passieve
immunisatie. Omdat MCA's vanwege hun muizeorigine in principe voor landbouwhuisdieren lichaamsvreemde eiwitten zijn en daardoor bij herhaalde toediening
afweerreacties oproepen, worden in samenwerking met het CDI en de Veterinaire
Faculteit MCA's geproduceerd afkomstig van cellen van dezelfde diersoort als die
83
f*
84 P.BOOMAN
welke met de antistoffen moet worden behandeld. Tegen onder andere PMSG, een
hormoon dat gebruikt wordt voor superovulatie, zijn op deze wijze reeds runderMCA's ontwikkeld. Ten slotte fungeren MCA's als hulpmiddel in het fundamentele
voortplantingsonderzoek.
11 Toepassing van monoklonale antistoffen bij het gebruik van
biologische produkten in de geneeskunde
A.D.M.E. Osterhaus en P. de Vries
11.1 Inleiding
Sindsdeintroductie vandehybridomatechnologiedoor Köhler&Milstein (1975) heeft
het gebruik van monoklonale antistoffen zijn intrede gedaan in het hele veld van het
biomedische onderzoek enereenwarerevolutieveroorzaakt. Vooralophetgebied van
deontwikkeling, produktie encontrolevanbiologischeprodukten, zoalsvaccins, antilichaampreparaten en immunomodulatoren, heeft het gebruik van monoklonale
antistoffen gedurende de laatste tien jaar grote invloed gehad.
11.2 Toepassing van monoklonale antilichamen bij de ontwikkeling van biologische
produkten
11.2.1 Definitie en selectie van immunogene structuren voor vaccinbereiding
Bij deontwikkeling van nieuwevaccins tegen infectieziekten bleek allereerst demogelijkheid om met behulp van monoklonale antistoffen antigene structuren en hun
variabiliteit tebestuderen tot ophet niveau vanindividueleantigenedeterminanten of
epitopen, vangrotewaarde (tabel9).Debestuderingvandevariabiliteit van influenza-,
rabies- en poliovirussen (Gerhard et al., 1981;Koprowski &Wiktor, 1980; Osterhaus
etal., 1983)vormden hiervan deeerstevoorbeelden, enleidden onder anderetot gedetailleerde antigene kaarten van de immunodominante structuren. De generatie van
zogenaamde escape-mutanten, die ontstonden door virussen aan te kweken in aanwezigheid van bepaalde monoklonale antistoffen, maakte het mogelijk om antigene
drift invitro na te bootsen, en antigenen dieonder invloed van immunologische druk
kunnen veranderen te identificeren. Met behulp van competitie-assays, gebruik-
Tabel 9. Gebruikvanmonoclonaleantistoffen t.b.v.deontwikkeling van nieuwe vaccins.
Bestudering antigene structuur en variabiliteit
Definitie, selectie en produktie van immunogene structuren
conventionele kweek
recombinant-DNA-synthese
peptidesynthese (pepscan methode)
Ontwikkeling van anti-idiotypische vaccins
85
86
A.D.M.E. OSTERHAUS EN P. DE VRIES
makend van direct gelabelde monoklonale antistoffen, bleek het eveneens mogelijk
om een 'mapping' van aldan niet voor deinductievan voor virusneutralisatie belangrijke epitopen uit te voeren op virusisolaten van epidemiologisch verschillende herkomst. Dit maakte het mogelijk om te komen tot een betere definitie en selectie van
immunogene structuren die minimaal in preventieve vaccins aanwezig dienen te zijn.
Dit geldt zowel voor de thans algemeen gebruikte op conventionele wijze geproduceerdelevendeof geïnactiveerde vaccins, alsvoor nieuwegeneraties geproduceerd met
behulp van recombinant-DNA- en peptidesynthese-technieken. Vooral ook voor de
zogenaamde pepscan-methode (Geysen et al., 1984), waarbij het mogelijk is om op
basis van bekende aminozuursequenties grote aantallen peptiden te synthetiseren, en
immunologisch relevantegebieden optesporen door hun reactiviteit met antilichaampreparaten te bepalen, is het ter beschikking komen van panels van monoklonale
antistoffen van cruciaal belang.
11.2.2 Anti-idiotype-vaccins
Eengeheelnieuwebenaderingswijze omvaccinstegeninfectieuze agentiateontwikkelen, lijkt gelegen te zijn in het gebruik van elementen van het immuunsysteem zelf in
plaats van externe antigenen: anti-idiotypische antistoffen (fig. 28;zievoor een overzicht UytdeHaag et al., 1986). Deze benaderingswijze is gebaseerd op de netwerktheorievanNielsJerne,engaat ervanuit dat er 'internal images' vanexterne antigenen
moeten bestaan. Lymfocyten dieverantwoordelijk zijn voor hetontstaan van cellulaire
en humorale immuniteit gaan via complementaire receptoren (T-cel-receptoren op Tcellen, en immunoglobulines op B-cellen) onderlinge interacties aan. Deze receptorreceptor-interacties tussen T-en T-, tussen T-en B-, en tussen B-en B-cellen kunnen
leiden tot zowel stimulatie als onderdrukking van immuunfuncties, en zijn verantwoordelijk voor eenevenwichtigebalans binnen het immuunsysteem diebij voorbeeld
door eenbinnendringend organismeverstoord kanworden. Eeninfectie zal vervolgens
een immuunrespons opwekken die uiteindelijk in gunstige gevallen resulteert in het
onschadelijk maken van het infectieuze agens, en eenhernieuwde evenwichtige balans
tussen de elementen van het immuunsysteem.
Het feit dat receptoren van lymfocyten (bij voorbeeld antistofmoleculen), die via
hun variabele deel dezeantigene determinanten kunnen binden, ook onderlinge complementariteit vertonen impliceert dat antistoffen in staat kunnen zijn zulke antigene
determinanten na tebootsen. Ditprincipevan 'antigenic mimicry'vormt debasis voor
hetgebruik vananti-idiotypische antistoffen alsvaccins(fig.28).Intalvan experimentele modellen is nu aangetoond dat anti-idiotypische antistoffen, gericht tegen antigene determinanten gelegen in de bindingsplaats van antistoffen met specificiteiten
voor parasitair, bacterieel, viraal antigeen en tumor-antigeen, in staat zijn een specifieke immuniteit tegen de respectievelijke antigenen op te wekken in afwezigheid van
deze antigenen zelf. Veel voorbeelden van het gebruik van anti-idiotypische antistoffen voor het opwekken van zowel B-als T-cel-gemedieerde immuniteit in parasitaire,
bacteriële en virale systemen zijn inmiddels gepubliceerd (Osterhaus & UytdeHaag,
MONOKLONALE ANTISTOFFEN EN GENEESKUNDE
oppervlakte
antigeen
VIRUS
*
r
-Y
. ^
/ ^ ^ T T ^
m i l t - < ^ ^ # )
cellen
^ _
' ^ ^
neutraliserende
antistof
abl
P P R
V7
'anti-idiotypische tweede panel
antistof,ab2
vanmonoclonale
antistoffen
virale
receptoren
resnons
immuunreactie
ontvanger
ab3neutraliantistofab3 seert virus
evaluatie
d.m.v.
competitietest
gepoolde ab2
gebruikt
als
vaccin
muis
ab 2
W
Virus
Fig. 28. Principe van inductie van antivirale antistoffen met behulp van ami-idiotypische antistoffen, ab
= antilichaam.
1990). Wanneer uiteindelijk inderdaad idiotypische structuren worden gebruikt voor
de inductie van specifieke immuniteit, lijkt het onder andere om produktietechnische
redenen het meest voor de hand liggend omhiervoor murine ofwellicht humane
monoklonale antistoffen als basis te gebruiken.
11.2.3 Gebruik van monoklonale antistoffen in vivo
Het direct gebruik van monoklonale antistoffen invivo blijkt enerzijds van interesse
bij 'imaging' van tumoren, en anderzijds voor therapie- en preventiedoeleinden (tabel
10).
De risico's enbeperkingen inrelatie totdewijze van produktie van monoklonale
antistoffen lijken vooral gelegen inmogelijke contaminatie vanhettoetepassen
produkt metnucleïnezuren meteventuele transformerende eigenschappen, en met
virussen die bij muizen enratten voorkomen. Het eerste risico lijkt door middel van
goede produktie- enzuiveringsprocedures, te testen inbij voorbeeld 'dot blot'-
87
A.D.M.E. OSTERHAUSEN P. DE VRIES
Tabel 10. Mogelijke toepassingen van monoclonale
antistoffen bij de mens.
In-vivo beeldvorming tumoren
Therapie en preventie
oncologie
orgaantransplantaties
'schoning' beenmergsuspensies
infectieziekten
allergieën/auto-immuunziekten
vergiftigingen/geneesmiddelenoverdosering
drug-targetting
hybridisatie-assays,grotendeelsteelimineren.Deafwezigheid vaneventueelhumaanpathogene virussen in deze produkten lijkt slechts door een uitgebreid controlesysteem en goed gecontroleerde en gevalideerde produktiemethoden te garanderen
(Gezondheidsraad, no. 1986/21).
11.3 Toepassing vanmonoklonale antistoffen bijdeproduktie van biologische
produkten
Het direct gebruik van monoklonale antistoffen bij de produktie van biologische
produkten, isvooral gelegeninimmunoaffiniteitschromatografische (IAC)procedures. Door monoklonale antistoffen te gebruiken met specificiteit voor hetzij de te
zuiveren component, hetzij bepaalde verontreinigingen, kan men respectievelijk
genoemdecomponent directzuiverenofdeverontreinigingverwijderen (fig. 29). Veel
voorbeelden hiervan zijn inmiddels bekend. Degezuiverde component kan bij voorbeeldeengeheelmicro-organismeofviruspartikelzijn(Rimmelzwaanetal., 1987), of
een bepaalde immunogene component ervan (DeVries et al., 1988).Wanneer aldus
ongezuiverde componenten bij voorbeeld als onderdeel van een vaccin worden
gebruikt is incorporatie ervan in multimere antigene presentatievormen zoals liposomen of iscoms nodig (De Vries et al., 1988;Morein et al., 1984).
11.4 Toepassing vanmonoklonale antistoffen bijdecontrole vanbiologische
produkten
Ook bij de controles van biologische produkten worden steeds vaker monoklonale
antistoffen gebruikt (tabel 11). Werden vroeger voor vele controledoeleinden polyklonale antisera gebruikt, degrote specificiteit, beschikbaarheid en standaardisatiemogelijkhedenvanmonoklonaleantistoffen hebbenertoegeleiddatdezethansveelal
devoorkeur verdienen. Dit geldt niet alleenvoor zogenaamde identiteitsbepalingen,
maar tevens voor de kwantificering van immunogene componenten. Ook het aantonen en kwantificeren van notoire contaminanten zoals bovine serum albumine
MONOKLONALE ANTISTOFFEN EN GENEESKUNDE
doorloop
gebonden
fractie
Fig. 29. Principe van immunoaffiniteitschromatografie met behulp van monoklonale antistoffen.
(BSA), kan routinematig met behulp van simpele ELISA-systemen, gebruikmakend
van BSA-specifieke monoklonale antistoffen, geschieden (Ter Avest et al., 1987).
Omdatvelevirusvaccinsnogopprimaireanimalecellenwordengeproduceerd, ishet
noodzakelijk om de afwezigheid van animale virussen in het produkt aan te tonen.
Hiertoe voert men in-vivo en in-vitro isolatieprocedures uit, waarbij het vaccinvirus
met behulp van een specifiek antiserum in zijn vermeerdering wordt geremd. Juist
door de hoge specificiteit en de hoge biologische activiteit die met monoklonaleantistofpreparaten kunnen worden verkregen, zijn deze ook voor dit doel meer
geschikt dan conventionele polyklonale antiserumpreparaten.
Tabel 11. Gebruik van monoclonale antistoffen voor controles van virale
vaccins.
Vaststelling identiteit
Kwantificering van immunogenen
Kwantificering/aantonen van contaminanten
Neutralisatievaccin-virusbijin-vivo/in-vitro aantonen vanvreemde agentia
89
90
A.D.M.E. OSTERHAUS EN P. DE VRIES
11.5 Conclusie
Concluderend maggesteld worden dat zowelbij deontwikkeling vannieuwegeneraties biologische produkten, als bij deproduktie encontrole van zowelbestaande als
nieuwe biologische produkten, monoklonale antistoffen een essentiële rol spelenen
reeds vele nieuwe ontwikkelingen hebben mogelijk gemaakt.
12 Vanmonoklonale antistoffen tot veterinaire farmaca
J.Th. Gielen
12.1 Inleiding
Deafgelopen jaren zijn erbelangrijke technische vorderingen gemaakt bij de ontwikkeling en produktie van monoklonale antistoffen (MCA's). Het is daarom niet verwonderlijk dat de MCA's een breed toepassingsgebied hebben gevonden sinds de
introductie van de hybridomatechnologie door Köhler &Milstein in 1975.Naast het
gebruik in de biologische en medische research beginnen toepassingen in de kliniek,
land- en tuinbouw, veehouderij en industriële biotechnologie zichtbaar te worden.
Mogelijke toepassingen van MCA's in de veehouderij vindt men in de:
- diagnostiek;
- preventie en behandeling van virale en bacteriële infecties;
- eliminatie van farmaca en toxinen;
- manipulatie van fysiologische processen, zoals regulatie van groei en voortplanting.
Zoals uit de vorige hoofdstukken blijkt, worden MCA's reeds in diverse diagnostischetestentoegepast. Voor deoverigetoepassingsgebieden zijn tot opheden nog maar
twee farmaceutische preparaten ontwikkeld. Het eerste farmacon, Genecol™ 99 , dat
MCA'stegenEscherichia colitypeK99bevat, werdin 1983geïntroduceerd. Dit preparaat wordt oraal toegediend aan neonatale kalveren ter voorkoming van diarree door
een infectie met E. coli type K99. In juni 1987 werd het eerste MCA-bevattende farmacon voor parenterale toediening, Neutra-PMSG, geïntroduceerd. Deze monoklonale antistof tegen PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotrophin) wordt gebruikt
om het restant van het exogene gonadotropine tijdens een superovulatiebehandeling
te neutraliseren.
In het hierna volgende zullen de verschillende stappen die nodig zijn om van een
monoklonale antistof tot een farmacon voor veterinairetoepassing tekomen, besproken worden.
12.2 Marktanalyse
De ontwikkeling van een MCA voor veterinaire toepassing kan in principe bepaald
worden door eenvraag vanuit depraktijk, of door het beschikbaar komen van nieuwe
(bio)technologische ontwikkelingen. Genecol™ 99 is ontwikkeld om het probleem
van E. co/;'-diarree bij neonatale kalveren te voorkomen. E. co/;-bacteriën type K99
dragen het pilusantigeen K99 en kunnen zich daarmee aan de darmwand hechten.
Door kalveren kort na de geboorte passief tegen K99 te immuniseren, worden aan91
92
J.TH. GIELEN
hechting en kolonisatie van deE. co//-bacteriënvoorkomen. Op dezemanier kan men
de sterfte door E. co//-diarree bij jonge kalveren aanzienlijk verminderen.
Bij de inductie van superovulatie met PMSG blijkt de lange halfwaardetijd van
PMSG nadelig te zijn voor de ontwikkeling van de embryo's (hoofdstuk 3).Dit nadeligeeffect vanPMSG kan echter voorkomen worden door dedierentijdens de oestrus
te behandelen met een antiserum tegen PMSG (Bouters et al., 1983).Door Dieleman
etal. (1989)isaangetoond dat toediening van een monoklonale antistof tegen PMSG,
Neutra-PMSG, kan leiden tot een kwantitatieve en kwalitatieve verbetering van de
embryonale ontwikkeling.
Datdemarkt voortoepassing vanMCA'snietalleenafhankelijkisvandetechnische
ontwikkelingen binnen de hybridomatechnologie blijkt uit de volgende voorbeelden:
- Door de ontwikkeling van 'cow-side' testen kan deveehouder of dierenarts zelf de
test uitvoeren en ismen niet meer afhankelijk vangespecialiseerde laboratoria. Doordat deresultaten snelbekend zijn kan eentestvoor diverseindicatiesgebruikt worden.
Hierdoor is het gebruik van in-vitro diagnostica, zoals de progesterontest (hoofdstuk
10), sterk toegenomen.
- Door het beschikbaar komen van farmaceutische preparaten die in staat zijn om
MCA's gedurende een periode van weken tot maanden af te geven, zijn er perspectieven voor indicaties waar passieve immunisatie over een langere periode gewenst is.
Hierbij kan men ook denken aan MCA's tegen somatotropine, zoals BST. Normaliter
verwacht men van dergelijke antistoffen dat deze de werking van het somatotropine
neutraliseren. Sommige specifieke MCA's tegen het groeihormoon hebben echter de
eigenschap om de biologische activiteit, zoals stimulering van groei en lactatie, teversterken in plaats van te remmen.
- Toepassing van recombinant-DNA-technieken heeft geresulteerd inhet maken van
chimaere MCA's, opgebouwd uit componenten van bij voorbeeld muis en rund. Deze
gerecombineerde immunoglobulinesbestaan uiteenantigeen-bindend stuk afkomstig
van de muis, en het resterende deel van het rund. Op deze manier hoopt men de kans
op een eventuele immuunrespons van de koe tegen de MCA sterk te reduceren.
12.3 Ontwikkelingskosten
Naast de selectie en produktie van deMCA's worden de ontwikkelingskosten van een
farmacon vooreenbelangrijk deelbepaald door defarmaceutische vormgeving enhet
effectiviteits- en kwaliteitsonderzoek. De ontwikkeling van Genecol™ 99 en NeutraPMSG heeft aangetoond dat het voldoen aan devraag vanuit de praktijk economisch
verantwoord was.Voor nieuw te ontwikkelen farmaca zaltelkens opnieuw zorgvuldig
afgewogen moeten worden of het economisch verantwoord isom een ontwikkeling te
starten of tecontinueren. Vaak zijn aan het begin van de ontwikkeling van een farmaceutisch preparaat de ontwikkelingskosten en daarmee samenhangend de uiteindelijke kostprijs van het farmacon niet exact te bepalen. Afhankelijk van het marktpotentieel zaldanbesloten wordenom deontwikkelingwelof niettestarten.Als voorbeeld kandeinhoofdstuk 10genoemdepassieveimmunisatie tegen geslachtssteroïden
VAN MONOKLONALE ANTISTOFFEN TOT VETERINAIRE FARMACA
93
aangehaald worden. Door ooien te behandelen met een MCA tegen testosteron worden er meer lammeren geboren. De vraag is echter of de veehouder deze extra opbrengst aan lammeren wel wil in ruil voor de op dit moment nog (te) hoge behandelingskosten en extra werkzaamheden.
12.4 Karakterisering van de MCA
Om te bepalen of een antistof-producerende hybridomakloon een commerciële toepassing kan vinden, zijn de volgende criteria van belang:
- stabiliteit en produktiecapaciteit van de hybridoma,
- specificiteit en affiniteit van de antistof,
- biologische activiteit van de antistof,
- kruisreactiviteit van de antistof.
Tijdens deeerstescreeningvandehybridomacellen wordt geselecteerd op aanwezigheid van antistoffen gericht tegen het antigeen. Cellen die een goede groei en hoge
antistofproduktie vertonen, worden vervolgens gebruikt voor de produktie van kleine
hoeveelheden MCA om de biologische activiteit te kunnen bepalen. Bij de ontwikkeling van Neutra-PMSG werd bij voorbeeld het neutraliserend vermogen van degeïsoleerdepositief metPMSG reagerendeMCA'sgetestinvijf daartoe speciaal ontwikkelde testen; een in-vitro neutralisatietest, en in-vitro en in-vivo bioassays. In tabel 12is
het neutraliserend vermogen van een aantal MCA's tegen PMSG weergegeven. MCA's
dieinvitroPMSG effectief neutraliseerden, werdengebruikt voorbepalingvandebiologische activiteit in vivo. Net als in vitro was de activiteit van de diverse MCA's ook
in vivo duidelijk verschillend. Tijdens een superovulatiebehandeling van koeien met
3000 IU PMSG was er van een bepaalde MCA 60-80 mg nodig om het resterende
PMSG teneutraliseren. VandeMCA diegebruikt isvoor deontwikkeling van NeutraPMSG bleek daarentegen slechts 1 mg nodig tezijn. Deze MCA, een IgGl, blijkt een
erg hoge affiniteit voor PMSG te bezitten.
12.5 Produktie van MCA's
12.5.1In-vivo produktie
Tot voor kort was de meest gebruikte methode om MCA's te produceren de in-vivo
produktie van ascites.Hierbij worden dehybridomacellen indebuikholte van muizen
Tabel 12. In-vitro neutraliserend vermogen vanverschillende MCA's tegen PMSG. Weergegeven ishet aantal
eenheden (IU) PMSG dat door 1mg MCA geneutraliseerd wordt.
MCA
A
B
C
D
IU PMSG
60
401000
401000
4000
E
>8000
F
G
4000
2000
94
J.TH. GIELEN
gespoten, en wordt de ascitesvloeistof twee tot drie weken later verzameld. Hierin
bevindt zich per muis gemiddeld 50mg MCA. Deze produktiemethode is echter om
de volgende redenen niet meer aantrekkelijk:
- De hybridomacellen groeien slechts in histocompatibele of immuun-suppressieve
dieren. Zo kunnen runder-MCA's niet in muizen geproduceerd worden.
- De opbrengst aan MCA is erg variabel, en controle op de produktie is niet mogelijk.
- Ascitesvloeistof bevat naast de MCA diverse andere ongewenste stoffen zoals
eiwitten en mogelijk virussen. Dit veroorzaakt extra problemen bij het zuiveren.
- De in-vivo produktie draagt niet bij tot een vermindering van het gebruik van
dieren voor experimenten en produktie. Voor de produktie van 1kg MCA zijn meer
dan 20 000 muizen nodig!
12.5.2 In-vitro produktie
Om de MCA's op grotere schaal in vitro te kunnen produceren zijn verschillende
methodes ontwikkeld (Lindl, 1988), namelijk:
- Het kwekenvan cellen insuspensieinbioreactoren (Birch etal., 1985).Dehybridomacellen worden bij deze methode in grote fermentoren (inhoud honderd tot duizenden liters) gekweekt. Naast het voordeel van relatief eenvoudige produktie op grote
schaal door het werken met grote volumina, is het nadeel van dit systeem de erg lage
concentratie aan cellen engeproduceerde antistof. Bovendien isondanks deontwikkeling van airlift-fermentoren (menging van medium door middel van zuurstofbelletjes
in plaats van een roerder), de mechanische belasting voor de cellen door het mengen
nog hoog.
- Demicro-encapsulatietechniek waarbij decellen inmicrocapsules verpakt worden
(Posillico, 1986).Het kweken vindt plaats ingrote (airlift-)fermentoren. Om debovengenoemde mechanische belastingteverminderen heeft men decellen in microcapsules
ingesloten. Bovendien bereikt men met deze methode hogere celconcentraties in het
medium.
- Het holle-vezel-dialysesysteem (Schönherr et al., 1987).Dein-vivo kweekmethode
vormde de basis voor het holle-vezel-dialysesysteem (fig. 30). Een detail van de, oorsponkelijk voor hemodialyse (kunstnier) ontwikkelde, holle-vezel-bioreactor is weergegeven in figuur 31. Voor de produktie van MCA's wordt een chemisch gedefinieerd
medium gebruikt dat géén serum en eiwitten bevat. Dit laatste is een groot voordeel
bij de zuivering van het produkt. In het extracapillaire compartiment van de hollevezel-bioreactor zitten de hybridomacellen in hoge concentratie. De voedingsstoffen
enzuurstof worden door het intracapillaire medium getransporteerd enkomen viadiffusie door de dialysemembraan bij de cellen. Dit membraan houdt macromoleculen
tegen waardoor de immunoglobulines zich in de extracapillaire ruimte ophopen. De
afvalstoffen worden weer via de vezels afgevoerd. De geproduceerde MCA's worden
semi-continu (tweekeerper week)geoogst. Om eenindruk van de produktiecapaciteit
tekrijgen, isintabel 13 deopbrengst vaneenaantal hybridoma-cellijnen weergegeven.
VAN MONOKLONALE ANTISTOFFEN TOT VETERINAIRE FARMACA
Zintuigen
regelen
de voeding
(Kunst)hart
pompt voeding
naarde
cellen
(Kunst)longen
voor
zuurstof
KweekruJmtevoor cellen
(kunst)buikholte
of kunstnier
(cellen: O produkt:) )
Afvalprodukten
van de cellen
Voeding voor de cellen
Oogsten van
het produkt
Fig. 30. Produktie van monoklonale antistoffen in een kunstmuis. Het kweken van cellen in de buikholte
van eenmuis kan nagebootst worden ineenholle-vezel-bioreactor (kunstnier). (Uit: Farmakopij nr. 8, 1985,
AKZO Pharma.)
Oxygen/nutrient
Metabolit«s/C0 2
Metabolites/C0 2
Fig. 31. Holle-vezel-bioreactor. De cellen groeien in de extra-capillaire ruimte van de bioreactor. Door het
dialysemembraan vindt uitwisseling plaats van de voedingsstoffen, gassen en afvalstoffen. (Uit: Research
within AKZO, 1987.)
95
96
J.TH. GIELEN
Tabel 13. ProduktievanMCAineenholle-vezel-bioreactor (Schönherr & Van Gelder, 1987).
MCA
Hybridoma
kloon
concentratie
(g/l)
produktie
(g/l per dag)
totale produktie
per week (g)
A
B
C
D
E
2,9
4,9
3,1
7,8
13,1
0,9
1,5
0,8
2,2
2,8
Al
66
53
136
202
Momenteel wordt er nog veel onderzoek verricht om het produktiesysteem voor
MCA's te optimaliseren. Een bioreactor die de voordelen van zowel de fermentorkweek als de dialysekweek combineert wordt als ideaal gezien op grond van:
- het grote volume,
- de hoge celdichtheden die ermee bereikt kunnen worden,
- de mogelijkheid tot continue bewaking van de kwaliteit van cellen en medium,
- het gebruik van chemisch gedefinieerd medium zonder serum of eiwitten,
- demogelijkheid om regelmatigMCAvan debioreactor teverzamelen voor verdere
verwerking,
- de produktie van MCA over langere tijd (enkele maanden).
12.6 Zuivering
Het zuiveringsproces van het kweekprodukt blijkt niet voor iedere MCA hetzelfde te
zijn. Ditbetekent dat er,naast despecifieke kweekcondities, voorelkeMCA eenzuiveringsmethode moet worden ontwikkeld. Bij de zuivering moeten alle niet-specifieke
antistoffen, brokstukken en aggregaten van immunoglobuline, DNA, virussen en
overige verontreinigingen verwijderd worden.
12.7 Farmaceutische vormgeving
Om de MCA tegen PMSG in een hoeveelheid van 5 ml intraveneus te kunnen toedienen, moest een stabiele oplossing ontwikkeld worden. Net als bij de produktie en
zuivering bleek ook hier voor elke MCA een specifieke farmaceutische formulering
nodig te zijn. De ontwikkeling van een dergelijke formulering, met name het stabiliteitsonderzoek, is een tijdrovende aangelegenheid.
VANMONOKLONALE ANTISTOFFEN TOT VETERINAIRE FARMACA
97
12.8 Kwaliteitscontrole
Dekwaliteitscontroleiseenzeerbelangrijk enomvangrijk onderdeelvandeontwikkeling van nieuwe produkten zoals MCA's. Talvan testen zijn nodig om deveiligheid
(voormens endier) eneffectiviteit tekunnen waarborgen. Enkelevoorbeelden zijn:
- Karakterisering van de hybridoma en stabiliteitsonderzoek van de hybridomacellijn.
- Testen op aanwezigheid van mycoplasma en virussen in de hybridoma-cellijn.
- Validatie van de produktie-, zuiverings- en virusinactiveringsmethode, onder
andere door aan tetonen dat virussen enDNAnatoevoegen aan het kweekprodukt
geïnactiveerd en verwijderd worden.
- KarakteriseringvandeMCA;onderanderemetbiochemische,immunologischeen
biologische parameters aantonen dat deMCAin alleproduktiepartijen identiekis.
- Testen van farmacon; steriliteit, stabiliteit en activiteit.
- Farmacologisch onderzoek, farmacokinetiek en farmacodynamiek.
/
- Toxicologisch onderzoek.
- Onderzoek naar dekruisreactiviteit van deMCA met andere lichaamseigen stoffen.
Het ligt voor de hand dat aan een MCA die éénmalig oraal wordt toegediend
(Genecol™99) andere eisen gesteld worden dan aan een stof diediversemalen intraveneus wordt gegeven (Neutra-PMSG). Bij de laatste stof zal het onderzoek naar
onder andere kruisreactiviteit en het eventueel optreden van anafylactische reacties
zwaarder wegen. Demuize-MCA tegen PMSG isvoor het rund eenvreemd element
enzalinprincipeeenimmuunresponsinduceren. Bijkoeiendietijdens diversesuperovulatiebehandelingen Neutra-PMSG kregen toegediend, zijn echter geen nadelige
effecten waargenomen.
12.9 Klinisch onderzoek enregistratie
AlseenMCAtot dezefasevan deontwikkeling tot eenfarmacon is doorgedrongen,
danhangthetvanderegistratie-autoriteiten afwanneerdestoftoegelatenwordt.Voor
registratiewordtaandeautoriteiteneendossieroverhandigdwaarinallehandelingen,
testen en resultaten van de ontwikkeling gedetailleerd zijn beschreven. Bepaalde
landen, zoals deUSA,eisendat onder andere deklinische effectiviteitsstudies indat
landuitgevoerdworden.Hettijdstipwaarophetfarmacon voordeveehouderbeschikbaar is zal echter van land tot land verschillen. Met name zal het afhangen van de
specifieke eisen die deregistratie-autoriteiten stellen.
13 Nucleïnezuren en genetische manipulatie
R.C. van den Bos en A. van Kammen
13.1 Inleiding
De moleculaire biologie en genetica — alsmede vele aanverwante takken van wetenschap - zijn door de recente ontwikkeling van de genetische manipulatie in een
stroomversnelling geraakt. De term genetische manipulatie heeft betrekking op een
breed scalavangeavanceerde in-vivogenetischetechnieken, maar omvat ook een aantalin-vitromanipulaties. Indithoofdstuk zullenweonsbeperkentotgenetische manipulatieals 'devormingvannieuwecombinatiesvanerfelijk materiaal doorinsertievan
nucleïnezuur-moleculen, die op welkewijze dan ook buiten de celzijn geproduceerd,
in een virus, bacterieel plasmide of ander vectorsysteem, om dit in te bouwen in een
gastheerorganisme, waarin deze moleculen van nature niet voorkomen, maar waarin
zenadezemanipulatie continu vermeerderd kunnenworden'.Eenvande belangrijkste
aspecten van deze genetische manipulatie - ook welin meer beperkte zin aangeduid
als recombinant-DNA-technologie - is, dat vreemde nucleïnezuren (meestal DNA)
in een ander gastheerorganisme kunnen worden vermeerderd; hierbij worden natuurlijke barrières tussen de soorten overschreden en kunnen genen van willekeurige
herkomst in een nieuwe omgeving worden geplaatst. Een ander belangrijk aspect is
dat een betrekkelijk klein en goed gedefinieerd stuk DNA kan worden vermeerderd,
waardoor het mogelijk isgrotehoeveelheden vaneenzuiver DNA-fragment in handen
te krijgen en te onderzoeken.
Dithoofdstuk geeft eeninleidingtot dehierbij gebruikte technieken. Daaraan vooraf wordt een overzicht gegeven van de belangrijkste eigenschappen van de nucleïnezuren (DNA en RNA). De belangrijkste processen waarbij overdracht van informatie
plaatsvindt tussen macromoleculen zullen daarbij tevens kort worden toegelicht. Het
betreft hier deprocessen replicatie (vorming vantweedubbelstrengs-DNA-kopieën uit
ééndubbelstrengs-oudermolecule), transcriptie (het overschrijven of kopiëren van een
deel van de informatie gelegen in één van beide DNA-ketens naar een enkelstrengsRNA-molecule), en translatie (vertaling van de informatie in een enkelstrengs RNA
naar een eiwitmolecule).
13.2 Structuur en eigenschappen van nucleïnezuren
DNA (desoxyribonucleic acid) en RNA (ribonucleic acid) zijn ketenvormige macromoleculen die functioneren in de opslag, de expressie en overdracht van genetische
informatie. Zij vormen in alle cellen zeer belangrijke componenten die ongeveer 2tot
10 % van het drooggewicht uitmaken. Nucleïnezuren zijn ook aanwezig in virussen.
98
NUCLEÏNEZUREN EN GENETISCHE MANIPULATIE
N,HC
99
ÎCH
CH
Pyrimidine
NH,
1
}f\
1, 11
H2N-C<^
JCH
N
H—Nf
Adenine
(A)
J'
ST
1
0 = C \ , J e—H
H
Guanine
(G)
5C-CH3
I
0=C^_ i i c —H
1
H
Thymine
(T)
Cytosine
(C)
H
Uracil
(U)
(alleen in RNA)
NH,
I
II
>
•0-P-O-P-O—P OCH
I
I
I
00- -0
H ^L^^^^ H
3'I
HO
I 2'
'.'H) (= OH in ribose)
(ß-D-2) Deoxyribose
Deoxyadenosine 5'-trifosfaat
(dATP), een nucleotide
Fig. 32a. Bouwstenen van nucleïnezuren. De eenheden waaruit nucleïnezuren bestaan zijn nucleotiden,
zoals desoxyadenosine 5'-trifosfaat (rechtsonder). Een nucleotide bestaat uit een heterocyclische base, een
ribose (in RNA) of desoxyribose (in DNA) en 1-3 fosfaatgroepen. Depurinebasen, G en A, zijn afgeleid
van purine, en de pyrimidinebasen C en T (U komt alleen voor in RNA) van pyrimidine. Ter onderscheid
van de atomen in de basen zijn die in de suiker voorzien van een accent.
Dit zijn nucleïnezuur-eiwit-complexen dieinstaat zijn omhun eigenvermenigvuldigingtebewerkstelligen inspecifieke gastheercellen. Hoewelnucleïnezuren hun naam
tedankenhebbenaanhetfeitdatzevoorheteerstuitnuclei(kernen)vancellenwerden
geïsoleerd, komen DNA en RNA ook in andere delen van de celvoor (cytoplasma,
mitochondriën, chloroplasten).
Net zoals aminozuren debouwstenen (monomere eenheden) van eiwitten zijn, zo
zijnnucleotidendemonomereeenhedenvannucleïnezuren.Deanalogietusseneiwittenennucleïnezurengaatnogverder.Netzoalseenbepaaldeiwitmoleculezichonderscheidtvaneenanderdoordevolgordevandekarakteristiekezijketensvandeaminozuren,zoonderscheidtiederenucleïnezuurmoleculezichdoordevolgorde(sequentie)
vandekarakteristiekeheterocyclischebasenvanzijnnucleotide-monomeren. Nucleïnezurenzijnlineairepolymerenvannucleotidendieaanelkaargekoppeldzijnviafosfodiesterbindingen. In DNAkomen desoxyribonucleotiden alsmonomere eenheden
voor, in RNA ribonucleotiden. Ieder nucleotide bevat drie componenten (fig. 32a):
- N-bevattendeheterocyclischebase:eenpurinebase(GofA)ofeenpyrimidinebase
100
R.C. VAN DEN BOSEN A. VAN KAMMEN
Fig. 32b. Schrijfwijze voor (d)ATP. Deverticale lijn geeft (d)ribose weer; de base Aisgekoppeld aan C-l'
en een trifosfaat aan C-5 '.
(Cof T;T komt slechts voor in DNA;in RNA neemt Udeplaats vanTin; fig. 32a
boven),
- suiker (pentose),
- fosfaat.
Inribonucleotidenisdesuikereenribose,indesoxyribonucleotiden isdesuikereen
2'-desoxyribose(fig. 32alinksonder).Inbeidegevallenzittendebasenmeteenzogenaamde N-glycosidische binding gebonden aan het Cl'-atoom van de suiker.
Een verbinding bestaande uit alleen een (N-heterocyclische) base en een suiker
wordteennucleosidegenoemd.Eennucleotideisduseigenlijkeenfosfaatester vaneen
nucleoside. Afhankelijk van het aantal fosfaatgroepen spreekt men dan over een
nucleoside-mono-,di-oftrifosfaat (fig. 32a,rechtsonder).Eennucleotidewordtvaak
in een verkorte vorm weergegeven; daarbij wordt (desoxy)ribose als een stok weergegeven (fig. 32b)met op positie 1' debase (in dit gevalA) en op positie 5' fosfaat
HOG
verkort : pTpApCpG
III
of
TACG
C
-OH
5'
3'
Fig. 33. Schematische weergave van een deel van een dubbelstrengs-DNA-molecule. De suiker-fosfaatketens liggen aan debuitenkant, waarbij de beide ketens een tegengestelde oriëntatie hebben (antiparallel).
De heterocyclische basen zijn door waterstofbruggen verbonden. A isdaarbij via twee bruggen verbonden
met T, en G via drie bruggen met C. Rechts is in verkorte schrijfwijze de volgorde van de onderste streng
weergegeven, waarbij volgens afspraak het 5'-einde links is getekend.
NUCLEÏNEZUREN EN GENETISCHE MANIPULATIE
(indit gevaleentrifosfaat). Denucleotiden ineenDNA-of RNA-moleculezijn aan
elkaar verbonden via fosfodiesterbruggen tussen de 3'-OH en 5'-OH groep van de
pentosen vantweeopeenvolgende nucleotiden (fig. 33).Hierdoor ontstaat eenpolymeer met suiker-fosfaat-suiker-moleculen als 'backbone', en basen die naar buiten
steken.De'backbone'vervulteenstructurelerolinnucleïnezuren,terwijldevolgorde
vandebasendegenetischeinformatie bepaalt.DebouwvaneenDNA-of RNA-keten
kan schematisch ook weergegevenwordenzoalsinfiguur 33, onderstehelft, waarbij
deverticalelijnen depentoses voorstellen (devolgordevandebasen indit voorbeeld
iswillekeuriggekozen).Eennogkorterenotatieis:pTpApCpGofTACG.Polynucleotideketenszijnpolair, datwilzeggendebeideuiteindenvaneenDNA-of RNA-keten
zijnverschillend:heteneuiteindeheeft een5'-OH-of 5'-fosfaatgroep enhet andere
uiteinde een 3'-OH-groep, die niet gekoppeld zitten aan een ander nucleotide. De
afspraak isdat het 5'-uiteinde (hetzogenaamde 5-primeend)van een nucleïnezuur
op schrift links zit (zoals aangegeven in figuur 33,onderste keten).
13.3 StructuurvanDNA
DNAismeestaldubbelstrengs. In 1953 hebbenWatsonenCrick eenmodelopgesteld
voor destructuur vanDNA,zoalshetincellenvoorkomt. Bijdeconstructievanhet
model maakten zij gebruik van gegevensover dechemische samenstelling van DNA
engegevensverkregenuitröntgendiffractie-studies. UitchemischeanalysesvanDNA
wasgeblekendatdemolairehoeveelhedenAenTinDNAgelijk zijn endat hetzelfde
geldtvoorGenC:dusA = TenG = C.Hieruitvolgtdatineendubbelstrengs-DNAmolecule dehoeveelheden purines enpyrimidines gelijk zijn: A + G = C + T.Uit
deröntgendiffractie-patronen bleek dat DNAeenhelixstructuur moest hebben. Het
model dat Watson en Crick hebben opgesteld bleek in overeenstemming tezijn met
later verkregen experimentele resultaten.
Dekenmerken van destructuur van DNA zoals dat in denatuur voorkomt zijn:
- HetDNAbestaatuittweeschroefvormig omelkaargewondennucleïnezuurketens.
De winding van de ketens is rechtsom: het is een rechtsgewonden dubbele-helixstructuur. De ketens kunnen alleen van elkaar gescheiden worden door ontwinding
van de dubbelspiraal.
- Detweeketensineendubbelstrengs-DNA-moleculelopenantiparallel.Tegenover
het 5'-uiteinde van de ene keten zit het 3'-uiteinde van de andere keten (fig. 33).
- Deketenswordenbijelkaargehouden doorwaterstofbruggen tussen basenparen.
Adenine(A)zitgepaardmetthymine(T),enguanine(G)metcytosine(C).Hetgevolg
isdatdenucleotidenvolgordeindeeneketendieindeandereketendicteert:debasenvolgorden in de beide ketens van DNA zijn complementair. De resultaten van de
chemische analyses van DNA worden hierdoor verklaard. Een G=C-basenpaar (bp)
kan drie waterstofbruggen vormen en is daardoor steviger gebonden dan eenA=Tbasenpaar dat twee H-bruggen vormt (fig. 33).
- ErzijngeenbeperkingenvoordevolgordevandebasenpareninhetDNA;devolgorde van debasen bevat degenetische informatie.
101
102
R.C. VAN DEN BOS EN A. VAN KAMMEN
13.4 Afmetingen en vormen van DNA
Dubbelstrengs DNA is de drager van de genetische informatie in alle levende organismen. Invirussen, dieook stukjes genetischeinformatie bevatten, kan de genetische
informatie ook zitten in enkelstrengs (es) DNA, in dubbelstrengs (ds) RNA of in
enkelstrengs (es)RNA. Debacteriofaag <J?X174bij voorbeeld bevat een klein es,circulair DNA als genoom. Reovirussen en Rice dwarf mosaic virus zijn voorbeelden van
virussen met een ds-RNA-genoom.
Degrotemeerderheid van deplantevirussen (bij voorbeeld tabaksmozaïek virus) en
eenaantal diervirussen (bij voorbeeld poliovirus, influenzavirus) hebben een es-RNAgenoom. In bacteriën is de genetische informatie gelegen op één cirkelvormig, dsDNA-molecule,hetbacteriëlechromosoom. Sommigestammen vanbacteriën hebben
daarnaast een aantal genen op kleine cirkelvormige ds-DNA-moleculen. Deze extrachromosomale DNAs worden plasmiden genoemd. Een aantal bacteriofagen, met
name dezogenaamde T-even-fagen, hebben lineair ds-DNA alsgenoom. Zowel bacteriëleplasmiden alsfaag-DNA's worden veelalsvector gebruikt bij genetische manipulatie. In eukaryote cellen bevindt de overgrote meerderheid van het DNA zich in de
chromosomen in de celkern. De chromosomen bevatten lineair ds-DNA dat geassocieerd is met specifieke eiwitten, de histonen. In eukaryote cellen komt buiten de celkern ook DNA voor in de mitochondriën en chloroplasten. Hier echter is het DNA
'kaal', dat wilzeggen niet gecomplexeerd met specifieke eiwitten zoals in de celkern.
DNA-moleculenkunnen zichtbaar gemaakt worden met een elektronenmicroscoop
(EM), en uit EM-foto's kan de lengte van het DNA bepaald worden; daaruit kan dan
het aantal basenparen in het DNA berekend worden (tabel 14).Degrootte van DNAmoleculen wordt vaak uitgedrukt in kilobasen (1 kb = 1000 baseparen). DNAmoleculen kunnen onderling sterk verschillen inlengte.(Bedenk dat het DNA in eukaryote cellen over een aantal chromosomen verdeeld is.)
Tabel 14. Afmetingen van DNA-moleculen.
Organisme
Virussen
Polyoma of SV40
faag a
faag T2
vaccinia
Bacteriën
Mycoplasma
Escherichia coli
Eukaryoten
Gist
Drosophila
Mens
Basenparen
(bp)
5,1
48,6
166
190
760
4000
13500
165000
2900 000
Lengte
(lim)
1,7
17
56
65
260
1 360
4 600
56000
999 000
NUCLEÏNEZUREN EN GENETISCHE MANIPULATIE
LangnietalhetDNAbevatinformatie diecodeertvooreiwitten.Sommigestukken
DNA hebben een structurele functie, bij voorbeeld de centromeergebieden op het
DNA in chromosomen; andere stukken hebben een functie in de regeling van de
genactiviteit.
13.5 DNA-replicatie
Organismen dienenvooriedereceldelinghunDNA(chromosomen) zeer nauwkeurig
tekunnen dupliceren (repliceren),zodatdenucleotidenvolgorde endusdegenetische
informatie behouden blijft. Het dubbele-helixmodel van Watson en Crick voor de
structuur van DNA met de karakteristieke complementaire basenparing (A-T,G-C)
suggereerdeonmiddellijk eenmanierwaaropDNAheelnauwkeuriggerepliceerdkon
worden:doorontwindingvandebeidestrengenvandeouder-DNA-moleculegaande
beide complementaire ketens uit elkaar waarna de nucleotiden (de monomere
bouwstenen)vandenieuwtesynthetiseren ketensparen (H-bruggen vorming;Amet
TenG metC)metdebasenuitdeouderstrengen, envervolgensaanelkaargekoppeld
worden.
De synthesevaneen'dochterstreng'diecomplementair is aaneen vande ouderstrengen, wordt gekatalyseerd door het enzym DNA-polymerase (fig. 34).Tegenover een
Tindeouderstrengwordteen ATP geplaatst,dieaande3 '-OH kantvande groeiende
ketenwordt gekoppeld onder afsplitsing vanpyrofosfaat (PP;).Deenergiedienodig
isvoor deze koppeling wordt geleverd door deafsplitsing van het pyrofosfaat ende
daaropvolgendehydrolysevan pyrofosfaat in tweefosfaten. De dochterketen is numet
eennucleotideverlengdinde5' -> 3'-richting.Ditproceskanopdezemaniercontinu
doorgaan, waarbij debeide ouderstrengen geleidelijk uiteengaan als een ritssluiting
diewordtgeopend (fig. 35,bovenstestreng).Dereplicatievandeonderstestrengkan
niet continu in dezelfde richting verlopen, omdat desyntheserichting tegengesteldis
aandie van hetopenenvande ritssluiting.Daaromverlooptdezesynthesein opeenvolgendezogenaamdeOkazaki-fragmenten, dielaterweeraanelkaarwordengekoppeld.
H0 D
aTxêxjWx^
T
G
C
II
III
III
A
C
G
oUderstreng
HOh&TreirxEirxpir^^
T
'®,
PPi
A
II
®kj_
A
DNA polymerase
(EUWWËX
'OH
5'
Fig. 34. Replicatie van DNA. De onderste DNA-keten heeft een vrij 3'-OH-uiteinde, waaraan een dATP
wordtgekoppeld. Despecificiteit wordtdaarbij gewaarborgd doorTindetegenoverliggende keten. Deenergie voor deze koppelingsreactie wordt geleverd door de afsplitsing van PPi (pyrofosfaat, dat vervolgens
wordt gesplitst in 2 Pi). De reactie wordt gekatalyseerd door DNA-polymerase. In dit voorbeeld zou de
volgende stap verlenging met een dTTP zijn.
103
104
R.C. VAN DEN BOS EN A. VAN KAMMEN
Okazaki fragmenten
^ 3'
replicatievork
Fig. 35. Replicatievan DNA. Beideouderstrengen vanhet DNAgaan alseen ritssluiting uit elkaar, waarbij
de 'replicatievork' indit voorbeeld naar linksschuift. Debovenste ouderketen ('leading strand') wordt daarbij in een continu proces overgeschreven in een dochterketen. De onderste ouderketen ('lagging strand')
wordt discontinu inOkazaki-fragmenten overgeschreven; dit isnoodzakelijk omdat inditgevaldesyntheserichting (5' -» 3')tegengesteld isaan de richting waarin de replicatievork beweegt. Bij het proces van replicatie zijn veel verschillende eiwitten betrokken, waaronder DNA-polymerase.
In werkelijkheid verloopt het proces van replicatie aanzienlijk ingewikkelder dan
hiervoor schematischisweergegeven.VoorhetopenenvandeDNA-duplexzijneiwittennodig.VoordestartvandesynthesevandeOkazaki-fragmenten wordteerstdoor
RNA-polymeraseeen RNA-fragment gemaakt, dat als 'primer' dient endoor DNApolymerasewordtverlengd.IntegenstellingtotRNA-polymeraseisDNA-polymerase
namelijkuitsluitendinstaattothetverlengenvaneenbestaandeRNA-ofDNA-keten.
Uiteindelijk worden de RNA-fragmenten weer verwijderd en vervangen door DNA,
waarnadeafzonderlijke fragmenten toteenvolledigeketenaanelkaargekoppeldworden.Hetuiteindelijke resultaat vandereplicatieis, dat tweeds-DNA-moleculenontstaan, die elk uit één ouderstreng en één dochterstreng zijn opgebouwd.
13.6 Structuur enfunctie vanRNA
DestructuurvanRNA-moleculenisenkelstrengsbehalvebijeenaantalvirussenwaarinds-RNAvoorkomt. RNA-moleculen hebben danookgeencomplementairebasenverhoudingen eninhetalgemeenverschiltdemolairehoeveelheidAvandievanU en
isdemolairehoeveelheid Gnietgelijk aan dievanC.Tochbevatten RNA-moleculen
ook dsgebieden, dietot stand komen door basenparing (G-C,A-U)tussen verschillende stukken van dezelfde keten.
BehalvedatRNAineenaantalvirussendragerisvangenetischeinformatie, komen
er nog vier klassen van RNA-moleculen voor, ieder met een duidelijk verschillende
functie. Drie klassen functioneren in de biosynthese van eiwitten in prokaryote en
eukaryote cellen. Devierdeklasse (uitsluitend ineukaryote cellen)lijkt betrokken te
zijnbijde'processing'van'precursor'totfunctionele RNA-moleculen. 1. Ribosomaal
RNA (rRNA) vormt een component vanribosomen. Dezelaatste zijn betrokken bij
desynthesevaneiwittenuitaminozuren. rRNAspeelthierbij geenrolals informatiedragerinhetproceswaarbij informatie uit DNAviaRNAineiwitwordtopgeslagen.
Hetvervult slechtseenstructurele rolinhetribosoom. 2.Boodschapper-RNA (messengerRNA,mRNA)heeft welinformatieoverdracht alsfunctie.Voordesynthesevan
NUCLEÏNEZUREN EN GENETISCHE MANIPULATIE
105
eeneiwit wordt eenspecifiek gebied vanhet DNA (eengenof 'coding region')gekopieerdineenmRNA. Ditproceswaarbij DNA-moleculenwordengetranscribeerd tot
RNA noemt men DNA-transcriptie (paragraaf 13.7) De informatie in het mRNA
wordt vervolgens met behulp van ribosomen in eiwit vertaald; dit proces heet translatie.IneukaryotecellenverlatendemRNA-moleculendekernominhet cytoplasma
desynthesevaneiwittentedirigeren.OmdatiederemRNA-moleculevertaaldkanworden in vele duizenden kopieën van één polypeptide-keten, kan de informatie die
opgeslagenligtineenkleingebiedvanhet DNAdesynthesevangrotehoeveelheden
van eenspecifiek eiwit bewerkstelligen. Zoworden bij voorbeeld in4dagen vanéén
enkel fibroïne-gen (in de zijderups) 104kopieën mRNA gemaakt die ieder weer de
synthese van 105 fibroïne-moleculen veroorzaken, zodat in totaal 109 moleculen
fibroïnepercelgesyntnetiseerdworden.mRNA-moleculenvariëreninketenlengtevan
eenpaarhonderdtotenkeleduizendennucleotiden.Erkomenduizendenverschillendebc"dschapper-RNA-moleculenvoor incellen,maar elkmeestal slechtsinzeergeringe hoeveelheden. mRNA vormt tenhoogsteeenpaar procent van het totale RNA
in een cel. Weliswaar vindt er in cellen voortdurend actieve synthese varf mRNA's
plaats, toch is de totale hoeveelheid steeds heel klein. De levensduur van mRNAmoleculen is namelijk zeer kort (in een bacterie 1—3 minuten). rRNA- en tRNAmoleculen (punt 3) zijn daarentegen veel stabieler. 3. Transfer-RNA (tRNA)moleculen fungeren als dragers van geactiveerde aminozuren in de biosynthese van
eiwitten.tRNA-moleculenkunnenaflezen welkevolgordevanaminozuren gecodeerd
isineenboodschapper-RNA-molecule.tRNA-moleculenzijnongeveer80nucleotiden
langenhebben eenkarakteristieke secundaire structuur, dieaan een klaverblad doet
denken.Zehebbeneen5'-uiteindedatbegintmetpGenhebbenaanhun3'-uiteinde
devolgorde - pCpCpA, waaraan een specifiek aminozuur wordt gekoppeld. Verder
bezitten alletRNA'seen3-basen volgorde(anticodon), dat eentriplet (codon)ophet
mRNAherkent. 4.Smallnuclear RNA. IneukaryotecellenkomeninkleinehoeveelhedenkorteRNA-moleculenvoor,dietotgeenvandehierbovengenoemdedrieklassenbehoren.SommigevandieRNA'smakendeeluitvanspecifieke ribonucleases,die
betrokken zijn bij de 'processing' van RNA 'precursors' tot functionele RNA's.Ze
wordenvooralindekernaangetroffen (small nuclear RNA = snRNA), waar zevermoedelijk betrokken zijn bij deprocessing van RNA-moleculen.
13.7 RNA-synthese (DNA-transcriptie)
Deverschillende soorten RNA-moleculen dievoorkomen, rRNA, tRNA, mRNA en
snRNA, zijn allekopieënvan denucleotidenvolgorde vanbepaaldegebiedenvanhet
DNA. De synthese van deze kopieën, dat wilzeggen het overschrijven van DNA in
RNA,DNA-transcriptie,wordtgekatalyseerddoorRNA-polymerases.Dezeenzymen
bewerkstelligen de polymerisatie van ribonucleosidetrifosfaten (de monomere
bouwstenen van RNA) waarbij 3'-5' fosfodiesterbindingen worden gevormd tussen
opeenvolgende nucleotiden onder afsplitsing van pyrofosfaat (PP;). De volgorde
waarinderibonucleotiden aanelkaarwordengekoppeld,wordtbepaalddoordevolg-
106
5"
R.C. VAN DEN BOS EN A. VAN KAMMEN
•
—
'T"
A T
U A
—1
3'
l
3'
G
i
C
C
G
i
C
G
i
i
T
A
i
C
A
U
i
G C
G G
i
3"
C
i
i
C
G
l
r
C
G
i.~
DNA streng
RNA streng
3' -~- 5'
Fig. 36. Transcriptie van DNA in RNA. Door middel van basenparing (waarbij U in RNA equivalent is
met TinDNA)wordt een deelvaneen DNA-keten overgeschreven ineencomplementaire RNA-keten. Evenals bij de DNA-replicatie geldt ook hier dat de beide ketens tegengesteld van oriëntatie zijn.
ordevan debasen indeDNA-keten diewordt overgeschreven. Hierbij worden deribonucleotiden geselecteerd op hun vermogen om basenparen te vormen:
A
DNA
->U RNA ( T k o m t
niet v o o r in
RNA), T DNA -> A RNA ,
^DNA "*• C R N A > (-DNÀ ~* ^RNA
DeRNA-streng dievanaf een(gedeeltelijk ontwonden) DNA-keten wordt gesynthetiseerd loopt in tegengestelde richting als die van de DNA-matrijs (fig. 36).
13.8 Promoter en terminator
In principe zou ieder stuk DNA overgeschreven kunnen worden in twee verschillende
RNA-moleculen, één van elk van de twee DNA-ketens. In het algemeen wordt maar
één van de DNA-ketens overgeschreven. Het is echter niet zo dat alle genen van het
DNA vanaf dezelfde keten worden overgeschreven. Voor sommige genen dient de ene
keten alsmatrijs, voor anderegenen de andere keten van deDNA-dubbelspiraal.Welke keten wordt gekopieerd in RNA en in welke richting dat gebeurt, wordt bepaald
door binding van het RNA-polymerase aan de zogenaamde promoter. Een promoter
is een gebied op het DNA dat ligt voor de startplaats van transcriptie en dat herkend
wordt door het RNA-polymerase op grond van twee karakteristieke nucleotidenvolgorden. De ene volgorde ligt in het zogenaamde -10-gebied, dat wilzeggen ongeveer 10basenparen voor (stroomopwaarts van)destartplaats vantranscriptie, en heeft
in prokaryoten gemiddeld devolgorde TATAAT. De andere karakteristieke promotersequentie ligtongeveer 35basenparen vanaf detranscriptiestartplaats en heeft gemiddeld een nucleotidenvolgorde TTGACA. Met gemiddelde volgorde wordt bedoeld dat
er kleine verschillen in deze sequenties kunnen bestaan in de verschillende promotergebieden ophet DNA vanEscherichia colienandere bacteriën. Alsdezetwee karakteristieke sequenties, namelijk TATAAT en TTGACA, voorkomen op een DNA-moleculeop eenonderlinge afstand vanongeveer 25basenparen, dan wordt dit gebied herkend door RNA-polymerase. De oriëntatie van dezetweesequenties ten opzichte van
elkaar bepaalt dan de richting waarin de DNA-keten wordt overgeschreven.
In de nucleotidenvolgorde van het -10- en het -35-gebied kunnen kleine verschillenzitten bij verschillendepromoters. Dit leidt ertoedat promoters kunnen verschillen
NUCLEÏNEZUREN EN GENETISCHE MANIPULATIE
107
insterkte,datwilzeggeninaffiniteit voorhetRNA-polymerase,endatsommigegenen
ophetDNApertijdseenheidveelvakerwordenovergeschrevendanandere.Promoters
regelen dan ook de frequentie waarmee genen worden overgeschreven.
Ook de plaatsen op het DNA waar RNA-polymerase de transcriptie beëindigt,
worden gekenmerkt door een specifieke nucleotidenvolgorde. Een kenmerk vaneen
zogenaamde terminator isdat deplaats waar detranscriptie ophoudt, voorafgegaan
wordt door een GC-rijk stuk gevolgd door een AT-rijke nucleotidenvolgorde.
13.9 Hybridisatie
Eenbelangrijketechniek waarmeederelatiekanwordenvastgesteldtussenDNA,en
het RNA dat daarvan is overgeschreven, is moleculaire hybridisatie. Als een DNAoplossingverwarmdwordttot 100 °C,dandenatureerthetDNAenscheidendebeide
ketensvandeDNA-helixzich.AlsRNAwordttoegevoegdenhetmengseldaarnalangzaam wordt afgekoeld, dan zullen de complementaire ketens weer ds structuren
vormen. Als het RNA complementair isaan éénvan de DNA-ketens (bijvoorbeeld
wanneer het overgeschreven isvan dat DNA)kunnenzichook DNA/RNA-hybriden
vormen. De DNA/RNA-hybriden kunnen op verschillende manieren aangetoond
worden. Zulke experimenten worden vrijwel altijd gedaan met radioactief gemerkt
RNA. DNA/RNA-hybriden kunnen dan aangetoond worden na evenwichtscentrifugatiein eenCsCl-gradiënt, of door filtratie door nitrocellulose filters, waar es-RNA
weldoorheen loopt, maar RNA/DNA-hybriden niet. Bij een andere, veel gebruikte
methode voor moleculaire hybridisatie wordt het gedenatureerde DNA geïmmobiliseerdopnitrocellulosefiltersvoordatdehybridisatiereactiewordtuitgevoerd. Daarna
DNA
fragmenten
overbrengen
op filter
electroforese
32
P-gemerkte
DNA probe
autoradiografie
agarose
gel
nitrocellulose
filter
autoradiogram
Fig. 37. PrincipevanSouthern blotting. DNA-fragmenten, diebijvoorbeeld verkregen zijn door specifieke
splitsing van DNA met restrictie-enzymen (paragraaf 12), worden door middel van elektroforese in een
agarosegel gescheiden. De gescheiden fragmenten worden overgebracht op een nitrocellulosefilter en
gehybridiseerd met eenspecifieke radioactieveprobe. Hybriden wordenvervolgens zichtbaar gemaakt door
autoradiografie.
108
R.C. VAN DEN BOS EN A. VAN KAMMEN
worden de filters geïncubeerd met het radioactief gemerkte RNA onder hybridisatiecondities. Demate van hybridisatie kan dan bepaald worden door meting van dehoeveelheidradioactiviteit dieaan hetDNAophet filter isgebonden, nadat defilters eerst
met ribonuclease zijn behandeld en gewassen om het RNA dat niet gereageerd heeft
teverwijderen (fig. 37).Metbehulpvandezemethodekanonderzocht worden of RNA
overgeschreven isvaneenbepaald DNA, welkgebiedvaneenDNA wordt overgeschreven, en hoeveel transcriptie-eenheden (genen) voor een bepaald RNA op het DNA
aanwezig zijn.
13.10 Biosynthese van eiwitten
Een samenvatting van het proces van informatieoverdracht uit DNA via mRNA naar
eiwit is weergegeven in figuur 38. Een deel van een dubbelstrengs DNA wordt in
mRNA overgeschreven, waarna de tripletten (codons) in mRNA worden vertaald in
de aminozuurvolgorde van een eiwit. Bij deze laatste stap wordt als woordenboek de
genetische codegebruikt; enkele voorbeelden van 'vertaling' zijn in figuur 38te zien:
AUG codeert voor methionine (als startcodon in dit geval) en UAA fungeert als stop.
Evenals de nucleïnezuren heeft ook een eiwit een bepaalde polariteit; bij afspraak
wordt het uiteinde dat een vrije aminogroep draagt (N-terminus) links getekend.
13.11 Eukaryote genen zijn gespleten
Inbacteriën worden polypeptideketens gecodeerd door een aaneengesloten reeks van
triplet-codons in het DNA. Gedurende lange tijd werd aangenomen, dat genen in
hogere organismen ook continu zijn. Hierin kwam echter plotseling verandering toen
ontdekt werd dat verscheidene genen discontinu zijn. Het gen dat codeert voor deiaketen van hemoglobine is bij voorbeeld in de coderende sequentie op twee plaatsen
onderbroken: eriseen550bpniet-coderende 'intervening sequence' (ofintron),ennog
een kortere van 120bp (fig. 39). Het /3-globine-gen is dus gesplitst in drie coderende
sequenties, die exons worden genoemd.
- ~ 5 ' A T C G A T T A ATG TTC ACA GAT/7GGT AGT TAA CGTTG 3 '
V
i,
-
h DNA
TAGCTAAT TAC AAG TGT CTA/ / C C A TCA AUU GCAAC 5'CGAUUA AUG UUC ACA GAU//GGU AGU UAA CGUUG3'
Met Phe Thr Asp / / G l y Ser STOP
N-terminus
mRNA —»-
eiwit
C-terminus
Fig. 38. Informatieoverdracht van ds-DNA viaes-mRNA naar eiwit. Eendeelvan eends-DNA wordt overgeschreven in mRNA. De basenvolgorde in het mRNA is daarbij complementair aan die in de ene DNAketenengelijk aan dieindeandere, hetgeen betekent dat Tin DNA vervangen isdoor Uin RNA. De basenvolgorde in mRNA codeert voor de aminozuurvolgorde van een eiwit. Een triplet of codon in mRNA
bepaalt de positie van een aminozuur. Synthese van het eiwit start op de N-terminus (op het methioninestartcodon AUG) en eindigt bij een stopcodon (hier UAA). De N-terminale kant van het eiwit correspondeert met het 5'-einde van mRNA.
NUCLEÏNEZUREN EN GENETISCHE MANIPULATIE
DNA fragmenten
>—i i—i I-J i 1i—i i i i i u
109
—»- genomische bank
Jrestictie-en zym
introns
ß-globine gen (=DNA)
transcriptie (RNA-polymerase)
cap-vorming
' poly A-aanhechting
cap
—?i
I
(A)
71
n 3 ' Primair transcript (=RNA)
I 'splicing'
I (=verwijde
dering van introns)
cap i
i(A)„ ß-globine mRNA
reverse transcriptase
DNA polymerase
-1
—
c-DNA bank
dubbelstrengs c-DNA
Fig. 39. Het /3-globine-gen van het konijn is gespleten. Transcriptie van het /3-globine-gen door RNApolymerase wordtgevolgddoor deaanhechtingvaneenCap-structuur aan het 5'-eindeeneen poly-A-staart
aan het 3'-einde van het primaire transcript. Hieruit worden vervolgens de niet-coderende introns verwijderd, waarbij de coderende exons worden gekoppeld ('splicing'), en zodoende een /3-globine-mRNA ontstaat. Voor het kloneren van de informatie voor ß-globine kan men uitgaan van dit mRNA. Hierbij wordt
met reverse transcriptase en DNA-polymerase een ds-cDNA gemaakt van het mRNA; dit leidt tot een
cDNA-bank. Anderzijds kan ook uitgegaan worden van genomisch DNA, waarbij het (3-globine-gen compleet met introns wordt gekloneerd. Dit leidt dan tot een genomische bank.
Inwelkstadiumvandegenexpressiewordendezeintronsverwijderd? NieuwgesynthetiseerdeRNA-moleculen (indekern)zijn veelgroter dandemRNA-moleculendie
daaruit ontstaan (inhet cytoplasma). Het primaire transcript van het (3-globine-gen
bevatbijvoorbeeldtweeonvertaaldegebiedencorresponderend metdeintrons.Deze
intronswordenviaeennauwkeurig mechanismeverwijderd waarbij hetrijpe mRNA
ontstaat.WanneermenDNAwilklonerenbehorendbijß-globineheeft mendekeuze
omdaarvoor directuittegaanvanhetDNA,zoalsdat inhetchromosoom voorkomt
(metinbegripvandeintrons),of omeenDNA-kopievanhetmRNAtemakenenvan
dit dubbelstrengs zogenaamde cDNAuit tegaan. In het laatste gevalzijn deintrons
dus niet aanwezig.
13.12 Principe vande recombinant-DNA-techniek
Met derecombinant-DNA-techniek worden nieuwecombinaties vangenetischmateriaal gemaakt uit DNA-moleculen afkomstig uit verschillende organismen. Zulke
recombinant-DNA-moleculenwordendanincellenvangeschiktegastheerorganismen
gebracht waarin zij vermenigvuldigd kunnen worden en waarin op de aanwezigheid
van de recombinant-DNA-moleculen geselecteerd kan worden. Deze omschrijving
110
R.C. VAN DEN BOS EN A. VAN KAMMEN
'vreemd' DNA
Vector
Selectie
Fig. 40. Schematische weergave van klonering in een plasmide-vector. Een plasmide wordt gelineariserd
door digestie met een restrictie-enzym engekoppeld aan een stuk 'vreemd' DNA, dat met hetzelfde enzym
is geknipt. Na de ligase-reactie zal een aanzienlijke fractie van de vectormoleculen geen vreemd DNA
('insert')hebben opgenomen. Het DNA-mengselwordt getransformeerd ineengastheercel, waarbij geselecteerd wordt voor deaanwezigheid van vector-DNA. In eenvolgende stap wordt een screeningof selectie uitgevoerd op cellen die een insert in het plasmide bevatten (recombinanten). Ieder plasmide bevat een 'ori'
(origin of replication) die replicatie in de gastheer waarborgt.
geeft aaninwelkestappeneenrecombinant-DNA-experiment verloopt(fig.40). Eerst
wordteenDNA-fragment, bijvoorbeeldeenstukDNAmeteengendatmenwilkloneren,covalentgebondenaaneengeschiktvehikel,dezogenaamdevector,omhetDNA
overtedragen naar eengastheercel. Vector-DNA'skunnen zichvermenigvuldigen in
bepaaldegastheercellen, omdat erop devector eenspecifiek DNA-structuurelement
aanwezigis,eenzogenaamdeoriginofreplication(ori).Detweedestapisdeintroductievanhetrecombinant-DNA ineengeschiktegastheercel door middelvan transformatie of transfectie. In de gastheercel waarin de vector zich kan vermenigvuldigen
worden nu veel kopieën gemaakt van het recombinant-DNA. Als de gastheercellen
zichdelenkomenderecombinant-DNA-moleculenookindecellenvandenakomelingen, waar dan weervermenigvuldiging van hetrecombinant-DNA kan plaatsvinden.
Gastheercellen wordendan uitgeplaat enafzonderlijke cellenkunnengroeientoteen
kolonie of kloon van identiekegastheercellen. Kolonies van cellen die recombinant-
NUCLEÏNEZUREN EN GENETISCHE MANIPULATIE
111
DNA-moleculen bevatten kunnen herkend en geïsoleerd worden met een geschikte
selectieprocedure.Afzonderlijke positievekolonies,afzonderlijke klonendus, kunnen
dan verder opgekweekt worden en in grote hoeveelheid worden aangemaakt. Het is
mogelijk om het gekloneerde recombinant-DNAingrotehoeveelheid uit de gastheercellen teisoleren. Het 'vreemde' DNA, het gezochte gen, isdan beschikbaar voor verder moleculair-biologisch onderzoek. In sommige gevallen kan het gewenst zijn dat
het 'vreemde' DNA tot expressie komt in degastheercel, dat wilzeggen dat de genetische informatie in het gen vertaald wordt in het eiwit waarvoor het codeert.
Welkedoelstellingen kunnen wordenbereikt metbehulp vande recombinant-DNAtechniek? Een voorbeeld moge dit duidelijk maken. Het DNA in cellen van hogere
organismen iszeer groot. Het totale DNA uit een menselijke celbij voorbeeld is 4 x
109basenparen lang. De 'concentratie' van een specifiek stuk, bij voorbeeld een gen
met een lengte van 1-2 kb, is dus minder dan 1op 106. Wanneer men het DNA in
stukken zou breken om uit het mengsel een bepaald gen te isoleren, zou men zóveel
ongeveer even grote stukken krijgen, dat het onmogelijk is om het gen direct zuiver
teisolerenuitcellenwaarin hetnatuurlijk voorkomt. Dezehindernis om zuivereDNAfragmenten (genen) te isoleren uit complexe genomen, is opgeheven door de
recombinant-DNA-techniek. Wanneer in de beschreven procedure begonnen wordt
met een ingewikkeld mengsel van fragmenten, die aan vectormoleculen gekoppeld
worden, krijgt men wel een ingewikkeld mengsel van recombinant-DNA-moleculen.
Echter, bij hetintroduceren vanhet recombinant-DNAingastheercellen, neemt iedere
gastheercel maar één recombinant-DNA-molecule (vector + 'vreemd' DNA) op. Dit
houdt vervolgens in dat een geïsoleerde kolonie (kloon) bestaat uit gastheercellen met
één bepaald 'vreemd' DNA-fragment erin. Het kloneren van DNA houdt dus in het
isoleren en zuiveren van een bepaald DNA-fragment of gen uit een complex mengsel,
waarna een grote hoeveelheid van dat gen verkregen kan worden door het opkweken
van de kloon. Voor het kloneren van genen worden speciale methoden en technieken
gebruikt, die niet uitgebreid worden behandeld. Daarvoor wordt verwezen naar de
aanbevolen literatuur. Wijzullenhierproberen eenaantalveelgebruiktebegrippen toe
te lichten. Op een zogenaamde fysische kaart van een DNA-molecule zijn de posities
aangegeven van de knipplaatsen voor verschillende restrictie-enzymen, zoals die door
restrictie-enzymanalyse zijn vastgesteld.
Derestrictie-enzymen van het type II kunnen dubbelstrengs DNA op tweeverschillende manieren knippen (tabel 15):
- Er wordt midden in deherkenningsplaats geknipt, op plaatsen dierecht tegenover
elkaar liggen.Daarbij ontstaan vlakkeuiteinden: 'bluntends' of 'flush ends' (bij voorbeeld HaelII, Smal).
- Debeideketensvanhet DNA wordengeknipt opplaatsen dieeenpaar nucleotiden
uit elkaar liggen, en er ontstaan fragmenten met uitstekende enkelstrengs-uiteinden:
'sticky ends' of 'cohesive ends' (bij voorbeeld EcoRl, BamHl).
Het kopiëren van RNA in DNA is van groot belang bij het maken van ds DNAkopieën van mRNA en het maken van een zogenaamde cDNA-bank (fig. 41en paragraaf 13.15). De mogelijkheid om ook chemisch stukken DNA met een bepaalde
112
R.C. VAN DEN BOS EN A. VANKAMMEN
nucleotidenvolgorde te synthetiseren is een belangrijk hulpmiddel geworden bij het
DNA-onderzoek ende genetischemanipulatie.De chemischesynthesevanDNAisnu
zodaniggestandaardiseerd en geautomatiseerddater'DNAsynthesizingmachines'of
'genesynthesizingmachines' indehandelzijn. Synthetischeoligonucleotiden vinden
Tabel 15. Oorsprong en eigenschappen van enkele restrictieenzymen.
Enzym
Organisme waaruit het
enzym afkomstig is
Herkenningsplaats
EcoRI
Escherichia coli
-GIAATTC
-CTTAAÎG
BamHl
Bacillus amyloliquefaciens
-GIGATCC-CCTAGÎG-
Haelll
Haemophilus aegyptius
^CGICC-CCÎGG-
Smal
Serratia marcescens
-CCCiGGG
-GGGÎCCC
-J (A). mRNA
plasmide-vector
I knippen met
t restrictie enzym
cDNA-vorming en
additie van C-staart
cDNA
met C-staart
3' CCCC
| additie van
\ G-staart
1 . . ^ , . ^ ^ . ^ . ^ . , . ^ GGGG 3'
3'GGGG '
J
V.
mengen;staarten hybridiseren
stuiten met ligase
transformatie/selectie
in E.coli
Fig. 41. Principevan cDNA-klonering. EenmRNA wordt gekopieerd inds-cDNA enenzymatisch voorzien
van polyC-staarten. Een plasmide wordt opengeknipt met een restrictie-enzym en voorzien van polyGstaarten. Plasmide en cDNA worden gekoppeld door middel van hybridisatie van decomplementaire staarten. Het recombinant-plasmide wordt daarna in een gastheer getransformeerd.
NUCLEÏNEZUREN EN GENETISCHE MANIPULATIE
onderanderetoepassingbijdesynthesevanstukkenvangenenofzelfsvanhelegenen,
voor desynthese van primersbijhetbepalen van denucleotidenvolgorde van DNA
en RNA, voor het synthetiseren van hybridisatieprobes voorhetscreenen vangenomische DNA-banken encDNA-banken (paragraaf 13.16), envoor desynthese van
hulpstukjes bijdegenetische manipulatie van DNA-moleculen.
13.13 Koppeling van DNA-fragmenten
Bij de constructie van recombinant-DNA-moleculen wordt de vreemdeDNAmolecule, dat menwilkloneren, covalentgekoppeld aanvector-DNA. Ditverbinden
vantweeDNA-moleculenmetelkaarwordtbewerkstelligdmetbehulpvanhetenzym
DNA-ligase.Het meestgebruikt wordt het enzymdat geproduceerd wordt inE.coli
cellengeïnfecteerd metbacteriofaag T4.Ditenzym,T4DNA-ligase,heeft ATPnodig
als cofactor enenergiebron. Alsuiteinden van DNA-fragmenten ontstaan zijn door
knippenmeteenrestrictie-enzymdat 'cohesive'of'sticky'uiteindenproduceert,zoals
EcoRlofBamHldatdoen,dankunnendiecohesiveendsassociëren,omdatdeuitstekendeenkelstrengs-uiteinden complementair innucleotidenvolgordenzijmHetligase
kanvervolgensbeideketens koppelen ener weereenintact ds-DNAvanmaken (fig.
42).
Het enzymT4DNA-ligaseisookinstaat omDNA-moleculen met een 'blunt' uiteindeaanelkaartekoppelen.VaakishetzodatDNA-moleculendieaanelkaargekoppeld moeten worden verschillen in uiteinden, bij voorbeeld wanneer het DNAfragment datmenwilklonerenbluntendsheeft endevectorgekniptismeteenenzym
datcohesiveendsproduceert.OfDNA-fragmenten moetenwordengekoppelddieverkregenzijn door knippenmettweeverschillenderestrictie-enzymen diecohesiveends
produceren dienietkunnenbasenparen(bijvoorbeeldEcoRl-enBamHl-uiteinden).
Er isdan een heel arsenaal van mogelijkheden om deuiteinden temodificeren met
behulp van nucleases en/of polymerases zodat uiteinden verkregen worden diegoed
aanelkaargekoppeldkunnenwordenmetT4DNA-ligase.Daarbij wordterookrekeningmeegehouden dat hetvaak gewenstisomdeDNA-moleculeinkwestiena klo5'
3'
3'
-G-A-A-T-T-C-EcoRl - G
i i i i i i
*- i
+
- C-T-T-A-A-G-C-T-T-A-A5,
koppeling
door
Jigase i
A-A-T-T-Ci
6-
/
/basenparing
/
' - G A-A-T-T-CI
I
I
I
I
I
- C-T-T-A-A G Fig. 42. Restrictie-enzymen en ligase werken complementair. Wanneer eenEcoRI-restrictieplaats wordt
opengeknipt ontstaan twee complementaire 5'-uitstekende einden. Deze einden kunnen vervolgens door
ligaseweerworden gekoppeld. Het isookmogelijk omtweeuiteindenvanverschillendeherkomst tekoppelen. Ditisdebasis vande recombinant-DNA-techniek.
113
114
R.C. VAN DEN BOS EN A. VAN KAMMEN
nerenweeruit devectortekunnen knippen omdeeigenschappen'naderteonderzoeken.
Een andere manier om 'sticky' of 'cohesive' uiteinden te maken aan een DNAmoleculeis'homopolymer tailing'.Metbehulpvanhetenzymterminaldeoxynucleotidyltransferase wordtaande3'-OH-uiteindenvanbijvoorbeeld hetDNAdatgekloneerdmoetwordeneenpoly(dC)staartgezet,enaande3'-OH-uiteindenvandeopengekniptevectoreenpoly(dG)staart (fig.42).Zulkeuiteindenzijn ook complementair
en kunnen via basenparing associëren, waarna DNA-ligasekoppeling tot stand kan
brengen. De combinatie poly(dA)-uiteinde met poly(dT)-uiteinde is uiteraard ook
mogelijk voor zulke koppelingen.
13.14 Veelgebruikte vectoren
Eenzeerbelangrijk elementbijhetklonerenvangenenisdevector,diesamenmethet
te kloneren DNA de recombinant-DNA-moleculevormt die vervolgens in gastheercellenvermeerderd moetworden. Devector moet instaat zijn eengastheercel binnen
te dringen om zich daar te vermenigvuldigen. Tweenatuurlijk voorkomende typen
DNA-moleculen voldoen aan dieeisen:
- Plasmiden: datzijn kleinecirculaireDNA-moleculen dievoorkomen inbacteriën
en in sommige andere organismen; Plasmiden kunnen repliceren onafhankelijk van
het gastheer genoom.
- DNA van bacteriofagen: dat zijn virussen, die specifiek bacteriën infecteren.
EcoRI 4361
AatR 4286
Seal3846
Pvul3735
Clal 23
Hindm 29
FcoRT 185
BamHl 375
Sphl 562
Sa/J 651
Pstl 3609
Xmalü 939
Nrul 972
Aval 1425
Sa/l 1444
Afim 2475'
Pvuïï 2066
A/del 2297 j Tth\\\J 2219
Snal 2246
Fig. 43. Een veelgebruikt vectorplasmide pBR322. Het plasmide bevat als markers resistentiegenen tegen
ampicilline en tetracycline; verder zijn veel unieke restrictieplaatsen aanwezig waarin kan worden gekloneerd.
NUCLEÏNEZUREN EN GENETISCHE MANIPULATIE
115
Demeestgebruiktegastheer-vectorsystemen bij recombinant-DNA-onderzoek zijn
E.colimeteenplasmideofE.colimetbacteriofaag X. Vector-DNAmoetverdergenetische informatie bevatten die gebruikt kan worden om te selecteren, zodat onderscheidgemaakt kanwordentussengastheercellendiewelofgeenvectorhebbenopgenomen. De genetische markers die hiervoor gebruikt worden zijn vaak resistenties
tegenantibiotica. Infiguur 43ishetplasmidepBR322afgebeeld, datgenenbevatdie
coderenvoorresistentietegenampicillineentetracycline.Vectorenmoetenverderunieke knipplaatsen bevatten voor zoveel mogelijk verschillende restrictie-enzymen, die
gebruikt kunnen worden als kloneringsplaatsen om 'vreemd' DNA in te zetten. De
kloneringsplaatsen moeten buiten de replicatieoorsprong (ori) en andere essentiële
faagXüNA
Muis-DNA
(-4.0x10 9 basenparen)
— 50kb
-••vervangbaar-*-
partiële digestie
met F c o R I in
—2x105 fragmenten
knippen met EcoRl en
midden-fragment verwijderen
•
üülil
—
Ill
X-armen met 'sticky ends'
20-kb fragment met 'sticky ends'
T
J
mengen, complementaire
uiteinden hybridiseren:
sluiten met ligase
ai
1
uitsluitend recombinant DNA van de juiste
afmeting (d.i. met—20kb insertie) kan na
' inpakken in faageiwitten vervolgens repliceren
faag met muis genomisch DNA
(—2x105 fagen worden geproduceerd waardoor
met e e n > 9 0 % waarschijnlijkheid het gehele
muis-genoom vertegenwoordigd is)
Fig. 44. Klonering infaag-DNA alsvector. Genomisch DNA vandemuiswordt partieelgeknipt met EcoRI
en fragmenten van circa 20kb worden geselecteerd. Deze fragmenten worden gekoppeld aan de armen van
faag-X-DNA (verkregen door het middelste gedeelte teverwijderen). Recombinant-DNA-moleculen van de
juiste lengte (circa 50 kb) kunnen in vitro worden ingepakt in faag-manteleiwitten. Hierdoor ontstaan
recombinant-fagen die volledig tot infectie en replicatie in staat zijn.
116
R.C. VAN DEN BOS EN A. VAN KAMMEN
genen liggen. Het kan vaak wélnuttig zijn wanneer eenkloneringsplaats inéénvan
demarkergenenligt,zodatinsertievaneenvreemd-DNA-moleculeresulteertininactiveringvaneenmarker. Ditmaakt hetmogelijk omopeeneenvoudigemanier onderscheid te maken tussen kolonies die geen vector hebben opgenomen, kolonies die
alléén de vector (zonder insertie) hebben opgenomen en kolonies die recombinantDNA-moleculen bevatten.
Inplasmiden kunnen DNA-moleculenmet eenlengtevariërend van minder dan1
kb tot 5à 10kb gekloneerd worden. Voor het kloneren van grotere DNA-moleculen
(15-20 kb) wordt bacteriofaag X veelgebruikt. Het DNA van faag X isongeveer 50
kblang,maareenstukvan25kbkangemistworden,datwilzeggendathetverwijderd
kanwordenenvervangendoorvreemdDNA,zonder dat daardoor hetvermogenvan
de faag om cellen te infecteren en zich te vermenigvuldigen verloren gaat (fig. 44).
Nadatindereageerbuishetrecombinant-faag-DNA geconstrueerd is,wordthetDNA
ingepakt infaag-manteleiwitten. AlleenDNA-moleculen meteenbepaaldeminimale
lengte worden ingepakt en alleen recombinant-faag-DNA-moleculen hebben die
lengte. Met de ingepakte faag-DNA's worden E, co//-cellen geïnfecteerd. De cellen
waarindeinfectie plaatsvindt, produceren danrecombinant-faagmoleculen. Degeïnfecteerde cellenvormen plaques door lysisvangeïnfecteerde cellen.Aandehandvan
de plaques kunnen de recombinant-faag-DNA-moleculen geselecteerd worden.
13.15 Onderscheid tussen genomische klonen encDNA-klonen
Tweeveelgebruikte typen recombinant-DNA-preparaten zijn genomische klonen en
cDNA-klonen.EengenomischeklooniseengastheerceldieeenstukgenomischDNA
Tabel 16. Termen in het recombinant-DNA-onderzoek.
Term
Genomisch DNA
cDNA copy
Plasmide
Vector
Gastheercel
Genomische kloon
cDNA-kloon
cDNA
Genenbank/bibliotheek
Probe
Verklaring
Alle DNA-sequenties van een organisme.
DNA (dubbelstrengs) gekopieerd van een mRNA.
Extrachromosomaal DNA dat in staat is zich onafhankelijk in een gastheer
te repliceren.
Eenplasmideof viraal-DNA-molecule,waarineencDNAofgenomische DNAsequentie kan worden geïnserteerd.
Een cel (vaak een bacterie) waarin een vector kan worden vermeerderd.
Eengeselecteerdegastheercelmeteenvectorwaarineengenomisch DNA-fragment uit een ander organisme is geïnserteerd.
Een geselecteerde gastheercel met een vector waarin een cDNA-molecule uit
een ander organisme is geïnserteerd.
Dubbelstrengs-DNA-kopie van (een mengsel van) RNA.
Eenvolledigesetvangenomische kloonsvaneenorganismeofvancDNA-kloons
uit een celtype.
Nucleïnezuurfragment (RNA of DNA)datgemerkt wordt(d.m.v.radioactiviteit
of opanderewijze)endatgebruiktwordtommetbehulpvanhybridisatie kloons
op te sporen.
NUCLEÏNEZUREN EN GENETISCHE MANIPULATIE
117
van een ander organisme bevat. Een cDNA-kloon is een gastheercel die een molecule
cDNA bevat, dat wilzeggen DNA dat van mRNA gekopieerd ismet behulp van enzymen (fig. 39 en 41). Een genomische bank of bibliotheek is een verzameling
recombinant-DNA-moleculen, die samen alle DNA-sequenties van het genoom van
een organisme representeert. Een genomische bank bestaat dus meestal uit een zeer
groot aantal verschillende klonen. Een bank van menselijk DNA gekloneerd in faag
Xbestaat uit ten minste 500 000klonen, om er zeker vante kunnen zijn dat alle DNAsequenties voorkomen in de bank. Een cDNA-bank bestaat uit een verzameling
cDNA-klonen die de mRNAs uit een cel vertegenwoordigen. cDNA-banken van een
organisme verschillen afhankelijk van het weefsel waaruit het mRNA is bereid. Niet
allegenen van een organisme komen in ieder weefsel tot expressie; daarvoor zijn dan
in een bepaald weefsel geen mRNA's aanwezig. Een samenvatting van de gebruikte
termen in het recombinant-DNA-onderzoek is in tabel 16gegeven.
13.16 Selectie en identificatie van recombinant-DNA
Delaatstestapvaneenkloneringsexperiment isdeidentificatie van recombinante bacteriën of fagen. Er zijn verschillende methoden om een specifieke kloon op te sporen.
Veeltechnieken gebruiken gemerkte nucleïnezuren als probe om een bank van klonen
tescreenen ophetvoorkomen vaneenbepaald recombinant-DNA (fig.45). Daarnaast
zijn er technieken om met behulp van antilichamen deeiwitten op te sporen diegecodeerd worden door een gekloneerd cDNA. Het gekloneerde cDNA moet dan wel tot
expressie komen. Op die manier kan dus het cDNA opgespoord worden dat overeenkomt met het eiwit gecodeerd door een bepaald mRNA. Met behulp van die cDNAkloon kan vervolgens een genomische bank gescreend worden om via kolonie- of
plaquehybridisatie het genomische DNA op tesporen met daarin het gen waarvan het
betreffende mRNA afkomstig is. Debesteselectiestrategie moet gevalvoor gevalvastgesteld worden. Na selectie moet steeds nadrukkelijk vastgesteld worden in onafhankelijke karakteriseringsexperimenten of wel de gewenste kloon geïsoleerd is.
13.17 Expressie van recombinant-DNA
Eenbelangrijk doelvanhet kloneren isvaak deproduktie vaneiwittengecodeerd door
de recombinant-DNA-moleculen. Daar iseen speciale klasse van vectoren voor nodig
dieexpressievectoren genoemd worden.Zulkevectoren moeten nietalleenvoldoen aan
dealgemene vereisten voor vectoren, maar bovendien moeten zeeigenschappen bezitten waardoor het DNA vertaald kan worden in eiwit. Normaliter zal een gen uit een
dierofeenplant niettotexpressiekomen alshetgekloneerd isinE. coli. Omtot expressiete komen moet een gen omgeven zijn door signalen die expressie mogelijk maken.
Diesignalenbestaanuit kortenucleotidensequenties ophet DNAdieinstructies bevatten voor het transcriptieapparaat van de cel, waarmee het gen wordt overgeschreven
in mRNA, en voor het translatieapparaat, waarmee het mRNA vertaald wordt in het
specifieke eiwit waarvoor het gen codeert. De drie belangrijkste signalen zijn:
118
R.C. VAN DEN BOS EN A. VAN KAMMEN
Faag-bank (^2x10 fagen)
uitplatenopeenlaag
bacteriën —»-plaques
Nitrocellulosefilterwordtopde
schaal gelegd,waardoor fagen
worden gebonden
nitrocellulose filter
alkalischeoplossing lyseert fagen
en denatureert vrijkomendDNA (tot
enkelstrengs,dataanhetfilter
bindt)
hybridisatiemetzuiver radioactief
gemerktecDNAofmRNA probe;daarna
autoradiografie
signaal (zwarting)verschijnt
ter plaatsevanfaagDNAdat
complementairisaandeprobe
Fig. 45. Screening vaneen faag-bank. De faag-bank bestaande uit bij voorbeeld 2 x 106 fagen wordt uitgeplaat op een laag bacteriën, waardoor plaatselijk lysis optreedt en 'plaques' ontstaan. Deze worden overgebracht op een filter. De fagen worden gelyseerd bij alkalische pH, waarbij het (nu enkelstrengs) DNA aan
het filter bindt. Door hybridisatie met een geschikte probe en autoradiografie kunnen recombinant-fagen
worden opgespoord.
x
- depromoter, dieaangeeft waardetranscriptievaneengendoor RNA-polymerase
moet beginnen;
- de terminator, die aangeeft waar detranscriptie moet eindigen;
- deribosoombindingsplaats dieaangeeft waareenribosoom zichkanhechten aan
het mRNA en met devertaling van de boodschap in eiwit kan beginnen.
De expressiesignalen zijn verschillend in eukaryote en prokaryote organismen.
Gekloneerde dierlijke genen komen in E. coli niet tot expressie, omdat de RNApolymerasevanE. colide regulerendesequentiesvandierlijkegenennietherkent.Een
verderecomplicatieis datgenenuithogeredierenenplantenvaakafwisselend bestaan
uitexonsenintrons.Alseendierlijk genwordtovergeschreveninRNA,ondergaat dit
RNAeerstnogeenaantalprocessingstappen,waarbij deintronsuithetRNAverwij-
NUCLEÏNEZUREN EN GENETISCHE MANIPULATIE
derdworden enten slotte hetrijpe mRNAontstaat waarin nu deexons naast elkaar,
aaneengesloten de informatie bevatten voor de aminozuurvolgorde van een eiwit.
Bacteriën bevatten niet het enzymapparaat voor deprocessing van transcripten van
eukaryote genentot rijpe functionele mRNA's. Voorhet produceren van een dierlijk
eiwitofplante-eiwitdooreenrecombinant-DNA-moleculewordtdaarommeestaluitgegaanvancDNA, dat eenvolledigekopievanhetmRNA bevat endus devolledige,
aaneengesloteninformatie (hetreadingframe) vooreeneiwit.Wanneernuzo'ncDNA
gekloneerd wordt in een vector tussen een bacterie-promoter en een bacterie-ribosoombindingsplaats aan deenekant eneenbacterie-terminator aan deandere kant,
ishet mogelijk dat het cDNA wordt overgeschreven in een RNA-molecule dat door
het bacteriële eiwit-synthetiserend apparaat in een eiwit vertaald wordt.
Erzijnnuverschillendeexpressievectorenontwikkelddiei?.colipromotershebben,
waardoor expressievangekloneerdecDNA'smogelijk is.Ditisvangrootbelangvoor
hetselecterenvancDNA-klonen,maar hetistevensvangrootbelangvoorhet produceren van dierlijke eiwitten op grotere schaal. Bekende promoters zijn de lacpromoter, detrp-promoter, detac-promoter en de\PL-promoter, elk methun eigen
karakteristieken.
13.18 Mutagenese van recombinant-DNA
Hetonderzoek vangenenuiteukaryoteorganismen ontwikkelt zichrazend sneldoor
het gemak waarmee DNA uit eukaryoten gekloneerd kan worden in bacteriën zoals
hiervoor is beschreven. Zulke gekloneerde sequenties kunnen gemakkelijk in grote
hoeveelheden worden aangemaakt en op hun eigenschappen onderzocht. Het effect
vanveranderingeninhetDNA(mutaties),dieookheelspecifiek aangebracht kunnen
wordeninvitrometbehulpvanmodificaties door enzymen, kannuveeleenvoudiger
dan vroeger bestudeerd worden. Om het effect te bepalen van experimenteel aangebrachtemutatiesopdefunctie enexpressievaneukaryote genenmoeten degekloneerde genen weer uit de bacterie gehaald worden en teruggebracht worden in een
eukaryoot organisme,bij voorkeur het organisme waaruit zij zijn geïsoleerd. Er zijn
dan ook systemen ontwikkeld voor het transformeren van eukaryote cellen, zoalsde
gist Saccharomyces cereviseae en verschillende typen dierlijke cellen, en voor het
klonerenvangenenindiecellen.Dieverschillendesystemenmoetenhieronbesproken
blijven, maar in deaanbevolen literatuur wordt daarover denodige informatie gegeven.
119
14 RFLP in de fokkerij
P. Stam
14.1 Inleiding
Met behulp van recent ontwikkelde technieken die gebruik maken van restrictieenzymenengekloneerdeDNA-fragmentenishetmogelijk demeest'naakte'vormvan
genetische variatie zichtbaar temaken: kleinevariaties in denucleotidenvolgorde in
het DNA kunnen worden blootgelegd.
Restrictie-endonucleasen zijnDNA-verterendeenzymendiespecifieke nucleotidenvolgordeninDNAherkennen eneenDNA-moleculeopdezeplaatsen 'knippen'.Met
elkrestrictie-enzym komt een 'eigen' nucleotidenvolgorde (4of 6basen) overeen,die
als knipplaats wordt herkend. Hoevaker dezesequentie in het DNAvoorkomt, des
tevakerzaldeDNA-moleculewordengesplitstbij blootstellingaanhetenzym.Dezo
gevormde DNA-fragmenten kunnen naar groottewordengescheiden metbehulpvan
gel-elektroforese.DeverteringvanhetDNAvanhogereorganismenmeteenrestrictieenzym resulteert in eenquagrootte min of meer continue reeks van fragmenten, die
na kleuring op de gel het beeld geven van één uitgesmeerde vlek. In de gel kunnen
specifiekeDNA-fragmenten wordenopgespoordmetbehulpvaneen'probe';ditiseen
gekloneerd (vermeerderd)DNA-fragment dathomoloogismetéénof meer fragmenten (of delen daarvan) uit het verteerde DNA. Het zichtbaar maken van specifieke
fragmenten geschiedt door het DNA van degeloverte brengen op een vaste drager
(nitrocellulose filter) en in contact te brengen met een radioactief gemerkte probe,
onder zodanige omstandigheden dat DNA-hybridisatie plaatsvindt. Er zal alleen
hybridisatie optreden metdiefragmenten ophet filter dievoldoendehomologie (dat
wil zeggen overeenkomstige nucleotidensequenties) bezitten met de probe. Na
wegspoelen van het niet-gehybridiseerde materiaal is de plaats van hybridisatie, en
daarmee het overeenkomstige DNA-fragment, zichtbaar te maken door autoradiografie.Detegebruikenprobeshoevengeenhomologietevertonenmetbekendegenen.
ElkeDNA-sequentiekan fungeren alsprobe,mitservoldoendehomologieismetéén
van de fragmenten gevormd door devertering met het restrictie-enzym.
Figuur46laatzienwatheteffect isvanhetaldannietaanwezigzijnvaneenbepaalde'knipplaats'indebuurtvaneenprobe-sequentie:ditaldannietaanwezigzijnresulteertineenanderelengtevanhethybridiserendefragment, endaarmeeineenandere
positievan devlek ophet autoradiogram. Het zalduidelijk zijn dat eenenkelebasesubstitutieinhetDNAreedskanresulteren inmeerof minder knipplaatsen vooreen
bepaaldrestrictie-enzym. Hetisgebleken datbij welhaast alletotnutoe onderzochte
organismentallozedergelijkevariantenvanhetDNAvoorkomenendaarmeedeovereenkomstige Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP's) (Beckmann et
120
RFLP IN DE FOKKERIJ
JL_
variant A
-J
—
variant B
—
variant C
•
CD
CD
CD
lang
1
AA
BB
CC
homozygoten
autoradiogrammen
CD
1 1
AB
AC
BC
heterozygoten
Fig. 46. Schematische weergave van een RFLP (restriction fragment length polymorphism). Afgebeeld is
een gebied van een chromosoom, waarvan een klein gedeelte (aangegeven met het blokje) i^ gekloneerd.
Depijlen gevendeknipplaatsen aan vaneenbepaald restrictie-enzym. Dedrieweergegeven varianten vertonen verschillen in de positie (en aantal) der knipplaatsen in dedirecte omgeving van de DNA-sequentie die
is gekloneerd (de 'probe'). Het beeld van de autoradiogrammen laat zien dat de lengte van het DNAfragment waarmee de 'probe' hybridiseert uiteenloopt voor dedrievarianten. Merk opdat de heterozygoten
teherkennen zijn aan deaanwezigheid vantweevlekken ophet autoradiogram. Devarianten in knippatroon
die zich voordoen in de onmiddellijke nabijheid van de probe-sequentie gedragen zich als 'mendelende'
genen.
al., 1986).RFLP'sgedragen zichalscodominante 'mendelende' genen,dietegebruiken zijn als 'marker'-genen.
Eenspecialeklassevanprobesvormendie,welkehomologievertonenmetdelenvan
repetitief DNA.Met eendergelijke probe kanvariatie opmeer dan éénplaats inhet
genoom worden opgespoord (Jeffreys, 1985). Voor hun gebruik als marker onderscheiden RFLP's zichvan de meer klassieke fenotypische enbiochemische markers
door het grote aantal dat er potentieel van voorhanden is. Heeft men eenmaal voldoendeprobes beschikbaar, dan ishet aantalteontdekken variabeleplaatsen inhet
genoom van hogere organismen vrijwel ongelimiteerd.
Klassiekegenetischekaarten(diedeonderlingepositiesvangenenopdechromosomen weergeven) worden thans in snel tempo opgevuld met de posities van RFLPmarkers.Dit'lokaliseren'moetgebeurenmetbehulpvanklassiekekoppelingsanalyses
van nakomelingschappen waarin de markergenen uitsplitsen; de voortgang op dit
gebiedisbijlandbouwhuisdieren mindersneldanbijplanten,waarmenvoorditdoel
kruisingen maakt en snelgrote nakomelingschappen kan analyseren (Helentjaris et
al., 1986;Tanksley et al., 1987).
121
122
P. STAM
14.2 Nuttig gebruik vanRFLP's
14.2.1 Afstammingscontrole, identificatie en diagnostiek
Hetgroteaantalvariabeleplaatseninhetgenoomvaneenorganismeresulteert ineen
voor elk individu (met uitzondering van eeneiige tweelingen) vrijwel unieke 'DNAvingerafdruk'. Doorgebruik temakenvangeschikteprobesenvandiverse(combinaties van) restrictie-enzymen, ontstaat een bandenpatroon op het autoradiogram dat
uniek isvoor elkindividu. Indien webeschikken over50restrictiemarkers zijn er250,
dit iscirca 1015,mogelijke haploïdegenotypen en350, ditiscirca7 x 1023, mogelijke
diploïdegenotypen! Hierdoor is,integenstelling tot hetgebruik van 'klassieke' markers,zoalsbloedgroepen, positieveindicatievanouderschap mogelijk geworden.GerechtelijkelaboratoriamakensindskortgebruikvanRFLP'svoor persoonsidentificatie.
In demedische diagnostiek zijn RFLP's een krachtig hulpmiddel om dragersvan
recessievegenen(dieinhomozygotetoestand verantwoordelijk zijnvooreen erfelijke
ziekte)alszodanigteidentificeren. Bij'geneticcounseling'(onderanderehetvoorlichten van risicovolle echtparen omtrent de kans op kinderen met erfelijke gebreken)
kunnen in een aantal gevallen, dank zij debeschikbaarheid van RFLP's, uitspraken
worden gedaan die vele malen betrouwbaarder zijn dan een tientaljaren geleden.
14.2.2 Gebruikalsmarkerin selectieprogramma's
Het besef dat het met RFLP's mogelijk is om, over het hele genoom verspreid, te
beschikken overveelmarkergenen, heeft geleidtot hetideedat het hiermee mogelijk
zouzijn genenteidentificeren entelokaliseren diebetrokkenzijnbij complexe,polygene kwantitatieve kenmerken (Soller &Beckmann, 1982;Smith &Simpson, 1986).
Het totale markergenotype zou dan tegebruiken zijn alsindicatievoor degenotypischewaarde(fokwaarde) vaneenindividutenaanzienvan gebruikswaardekenmerken
alsmelkgift, voederconversieenspekdikte(genlocibetrokkenbijeenkwantitatiefkenmerk zullenin het vervolgworden aangeduid alsQTL, Quantitative Trait Loci).Een
dergelijkeindicatieisalleenmogelijkwanneerdeallerenvandemarkerlociassociaties
vertonenmetdeallelenvandeQTL.Zulkeassociatieskunnenvantweeërleiaardzijn:
- Pleiotropie; de marker ligt binnen een QTL en de allelen hebben een (hopelijk
meetbaar) verschillend effect op het kenmerk.
- Koppelingsassociaties; demarker isgekoppeld met één of meer QTL.
Bijgebruik van 'random probes'islJeTcansTopassociatiesvanheteerstetypetamelijk gering,omdat demeestemoleculairevariantenbuitendeQTLzullenvallen.Koppelingsassociaties zijn-op hun beurt niet te verwachten op populatieniveau: éénvan
debasisprincipesvandepopulatiegenetica leertdatingrote'randommating' populatiesvroegof laat detoestand vantussen-locusevenwicht (linkageequilibrium) wordt
bereikt, hetgeen wilzeggen dat de allelen van een willekeurig tweetal loei, ongeacht
koppeling,onafhankelijk vanelkaaroverdechromosomenzijnverdeeld.Koppelings-
RFLP IN DE FOKKERIJ
Tabel 17. De gezamenlijke uitsplitsing van marker-allelen (A', A2) en die van een
daarmee gekoppeld QTL (Qi, Q2)in de nakomelingschap van een diheterozygote ouder.
Derecombinatiefrequentie tussen deloeiisr(bijvoorbeeld r = 0,1 = 10°7o).In de nakomelingenzijndegenenwelkeafkomstig zijnvandeandere(willekeurige)ouder aangegeven
met A. resp. Q.. De onder de gameten voorkomende associatie tussen de allelen wordt
ook aangetroffen in denakomelingen. Als deallelen Qi en Q2verantwoordelijk zijn voor
eenmeetbaarverschilinbijvoorbeeld melkgift, zalditverschiltendeleweerspiegeld worden
in de gemiddelde melkgift van de twee aangegeven groepen nakomelingen (x> en x2).
Wanneer dergelijke, met markergenen geassocieerde verschillen gevonden worden, is dit
een sterke aanwijzing dat het markergen gekoppeld is met een 'major gene' voor het
onderhavige kenmerk.
Ouder
Gameten
Frekwentie
Nakomelingen
A1Q1
(1 - r)/2
A1A.Q1Q.
A1Q1
A1Q2
r/2
A i A . Q2Q.
A2Q2
A2Q1
r/2
A2A.Q1Q.
A2Q2
(1 - r)/2
Gemiddelde
fenotypische waarde
A2A • Q2Q.
associatiestussen(biochemische)markersenQTLzijndaarentegenwélteverwachten
binnen de (half sib) nakomelingschap van één individu.
Tabel 17 illustreert dit ideevoor eendenkbeeldige marker die(nauw) gekoppeldis
meteenQTL.Binnendenakomelingschap vaneenindividu dat heterozygoot isvoor
zoweldemarkeralsdeQTL,isereenassociatietussendemarkerallelenenhetkwantitatievekenmerk.Wilmengebruikkunnenmakenvandergelijkeassociatiesomuithet
markergenotype een voorspelling te doen omtrent bij voorbeeld de melkgift, dan
dienen werekening te houden met het volgende:
- Voorspellingenzijnalleenmogelijkbinnenfamilies (de'richting'vandeassociatie
kanvan familie tot familie verschillen enbovendien kunnen andereallelenvanzowel
marker als QTL geassocieerd zijn).
- Dekansomeenassociatiealsgeschetstintabel 17 daadwerkelijk te onderkennen
issterkafhankelijk vandenauwkeurigheid waarmeedegroepsgemiddelden (x1enx2)
kunnenwordenbepaald.Dezenauwkeurigheid hangtvoornamelijk afvandeheritability van het onderhavige kenmerk, de familiegrootte en de recombinatiefrequentie
tussen marker en QTL.
Wanneer associaties worden gevonden tussen kwantitatieve variatieen RFLP's die
op de genenkaart zijn gelokaliseerd, is het in principe mogelijk om ook de met de
markers gekoppelde QTL's 'in kaart te brengen'. Evenals bij het lokaliseren van de
RFLP's zelf, lenen ook hiertoe planten zich beter dan dieren vanwege de snellere
beschikbaarheidvangroteaantallennakomelingenuitspeciaalvoorditdoelopgezette
kruisingen. Hetbasisideeachter ditkarterenvanQTL'sisuitermate simpel:hoedich-
123
124
P. STAM
tereenQTLbij eenbepaaldemarkerligt,hoemeerassociatiediemarkerzalvertonen
metdekwantitatieveverschillen ineensplitsendefamilie. Dehiervoor benodigdestatistische techniek isminder eenvoudig; Lander &Botstein (1989)hebben statistische
methoden en computerprogrammatuur ontwikkeld voor 'interval mapping' van
QTL's;hiermee wordengebieden op degenenkaart aangegeven waarbinnen zichmet
eenzekerewaarschijnlijkheid eenQTLbevindt.Erzijn overigensdiversealternatieve
statistische methoden beschikbaar (Weiler, 1986, 1987;Knapp &Bridges, 1989).
Eveneensgeïllustreerd aan heteenvoudigegevalvanéénmarker enéénQTL, geeft
tabel 18 aanhoebinneneen(HS)familie hetmarkergenotypeistegebruiken alsvoorspeller van degenotypische waarde (fokwaarde) van een dier, opgrond van de metingenverrichtaanzijn/haar halfsibs.Degeschetstevoorspellingsprocedureisrelatief
eenvoudiguittebreidentothetgebruikvandiversemarkers.Eventueelkanook informatieafkomstigvanandereverwanten(bijvoorbeeld demoeder)wordenopgenomen
in devoorspeller (Solier &Beckmann, 1983).Een voor dehand liggende toepassing
vandergelijke fokwaardevoorspellingen ishetgebruik ineen rundveefokprogramma;
er zijn grote HS-families beschikbaar eneenvoorselectie van teststieren kan plaatsvindenopgrondvanhunvoorspeldefokwaarden. Hierdoorkomtenerzijdsruimtevrij
indetestcapaciteit,enanderzijds kandegeneratieduur inhetvader-zoon-pad worden
bekort. Omhet hiervoor aangegeven gebruik vanmarkers ophaar meritestekunnen
beoordelen, kande correlatie tussen voorspelde en werkelijke fokwaarde worden
gehanteerd alscriterium, waarbij mendienttebedenken dat ookzonder gebruik van
markers defokwaarden voorspeld kunnen worden. Berekeningen, stoelend op een
Tabel 18. Eenvoudige voorspellingsprocedure voor de genotypische waarde
(fokwaarde) van een jonge stier opbasis van geklassificeerde (engemeten) sibs.
De fokstier isheterozygoot voor eenmarkergen; voor een deel derdochterskan
worden vastgesteld welk allelzijvan devader geërfd hebben; deze dochters zijn
hiermee in te delen (te klassificeren) in twee groepen (Ai en A2), waarvan de
groepsgemiddelden worden bepaald (x' enx2). Vaneen jonge, nogniet geteste,
zoon kan eveneens bepaald worden welk allel hij van de vader heeft geërfd.
Afhankelijk van het geërfde vaderlijke allel, wordt de genotpyische waarde
voorspeld alsxi danwelx2. (Vereenvoudigd naar Stam, 1986).
Fokstier
Gameten
Geklassifieerde
dochters
Gemiddelde van
geklassificeerde
dochters
Ai
Ai-dochters
XI
A2
A2
X2
AiA2
Jongestier
Voorspelde fokwaarde
AiA.
xi
A2A.
X2
RFLP IN DE FOKKERIJ
kwantitatief-genetische benadering, laten ziendat demaximaal haalbare extra informatie die met behulp van markers is te bereiken, ongeveer 40 % bedraagt, hetgeen
betekentdatdegenetischevooruitgangdoorselectieinhetvader-zoon-padtheoretisch
met 40 % kan toenemen (Stam, 1986).Bij dezeberekeningen iservan uitgegaan dat
allekwantitatieve variatievollediggeassocieerd ismetmarkers (absolutekoppeling);
inwerkelijkheid isdituiteraard nooithetgeval.Simulatiestudieslatenechterziendat
volledigeverzadigingvanhetgenoommetmarkergenengeenvereisteisomtotredelijk
goedevoorspellerstekomen;eengemiddeldekaartafstandtussenmarkersvan 20-30
centimorgan lijkt hiervoor voldoende (Stam, 1987).
Enkelepraktischeaspectenvandetoepassingvandehiervoorgeschetsteprocedure,
die wel wordt aangeduid als 'marker assisted selection' (MAS), zijn onder meer de
volgende.
- Bij gebruik vanveelmarkers, 1 à 3per chromosomenpaar, zijn niet allemarkers
ineenbepaaldefamilie informatief. Eenineenbepaaldefamilietoevalligoptredende
associatie tussen de allelen van een tweetal markers maakt dat slechts één van deze
markerskanwordengebruikt alsverklarendevariabeleindevoorspellingsprocedure.
Een geheel met markers verzadigd genoom, zoals bepleit door Soller &Bekmann
(1983),leidt, integenstelling tot watdezeauteurs zichdaarvan voorstellen, tot onbetrouwbare fokwaardevoorspellingen.
- Aangezienbruikbare associatieszichslechtsbinnen families manifesteren, dienen
dezeinelkegeneratieopnieuwtewordenvastgesteld.Ditimpliceertcontinue'monitoring' van de fokpopulatie.
14.3 Conclusies
De in de literatuur gewekte verwachtingen (een volledige ontbinding van de
kwantitatief-genetische variatieinsimpele'mendelende'factoren)omtrenthetgebruik
van RFLP's, moeten wordenbeschouwd alsonrealistisch. Theoretische beschouwingen en simulatiestudies laten echter zien dat 'marker assisted selection' wel degelijk
perspectievenbiedt,zonder datdehandgelegdmoetwordenopeenzeergroot aantal
individuele genen die betrokken zijn bij kwantitatieve kenmerken.
125
15 Nieuwe strategieën voor de ontwikkeling van veterinaire vaccins
A.L.J. Gielkens
15.1 Inleiding
Infectieziekten vormen een voortdurende en belangrijke bedreiging voor de veehouderij. Door detoenemendeintensivering, diegeleidheeft tot grotereeenheden met
dichte bezetting, is het risico voor dierziekten en daarmee de kans op soms aanzienlijke economische schade toegenomen. Geschat wordt dat door mortaliteit, morbiditeit, verlaagde reproduktie en behandelingskosten 10-20 % van de produktiewaarde
verloren gaat. Individuele infectieziekten, zoals die welke veroorzaakt wordt door
varkenspestvirus, kunnen voor aanzienlijke economische schade zorgen en onze
exportpositie verzwakken.
Ter preventie van inheemse infectieziekten en het voorkómen van insleep van exotischeziekten, zoalsAfrikaanse varkenspest, zalook inkomende decennia veel onderzoek nodig blijven gericht op de optimalisering en modernisering van diagnostiek en
deontwikkeling vanverbeterdeennieuwevaccins.Voordebestrijding enpreventievan
infectieziekten wordt op grote schaal en met wisselend succes gebruik gemaakt van
levende en geïnactiveerde vaccins. In dit hoofdstuk zal aandacht worden geschonken
aanontwikkelingen ophetgebiedvanviralevaccins.Deklassiekelevende virusvaccins
zijn veelal verkregen door seriepassage in heterologe gastheercellen of chemische
mutatie in combinatie met passage. Hierbij ontstaan mutanten die hun ziekteverwekkende eigenschappen gedeeltelijk of geheel hebben verloren. Tijdens attenuatie
worden mutaties gedeeltelijk at random endus oncontroleerbaar geïntroduceerd in de
virale genetische informatie. Het gebrek aan kennis ten aanzien van het mechanisme
dat tengrondslag ligtaan attenuatieheeft ertoegeleid, dat zekerindehumane gezondheidszorg grote reserves bestaan tegen toepassing van levende virusvaccins. Geïnactiveerde virusvaccins worden bereid door virulent virus op grote schaal te kweken in
eieren of weefselkweekcellen, gevolgd door chemische of thermische inactivatie.
15.2 Voor- en nadelen van levende en gedode vaccins
Een belangrijk voordeel van levendevirusvaccins isgelegen in debrede stimulatie van
hetimmuunapparaat, zowelsystemisch, lokaalalscellulair. Door eenbeperkte infectie
van degastheer zaleenlangdurige immuunrespons opgebouwd worden, dieeen goede
nabootsing is van die welke volgt op een natuurlijke infectie met een virulent pathogeenen(veelal)gericht istegen allevoor bescherming relevanteantigenen. De produktiekosten van deze vaccins zijn laag en ze zijn makkelijk te appliceren. Nadelen zijn
de mogelijke contaminatie, als gevolg van de produktiewijze, van vaccin-batches met
126
ONTWIKKELING VAN VETERINAIRE VACCINS
127
andere pathogenen, hun eventuele restvirulentie, de potentiële kans op reversie naar
virulentie, en bij labiele vaccins, de speciale maatregelen voor opslag en distributie.
Het belangrijkste voordeel van geïnactiveerde vaccins is hun grotere veiligheid, die
bij gezuiverde of synthetische subunit-vaccins vrijwel absoluut is.Nadeelisdat inactivatie kan leiden tot differentiële vermindering van de immunogeniciteit van voor
bescherming belangrijke antigenen. Verder zullen deze vaccins minder effectief zijn
indien voor bescherming een goede stimulatie van mucosale en cellulaire immuniteit
noodzakelijk is.
15.3 Moderne benadering voor de bereiding van vaccins
Door dewetenschappelijke doorbraken indemoleculairebiologie ende immunologie
zijn nieuwemethoden entechnische mogelijkheden beschikbaar gekomen, die al snel
huntoepassingvondenbij deontwikkelingvanvaccins.Deaandacht richt zich daarbij
met name op de bereiding van subunit-vaccins met behulp van recombinant-DNAtechnieken of via chemische synthese, en de bereiding van geattenueerde yaccins via
manipulatie van micro-organismen. Hoewel de nieuwetechnologie vooral van belang
lijkt omvaccinstekunnen produceren voor agentia dieniet of moeilijk tekweken zijn
of voor zeer pathogène agentia, is te voorzien dat deze technologie toepassing zal
vinden voor de ontwikkeling van een breed scala van vaccins.
15.3.1 Recombinant-DNA-vaccins
De genetische informatie coderend voor antigenen van micro-organismen kan met de
recombinant-DNA-techniek gekloneerd worden en vervolgens na plaatsing in een
geschikte vector tot expressie gebracht worden in zowel prokaryote als eukaryote
cellen. Hoewel geïnserteerde genen veelal zeer efficiënt tot expressiegebracht worden,
blijkt de biologische activiteit van de eiwitprodukten vaak teleurstellend. Als oorzaken van de beperkte effectiviteit van deze produkten kunnen genoemd worden:
—De veelal afwijkende conformatie van die welke het antigeen aanneemt in zijn
natuurlijke omgeving, als onderdeel van het oppervlak van een virion of bacterie.
Onzekennisover dedriedimensionale distributie van 'antigene sites'ophet oppervlak
van virussen, en de structuren van virale oppervlakteglycoproteïnen, is zeer beperkt.
Van een aantal Picornaviridae, waaronder poliovirus en mond-en-klauwzeervirus, is
de driedimensionale structuur inmiddels opgehelderd (Hogle et al., 1985;Acharya et
al., 1989). Het kapsel van deze virussen bevat 60 kopieën van de vier manteleiwitten
VP1, VP2,VP3enVP4.Deeiwitten VP1- 3 zijn gedeeltelijk geëxposeerd aan het kapseloppervlak. De beschikbaarheid van voornoemde structuurmodellen heeft de lokatie van epitopen op het oppervlak van deze virussen aanzienlijk vereenvoudigd. Het
blijkt dat diverse epitopen op het virusoppervlak betrokken zijn bij de inductie van
een virale (neutraliserende) antilichaamrespons. Naast lineaire epitopen (opgebouwd
uit opeenvolgende aminozuren in één eiwitmolecule, bij voorbeeld VP1 141-160)
werden ook discontinue (de samenstellende aminozuren worden ruimtelijk bij elkaar
128 A.L.J.GIELKENS
gebracht)epitopen aangetroffen. Erzijn aanwijzingen dat dezediscontinue epitopen
opgebouwd kunnen zijn uit aminozuren afkomstig van minimaal twee virale eiwitcomponenten (Thomas et al., 1988).
- Demogelijke noodzaak voor eeneffectieve bescherming vaneencoöperatieverol
vanandereviraleeiwitten.Daarbij komtdateengoedebeschermingnietgegarandeerd
volgt op de inductie van een krachtige neutraliserende antilichaamrespons, maar
bescherming tevens afhankelijk isvan de applicatieroute van het subunit-vaccin, en
onder andere de Pathogenese van het agens waartegen wordt gevaccineerd.
- Onvoldoende fundamentele kennis op het gebied van de immunologische adjuvantiaomeenoptimalepresentatietekunnenbewerkstelligenvanhetantigeenaanhet
immuunsysteem. Het immuunmechanisme dat eenrolspeelt bij preventie of begrenzingvan eenviraleinfectie iscomplex, envereistveelaleengebalanceerde stimulatie
van deverschillende onderdelen van het immuunsysteem - humoraal, celgebonden
en lokaal.
Voor een succesvolle en volledige benutting van de mogelijkheden die de
recömbinant-DNA-technologie biedt voor de ontwikkeling van subunit-vaccins, zal
meer fundamentele kennis beschikbaar moeten komen over de structuur en configuratievanantigeneninhunnatuurlijke omgeving,hetmechanismedattengrondslag
ligtaanbeschermingendewijzewaaropdoor adjuvering eenbredestimulatievanhet
immuunapparaat kan worden verkregen.
15.3.2 Synthetische vaccins
Desnellevooruitgang diegemaakt isin het bepalen van deaminozuurvolgorde van
antigenenviadewegvangen-kloneringenbepalingvandenucleotidesequentie, iseen
krachtigestimulansgeweestvoorhetonderzoekgerichtopdeontwikkelingvanpeptidevaccins.Deontwikkelingvansynthetischepeptidevaccinslijkt, geziendevoordelen
diezekunnen bieden ten aanzien van veiligheid, stabiliteit en lagere produktieprijs,
een zeer aantrekkelijk lange termijn doel, leidend tot goed gedefinieerde (multivalente) vaccins.
Voordeselectievanpeptidenmetmogelijkantigeneactiviteitzulleneerstdebelangrijkste epitopen moeten worden opgespoord. Hiervoor is een aantal strategieën
beschikbaar zoals:
- sequentieanalysevanvirusmar-mutanten (neutralisatie-resistente mutantenselecteerbaar met neutraliserende monoklonale antilichamen),
- predictie van hydrofiele en antigene gebieden,
- het aftasten met eenpanel (neutraliserende) monoklonale antistoffen van alleelkaar overlappendepeptiden, homoloogmetdeaminozuurvolgorde vaneeneiwitmolecule - bij voorbeeld alle overlappende hexapeptiden in volgorde opgebouwd uit
aminozuurresiduen 1-6, 2-7, 3-8 enz.(fig. 47).Ditlaatste kanmet behulp vande
pepscan-techniek, dieinNederlandisontwikkelddoormedewerkersvanhetCentraal
Diergeneeskundig Instituut (CDI)insamenwerkingmeteenAustralischegroep(Geysen et al., 1984).
ONTWIKKELING VAN VETERINAIRE VACCINS
1
213
N H 9 - T - T - S - A - G - E - S - A - D - P - ( 2 0 1 aminoacids)-T-L-COOH
I — 1
1
OMe
Ac-NH - (Hexapeptide)-A-K - NH
Fig. 47. Het principe van depepscan-techniek berust op de synthese van alle overlappende (hexa-, hepta-,
octa- etc.)peptiden, die overeenkomen met deaminozuurvolgorde van een eiwit. In dit voorbeeld, de overlappende hexapeptiden opgebouwd uit aminozuurresiduen 1-6, 2 - 7 , 3 - 8 etc, intotaal 208peptiden, van
het immunogene eiwit VP1 van mond- en klauwzeervirus (MKZ), dat 213 aminozuren lang is. Elk hexapeptide isgekoppeld aan een eigen vaste drager en wordt na synthese in een ELISA getoetst'óp reactiviteit
meteen polyvalent antiserum of monoklonale antistoffen tegen MKZ. Deaminozuren zijn aangegeven met
de 'enkel-letter' code.
Depepscan-techniek maakthetmogelijk honderdenpeptidengelijktijdig ensnelte
synthetiserenopeenvastedrager,enhunreactiviteitmetantilichamentemetenineen
ELISA-opstelling.Opdezewijze kunnen peptiden wordengeïdentificeerd dieonderdeel uitmaken van een lineaire epitoop. Additionele voordelen van deze methoden
zijn:
- Viasubstitutievaniederaminozuurresidu binneneenreactief peptidekanderelatieve bijdrage van antilichaambinding van ieder van de mogelijk 20 aminozuren
worden bepaald.
- Zondervoorkennisoverdevolgordevandeaminozuurresiduenbinneneenepitoop
kandezeviasynthesenagebootstworden(mimotoop).Aangeziendemeesteepitopen
discontinu van samenstelling zijn, biedt dezebenadering demogelijkheid ook deze
epitopen op te sporen (Geysen et al., 1986).
- De mogelijkheid voor de identificatie en karakterisering van T-cel-epitopen in
eiwitten waarvan deaminozuurvolgorde bekend is(Van der Zeeet al., 1989).
Of synthetische peptidevaccins in detoekomst een belangrijke plaats zullen gaan
innemenindeveterinairevaccinwereldis,gezienhetvroegestadiumwaarinditonderzoek verkeert, onzeker. Duidelijk is dat nog veel onderzoek nodig is, gericht op de
manipulatie van antigene peptiden met als doel het verhogen van de immunogene
eigenschappen,opdeontwikkelingvaneffectieve carriersenopdeoptimaliseringvan
adjuvantia entoedieningsroute. Niettemin zijn devaccinatieresultaten dieinmiddels
verkregen zijn met eenpeptide, samengesteld uit tweegebieden vanhet viraleoppervlakte eiwit VP1vanmond-en-klauwzeervirus, veelbelovend (DiMarchi et al., 1986).
Opbasisvandehuidigekennisistevensteverwachtendattoekomstigepeptidevaccins
129
130
A.L.J. GIELKENS
samengesteld zullenzijnuitsynthetischepeptiden, diezowelB-cel-epitopenalsT-celepitopen bevatten.
15.3.3 Levendevaccins en recombinant-vaccins
Doordesnelgroeiendemoleculair-biologische kennisvanvirussenenbacteriën,ende
mogelijkheid recombinant-DNA-technieken aantewendenvoormanipulatievanhun
genetischeinformatie,zijnereenaantalnieuwestrategieënbeschikbaargekomenvoor
de ontwikkeling van levendevaccins. Tweein het oog springende benaderingen zijn
de attenuatie door gen-deletie en detoepassing van virale en bacteriële vectoren als
dragers van heterologe genen. Door het aanbrengen van deleties in bepaalde virale
genenishetmogelijk geblekendevirulentietereducerenendePathogenesevaninfectietebeïnvloeden(bijvoorbeeldgeenpersistentie).Hoeweldeaandachtzichthansnog
met name richt op manipulatie van DNA-virussen, wordt verwacht dat deze
attenuatie-methode ook goede toekomstperpectieven heeft voor de constructie van
deletiemutanten van virussen met zowel positief- als negatief-enkelstrengs RNA.
RegeneratievaneenRNA-virus kanbij voorbeeld bewerkstelligd worden doortransfectie in weefselkweekcellen van een volledige DNA-kopie, opgebouwd uit kleinere
fragmenten waarin gemanipuleerd wordt.
InNederlandwordtdoormedewerkersvanhetCDIenNederlandsKankerInstituut
(NKI)gewerktaan deontwikkelingvaneennieuwegeneratielevendevaccinstegende
ziektevanAujeszky (herpesvirus suis,ADV)bijvarkens.Doelstellingiseenimmunogeenenveilig,levendvaccinteontwikkelen dat zowelserologisch teonderscheidenis
van wildtype-virus als geschikt is als vector voor exogene virale en bacteriële antigenen. Dethans beschikbare resultaten geven aan dat dezebenadering voor vaccinontwikkeling snelen succesvol kan worden uitgevoerd. Uitgaande vaneenwildtypevirus zijn mutanten geconstrueerd met deleties in eendrietal gebieden van het virale
U|
Rs
1
-i
Us
1
y
Rs
1
1—V/-I y
I
I
-<=jz^H=i
TK-
NIA-3
2.4N3
2.JN3AATK"
gl-
Fig. 48. Schematische weergave van het DNA-genoom van het virus van de Ziekte van Aujeszky (stam
NIA-3), en de NIA-3 deletiemutanten 2.4N3A en 2.4N3AATK". De lokaties van de deleties in het virale
genoom van de mutanten zijn aangegeven. U| = unieke lange sequentie, U s = unieke korte sequentie, R s
= omgekeerd herhaalde sequentie.
ONTWIKKELING VAN VETERINAIRE VACCINS
genoom.Doordeletiezijnondermeerdegenencoderendvoorhetviraleglycoproteïne
glenthymidine-kinase(TK)geïnactiveerd(fig.48).Hetgeconstrueerdevirusheefteen
beperkt replicatief vermogen invivo,ismededaardoor (volledig) avirulent voor een
weekoudebiggen,enbeschermtvarkensdiemetdezemutantgevaccineerdzijn effectief tegenchallengemetvirulent wildtype-virus. Aangezien hetTK-genvermoedelijk
eenbelangrijke rolspeeltbij hettot stand komenvanlatentieenreactivatievanveldvirus van deziekte van Aujezsky, wordt verwacht dat het TK-negatieve mutantvirus
zich niet sluimerend kan handhaven in gevaccineerde dieren. Van groot additioneel
belang isdat, gebruikmakend van monoklonale antilichamen tegen gl, thans tevens
eentestmethodebeschikbaar isdieonderscheid maakt tussen de antilichaamrespons
in het serum van varkens gevaccineerd met deze mutant of bepaalde geattentueerde
ADV-vaccins,endeserumrespons doorinfectie metveld-virus.Hiermeeishet fundamentgelegdvooreengecombineerd vaccinatie-uitroeiingsprogramma tegendeziekte
van Aujeszky in Nederland.
Tweeandere veterinair belangrijke ziekten, namelijk de infectieuze ziekte bovine
rhinotracheitis (IBR)bij het rund enrhinopneumonie (EHV) bij het paard, worden
evenalsADveroorzaakt door een herpesvirus. Gezien deovereenkomst in structuur
en organisatie van het genoom van dezevirussen, moet het ook mogelijk zijn EHVen IBR-virus-deletiemutanten met vaccineigenschappen te construeren.
Het onderzoek naar detoepasbaarheid vangeattenueerd virusalsdrager vanheterologeantigenenvanbelangvoorprotectieontmoeteensnelgroeiendebelangstelling.
Deexperimentele resultaten met recombinant-vacciniavirussen duiden erop dat deze
benadering voor deontwikkelingvannieuwe(multivalente) vaccinseensucceswordt
(Taylor&Paoletti, 1988). Degeïnserteerdeheterologegenenwordenoverhetalgemeen
efficiënt tot expressie gebracht, zijn biologisch actief, en een aantal recombinantprodukten blijken bescherming te geven in experimenteel gevaccineerde dieren. De
bevinding dat recombinant-vacciniavirus een voor het geïnserteerde glycoproteïne
specifieke cytotoxische T-cel-respons kan induceren, doet vermoeden dat dit type
vaccins een bredere en betere prikkeling zal geven van het immuunsysteem dan
subunit-vaccins ofgedodevaccins.Naastvirussenzullenindenaastetoekomstongetwijfeld ook bacteriestammen geschikt gemaakt wordenvoor insertievan heterologe
genen en applicatie als vaccin. Ervaring in deze richting is reeds opgedaan met een
geattenueerd derivaat van Salmonellatyphimurium (Maskell et al., 1986).
15.4 Conclusies
Demoderne biotechnologische technieken enmethoden hebben in kortetijd nieuwe
impulsengegevenophetgebiedvandevaccinontwikkeling.Verwachtmagwordendat
ditzalleidentotnieuwegeneratiesvanverbeterdevaccinsvoorveterinairetoepassing.
Opkortetermijnzijnvooralsuccessenteverwachtenophetgebiedvandegeattenueerde vaccins en hun toepassing als drager van heterologe antigenen. Gezien de
veiligheidsaspecten ishetwaarschijnlijk dat oplangeretermijn levendevaccins,waar
mogelijk, vervangen worden door sububit-vaccins en synthetische vaccins.
131
16 Transgene landbouwhuisdieren
A.L. Archibald
16.1 Inleiding
Al zolang er landbouw bedreven wordt, zo'n 10 000jaar, heeft demensheid de genetischeeigenschappenvanplantenendierengemanipuleerd. Degedomesticeerde soorten
zoals we die nu kennen, zijn het resultaat van vele jaren van genetische verbetering
door deselectievan superieure dieren. Deeersteboeren wisten waarschijnlijk intuïtief
dat superieure dieren een deel van hun superioriteit kunnen overdragen op hun nakomelingen. De meest recente kennis over de grondslagen van de genetica heeft geleid
tot ontwikkeling van verfijndere technieken voor een gerichte fokkerij. Veefokkers
zijn tot nu toe echter beperkt in hun mogelijkheden door de biologische wetmatigheden vandevoortplanting envooraldoor detot ééndiersoort behorende beschikbare
genetische variatie.
Genetische vooruitgang door traditionele fokkerijmethoden is tot stand gekomen
door selectieopbestaande genetischevariatie enhetinbrengen vannieuwegenen door
kruisingen. Uitgangspunt voor de huidige wetenschap van de moleculaire genetica en
recombinant-DNA-technologie was de ontdekking van het DNA-molecule als drager
van genetische informatie. Door methoden als recombinant-DNA-technologie,
embryomanipulatie en embryotransplantatie te combineren is het nu mogelijk om
naar believen bepaalde genen teintroduceren bij landbouwhuisdieren. Individuen die
een dergelijk gen dragen worden transgeen genoemd, en het geïntroduceerde gen het
transgen. Door het toevoegen van extra en/of compleet nieuwe genen (transfectie)
kunnen debeschikbaregenetischevariatieendaarmee ook demogelijkheden tot selectie vergroot worden.
16.2 Technologie voor genoverdacht (transfectie)
Detechnieken voor het inbouwen van exogeen genetisch materiaal bij dieren zijn ontwikkeld bij muizen (overzichtsartikelen door Brinster etal., 1985;Palmiter &Brinster,
1986;Jaenisch, 1988).Debestaande technieken voor genoverdracht zijn teverdelen in
drie categorieën: micro-injectie, retrovirale infectie en embryonale-stamcelmanipulatie. Deze technieken moeten echter niet slechts onafhankelijk van elkaar bezien
worden, omdat ze ook samen gebruikt (kunnen) worden.
132
TRANSGENE LANDBOUWHUISDIEREN
16.2.1 Micro-injectie
Micro-injectie van DNA direct in één van depronuclei van bevruchte eicellen wordt
tegenwoordig routinematig toegepast in vele laboratoria om transgene muizen te
produceren. Tot op heden is dit de enige methode waarmee succesvol transgene
schapen, varkens enrunderen zijn verkregen. Bevruchte eicellen worden chirurgisch
verzamelduitgesuperovuleerdevrouwelijke dieren.Bevruchting komttot stand door
natuurlijke dekkingofdoor kunstmatigeinseminatie.Bijhetschaapishet inbrengen
van sperma direct in het oviduct een bijzonder effectieve manier gebleken om de
opbrengst vanbevruchte eicellenteverhogen (McKelveyetal., 1985).Bij het huidige
succespercentage van gentransplantatie door micro-injectie is het noodzakelijk te
beschikkenovergroteaantalleneicelleninhetjuistestadiumvanontwikkeling,namelijkhetpronucleus-stadium. Hetverzamelenvangroteaantalleneicellengaatgemakkelijk bij demuis,maariseentijdrovende enkostbareaangelegenheid bij landbouwhuisdieren. Eén ervaren persoon kan bij voorbeeld in twee dagen 100-200 muizeeicellen verzamelen, injecteren en transplanteren. Het uitvoeren van dezelfde werkzaamheden voor 30-40 schape-eicellen vereist eenteam van maar liefst zesmensen
diehieraaneenheledagmoetenwerken.Mogelijkkandein-vitromaturatieenin-vitro
fertilisatie van oöcyten, verkregen uit ovaria van geslachte dieren, de efficiëntie van
bevoorrading van eicellen voor micro-injectie verhogen (Luet al., 1987;Fukuletal.,
1988).
Bijmicro-injectiewordenmeteenzeerkleineinjectienaald eenpaarhonderdDNAmoleculeninéénvandepronucleivaneenbevruchteeicelgeïnjecteerd. Deeicelwordt
daarbij op haar plaats gehouden door zuigkracht van een stompe pipet. Lokalisatie
vandepronucleiinmuize-eicellenwordtvergemakkelijkt door dehelderheid vanhet
cytoplasma endeduidelijke verschijningsvorm van denucleoli. Het cytoplasma van
schape-, varkens- en runder-eicellen is daarentegen ondoorschijnend waardoor de
pronucleimoeilijk tezienzijn.Bijhetschaapzijndezeproblemenopgelostdoorzorgvuldigemicroscopie metdifferentieel-interferentiefasecontrast (Hammer etal.,1985;
Simons et al., 1988).Bij varkens-enrundereicellen kunnen depronuclei beter zichtbaarwordengemaaktdoorkortstondigtecentrifugeren (Walletal., 1985; Bieryetal.,
1988).DeresultatenvanPurseletal.(1988)wijzeneropdatbijhetvarkendeintegratie
vangenenbeterslaagtwanneerdeDNA-moleculenin2-celligeembryo'swordengeïnjecteerd.
Nademicro-injectie wordendegeïnjecteerde eicellenchirurgischovergebrachtnaar
vrouwelijke ontvangsterdieren. Bij experimenten met muizen worden de eicellen
gewoonlijk eennachtinvitrogeïncubeerd vóór deimplantatie. Deeicellendietijdens
deze periode blijven leven en zich ontwikkelen, worden overgebracht naar schijndrachtige dieren die gedekt zijn door een gevasectomeerd mannelijk dier. Bij het
schaap worden bijna direct na injectie drie tot vier eicellen overgebracht naar
ontvangster-ooien diedooreenhormonalebehandeling zijn gesynchroniseerd metde
donor-ooien. Bij het varken ishet noodzakelijk omgroteaantallen eicellentetransplanteren, omdat ten minste vier embryo's moeten overleven om de dracht bij
133
134 A.L.ARCHIBALD
ontvangster-zeugen in stand te houden. Vandaar dat het gunstig kan zijn om naast
behandelde ook onbehandelde embryo'stetransplanteren. Omdat ongeveer70- 80 %
van de getransplanteerde embryo's verloren zullen gaan, kan het nuttig zijn om
embryo's over te brengen in een tijdelijk plaatsvervangende moeder vóór de uiteindelijke transplantatie. Vooralbij rundvee, waar de kosten van recipiënten hoog zijn, kan
een dergelijke werkwijze aantrekkelijk zijn.
Ongeveer 20 % van de geïnjecteerde eicellen zullen overleven tot aan het einde van
dedracht. Enkele daarvan zullen het geïnjecteerde DNA inhun genoom hebben ingebouwd. Normaliter worden meer kopieën vanhetgeïnjecteerde DNAbinnen éénchromosomale lokatieteruggevonden. Eénvandevoordelen van de micro-injectietechniek
is dat het transgen meestal terug wordt gevonden in elke lichaamscel, inclusief de
geslachtscellen. Dit betekent dat het genvóór deeersteklievingsdeling geïncorporeerd
moet zijn.
De lage frequentie van succesvolle gentransplantatie door micro-injectie is geen
groot probleem bij muizen. De grotere kosten, langere draagtijd, langere generatieintervallen, en kleinere tomen zullen echter een wijdverspreide toepassing van deze
techniek in de praktijk van de veehouderij tegengaan zolang niet een meer efficiënte
methode van gentransplantatie is gevonden.
16.2.2 Retrovirale vectoren
Retrovirussen bevatten RNA dat, na infectie van een cel met het betreffende virus,
wordt gekopieerd tot een DNA-molecule. Deze DNA-molecule wordt ingebouwd in
een chromosoom van de geïnfecteerde cel. Deze eigenschappen maken retrovirussen
tot idealevectoren voorgentransplantatie. Vermenigvuldiging vanhetvirus,en infectie
van andere lichaamscellen en andere dieren zijn duidelijk ongewenste eigenschappen.
Wetenschappers zijn erin geslaagd retrovirale vectoren te maken die wel in staat zijn
tot infectie enintegratie van DNA-sequenties, maar dieniet in staat zijn nieuwe infecterende virussen te produceren. Het voordeel van retrovirale gentransplantatie is dat
niet-chirurgisch verkregen multicellulaire embryo's kunnen worden geïnfecteerd, en
dat integratie van een gen meestal slechts op één plaats binnen het genoom plaatsvindt. Bij diersoorten zoals dekip,waar het eencelligeembryo bijzonder moeilijk toegankelijk entehanteren is, kunnen retrovirussen eenuitkomst bieden. De verwachting
dat dezetechniek efficiënter zou zijn dan micro-injectie istot nu toenog niet bewaarheid geworden (Van der Putten et al., 1985;Jaehner et al., 1985).Verder blijkt uit het
gebruik vaninfecterende helpervirussen inexperimenten metmuizen dat het transgene
nageslacht viremisch wordt.
Het nadeel van het gebruik van meercellige embryo's is dat de lichaamscellen van
de geproduceerde transgene dieren slechts voor een deel het transgen bevatten, en de
kiemlijn duschimaer is.Overdracht vandegetransplanteerde genennaar eenvolgende
generatiekandaardoor inefficiënt zijn, of inhetgeheelnietplaatsvinden. De publieke
acceptatie kan ook eenbelangrijke hinderniszijn bij het gebruik vanretroviralevectoren voor gentransplantatie bij landbouwhuisdieren.
TRANSGENE LANDBOUWHUISDIEREN
135
16.2.3 Embryonale stamcellen
Cellen, afkomstig uit de 'inner-cell-mass' van eenembryo in het blastocyst-stadium,
kunnenineenin-vitrokweekinlevenwordengehouden. Onder bepaalde omstandighedenzullendezeembryonalestamcellen(ES)zichnietgaandifferentiëren enbehoudenzehuneigenschapomuittekunnengroeientotverschillendeceltypen,metandere
woorden, zeblijven pluripotent (Evans& Kaufman, 1981).Tijdens de kweekperiode
kunnendecellengenetischgemanipuleerd worden.Transfectie kanplaatsvinden door
calciumfosfaat-precipitatie, micro-injectie, retrovirale infectie of elektroporatie.
Onlangsisaangetoond dat het mogelijk isom eengenop eenbepaalde plaats inhet
chromosoom vaneenES-celintebouwen door homologe recombinatie (Mansour et
al., 1988;Zimmer & Gruss, 1989;Joyner etal., 1989).Genetisch gemanipuleerdeEScellen kunnen weerterug worden geplaatst in de 'inner-cell-mass' van een blastocyst
(Bradley et al., 1984; Zimmer &Gruss, 1989). Het transgen kan in principe in elk
lichaamsweefsel vanhetzichontwikkelendedier,inclusief degeslachtscellen, worden
ingebouwd (Gossler et al., 1986). De nadelen van de via deze techniek verkregen
chimaeren,waarvaneendeelhettransgen nietzullenoverdragen,wegennietoptegen
de mogelijkheden van de in-vitro manipulatie van ES-cellen.
Tot op heden isniets bekend over ES-cellen geïsoleerd uit andere diersoorten dan
demuisendehamster.WelisonlangsverslaggedaanvaneenpogingomeenschapeES-cellijn optezetten (Handyside etal., 1987).Het identificeren vaneen groeifactor
diededifferentiatie vanES-cellenindein-vitrokweekinhibeert, zouhet ontwikkelen
vanES-cellijnen voor landbouwhuisdieren aanzienlijk versnellen (Smith et al.,1988;
Williams et al., 1988;Moreau et al., 1988).
16.3 Transgene landbouwhuisdieren
Detoepassingsmogelijkheden vangenetischemanipulatie bij landbouwhuisdieren
waren vanaf het begin duidelijk (Palmiter et al. 1982;Church et al., 1985;Wagner,
1985). Vooralberichtenoverdeproduktievan'supermuizen', uiteicellendiehetrattegroeihormoon-gen onder de controle van de muize-metallothioneïne-promoter
hadden ontvangen, sprak tot de verbeelding van veel dierveredelaars. Hoewel de
produktievantransgenelandbouwhuisdieren gemakkelijk leek,zijn erzoalshiervoor
isuiteengezeteenaantalproblemen.Desondanksismenermetbehulpvandemicroinjectie-techniek in geslaagd om transgene konijne-, schape-, varkens- en runderembryo's te produceren. Eerste onderzoeksresultaten uit verschillende laboratoria
laten zien dat de produktie van transgene landbouwhuisdieren minder succesvol
verloopt dan de overeenkomstige experimenten bij muizen (Hammer et al., 1985;
Bremet al., 1986;Ward et al., 1986;Simons et al., 1988).
136
A.L. ARCHIBALD
16.3.1 Varkens
Deeerstepublikaties overtransgenevarkenszijn afkomstig van eensamenwerkingsverbandtussenonderzoekersuitPhiladelphia,envanhetAmerikaanseMinisterievan
LandbouwinBeltsville,Maryland(Hammeretal.,1985). Diversekopieënvanhetgen
dat codeert voor het humane groeihormoon, gekoppeld aan een muize-metallothioneïne-promoter (MT-hGH), werdeninbevruchte varkenseicellen geïnjecteerd. Tweeduizend eicellen van het varken werden op dezemanier behandeld enovergezet naar
64recipiënten.Vande192biggendiezichontwikkeldenuitdezegeïnjecteerde eicellen
blekener20hetgeïnjecteerde geninhungenoomtehebbeningebouwd. Ongeveerde
helft van de transgene varkens brachten het gen daadwerkelijk tot expressie, resulterend in meetbare concentraties humaan groeihormoon in het bloed. De varkens
waren echter nietgroter engroeiden ook niet sneller dan controledieren (Hammer et
al., 1986).Dit isniet verwonderlijk alsmen bedenkt dat het dagelijks toedienen van
doormiddelvanrecombinant-DNA-technieken verkregenhumaangroeihormoonaan
varkens evenmin een gunstig effect had op de groeisnelheid.
Hieropvolgend zijn transgene varkens met een verscheidenheid aan fusie-genen
geproduceerd door groepen onderzoekers uit West-Duitsland, Australië en deVerenigdeStaten. Dedoor dezegroepen behaaldeefficiëntie inhetproduceren vantransgene dieren is samengevat in tabel 19.Deze experimenten hadden voornamelijk tot
doel de groei van varkens te versnellen en de groei-efficiëntie te verbeteren. De
Beltsville-varkens met het MT-bGH-gen groeiden 23 % sneller en waren 18%
efficiënter met voer bestaande uit 18% ruw eiwit (Wall, 1989).Een tweedeverbetering, diezowelbij het hGH-alshet bGH-fusie-gen werdgevonden, waseenaanzienlijkeafname vandespekdikte(Purséletal., 1988). Vizeetal.(1988)constateerdendat
ook éénvan deMT-pGH-transgene varkens sneller groeide dan controledieren.Veel
Tabel 19. Efficiënte van gentransplantatie door micro-injectie bij het varken3
Fusie-gen
Aantal geïnjecteerde
en getransplanteerde
embryo's
Aantal
geboren
biggen
Aantal
transgene
biggen
Referentie
MThGH
MThGH
MTbGH
MLVrGH
PEPCKbGH
MTpGH
MThGRF
MThGHRH
MTNx
2035
268
2193
170
1057
423
2627
1041
1083
192
15
149
15
94b
17
253
20
1
11
1
2b
6
9
6
6
Hammer et al., 1985
Brem et al., 1986
Pursel et al., 1987
Ebert et al., 1988
Wieghartetal., 1988
Vize et al., 1988
Pinkert et al., 1987
Bremetal., 1988
Brem et al., 1988
c
a. Er zijn kleine tegenstrijdigheden in de gegevens daar waar ze meer dan eens zijn gepubliceerd.
b. Analyses niet compleet.
c. Punt betekent gegevens ontbreken.
TRANSGENE LANDBOUWHUISDIEREN
137
van de transgene varkens bleken echter onder andere te lijden aan letargie, artritis,
anoestrus bij gelten, gebrek aan libido bij beren, en een hoge incidentie van maagzweren (Pursel et al., 1987).
16.3.2 Rundvee
In deliteratuur wordt verslag gedaan van deproduktie van transgene runderembryo's
(Church et al., 1986; Biery et al., 1988). Church et al. (1986) verzamelden eicellen uit
koeiendiewarengesuperovuleerd, natuurlijk gedektenvervolgensgeslacht.Er werden
852bevruchteeicellengeïnjecteerd met eena-foetoproteïne-fusie-gen, en237van deze
embryo's werden overgebracht naar ontvangster-koeien. Van de 111embryo's die zich
ontwikkelden bleken er 4 transgeen te zijn. Met andere woorden, 2 % van de overgebrachte embryo's was transgeen, en slechts 0,5 % van de geïnjecteerde eicellen ontwikkelde zich tot transgene embryo's.
Biery en zijn collega's, verbonden aan 'Granada Genetics Inc.' in Texas, verzamelden 1325 rundereicellen. Deze eicellen werden gecentrifugeerd om de^pronuclei
zichtbaar te maken, en 819 eicellen werden met het RSV-CAT-fusie-gen (bacterieël
chloramphenicolacetyltransferase gekoppeld aan een Rous Sarcoma Virus promoter)
geïnjecteerd. Schapen werden gebruikt als tijdelijke draagmoeder voor deze geïnjecteerde embryo's. De embryo's die overleefden werden na 6 dagen overgebracht naar
ontvangster-koeien. Op dag 60van de dracht werden de koeien geslacht, en de foeten
onderzocht omteachterhalen of hetRSV-CAT-DNAinhungenoomgeïntegreerd was.
Er werden 4transgene foeten aangetroffen. Voorgaande gegevens zijn samengevat in
tabel 20.
16.3.3 Schaap
De eerste publikatie over transgene schapen is eveneens afkomstig van de Beltsvillegroep. Het MT-hGH-fusie-gen werd in 1032 schape-eicellen geïntroduceerd, en deze
eicellen werden overgebracht naar 192 ontvangster-ooien. Van de 73 lammeren die
werden geboren was er één transgeen. Het transgen was structureel veranderd, zodat
het niet mogelijk was om expressie van het transgen vast te stellen in dit lam. In de
Tabel 20. Efficiëntie van gentransplantatie door micro-injectie bij rundvee.
Fusie-gen
Aantal
geïnjecteerde
embryo's
Aantal
getransplanteerde
embryo's
Aantal
onderzochte
embryo 's
Aantal
transgene
embryo's
Referentie
a-fetoproteïne
RSV-CAT
842
842
819
237
175"
111
79
4
4
Church et al., 1986
Biery et al., 1988
a. Van tijdelijke draagmoeder (schaap) overgebracht naar uiteindelijke recipiënt (koe).
138 A.L.ARCHIBALD
Tabel 21. Efficiëntie van gentransplantatie door micro-injectie bij schapen.
Fusie-gen
Aantal geïnjecteerde en getransplanteerde
embryo 's
Aantal
geboren
lammeren
Aantal
transgene
lammeren
Referentie
MThGH
MTbGH
MTbGH
oMToGHS
oMToGH9
TFbGH
MThGRF
pMK
BLG-FIX
BLG-AAT
BLG-AAT
1032
578
133
1079
409
247
435
108
252
42
256
73
18
20
81
23
33
63
29
52
11
36
1
Hammer etal., 1985
Purselet al., 1987
Pursel etal., 1987
Nancarrow et al., 1988
Nancarrow et al,,1988
Rexroadet al., 1988
Rexroad &Pursel,1988
Simonsetal., 1988a
Simons etal., 1988a
Simons et al., 1988a
Clark etal., 1988a
2
4
3
7
9
1
4
1
2
a. Alleen deeencellige embryo's diegeïnjecteerd zijn, zijn meegeteld.
loopvandetijd zijn opnieuw door deBeltsville-groep,maar ook door onderzoekers
uit Australië enSchotland, transgene schapen geproduceerd (tabel 21).Bijgeenvan
detransgeneschapendiegroeihormoon-fusiegenen droegenwerdeenverhoogdegroei
geconstateerd.OpdesuccesvolleexpressievandeBLG-FIX-en BLG-AAT-fusie-genen
zal hierna nog worden ingegaan.
16.3.4 Pluimvee
Tot voor kort was infectie van vroege kippe-embryo's met replicatiecompetente
'wildtype'-ofrecombinanteretrovirussen deenigesuccesvollemethodeomtransgeen
pluimveetecreëren (Salter etal., 1987).Dealdus verkregen transgene kippen bleken
echterviremischtezijn. Bosselmanetal. (1989)beschrijven deintegratievaneenniet
tot replicatieinstaat zijnde reticulo-endoteliosis-virus (REV)retrovirale vectorinde
kiemlijn bijkippen. Devector, dieniet-viraal DNA heeft, werd geïnjecteerd via de
zonapellucidaindesubgerminaleholtevanhetblastoderm vannietbebroedeeieren.
Vande2599geïnjecteerde eierenkwamener760uit.Vandeuitgekomen kuikensdroegen 173 devectorsequentie alseentransgen. Hettransgen werd teruggevonden in
spermavan33 vande82transgenehanen. Devierhanen diegebruikt werdenvoorde
voortplanting,gavenhettransgendoornaardevolgendegeneratiemeteen frequentie
van2tot8 %.Bijenkele transgene dieren werden lage niveaus van competent virus
aangetroffen. Erwerd geen competent virus aangetroffen bijdedieren die werden
gebruikt voor defokexperimenten. Zoalsuithetvoorgaande magblijken, zijn erdus
transgenekippelijnen geproduceerd doorgebruik temakenvaneenretroviralevector
als medium voor genoverdracht indeprimordiale kiemcellen, aanwezig inde onbebroede kippe-embryo's.
TRANSGENE LANDBOUWHUISDIEREN
Het eencelligekippe-embryo istegelijkertijd ontoegankelijk enmoeilijk tebehandelen. Op het 'Institute of Animal Physiology and Genetics Research' (IAPGR) te
Edinburgh zijn methoden ontwikkeld voor de in-vitro kweek van kippe-embryo's
vanaf het eencellig stadium tot het moment van uitkomen (Perry, 1988). Op dit
momentwordt geprobeerd omnieuwgenetisch materiaalinheteencelligestadiumte
introduceren. Dit zou de volgende stap moeten zijn om te komen tot alternatieve
produktiemethoden van transgeen pluimvee.
16.4 Welkegenen zullen deproduktieverhogen?
Hetgroteprobleembijdeproduktievanveeteeltkundiggezien'verbeterde' landbouwhuisdieren doormoleculair-genetische manipulatieisnietlangereenvooraltechnisch
probleem.Hetprobleemisvooraleentekortaangeïdentificeerde enkelvoudigegenen
die grote effecten hebben op de produktie-eigenschappen. Er is een aantal
enkelvoudige genen bekend die, wanneer zegekloneerd zouden kunnen worden, in
aanmerking komen voor transfectie. Het eerste is het halothaan-gen, een gen dat
verantwoordelijk is voor het varkensstress-syndroom en de daarmee verband houdendeafwijkende vleeskwaliteit (PSEvlees).Ophet 'Institute of Animal Physiology
and GeneticsResearch' wordtgetracht hethalothaan-gen door middelvaneenmoleculaire benadering te identificeren (Archibald, 1987).Wanneer dehoge vruchtbaarheidvanenkeleChinesevarkensrassen toegeschreven kanworden aan éénenkelgen,
of wanneer deaard vanhet Booroola-gen, dat deworpgrootte bij schapen verhoogt,
kanwordengeïdentificeerd, zoudendezegenenlosvanhungenetischeoorsprongsnel
getransplanteerd kunnen worden naar andere hoogproduktieve rassen om aldus de
produktie versneld te kunnen verhogen.
De ziekteresistentie zou verhoogd kunnen worden door het toevoegen van extra
'Major Histocompatibiliteits Complex' (MHC) genen. De expressie van genen die
coderenvoorviraleoppervlaktemoleculen bijdierendienormalitergevoeligzijnvoor
de betreffende infectie, zou door zijn concurrerende werking het aantal mogelijke
bindingsplaatsen van infecterende virussen kunnen verlagen, endaardoor resistentie
tegen een dergelijke infectie kunnen verlenen. Een voorbeeld hiervan wordt geleverd
door de groep van Brem uit München. Zij hebben het Mx-gen van de muis, dat bij
muizen verantwoordelijk isvoor resistentie tegen influenzavirus type A, ingebouwd
bij varkens (Brem et al, 1988).
Delijst met detot nu toegeïdentificeerde enkelvoudige genen dieeen belangrijke
invloed hebben op produktiekenmerken, isnog klein. Pogingen omhet genoomvan
landbouwhuisdieren inkaart tebrengen kunnen dezelijst indetoekomst uitbreiden.
Degenen diein aanmerking komen voor transfectie kunnen in drie klassen worden
verdeeld: genen die coderen voor:
- signaal-eiwitten (bij voorbeeld hormonen),
- enzymen,
- structurele eiwitten zoals die voorkomen in bij voorbeeld spierweefsel, melk en
wol.
139
140 A.L.ARCHIBALD
Zoals isaangetoond door de 'supermuis'-experimenten kan het inbouwen vaneen
transgen, dat codeert voor een hormoon en onder controle staat van een heterologe
promoter, eenenorm effect hebben op degroeivan dedieren (Palmiter et al., 1982).
Hetinbrengenvandergelijkegenenbuitenhundoor 'feedback'-mechanismen gecontroleerde natuurlijke omgeving, kan echter ernstig schadelijke bijeffecten oproepen
opkenmerken alsvruchtbaarheid, libidoenoverlevingskansen (Palmiter etal.,1982;
Purseletal., 1987).Hetgebruikvangenendiecoderenvoorsignaal-eiwittenalstransgenvereist dan ook onderzoek naar dejuiste regulatoire DNA-elementen, waardoor
weliswaar nieuwe, maar toch gecontroleerde patronen van expressie ontstaan.
Simpelgedacht zou men verwachten dat het verhogen van dehoeveelheid vaneen
enzym dat een sleutelrol speelt bij bepaalde metabole processen, de produktie zou
verhogen. Kascer &Burns (1979) toonden aan dat de snelheid waarmee metabole
processendoorlopenwordennietgevoeligisvoorveranderingeninhetniveauvanindividuele enzymen. Het zalwaarschijnlijk noodzakelijk zijn omgebruik temakenvan
multigen-fusieprodukten omzodoendedemetaboleprocessentekunnenbeïnvloeden.
Het isechter waarschijnlijker dat hetintroduceren vancompleet nieuweseriesgenen
effectiever zal zijn. Als voorbeeld kan genoemd worden debeschikbare hoeveelheid
van eenbepaald zwavel-bevattend essentieel aminozuur dat bepalend isvoor deproduktie van wol. Ward en zijn collega's in Australië zijn van plan om twee bacteriële
genen in schapen te implanteren die de produktie van cysteine uit serine
vergemakkelijken, waardoor hetaanvankelijk essentiëleaminozuur cysteineeennietessentieel aminozuur wordt (Nancarrow et al., 1988).
De derde klasse van genen zijn genen die coderen voor eindprodukteiwitten als
vlees-,melk-enwoleiwitten. Degenendiecoderenvoor keratineproduktie zijn intensief bestudeerd, maar erzijn sterkeaanwijzingen dat keratine-mRNA niet debeperkendefactor isbij deproduktie vanwol.Verderishetmogelijk desamenstelling van
melktebeïnvloeden doorgenmanipulatie.Hetisbijvoorbeeldmogelijk omheteiwitpercentage in demelk teverhogen door extra melkeiwit-genen bij koeien te implanteren (Simons et al., 1987).Derijping van kaasisafhankelijk van de caseïnesoorten
dieaanwezigzijnindemelk.Doorgenetischgemanipuleerdecaseïnegenenteimplanteren bij koeien, zou het mogelijk kunnen zijn om deeigenschappen van melk voor
de kaasproduktie te veranderen. Het zou ook wenselijk kunnen zijn om koeiemelk
voor demensgeschikter temaken, door hetlactoseenhet/3-lactoglobulinegehaltete
verlagen.Hetverlagenvanhetlactosegehaltezoubereiktkunnenwordendoortransgeneindividuentecreeërendieeenlactoseafbrekende ß-galactosidase-activiteitvertoneninhunuier,ofwaarbij heta-lactalbumine-genvernietigd ofgeïnactiveerd wordt.
16.5 Zijn eralternatieve aanwendingsmogelijkhedenvoortransgene
landbouwhuisdieren?
Op het 'Institute of Animal Physiology and Genetics Research' te Edinburgh ishet
onderzoeksprogrammavoordeproduktievantransgenedierennietgerichtophetproducerenvanveeteeltkundiggezienverbeterdelandbouwhuisdieren.Melkvee(schapen)
TRANSGENE LANDBOUWHUISDIEREN
wordt in Edinburgh gebruikt alsvehikel voor deproduktie van belangrijke humane
eiwittenzoalsbloedstollingsfactor IX(FIX)ena-1-antitrypsine(AÄT).Hetdoelisom
melkklierenbijtransgeneschapenertoeaantezettenomhumaneeiwittenteproduceren(Latheetal., 1986).Omdat het schape-programma duur entijdrovend is,worden
deverschillendefusie-genen geëvalueerdbijtransgenemuizen.Dewerkzaamheidvan
hetmuizemodelisaangetoonddoortransgenemuizendiehetschape-/3-lactoglobuline
(BLG)genalstransgen droegen, wattot uitingkwaminhogeconcentraties aanBLG
in hun melk (Simons et al., 1987).Expressie van het BLG-transgen bij deze muizen
isspecifiek voor demelkklier.Eenserievanhybridegenen,dieregulatoireelementen
vanhetschape-BLG-gen combinerenmetsequenties(cDNA's)diecoderenvoor ofwel
humaan FIX ofwel humaan AAT,zijn geconstrueerd enworden gebruikt omtransgenedieren teproduceren. Expressie van FIX en AATmet sommigevan deze fusiegeneniswaargenomen inmelkvanzoweltransgenemuizenalsschapen(Clark etal.,
1989;Archibaldetal., 1988).Hetgebruik vaneenhybridegendat depromoter en5'flankerende sequenties van het BLG bevat, en gefuseerd werd met de genomische
sequenties die coderen voor AAT, heeft geresulteerd in hoge concentraties AATin
melk van transgene muizen. Dit fusie-gen wordt nu bij schapen getest.
16.6 Transgenelandbouwhuisdieren inde fokkerij
De hoge waarde van 'farmaceutische' eiwitten, geproduceerd in programma's voor
transgenenonderzoek zoals hiervoor beschreven, zalin het algemeen opwegen tegen
demeeste schadelijke bijeffecten vanhet transgen of van het integratieproces. Inde
traditioneleveehouderij echtermoethettransgeneindividu eengrotere economische
waarde hebben dan debeste vergelijkbare dieren dieaanwezig zijn. Deintegratie en
exploitatievantransgeenveeinveeteeltkundige, agrarischesystemenwordtbediscussieerd door Smith et al. (1987).Wanneer micro-injectie gebruikt wordt om genen in
tebouwen, wordt hettransgen opeenwillekeurigeplaats inhet chromosoom geïntegreerd. Vandaar dat iedertransgeendieruniek is.Omdatgenetischevooruitgangniet
nauwkeurig kan wordenvastgesteld door slechts éénindividu per genotypetebestuderenzalhet,omdeeffecten vaneennieuwgentemeten,noodzakelijk zijnompopulatiestecreëren diehomozygoot danwelhemizygoot zijn voor hetnieuwegen. Ditis'
een kostbare aangelegenheid. Smith en collega's geven aan dat er nooit voldoende
financiële middelen zijn vrijgemaakt voor een goede vergelijking van bestaande
rassen,envragenzichdanookafofditwelhetgevalzouzijnvoordenieuwetransgene
populaties.Omdathettestprogrammaveeltijd inbeslagzalnemen,zalhetnoodzakelijk zijn omeicellentegebruiken, afkomstig uit genetisch superioredieren, als 'gastheer' voordetransgenen. Hetisookbelangrijk datdeuiteindelijke voordelenvanhet
transgenediertenminste 10%hogerzijn danhetgemiddeldevandegemeteneigenschap, opdat de transgene individuen niet achterlopen bij de rest van de populatie
waarin tijdens deevaluatie wordt geselecteerd.
141
142 A.L.ARCHIBALD
16.7 Toekomst
Inhetzichsnelontwikkelendevakgebiedmogenverdereverbeteringenbij hetproducerenengebruikvantransgenedierenverwachtworden.Deidentificatievangenendie
voor manipulatie in aanmerking komen is van essentieel belang wanneer gentransplantatie in de landbouw verder effectief toegepast wordt. Op korte termijn
zullentransgene dieren waarschijnlijk niet voor praktische toepassing maar voor de
identificatie vangenenendestudievangenexpressiegebruikt worden.Er zijn mogelijkhedenomdetechniekenenmethodenvangentransplantatieteverbeteren.Hetniet
totexpressiekomenvaneenbepaaldtransgenisveelaltoeteschrijven aaneenpositieeffect: het transgen is in een inert deel van het genoom terechtgekomen. De incorporatieinfusie-genen vansequentiesdieeenpositieonafhankelijke expressiemogelijk
maken zou eengroteverbetering zijn bij het ontwerpen van eentransgen (Grosveld
etal., 1987).Deontwikkelingvantechniekendiegebruik makenvanretrovirussenen
embryonalestamcellen,zullenvangrootbelangzijn. Vooraldeplaatsgerichtegenetische manipulatie van embryonale stamcellen, die vervolgens gebruikt worden om
transgene dieren teproduceren, vormt desleutel voor detoekomstige produktie van
transgenelandbouwhuisdieren. Dezevorderingen zullendeontwikkeling vanmethoden omgenentebeschadigen, teneutraliseren, entesubstitueren, vergemakkelijken.
Een alternatieve methode voor gen-neutralisatie ishet gebruik van deantisensegenexpressie. Deeerstestapvoor expressievan eengenisdetranscriptie, dat wilzeggen
desynthese van 'messenger' RNA (mRNA), gebruik makend van éénstreng vanhet
genalscoderendemal.Doorinvitrodeselectieveplaatsenvandepromoterendecoderendesequenties van eengenteveranderen, moet het mogelijk zijn deexpressievan
decomplementerende (tweede)strengtebemachtigen.Ditdoortranscriptieverkregen
anti-sense-RNA,enhetoorspronkelijkemRNA,zijncomplementairenkunnenhybridiserenzodateendubbelstrengs RNAontstaat. Ditdubbelstrengs RNAzouongevoeligmoetenzijnvoordedaaropvolgendeverwerkingvanhetRNA,transportvanuitde
celkern en translatie. Hoewel deze benadering in een celculture heeft gewerkt, iser
slechts één bericht waarin melding wordt gedaan van een succesvolle toepassing bij
transgene dieren (Katsuki et al., 1988).
16.8 Conclusie
Tegenwoordig kunnen genenwordengeïdentificeerd, geïsoleerd engemanipuleerd in
het laboratorium omnieuwegenentegenereren. Het introduceren vandezegenenin
embryo'svan dezelfde of eenanderediersoort leverttransgenedieren op.Hoewelop
deze manier reeds transgene muizen, konijnen, schapen, varkens en runderen zijn
geproduceerd, zijn desuccespercentages nog laag:slechts 1-5 %vandeeicellendie
met behulp van micro-injectie genetisch gemanipuleerd zijn, ontwikkelt zichtot een
transgeendier.Transgeenpluimveeisgeproduceerddoorgebruiktemakenvanretroviralegen-transplantatie. Bijmuizenzijnnaplaatsgerichteintegratievanexogeengenetisch materiaal in gekweekte embryonale stamcellen transgene dieren geproduceerd.
TRANSGENE LANDBOUWHUISDIEREN
Dit isdeaangewezen wegomte komen tot een kostenbesparende en gecontroleerde
wijze van produktie van transgene landbouwhuisdieren.
Genetische manipulatie kan gebruikt worden om deproduktie teverhogen of om
nieuwe methoden te ontwikkelen waarmee kostbare eiwitten geproduceerd kunnen
worden. Genetische manipulatie met genen die betrokken zijn bij agrarisch gezien
belangrijke produktiekenmerken, wordt verhinderd door eengebrek aan kennisover
de genen die deze produktiekenmerken bepalen. Er is aangetoond dat transgene
schapen kunnen worden gebruikt bij de produktie van humane plasma-eiwitten.
16.9 Verantwoording
Hetconceptvan ditartikelishetresultaatvaneensynthesevanideeënafkomstig uit
veelbronnen,maarmetnamevancollega'sinEdinburgh - wijlenprof.RogerLand,
enJohn Clark, Paul Simons,IanWilmut, John Bishop,RickLathe,StephenHarris,
Margaret McClenaghan en Bruce Whitelaw. Ik zou in het bijzonder het artikel
geschrevendoor Simons&Land (1987)aanwillenbevelen.Ditartikelgeeft eengrondig engoed gepresenteerd overzicht van transgene landbouwhuisdieren.
143
17 Industriële ontwikkelingen van derecombinant-DNA-technologie
voor de veehouderij
J.P.M. Sanders
17.1 Inleiding
De recombinant-DNA-technologie heeft in de laatste 10-15 jaar eengrote ontwikkeling doorgemaakt. Deze technologie heeft reeds een grote invloed op verschillende
industriële gebieden gehad en zalin detoekomst de samenleving aanzienlijk veranderen. Veelvan de onderwerpen die in dit boek worden behandeld, zijn reeds beïnvloed
door de recombinant-DNA-technologie.
In deze bijdrage worden enkele aspecten van ontwikkelingen binnen de biotechnologische industrie ten aanzien van de veehouderij belicht. Omdat verschillende
ontwikkelingen zoals diagnostiek met recombinant-DNA voor ziektepreventie, therapie en transgene dieren reeds behandeld zijn, zal de aandacht in het hierna volgende
vooral gericht zijn op een aantal voorbeeldprodukten die de produktie in de veehouderij efficiënter kunnen maken, enprodukten dietot nutoedoor het dier gemaakt
worden en die in hoedanigheid zullen veranderen. Bovendien zal de interactie die de
verschillende onderzoeksgebieden in de toekomst op elkaar uit kunnen oefenen
belicht worden. Uit figuur 49blijkt decentraleplaats diehetdierinde veeteeltkundige
Boeren in Biotechnologie
vaccins,diagnosticsI
antibiotica,probiotica
aminozuren,enzymen,plantengeneticengineering|
groeihormonen,dierengenetic engineering
insuline/ stremsel /mest
Fig.49. In deproduktieketen van deveeteelt neemt het dier een centrale plaats in.
144
INDUSTRIËLE ONTWIKKELINGEN
produktieketen inneemt. Aan de hand van deze keten zal eerst de invloed van de
recombinant-DNA-techniek op dierlijke Produkten zoals insuline, stremselen opde
mestproblematiek aan deordekomen. Vervolgenszullendemogelijkheden vandeze
technieken ter verbetering van antibiotica, diagnostica, veevoeder en groeibevorderaars worden behandeld.
17.2 Produkten uit hetdier
17.2.1 Insuline
Detechniek vanhet kloneren diein 1973voor het eerst lukte, ontwikkelde zichsnel
verder(Cohenetal., 1973).Nadat eenaantalbacteriëlegenenwasgekloneerd, wasde
lolervoor dewetenschappers snelaf, omdathetduidelijk werddatelkbacterieelgen
zichwelzoulatenkloneren.VoorDNAuithogeremicro-organismen, enhogeredieren
en planten was dit geheel anders, omdat degenen uit deze organismen niet continu
maaronderbroken georganiseerdzijn(hoofdstuk 13).MetbehulpvanhetzogenaamdecDNA-klonerenkonook dezedrempelwordengenomen (Efstratiadis etal.,1976).
In 1976 ontstond het besef dat de 'genetic engineering' rijp genoeg was voor een
commerciële aanpak. Met een 'meesterstuk' liet dein 1978opgerichte firma Genentechziendat inprincipeelkeiwitmetbehulpvanmicro-organismen teproducerenis
mitsmendeaminozuurvolgorde kent. Het genvoor het 14aminozuren langesomatostatine werd met eennieuwealgemeen toepasbare methode gesynthetiseerd, entot
expressie gebracht (Itakura et al., 1988).
Tegenwoordig, amper 10 jaar later, is de derde generatie automatische DNAsyntheseapparaten opdemarktwaarmeeeenopgeleidemedewerkereendrietalDNAstukken van elk 50-70 nucleotiden lengte in één nacht kan maken.
NaditmeesterstukhebbenGenentecheninmiddelsookveelandere DNA-bedrijven
zichgestort opveelprodukten diemin of meervoor dehand lagen. Detechniekwas
nogzoonvolmaakt dat eerstvooral deduursteprodukten aandacht konden krijgen.
Dit betrof met name humane geneesmiddelen. De microbiële produktie van het
betrekkelijk kleine eiwitinsuline werd alweer door Genentech in samenwerking met
Eli Lilly ontwikkeld (Goeddel et al., 1979).Het aantal suikerziektepatiënten isnog
steeds groeiend waardoor debeschikbaarheid van insuline uit varkens, runderen en
paarden somseensterkbeperkendefactor vormde.Inprincipeisdebeschikbaarheid
nuongelimiteerdmitsmenvoldoendefermentors inzetendetechnologiebeheerst.Dit
aspectspeelt eenstemeervoorprodukten dietot nutoeslechtsuitmensengeïsoleerd
kondenworden, zoalshumaan groeihormoon, interferon enfactor VIII.Eentweede
belangrijk voordeelvandetechniekisdatmeneenhomogeenprodukt krijgt waarvan
mendeherkomstprecieskentenwaaringeenziektekiemen kunnenzitten.Ditaspect
speeltvooraleenrolbijdehumanebloedprodukten zoalsstollingsfactor VIII,dieaan
hemofiliepatiënten wordt toegediend. Vanwegehet grote aantal factor-VIII-donoren
isdekansaanzienlijk datbesmettingmetHepatitisen/ofAIDSplaatsvindt.Tenderde
ishet van belang een produkt te gebruiken dat identiek ismet de humane stof.
145
146
J.P.M. SANDERS
Varkensinsuline wijkt in één aminozuur af van humaan insuline waardoor allerlei
immunologische bijverschijnselen optreden. Het door genetic engineering verkregen
insuline is uiteraard identiek gemaakt aan het humane produkt.
17.2.2 Chymosine/stremsel
Een zelfde situatie vinden we bij de bereiding van kaas. De beschikbaarheid van
chymosine of rennine, dat verkregen wordt door extractie van lebmagen van nuchtere
kalveren, is geen zaak van leven of dood zoals dat voor insuline wel het geval is. Het
is eerder een kwestievan smaak. Chymosine splitst van het x-caseïne, een hoofdcomponent in melk, slechts één peptidebinding. Er ontstaat hierdoor een coagulaat van
melkeiwitten: de melkeiwitten worden onoplosbaar en gaan over in de vaste vorm.
Door zijn zeer specifieke werking worden demelkeiwitten nietverder door chymosine
afgebroken.
Zowel de kwaliteit als de kwantiteit van chymosine is aan schommelingen onderhevig,zeker nu men kalveren langer houdt dan enkelejaren geleden.Bij ouderekalveren neemt de pepsinehoeveelheid ten opzichte van de chymosine hoeveelheden toe.
Gedurende de laatste decennia is een aantal vervangende enzymen ontwikkeld,
afkomstig van voornamelijk schimmels. Alhoewel deze vervangende enzymen een
veelvuldige toepassing genieten, zijn er geringe maar belangrijke verschillen in de
enzymatische eigenschappen, zodat desmaak vaak nadelig wordt beïnvloed en er nog
steeds behoefte aan chymosine bestaat. Recombinant-DNA-technieken hebben de
mogelijkheid geopend chymosine op alternatieve wijze te produceren.
17.2.3 Expressie van chymosine in Kluyveromyces
Aangezien Escherichia coli minder geschikt is voor de produktie van enzymen voor
devoedingsmiddelenindustrie, isgezocht naar andere micro-organismen als gastheer.
Eén van de micro-organismen waarop de keus is gevallen is de gist Kluyveromyces
lactis, eenniet-pathogene gist diewordtgebruikt voor deindustriëleproduktie van het
enzym lactase (galactosidase). Daartoe moest voor K. lactis een vector-gastheersysteem ontwikkeld worden (Van den Berg et al., 1983). Van het chromosoom van
K. lactis werden diegedeelten gekloneerd diedemogelijkheid bezaten zich autonoom
inK.lactisterepliceren.Tevenswerdeenaantal selectiemethoden ontwikkeld waarmee
de aanwezigheid van een plasmide kan worden aangetoond. Veel Plasmiden werden
gevonden die tot de expressie van (pro-)chymosine in K. lactis aanleiding geven. Een
industriële fermentatie van chymosine is ontwikkeld, en in 1988 heeft de Zwitserse
overheid als eerste land in de wereld dit recombinant-DNA-produkt voor toepassing
in de kaasindustrie toegelaten.
INDUSTRIËLE ONTWIKKELINGEN
17.2.4 Mest
Aanhet derdeprodukt van onzelandbouwhuisdieren dat indit verband aan deorde
komtbestaatopditogenblikzekergeentekort.Decirca 14miljoenvarkens,5miljoen
runderen en80miljoen kippenzijngoedvoor eenjaarlijkse mestproduktie vancirca
130miljoen m3. In de mest zit nog een aantal nuttige stoffen waarop verschillende
organismen goedgroeien. Ditisdan ook hetprobleem. Bijvoorbeeld het fosfaat dat
indemestaanwezigis,isverantwoordelijk vooreenovermatigegroeivanalgenwaardoor oppervlaktewateren dichtgroeien enwaardoor teweinigzuurstof voor dewaterdieren overblijft.
Analyse van het probleem leert dat hieraan betrekkelijk gemakkelijk iets kan
worden gedaan: veelplantaardig materiaal bevat fosfaat in een bepaalde gebonden
vorm:fytine datdoorvarkensenkippen nietkanwordenafgebroken enderhalveniet
kanwordenbenut. Omdevarkensenkippen tochinhun behoefte tevoorzien wordt
in Nederland jaarlijks circa 20000 ton fosfaat aan de verschillende voeders toegevoegd.Defytineverlaatonaangetasthetdier(indehuidigesituatiekomt^Omiljoen
kgfytine onverteerd in demest)enwordt pas door micro-organismen indemest tot
fosfaat omgezet. Dit fosfaat spoelt uit demest dat inmiddels op het land uitgereden
isenveroorzaakt aldus het milieuprobleem, althans in diegebieden waar eenintensieveveehouderij plaatsvindt. In 1987 iseenonderzoek gestart doorGist-Brocadesen
hetProduktschapvoorVeevoederwaarbij ookhetIVVO,SpelderholtenTNObetrokkenzijn, naardemogelijkheden omeenenzym(fytase) aanhetvoertoetevoegendat
instaatisalinhetvarkenofdekipvoldoendefosfaat uithetfytinevrijtemaken,zodat
nietlanger extrafosfaat aan dezemengvoeders hoeft tewordentoegevoegd. Opdeze
wijzezoudehoeveelheidfosfaat dieviadeveeteeltindenatuur komtmetcirca20000
tonverminderdkunnenworden.Alswebedenkendatdetotalehoeveelheidfosfaat die
inNederland indebodemgeloosd wordtcirca 140000tonbedraagt, endat 8000ton
vanuitwasmiddelen inhetoppervlaktewater terecht komt, danishetduidelijk datdit
een grote inspanning waard is.
Zomogelijk ishetstikstofprobleemindemestnoggroterdanhet fosfaatprobleem.
Ammoniak uitmestwordtverantwoordelijk gesteldalseengedeeltelijkeoorzaakvan
zure regen. Nitraat spoelt in sommige delen van het land uit debodem in het drinkwater, en moet dan daaruit weer worden verwijderd. Alhoewel het ontbreekt aan
kwantitatieve gegevensoverdeomvangvandit probleem endaarmeegeen duidelijke
economische waarde aan het oplossen ervangegeven kan worden, wordt opverschillendewijzen getracht ook ditprobleem optelossen.Hetmeestelegant isdemethode
omdestikstof indemestomtezetteninessentiëleaminozuren zoalslysine,zodat de
omzettingeconomisch betaalbaar wordtendeimport vanstikstofhoudende Produkten in ons land enigszins kan afnemen (Sanders &Slijkhuis, 1986).
147
148
J.P.M. SANDERS
17.3 Produktieverhogende middelen (naar hetdier)
17.3.1 Antibiotica enprobiotica
Antibiotica, vooraltegenbacteriën, wordenveelvuldigtoegepast indeintensieveveehouderij, nietalleenvoor depreventieenbehandeling vanziektes,maar ook alsvoederadditief in lage concentraties om degroeite versnellen en een hogere voederconversietebewerkstelligen. Indekomendejarenzullendeproduktiemogelijkhedenvan
antibioticadoor 'geneticengineering'nogaanzienlijk verbeteren.Vanwegehetfeitdat
antibiotica doorgaans geen eiwitten zijn eneencomplexe syntheseroute in demicroorganismen hebben, veelcomplexer dan desynthesevaneiwitten, istot nu toeindit
opzicht nog nauwelijks melding gemaakt van enige stamverbetering metbehulp van
'genetic engineering', maar aanzienlijke verbeteringen zijn te verwachten zodra de
beperkendestappenindesyntheseroutebekendzijn geworden.Eentweedeeffect van
'genetic engineering' zal zijn dat nieuwe antibiotica gemaakt zullen kunnen worden
dieresulterenuiteencombinatievandesynthesestappenvantweeofmeerverschillende bekende antibiotica.
Eennieuweontwikkelinginditverbanddieookdoordebiotechnologie 'getriggerd'
wordtishetzoekennaar eenacceptabelalternatief voordetoepassingvanantibiotica
als groeistimulator. Het toedienen van antibioticum in zeer lage concentraties heeft
waarschijnlijk zijn invloed ophetaantal en/of soort bacteriën indedarm, waardoor
de voedselvertering direct, of indirect door toxineproduktie, wordt beïnvloed. Om
zulke nadelige effecten tegen te gaan worden op dit ogenblik verschillende probioticum-preparaten aanhetdieraangeboden diedeaanvoedertoegevoegde antibiotica
lijkentekunnenvervangen.Omdathetomkleineeffecten gaatmoetendevoorlopige
conclusies nog met meer proeven worden onderbouwd. De tot nu toe aangeboden
preparaten zijn in het algemeen nog onvoldoende constant in hun werking.
17.3.2Vaccins en diagnostica
Door de ontwikkeling van dehybridomatechnologie, die in dit boek reeds uitvoerig
is behandeld, zal in de nabije toekomst een groot scala aan zeer specifieke antilichamen beschikbaar komen diedediagnosevanziektenenook deconcentratievan
allerleistoffen indeveeteeltprodukten snelendoeltreffend kunnenhelpenvaststellen.
Immunologische en 'genetic engineering' technieken samen zullen ons bovendien
binnen korte tijd in staat stellen veel vaccins te maken en/of te verbeteren. Beide
ontwikkelingen, waarop in deverschillende hoofdstukken uitvoerig wordt ingegaan,
zullen ziektes kunnen voorkomen dan wel in een vroeger stadium dan tot nu toe
kunnen herkennen. Bovendien zal het wetenschappelijk onderzoek over een extra
krachtige techniek kunnen beschikken.
INDUSTRIËLE ONTWIKKELINGEN
149
17.3.3 Aminozuren en plantenveredeling
Desamenstellingvanhetvoerdatvoordierenwordtaangemaakt,wordtvoornamelijk
doordekostprijs vandegrondstoffen bepaald.Daardoorkomthetvoordatbepaalde
stoffen in overmaat aanwezig zijn, omdat in een bepaalde voedercomponent een
essentiële stof weinigvoorkomt. In demeeste plantaardige stoffen die alsveevoeder
worden gebruikt, komen deaminozuren lysine, methionine enenkeleandere relatief
weinigvoor. Dezeaminozuren wordenvoor eendeelchemischenvoor eendeellangs
microbiologischeweggemaakt. Door demogelijkheden van 'geneticengineering'om
stamverbetering te bewerkstelligen, zal een aantal aminozuren die tot nu toe langs
chemische weg gemaakt werden in de toekomst mogelijk fermentatief gemaakt
worden. Voorlysinedat nu fermentatief tot 70g/l gemaakt wordt zaleenproduktieverhoging tot 200g/l wellicht mogelijk blijken. Daardoor zal detoepassing ruimer
worden, enzal er minder veevoeder nodig zijn omhet lysinetekort optevullen.Een
anderemogelijkheiddiezichnuaankondigt,ishetgebruikvanenzymendieeenaantal
voedercomponenten optijd kunnen vrijmaken, omdat het varken of dekip daartoe
zelfnietinstaatis.Dathiernogveelmogelijkmoetzijnvalttevoorspellenuitdegrote
hoeveelheidvoederstoffen dieuiteindelijk indemestterechtkomen.Intabel22wordt
de groeiopbrengst van verschillende landbouwhuisdieren met microbiële systemen
vergeleken. Uit deze vergelijking blijkt dat nog veel componenten het dier onaangeroerd verlaten. Tabel 23 toont het verteringspercentage van verschillende voedercomponenten inhetvarkeninmonstersuit het eindevanhetileum.Gemakkelijk zal
dezeopgavevan 'voorvertering' echter nietzijn, omdathetvarken endekipookzelf
hunenzymentevergeefsopdezestoffen hebbenlateninwerken.Hierzouhet verrijken
vandepensflora en/of dedarmflora metbacteriëndieinstaatzijncelluloseenlignine
aftebreken,soortgelijkegroeiverbeteringenkunnenopleveren.Hetisdenkbaarbacteriën op dezewijze intezetten alsvitamine enaminozuren producent. In dit verband
moetookdeinwerkingvanenzymenop 'silage'wordengenoemdomalduseenhogere
opbrengstteverkrijgen, ofwel demogelijkheid tescheppendatvarkenszichmet 'silage' zullen kunnen voeden.
Tabel 22. Vergelijking van degroeiopbrengst vanverschillendelandbouwhuisdieren metmicrobiële systemen.
Systeem
Conversie
(kg/kg)
Grondstoffen
(Hfl/kg voer)
Grondstof kosten
(Hfl/kg biomassa)
Rund
Varken
Kip
Gist
Theoretisch optimum (micro -organismen)
Alkohol uit hout
Alkohol uit graan
12-14
6-7
4-4,5
3-4
2
2,9
2,2
0,10-0,35
0,45
0,60
0,40
1,00
0,08
0,50
1,20-4,90
2,70-3,15
2,40-2,70
1,20-1,60
2,00
0,25
1,25
150
J.P.M. SANDERS
Tabel 23. Het verteringspercentage van
verschillende voedercomponenten in het
varken in monsters uit het einde van het
ileum.
Lignine
Cellulose
Hemicellulose
Eiwit
Zetmeel
Overige suikers
0
10 20
20
75
95
>95
Hoelang dezeroutesineconomisch opzichthaalbaar blijven hangt afvande resultatenindeplanten 'geneticengineering'. Opditogenblik ismen eralingeslaagd planten
voor bepaalde insekten en bepaalde gewasbeschermingsmiddelen resistent te maken.
Daarnaast zoekt men ijverig naar methoden om planten een hogere opbrengst te
geven, of hen bij ongunstige omstandigheden te kunnen laten groeien (bij voorbeeld
in zout milieu).
In veel gewassen komen stoffen voor die remmend werken op de vertering in grote
huisdieren. Inditverband ismetnamehetonderzoek metraapzaad vergevorderd. Men
heeft nueenvariëteit ontwikkeld diezowellaagisinderemstof erucazuur alsook laag
is in glucosinolaat in het uiteindelijke meelprodukt. De produktie per ha kan echter
nog niet op tegen de originele variëteit. Evenzo is op dit ogenblik veel onderzoek
gericht op het verhogen van de lysineconcentratie in de plantaardige voedercomponenten. Het ligt voor dehand dat ook veelvan deoverigevoedercomponenten die aan
veevoeder moeten worden toegevoegd, omdat dit essentiële aminozuren dan wel vitamines, conserverings- en smaakstoffen zijn, in de toekomst met behulp van planten
'genetic engineering' gemaakt kunnen worden. In principe kan het mogelijk worden
dat één gewas een optimaal dieet betekent voor een diersoort. Deze ontwikkeling zal
nog geruime tijd op zich laten wachten, omdat de voedersamenstelling sterk afhangt
van soort dier en leeftijd en omdat de produktie van planten zich zeker niet in een
keurslijf laat dwingen. Bovendien zal de tegengestelde eis, namelijk gemakkelijk
afbreekbaar voor het dier en resistent tegen de invloeden van de natuur, ruimte openlaten voor bovengenoemde enzympreparaten. Dank zij de recombinant-DNAtechnologie en de grote hoeveelheden veevoeder die in de wereld verhandeld worden,
zou het lonend kunnen zijn met behulp van enzymen verbeteringen aan het veevoeder
te blijven aanbrengen.
17.3.4 Groeihormoon
In tegenstelling tot de antibiotica die als groeibevorderaars worden toegediend, beïnvloeden hormonen de groei via cellulaire regulatiemechanismen in het dier. Deze
cellulaire regulatie beïnvloedt de synthesesnelheid en de hoeveelheid eiwit die in de
INDUSTRIËLE ONTWIKKELINGEN
spier wordt gemaakt. Daarnaast hebben groeihormonen invloed op de afbraak van
eiwitten die normaal een flinke turn-over kennen. In koeien heeft groeihormoon een
sterkeinvloed op demelkproduktie. Decommerciëleontwikkelingvandierlijke groeihormonen werd pas zoals vaak in gang gezet na de klonering van humaan groeihormoon. Dit hormoon kon tot nu toe slechts zeer spaarzaam worden toegepast om
kinderen met een achtergebleven groei te behandelen, omdat het slechts uit de overledenmensgeïsoleerd konworden. Nainsulineisdithettweedeprodukt dat sinds 1977
op de markt is gekomen, en dat allerlei stadia van 'clinical trials' heeft doorstaan.
Runder-groeihormoon bevindt zich op het ogenblik in een laatste teststadium. Dit
rundergroeihormoon, ook wel BST genaamd, is een vertegenwoordiger van de zogenaamde peptidéhormonen. Dit type hormonen kan in tegenstelling tot de Steroidhormonen, niet in het lichaam van de consument terecht komen. Men verwacht dat
verschillende bedrijven in 1990met dit produkt op de markt gaan komen (voorlopig
niet de Europese markt).
Dank zij dezichsnelontwikkelende 'genetic engineering' ziet men opveel terreinen
een explosie in kennis van processen dievroeger nauwelijks wetenschappelijk toegankelijk waren. Vaak was vanwege de lage concentraties en de veelheid van betrokken
stoffen een zuivering onhaalbaar, zodat de effecten van zuivere componenten niet te
bepalen waren. Wat betreft de fysiologie van de groei is gebleken dat er een eiwit
bestaat dat de aanmaak van groeihormoon in de hypofyse regelt: de zogenaamde
Groeihormoon Releasing Factor (GRF). Dit eiwit is vijfmaal kleiner dan groeihormoon enisbovendien bij veellagereconcentraties actief. Het zalduidelijk zijn dat
te zijner tijd het groeihormoon door deze GRF van de markt verdrongen wordt. Ook
wordtgewerktaan eenimmunisatietegenhetsomatostatine dat deeigenproduktie van
het groeihormoon in de koe onderdrukt. Hierdoor zouden de groeihormoonspiegels
verhoogd worden zonder de daadwerkelijke al dan niet door de EEG geaccepteerde
toediening van groeihormoon. Daarmee zalhet eindstadium nog niet bereikt zijn. Op
grond van het vermelde in hoofdstuk 16zal het ieder duidelijk zijn dat uiteindelijk
groeihormoon of GRF en andere groeistimulerende middelen misschien niet langer
hoeventeworden toegediend. Door het inbrengen van dejuiste genetische informatie
zullen efficiënte en snelgroeiende dieren geselecteerd kunnen worden. Een ander al
eerder genoemde mogelijkheid is een auto-immunisatie tegen somatostatine, hetgeen
bij lammeren een verhoging van de groeihormoonconcentratie tot gevolg had waardoor in het experiment het vetgehalte met 20 % daalde ten opzichte van de controles.
Voor de hand ligt in varkens de biochemische pathway voor bij voorbeeld lysine te
kloneren, zodat dit aminozuur niet langer 'essentieel' genoemd mag worden. Uiteraard zullen ook vitamines en andere voederhulpstoffen in het dier gemaakt kunnen
worden endusniet langer aan hetvoer toegevoegd hoeven worden. Deze ontwikkeling
zalzeker een aantal vragen oproepen inonzemaatschappij. Het isechter ondenkbaar
dat detechnologische ontwikkeling stopgezet wordt, hoewel dit zeker dewensvan een
aantal mensen zalzijn. Wanneer deproevenzorgvuldig worden uitgevoerd en acceptabele grenzen worden bepaald, zullen weover tien tot vijftien jaar terugblikkend meer
genuanceerd over deze periode zijn gaan denken.
151
18 Ethiek en biotechnologie in de veehouderij
H. Verhoog
18.1 Inleiding
In kringen van natuurwetenschappelijk geschoolde mensen is het onvermijdelijk dat
eerst iets over ethiek in het algemeen moet worden gezegd. Scholing in aard en mogelijkheden van de ethiek ontbreekt veelal. Dit kan geïllustreerd worden aan twee
NRLO-studierapporten over dierlijke biotechnologie (NRLO-Studierapport 14c,
1983;NRLO-Studierapport 14e, 1984).Inrapport 14cworden enkeleregelsgewijd aan
de ethische aspecten. Verwezen wordt naar het intussen 'grote aantal publikaties' dat
hierover is verschenen, maar ondanks dit grote aantal publikaties (waarvan er geen
enkele genoemd wordt) 'lijkt minder voortgang te zijn geboekt op het terrein van de
ethische aspecten van de resultaten en toepassingen van moderne celbiologische technieken'. In-vitro fertilisatie en kloneren verdienen volgens de auteurs overdenking,
vooral vanwege mogelijke toepassing van deze technieken bij de mens. In rapport 14e
is van 'overdenking' helemaal niets meer te merken. Als in dat rapport wordt gesproken over in-vitro fertilisatie wordt enkel gezegd dat de ontwikkelingen op het gebied
van dierbiotechnologisch onderzoek 'een wetenschappelijke aanvulling zou kunnen
betekenen voor de humane sector'. De op gang gekomen technologische ontwikkelingen worden eenvoudig als gegeven aanvaard. Bestaande onderzoekslijnen worden
alleen getoetst op haalbaarheid, economische relevantie, wetenschappelijke relevantie
en toepasbaarheid.
Vanintegratie van deethische aspecten, of 'technology assessment' in dezin van de
Nota Integratie van Wetenschap en Techniek in de Samenleving (IWTS-Nota, 1984),
is in genoemde NRLO-rapporten geen sprake. Wel zitten er in deze rapporten vooronderstellingen verborgen dievanuit ethisch oogpunt niet vanzelfsprekend zijn. In de
eersteplaats wordt erimpliciet van uitgegaan, dat ethische problemen met betrekking
tot de omgang met dieren beperkt zijn tot welzijnsproblemen (gedragsstoornissen,
pijn, en dergelijke), want waarom zouden anders technieken als in-vitro fertilisatie,
embryotransplantatie en kloneren alleen moreel problematisch zijn als ze op mensen
worden toegepast? Men gaat er dan alvan uit dat er moreel relevante verschillen zijn
tussen mensen endieren. Beiderapporten veronderstellen dat diereneenlouter instrumentele waarde hebben, dat alles wat kan ook mag, mits onnodige pijn maar wordt
voorkomen. Het gevolg is dat er geen enkel afwegingsproces plaatsvindt tussen de
belangen van mensen en dieren.Er wordt alleengekeken naar de(mogelijke) belangen
van (sommige) mensen.
Overheidsbeleid heeft te maken met keuzes tussen verschillende mogelijkheden,
met verschillende gevolgen voor het welzijn van (bepaalde groepen van) mensen en
152
ETHIEK EN BIOTECHNOLOGIE
dieren(alsdezetenminstemorelestatus hebben).Bij dit soort keuzesisethiek altijd
meer of minder expliciet in het geding. Ethiek houdt dus veelmeer in dan devraag
of er ook welzijnsproblemen zijn enof de 'ethische vragen welzwaarder wegen dan
deeconomische' zoals het vaak, enten onrechte, wordt geformuleerd.
18.2 Normatieve ethiek
Het is nietgoedmogelijk ominditbestekeenenigszinsverantwoord envolledigbeeld
vandeethiek teschetsen. Deboekjes van Frankena (1963),DeGraaf (1972)enFretz
(1980)biedengoedeinleidingen. De hiergeschetsteuitgangspuntenzijnonderdeelvan
een stroming die wel 'argumentatie-ethiek' of 'verantwoordelijkheidsethiek' ('goodreasonsapproach')wordtgenoemd.De vraagnaareenuiteindelijke('absolute') funderingvanwaardenwordtopengelaten. Hetisvoldoendeomteaanvaarden datermin
ofmeergoederedenenvooreennormatief standpuntmogelijk zijnendatde rationaliteit(geldigheid,universaliteit)zaltoenemen,alsmeer'moreleactoren'erinslagenzich
belangeloos in een machtsvrije dialoog op te stellen. Ervaring heeft geleerd dat de
volgende uitgangspunten geschikt zijn voor een in depraktijk bruikbare ethiek:
- het onderscheid tussen descriptieve ethiek (sociaalwetenschappelijk onderzoek
HANDELING
EFFEKTIVITEIT
DOELSTELLING
REDELIJKHEID van dehandeling
met het beoogde doel
BELANGEN- mensen
- dieren
NOODZAKELIJKHEID van de
handeling
-*- AFWEGING: Toetsingscriteria
- wettelijke
- ethische
- beroepscodes
beginselen
- publieke opinie
ALTERNATIEVEN
(ON)TOELAATBAARHEID
CONDITIES m.b.t.de
uitvoering
ETHISCHE NORM
Fig. 50. Een ethisch toetsingsmodel.
BELEIDSMAATREGELEN
153
154 H.VERHOOG
naarheersendenormenenwaarden),normatieveethiek(aangeven-vangegronderedenen voor een normatieve uitspraak) en meta-ethiek (de vraag naar de fundering of
geldigheid van normatieve uitspraken);
- normatieveethiekalswijsgeriggebiedvanonderzoekgaatuitvandemogelijkheid
datmensenzichkunnenopstellenalsmoreleactoren, alsethischvolwassenpersonen,
die in vrijheid kunnen handelen, rationeel kunnen denken en in staat zijn omzich
belangeloos en onpartijdig op te stellen;
- erissprakevaneenmoreelprobleemwanneerereenreëlekeuzemogelijkheidisuit
verschillende alternatieven, dieverschillend gewaardeerd kunnen worden wat betreft
hun gevolgen voor menselijk (en dierlijk) welzijn;
- eenmoreleactorprobeerttoteenzodanigekeuzetekomen, opbasisvaneenredelijke afweging van de relevante feiten, waarden en normatieve principes, dat hij/zij
mag aannemen dat een andere morele actor onder dezelfde omstandigheden tot een
gelijke keuze zou komen (streven naar 'universalisering');
- het voorgaande punt impliceert dat men zijn/haar keuze moet toetsen aan de
mening van anderen, idealiter in eenmachtsvrije dialoog;
- komentoteen'redelijkeafweging' betekentdateendooranderennavolgbaartoetsingsmodel wordt gehanteerd, waarin de verschillende stappen dietot een bepaalde
conclusieleiden duidelijk wordengemaakt. Figuur 50geeft eenvereenvoudigd voorbeeld van een dergelijk toetsingsmodel.
18.3 Ethiek en mens-dier-relatie
Tenaanzienvandeethischeaspectenvanhetgebruikvandierendoordemenskunnen
problemen op drie niveaus worden onderscheiden (Verhoog &Visser, 1987).
Het eerste niveau ishet niveau waarop devraag kan worden gesteld of dieren een
morele status hebben en zo ja, wat voor status. Dat alleen mensen morele actoren
kunnen zijn in deeerder beschreven betekenis (paragraaf 18.2),betekent niet dat de
moreleaspectenvanonshandelenalleenmaarbetrekkingzoudenhebbenopdegevolgenervanvoor anderemoreleactoren. Mensen diedeeigenschappen van het ethisch
autonomeindividumissenblijken indepraktijk weldegelijk morelestatustehebben.
Alshetbijexperimentenopmensenbijvoorbeeldgaatomminderautonomemensen,
danwordtaanhenzelfseengroterebeschermwaardigheid toegekend danaanmensen
diezelf eenbewuste afweging kunnen maken en invrijheid erin toestemmen omals
proefpersoon tewordengebruikt. Decentralevraag op dit niveau isdus devraagin
hoeverrebepaaldeverschillenofovereenkomstentussenmensen,oftussenmensenen
dieren, moreel relevant zijn of niet. Fundamentele rechten van de individuele mens
gelden voor alle mensen, ongeacht bestaande verschillen in huidskleur, godsdienst,
geslacht,enzovoort.Zoudenerooknietbepaaldefundamentele rechten geformuleerd
kunnen worden diezowelvoor mensen alsvoor dieren gelden, enop grond waarvan
menzoukunnenzeggen,dateen'primafacie'gelijkebehandelingtenaanzienvandie
rechtengerechtvaardigd is?Primafaciewilzeggendaternieteenbelangrijker normatief principe isop grond waarvan dierechten geschonden mogen worden. Goedeen
ETHIEK EN BIOTECHNOLOGIE
uitvoerige samenvattingen van deze discussie worden gegeven door Rollin (1981)en
Regan(1984).
Watbetreft demorelestatuskunnenantropocentrischeenbiocentrischeargumentatielijnen worden onderscheiden, waarbij respectievelijk de verschillen en overeenkomsten tussen mensen endieren centraal worden gesteld (Verhoog &Visser, 1987).
In de discussies is de vraag heel belangrijk of aan dieren, naast hun instrumentele
waarde voor de mens, ook een 'intrinsieke' of 'inherente' waarde moet worden toegekend(Visser&Verhoog,1986). Reedsin1981 heeft deoverheiddeintrinsiekewaarde
van dieren erkend (Nota 'Rijksoverheid en Dierenbescherming', 1981), en komt op
grondhiervantotdeconclusiedatdefunctie vanhetdiervoordemens(deinstrumentele waarde) aan de eigenwaarde van het dier ondergeschikt kan worden gemaakt.
Erkenning of toekenning vanintrinsieke waarde aan dieren geeft hen een ondubbelzinnigemorelestatus,enlegtmensendeplichtopominconflictsituaties metdebelangen van dieren rekening te houden en/of te zoeken naar alternatieven voor diergebruik. Dit brengt ons op het tweede niveau.
Het tweede niveau ishet niveau waarop belangen van mensen worden afgewogen
tegenbelangen vandieren. Deerkenning dat zowelmensen alsdieren een intrinsieke
waardehebben,levertproblemenopalsergekozenmoetworden,alsbeschermingvan
enrespect voor deintegriteit vandiereninconflict komt metrespect voor het welzijn
endeintegriteitvanmensen.Erkenningvandeintrinsiekewaardebrengtmetzichmee
dat eendier nooit alleen alsmiddelgebruikt magworden, endat gebruik van dieren
dathunintegriteitenwelzijnschaadtinprincipenietmagplaatsvinden.Hierissprake
van een 'deontologisch' normatief principe dat bij conflictsituaties aangevuld moet
worden met 'teleologische' argumenten, waarbij door een afweging nagegaan moet
wordenofdevoorgenomenhandelingredelijk (ermoetengoederedenenvoorzijn)en
noodzakelijk (er mogen geen alternatieven zijn) is. Bij teleologische argumentaties
wordt gekeken naar de gevolgen van de handeling voor de betrokken belangengroepen. Dit iseeningewikkelde problematiek, waarmee nog maar weinig praktijkervaring is opgedaan.
Het derde niveau ishet niveau van deuitvoering van een handeling. Stel dat men
deafweging vanbelangentot eenbevredigend eindheeft gebracht entot deconclusie
isgekomen dat dieren voor een bepaald doelgebruikt mogen worden, dan betekent
datnognietdatmendanmaarallesmetdiedierenmagdoen.Menzalzegoedmoeten
huisvesten en verzorgen, pijn zoveel mogelijk voorkomen, enzovoort. De regels die
hiervoor worden opgesteld liggen op het derde niveau.
18.4 Ethische problemen met betrekking tot demoderne biotechnologie
De in de vorige paragraaf behandelde algemene ethische vraagstellingen over de
mens-dier-relatie spelen ook met betrekking tot biotechnologie en veehouderij. Als
voorbeeld dient de door een studiegroep (Sonderegger, 1978) in Zürich opgestelde
'sozialethische Grundforderungen' over het houden van landbouwhuisdieren:
1. Menschen,TiereundPflanzen habenTeilandergleicheneinenWeltundUmwelt.
155
156 H.VERHOOG
Das bedeutet, dass sie zueinander in Beziehung stehen und aufeinander angewiesen
sind.
2. Im Gegensatz zum Tier und zu den Pflanzen kann der Mensch aus dem ökologischen Gleichgewicht ausbrechen, worauf seine Fähigkeit beruht, Macht über Tiere
und Pflanzen auszuüben. Für die Natur haben sich daraus verhängnisvolle Folgen
ergeben.
3. Dieses Machtpotential des Menschen bedingt seine Verantwortlichkeit für die
gesamte Umwelt, somit auch für das Tier.
4. Gegenüber der menschlichen Machtposition ist das Tier ohne gleiche Chance, es
muss unterliegen. Die menschliche Macht ist darum einzugrenzen. Als Kriterium für
diese Eingrenzung sehen wir die Mitgeschöpflichkeit, welche in der Ehrfurcht des
Menschen gegenüber dem Tier zum Ausdruck kommt.
5. DerMensch darf dieReichhaltigkeit der lebenden Natur nicht noch weiter vermindern. Seine Tätigkeit sollte dahin wirken, dass eine Regulierung durch natürliche
Kräfte gewährleistet ist.
6. Soweit der Mensch seineMacht über das Tier ausübt, ist erverantwortlich für eine
den Bedürfnissen desTieres möglichst entsprechende Existenz. Insbesondere darf das
Tier nie nur zum Objekt menschlichen Handelns werden.
7. Der Mensch soll grundsätzlich das Recht haben, das Tier zu wirtschaftlichen
Zwecken zu nutzen. Wo der Mensch aber von diesem Recht Gebrauch macht, soll er
dafür sorgen, dass dieHaltungsbedingungen den Bedürfnissen desTieres entsprechen
und seine physische und psychische Gesundheit garantieren.
8. DieBeeinflussung desErbmaterials darf nur soweitgehen, alsdasTier seine Kreatürlichkeit beibehalten kann, d.h. dass seine selbständige Lebensfähigkeit jederzeit,
auch in natürlicher Umgebung, gewährleistet bleibt.
In deze eisen wordt gesteld dat een dier nooit alléén maar object van menselijk
handelen mag worden. In verband met biotechnologie is vooral punt 8 van belang.
Hierin wordt onder andere gesteld dat een dier 'zijn eigen aard' moet kunnen behouden. Binnen een dergelijke visie staat men bij voorbaat kritisch tegenover het maken
van chimaeren of transgene dieren ('doorbreken van soortbarrières'). Het is duidelijk
dat dezestellingname betrekking heeft op het niveau van demorele status van dieren,
en dat hier ethische vragen opdoemen die veel verder reiken dan de zoöcentrische
ethiek, diezichalleenmaar richt ophetwelzijn van dieren(accent opbewustzijn, pijn,
en dergelijke).
Rollin (1986) is een goed voorbeeld van een vertegenwoordiger van een dergelijke
welzijnsethiek. Het doorbreken van soortsgrenzen, deintroductie vangenetisch materiaal van mensen in dieren of omgekeerd, en het maken van chimaeren, zijn volgens
hem geen 'genuine moral issues'. Niet soorten, maar individuen zijn moreel relevant
volgens Rollin, omdat eensoort niet kanlijden. Hij beschouwt genetische manipulatie
als een moreel neutraal stuk gereedschap. De morele waarde wordt dan afhankelijk
van de aard van de gevolgen van toepassing ervan voor mensen en dieren. Wat dieren
betreft gaat het om degevolgen voor 'the animal's happiness or satisfaction'. Stel dat
men bij voorbeeld door genetische manipulatie de behoefte om te scharrelen bij
ETHIEK EN BIOTECHNOLOGIE
157
kippen zou kunnen wegnemen, dan iser, volgens Rollin, moreel gezien niets aan de
hand. Intuïtief voelen veel mensen bezwaren tegen een dergelijke conclusie. Rollin
wijst dezebezwaren van dehand door tezeggen dat zegebaseerd zijn opniet-morele
gronden: theologische, statische soortsopvattingen, dieinstrijd zijn met deevolutietheorie,ofesthetischegronden(verliesvansoorten).Destellingnameroepttweeprincipiële vragen op:
1. Wat is de definitie van een soort enwat is demorele relevantie daarvan?
2. Watbetekent'intrinsiekewaarde'nogalsdemensdeeigenaardvaneendier(-soort)
naar believen kan gaan veranderen?
Met het ontstaan van natuurwetenschap ontstond ook de tegenstelling tussen
'feiten' en'waarden'.Dewetenschapmoestzichbeperkentothetaandragenvaneigenlijke, empirische kennis. De geldigheid van bepaalde waarden viel voortaan buiten
haar domein; discussie daarover werd overgelaten aan theologen, filosofen, politici.
Uit objectieve feiten kon (en kan) men, logisch gezien, geen normatieve uitspraken
afleiden. Een tweede complicatie is dat 'natuurwetenschappelijke feiten' veelal zo
wordenopgevatdatmenbedoeltmateriële,zintuiglijk waarneembarefeiten':Ditbetekent in de praktijk dat natuurwetenschap over een mogelijke spirituele, geestelijke
werkelijkheid geenuitspraken kandoen,nochindebevestigende,nochindeontkennende zin. Een en ander geldt ook voor de evolutietheorie, voorzover deze er aanspraak opmaakt eenwetenschappelijketheorietezijn, maar alsdat zois,watisdan
demorele relevantie van Rollin's tegenwerping dat eentheologische soortsopvatting
(doorGodgeschapensoorten)instrijd ismetdeevolutionairesoortsopvatting? Moet
eendergelijk argument indecontextvaneendiscussieovermorelerelevantiedanniet
gelijkgesteld wordenmeteen(sciëntistische)geloofsovertuiging enopdezelfdemanier
beoordeeld worden als een andere geloofsovertuiging?
Rollin gaat ervan uit dat er maar één algemeen aanvaarde soortsopvatting in de
biologieis.Ditisallerminst hetgeval;erzijn biologenenfilosofen dieverdedigen dat
soorten in een aantal belangrijke opzichten als 'individuen' moeten worden beschouwd (Kornet, 1987). Overigens geldt hier opnieuw dat men van een dergelijk
wetenschappelijk soortsbegrip niet zonder meer kan overgaan op eenconclusieover
demorelerelevantiehiervan. Heelinhetalgemeengeldtdatdatgenewat 'natuurlijk'
isniet zonder meer goed hoeft tezijn vanuit moreel gezichtspunt. Dit geldt dusook
voordevelebiotechnologen diebewerendatwatzijdoen 'indenatuurookvoorkomt'
ZozegtW.A.deVoogdvanderStraaten (1987):'Derecombineerbaarheid isinherent
aan moleculaire eigenaardigheden van DNA. De recombinant-DNA-technologie
maakt 'eenvoudig' gebruik van deze eigenaardigheid! 'Terug naar de natuur!' Kurt
Bayertz(1987)citeertinditverbandReinhardLöwdieheeft gezegd: 'Rechtfertigungsbedürftig istnichtdieNatur,sonderndieHandlungendesMenschensindes,undzwar
gerade insofern, als sie keine Naturereignisse sind. Grob gesprochen: Wer Gene
manipuliert,machtnichtdasGleichewiedieNatur,sonderndadurchdasseresmacht
ist esgerade nicht das Gleiche' (p.170).
Integenstellingtot RollinisFox(1988)eenuitgesprokenvertegenwoordigervaneen
rentmeesterethiek. Ook hij benadrukt dat de gevolgen van genetische manipulatie
158 H.VERHOOG
voor het welzijn van dieren niet te voorzien zijn. Volgens Van Putten (1988) wordt er
ook nauwelijks enig onderzoek gedaan naar de gevolgen voor het gedrag van de
dieren.Er zijn grotepotentiëlerisico'svoor dedieren aanverbonden. Zelfs indetraditionele fokkerij zien we dat het streven naar verdergaande efficiëntie en produktieverhoging geleid heeft tot ziektes en verstoring van het welzijn van dieren, maar Fox
gaat duidelijk verder. Hij zegtdat helemaal losvandevraag of genetische manipulatie
het welzijn van de dieren kan verstoren, het ook een ethische vraag is of de mens 'de
waardigheid' ('sanctity and dignity') (Van Meisen, 1987) van het individuele dier, en
de 'integriteit' en continuïteit van desoort waartoe het dier behoort, geweld mag aandoen. Foxciteert detheoloog Thomas Berry: 'Everybeing has itsowninterior, itsself,
its mystery, its numinous aspect. To deprive any being of this sacred quality is to
disrupt the total order of the universe' (p. 89). Ook Van Meisen (1987) wijst op het
gevaar dat wedoor biotechnologisch onderzoek 'de eerbied voor het mysterie van het
leven zouden kunnen gaan verliezen'. Als we überhaupt 'voor God willen spelen',
laten we, zegt Fox, het dan doen vanuit een houding van nederigheid, wijsheid en
medeleven, en niet geleid door een streven naar winst. Dit wordt heel actueel nu voor
heteerstindeUSAeenpatent isgegevenopeenlevendorganismewaarvan het genoom
door demensisveranderd. In april 1987heeft deUnited States Patent and Trademark
Office een memorandum gepubliceerd, waarin staat dat genetisch gemanipuleerde
dieren, als 'products of human ingenuity', vallen onder de rubriek 'non-naturally
occurring manufactures or compositions of matter'. Dit besluit heeft een storm van
protesten losgemaakt, onder andere vangenoemde Fox, diesamen met Jeremy Rifkin
tot tegenacties is overgegaan.
Het begripintrinsieke of inherente waarde isonverbrekelijk verbonden met het idee
van het hebben van een 'eigen aard'. Ook als in welzijnsdiscussies gesproken wordt
overhet waarborgen vanhet 'soortspecifieke gedrag', wordt van eendergelijk idee uitgegaan. Achterberg &Visser (1988)hebben laten zien dat debestaande argumentaties
voor toekenning van morele status aan dieren systematisch ondermijnd of zelfs geëlimineerd kunnen worden door voortgezettegenetischemanipulatiemet landbouwhuisdieren. Hoe ingrijpender de manipulatie, hoe groter het artefact-karakter van de zo
gemanipuleerde dieren wordt: 'De status van uitsluitend middel tezijn tot bevrediging
van externe, namelijk menselijke, doeleinden, wordt nu in de erfmassa van dieren
onomkeerbaar - voor de betrokken dieren - vastgelegd'. Het artefact-karakter
wordt juridisch bevestigd (maar daarmee nog niet moreel gerechtvaardigd) door deze
'Produkten van menselijke inventiviteit' te patenteren. Het begrip intrinsieke of
inherente waarde in de morele zin is per definitie niet meer op deze 'artefacten' van
toepassing; door het patent is het dier namelijk louter middel geworden, zonder doel
inzichzelf. Watnogaandoelaanwezigis,isdoor demensopgelegd. De objectiverende
tendens inhet natuurwetenschappelijk denken, en deinstrumentalisering van het dier
voor menselijke doeleinden zijn volledig samengevloeid. Een verklaring voor de bij
sommige groepen aanwezige principiële weerstand tegen het maken van transgene
dieren zou kunnen zijn dat, als men er eenmaal aan begint, een weg terug niet meer
mogelijk lijkt.
ETHIEK EN BIOTECHNOLOGIE
159
Het moleculair-biologische referentiekader van waaruit binnen de biotechnologie
naar dieren wordt gekeken, versterkt detendens tot instrumentaliseringinhoge mate.
Volgens Rifkin (1984) staat de eeuw van de 'algenie', de eeuw van de doelgerichte
verandering van levende wezens om hun prestaties te vergroten, of geheel nieuwe
wezens te creëren, voor de deur. Om manipulatie over de soortsgrenzen heen te rechtvaardigen, moet het idee van een levend organisme of een soort als identificeerbare
en discrete eenheid, met een relatief constante verzameling eigenschappen, worden
opgegeven. Dit gebeurt op het moleculair-biologische vlak, waar levende organismen
worden gezien als dragers van 'informatie' en het leven als een code die ontcijferd en
naar believen veranderd kan worden. Dit 'reductionistische' beeld van de natuur, van
leven, van de mens, wordt meer dan een vrijblijvende interpretatie of referentiekader
zodratechniek eraan gekoppeld wordt. Danwordt hettot concretewerkelijkheid zoals
nu om onsheenzichtbaar wordt. Steldat men overeenstemming zou kunnen bereiken
dat opgrond van deintrinsiekewaardevan dierenbepaaldeingrepen inhetdier ontoelaatbaar zijn. Betekent dit nu dat dergelijke ingrepen onder geen enkele voorwaarde
toelaatbaar zijn, of wil men uitzonderingen maken voor die gevallen waarin het niet
uitvoeren van de ingreep een ten minste even grote aantasting van de menselijke integriteit metzichmeebrengt? Rechtvaardigt hetdoelelkmiddelom dat doeltebereiken?
Bij mensen is het antwoord duidelijk: 'neen'. Het toekennen van individuele rechten
dient om de mens te beschermen tegen utilistische afwegingen, die de belangen van
een individu ondergeschikt kunnen maken aan een al dan niet gefundeerd 'algemeen
belang'. Wat dieren betreft wordt tot nu toe vrijwel uitsluitend utilistisch gedacht,
althans in de praktijk.
Erkenning van en toekenning van intrinsieke waarde aan dieren zal hierin veranderingbrengen. Danzalvoor elkeingreepindiereneenserieuzeafweging moeten worden
gemaakt, waarbij rekening wordt gehouden met de belangen van dieren. Ten aanzien
van de belangen van proefdieren zullen dierexperimenten-commissies in het leven
worden geroepen om overethische aspecten tepraten. In detoekomst zalook biotechnologisch onderzoek met dieren onder de wet op de dierproeven vallen. Rozemond
(1989)heeft voorgesteld om voor het dierexperimentele biotechnologische onderzoek
categorale dierexperimenten-commissies in te stellen, terwijl de komende
Gezondheids- en Welzijnswet voor Dieren (1985)een overlegvorm zou kunnen creëren
voor discussies over de toepassingen in de praktijk van de dierhouderij. In laatstgenoemd Wetsvoorstel is een artikel 37v.bis opgenomen, dat luidt:
1. Bij algemene maatregel van bestuur kunnen uit ethische overwegingen regelen
worden gesteldten aanzien vanhandelingen met dieren of metgenetisch materiaal van
dieren.
2. Vanwege het eerste lid gestelde regelen kunnen onder meer betrekking hebben op:
a. wijzigen van genetisch materiaal van dieren;
b. toepassen van biotechnologische technieken bij een dier;
c. ingrepen bij een dier;
d. verandering van het functioneren van een dier door het toedienen van stoffen.
Het opnemen van dit artikel is een bevestiging dat er ethische problemen zijn ten
160 H.VERHOOG
aanzienvangenetischemanipulatiemetdieren.Devolgendenoodzakelijke stapishet
creëren van organen van overleg over dezeethische problemen, zodat niemand inde
toekomst zal kunnen zeggen: 'we hebben het niet geweten'.
Literatuur
Acharya, R., E. Fry, D. Stuart, G. Fox, D. Rowlands &F.Brown, 1989.The three dimensional structure of
foot-and-mouth disease virus at 2.9 A resolution. Nature (London) 337: 709-716.
Achterberg, W.&M.B.H. Visser, 1988.Het gemaakte dier. Levendeartefacten - ethiek engenetische manipulatie van dieren. In: M.B.H. Visser & F.J. Grommers (Eds): Dier of ding, objectivering van dieren.
Pudoc, Wageningen, p. 87-109.
Aitken, R.J., 1979.Uterine proteins. In: C.A. Finn (Ed.): Oxford Reviews of Reproductive Biology Vol. 1.
Clarendon Press, Oxford, UK. p. 351-382.
Altshuler, G.L., D.M. Dziewulski, J.A. Sowek & G. Belfort, 1986. Continuous hybridoma growth and
monoclonal antibody production inhollow fibre reactors-separators. Biotechnology and Bioengineering
28: 646-658.
Anderson, G.B., 1987. Identification of embryonic sex by detection of H-Y antigen. Therio^enology 27:
81-97.
Archibald, A.L., 1987. A molecular genetic approach to the porcine stress syndrome. In: P.V.Tarrant, G.
Eikelenboom & G. Monin (Eds): Evaluation and control of meat quality in pigs. Martinus Nijhoff
Publishers, Dordrecht, p. 343-357.
Archibald, A.L., A.J. Clark, S.Harris,M.McCleneghan, J.P. Simons&C.B.A. Whitelaw, 1988.Transgenic
constructs with some introns. U.K. patent application no. 882446.
Astaldi, G.C.B., M.C. Janssen, P. Lansdorp, C. Willems, W.P. Zeijlemaker &F.Oosterhof, 1980. Human
endothelial culture supernatant (HECS): a growth factor for hybridomas. Journal of Immunology 125:
1411-1414.
Austin, C R . & R.V. Short, 1982. Embryonic and fetal development. Cambridge University Press, Cambridge, UK.
Austin, C R . & R.V. Short, 1984. Hormonal control of reproduction. Cambridge University Press, Cambridge, UK.
Avest, A.R. ter, G. van Steenis & A.D.M.E. Osterhaus, 1987. Comparison of a counter current electrophoresis and an enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of bovine serum albumin in virus
vaccines. Journal of Biological Standardization 15: 245-250.
Bahr, G.M., D.S.Tello&L.A. Chedid, 1985.Marked enhancement in vivo of adjuvant of muramyl dipeptide to protein antigens and to synthetic weak immunogens with monoclonal anti-muramyl dipeptide
antibodies. Infection and Immunity 49: 312-319.
Bankert, R.B.,D.DesSoye&L. Powers, 1980.Antigen-promoted cellfusion: antigen-coated myeloma cells
fuse with antigen-reactive spleen cells. Transplantation Proceedings 12: 443-446.
Bayertz, K., 1987. Naturphilosophie als Ethik. Philosophia Naturalis 24: 157-185.
Bazer, EW., J.L. Vallet, R.M. Roberts, D.C. Sharp & W.W. Thatcher, 1986. Role of conceptus secretory
products in establishment of pregnancy. Journal of Reproduction and Fertility 76: 841-850.
Beckmann, J.S., Y.Kashi, E.M. Hallerman, A. Nave &M. Soller, 1986. Restriction fragment length polymorphism among Israeli Holstein Friesian dairy cattle. Animal Genetics 17: 2 5 - 3 8 .
Beier, H.M., 1974. Oviducal and uterine fluids. Journal of Reproduction and Fertility 37: 221-237.
Berg, J.A. van den, et al., 1983.Kluyveromyces yeast cells useful as hosts for recombinant DNA material.
WO Patent no. 8304-050-A.
Biery, K.A., F.R. Bondioli &F.J. De Mayo, 1988.Gene transfer by pronuclear injection inthe bovine. Theriogenology 29: 224.
Birch, J.R., P.W.Thomspon &R. Boraston, 1985.Production of monoclonal antibodies in large scale cell
culture. Biochemical Society Transactions 13: 10-12.
161
162
LITERATUUR
Bischoff, R.,R.M.Eisert, I.Schedel, J.Vienken&U.Zimmerman, 1982.Human hybridoma cells produced
by electro-fusion. FEBS Letters 147:6 4 - 6 8 .
Bishop, M.W.H., 1964.Paternal contribution to embryonic death. Journal of Reproduction and Fertility
7: 383-396.
Boer, P.de,F.A.vander Hoeven &M.P. Cuijpers, 1986.Genetic constitution of early stage pig embryos
and embryo mortality. In: J.M. Sreenan &M.G. Diskin (Eds): Embryonic mortality in farm animals.
Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, p. 207-215.
Bondioli, K.R. &R.W. Wright, 1983.In vitro fertilization of bovine oocytes by spermatozoa capacitated
in vitro. Journal of Animal Science 57: 1001-1015.
Booman, P., 1986.Control of sex ratio by sexing sperm and embryos. In: C. Smith, J.W.B. King & J.C.
McKay (Eds):Exploiting newtechnologies inanimal breeding; genetic developments. Clarendon Press,
Oxford, UK.p. 13-23.
Booman, P.,1988.Application ofmonoclonalantibodiesinanimalproduction;areview.Livestock Production Science 18: 199-215.
Booman, P.,M.Tieman, D.F.M.vandeWiel, J.M.Schakenraad &W.Koops, 1984a.Application of monoclonal antibodies inanimal production; pregnancy diagnosisincattle. In:E.H.Houwink &R.R. vander
Meer (Eds): Innovations in biotechnology. Elsevier Science Publishers, Amsterdam, p. 259-266.
Booman, P.,D.F.M.vandeWiel,J.M.Schakenraad, W.Koops,M.Tieman&L.Kruijt, 1984b.Administration ofmonoclonal antibodies against progesterone incyclicpigs.Proceedings of the 10th International
Congress on Animal Reproduction and Artificial Insemination, Illinois, Vol. Ill: 503-505.
Booman, P.,L.Kruijt, M.Tieman, J.A.Piedrahita, R.Veerhuis,P.deBoer&F.E. Ruch, 1989a. Production
and characterization ofmonoclonal antibodies against theH-Yantigen. Journal orReproductive Immunology 15: 195-205.
Booman, P.,L.Kruijt, R.Veerhuis, A.M.Hengst, M.Tieman &F.E. Ruch, 1989b.Sexing bovine embryos
with monoclonal antibodies against the H-Yantigen. Livestock Production Science 23: 1-16.
Booman, P.,M.Tieman, D.vanZaane,A.A. Bosma&G.F.deBoer, 1990.Construction ofa bovine-murine
heteromyeloma cell line; production of bovine monoclonal antibodies against rotavirus and pregnant
mare serum gonadotrophin. Veterinary Immunology Immunopathology 24: 211-226.
Boss, B.D., 1984.An improved in vitro immunization procedure for the production of monoclonal antibodies against neural and other antigens. Brain Research 291: 193-196.
Bosselman, R.A.,RrY.Hsu,T.Boggs, S.Hu,J. Bruszewski, S.Ou,L.Kozar, F.Martin, C.Green, F.Jacoben, M. Nicolson, J.A. Schulz, K.M.Semon, W. Rishell &R.G.Stewart, 1989.Germline transmission
of exogenous genes in the chicken. Science (N.Y.) 243: 533-535.
Bouters, R., I. Moyaert, M. Corijn &M. Vandeplassche, 1983. The use of a PMSG antiserum in superovulated cattle:endocrinological changesandeffects ontimingofovulation. Zuchthygiene 18: 172-177.
Brackett, B.G.,D.Bousquet, M.L.Boice,W.J.Donawick, J.F.Evans &M.A. Dressel, 1982.Normal development following in vitro fertilization in thecow.Biology of Reproduction 27: 147-158.
Bradley, A., M. Evans, M.H. Kaufman & E. Robertson, 1984.Formation of germ-line chimaeras from
embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature (London) 309: 255-256.
Brem, G.,B.Brenig, H.M.Goodman, R.C. Seiden, F.Graf, B.Kruff, K.Springman, J. Hondele, J. Meyer,
E.-L. Winnacker &H. Krausslich, 1986. Production of transgenic mice, rabbits and pigs by microinjection into pronuclei. Zuchthygiene 20: 251-252.
Brem,G.,B.Brenig,M.Muller, H. Krausslich &E.-L. Winnacker, 1988.Production oftransgenic pigsand
possible application topigbreeding. Occasional Publications oftheBritisch Society of Animal Production 12: 15-31.
Brennan, M.,P.F.Davison &H. Paulus, 1985.Preparation of bispecific antibodies bychemical recombination of monoclonal immunoglobulin Gi fragments. Science (N.Y.) 229: 81-83.
Brinster, R. L., H.Y.Chen, M.E.Trumbauer, M. Yagle &R.D.Palmiter, 1985.Factors affecting the efficiencyofintroducing foreign DNAinto micebymicro-injecting eggs.Proceedings oftheNational Academy of Sciences USA82: 4438-4442.
Brocades-Zaalberg, O. & F.H. Lubbe, 1984.Methods for the rapid selection of hybrid cells producing
LITERATUUR
specific antibodies of high affinity. In: E.H. Houwink &R.R. van der Meer (Eds): Innovations in biotechnology. Elsevier Science Publishers, Amsterdam, p. 251-257.
Brück, C , D.Portetelle, A. Burny&J. Zavada, 1982.Topographical analysis by monoclonal antibodies of
BLV-gp51 epitopes involved in viral functions. Virology 122: 353-362.
Chang, T.H., Z. Steplewski & H. Koprowski, 1980. Production of monoclonal antibodies in serum free
medium. Journal of Immunological Methods 39: 369-375.
Christensen, L.G. &T. Liboriussen, 1986. Embryotransfer in the genetic improvement of dairy cattle. In:
C. Smith, J.W.B. King & J.C. Mc Kay (Eds): Exploiting new technologies in animal breeding: genetic
developments. Clarendon Press, Oxford, UK. p. 37-46.
Church, R. B.,A. McRae &J. McWhir, 1986.Embryo manipulation and genetransfer in livestock production. Proceedings of the 3rd World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. Lincoln,
Nebraska, USA. p. 133-138.
Church, R.B., EJ. Schaufele & K. Meckling, 1985. Embryo manipulation and gene transfer in livestock.
Canadian Journal of Animal Science 65: 527-537.
Clark, A. J., S.All,A.L.Archibald, P.Brown, G. Bulfield, S.Harris, M.McClenaghan, M. Perry, H. Sang,
J.P.Simons, C.B.A. Whitelaw &I.Wilmut, 1988.TransgenicBiology. AFRC Institute of Animal Physiology and Genetics Research, Edinburgh Research Station Report for 1986-1987. p. 3 - 9 .
Clark, A. J., H. Bessos, J.O. Bishop, P. Brown, S. Harris, R. Lathe, M. McClenaghan, C. Prowse, J.P.
Simons,C.B.A. Whitelaw&I.Willmut, 1989.Expression of human anti-hemophilicfactor I^Cinthemilk
of transgenic sheep. Biotechnology 7: 487-492.
Cohen, S.N., A.C.Y. Chang, H.W. Boyer & R.B. Helling, 1973. Construction of biologically functional
bacterial plasmids in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 70: 3240-3244.
Cole, S.P.C., D.Kozbor &J.C.C. Roder, 1985.Strategies for production of human monoclonal antibodies.
In: T.A. Springer (Ed.): Hybridoma technology in the biosciences and medicine. Plenum Press, New
York. p. 4 3 - 5 5 .
Cotton, R.G.H.&C. Milstein, 1973.Fusion of twoimmunogobulin-producing myeloma cells.Nature (London) 244: 4 2 - 4 3 .
Dangl, J.L. &L.A. Herzenberg, 1982. Selection of hybridomas and hybridoma variants using the fluorescence activated cell sorter. Journal of Immunological Methods 52: 1-14.
Diamond, B.&M.D. Scharff, 1984.Somaticmutation of theT15heavy chain givesriseto an antibody with
autoantibody specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 5841-5844.
Dieleman, S.J., M.M. Bevers,Y.A.Wurth, J.Th. Gielen &A.H. Willemse, 1989.Improved embryo yield and
condition of donor ovaries in cows after PMSG-superovulation with monoclonal anti-PMSG administered shortly after the preovulatory LH peak. Theriogenology 31:473-487.
DiMarchi, R., G. Brooke,C. Gale, V.Cracknel, T.Doel&N.Mowat, 1986.Protection of cattle against footand-mouth disease by a synthetic peptide. Science (NY.) 232: 639-641.
Donaldson, L.E., 1985.Matching of embryo stages and grades with recipient oestrous synchrony in bovine
embryo transfer. Veterinary Record 117: 489-491.
Donaldson, L.E., 1986.Day of embryo collection, quality and pregnancy rates in cattle. Veterinary Record
118: 661-663.
Ducsay, CA., W.C. Buhi, F.W. Bazer, R.M. Roberts &O.E. Combs, 1984. Role of uteroferrin in placental
iron transport: effect of maternal iron treatment on fetal iron and uteroferrin content and neonatal haemoglobin. Journal of Animal Science 59: 1303-1308.
Duff, R.G., 1985. Microencapsulation technology: a novel method for monoclonal antibody production.
Trends in Biotechnology 3: 167-170.
Ebert, K.M., M.J. Low, E.W. Overstrom, F.C. Bounomo, C A . Balle, T.M. Roberts, A. Lee, G. Mandel &
R.H. Goodman, 1988.AMoloney MLV-rat somatotropin fusion geneproduces biologically active somatotropin in a transgenic pig. Molecular Endocrinology 2: 277-283.
Efstratiadis, A., F.C. Kafatos, A.M. Maxam & T. Maniatis, 1976. Enzymatic in vitro synthesis of globin
genes. Cell 7: 279-288.
Evans, M. &M.H. Kaufman, 1981.Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.
163
164
LITERATUUR
Nature (London) 292: 154-156.
Ey,P.L., S.J. Prowse&C R . Jenkin, 1978.Isolation of pure IgG;, IgG2 aand IgG2bimmunoglobulins from
mouse serum using protein A-sepharose. Immunochemistry 15: 429-436.
Fayrer-Hosken, R.A., A.I. Younis, B.G.Brackett, C E . McBride, C L . Keefer &D.C Cabannis, 1988.Pregnancy after laparoscopic oviductal bovine oocytes. Biology of Reproduction 38 (Suppl. 1):72.
Fazekas de St. Groth, S., 1983.Automated production of monoclonal antibodies in a cytostat. Journal of
Immunological Methods 57: 121-136.
Fazleabas, A.T., R.D. Geisert, F.W.Bazer &R.M. Roberts, 1983.Relationship between release of plasminogen activator and estrogen by blastocysts and secretion of plasmin inhibitor by uterine endometrium in
the pregnant pig. Biology of Reproduction 29: 225-238.
Fox, M.W., 1988.Genetic engineering biotechnology: animal welfare and environmental concerns. Applied
Animal Behaviour Science 20: 83-94.
Fox, P.C.&R.P. Siraganian, 1986.Multiple reactivity of monoclonal antibodies. Hybridoma5: 223-229.
Frankena, W.P., 1963. Ethics. Englewood Cliffs, Prentice Hall.
Fretz, L., 1980. Ethiek als wetenschap. Boom, Meppel.
Fukul, Y.,A.M. Glew,F.Gandoifl &R.M. Moor, 1988.In vitro culture of sheepoocytesmatured and fertilized in vitro. Theriogenology 29, 883-891.
Fulka, J., A. Pavlok &J. Fulka, 1982. In vitro fertilization of zonafree bovine oocytes matured in culture.
Journal of Reproduction and Fertility 64: 495-499.
Gardner, D.K. & H.J. Leese, 1986. Non-invasive measurement of nutrient uptake by single cultured preimplantation mouse embryos. Human Reproduction 1: 25-27.
Gearing, A.J.H., R. Thorpe, L. Spitz &M. Spitz, 1985.Use of 'single shot' intrasplenic immunization for
production of monoclonal antibodies specific for human IgM. Journal of Immunological Methods 76:
337-341.
Geisert, R.D., W.W.Thatcher, R.M. Roberts &F.W.Bazer, 1982.Establishment of pregnancy inthe pig. III.
Endometrial secretory response to estradiol valerate administered on day 11of the estrus cycle. Biology
of Reproduction 27: 957-965.
Gerhard, W., J. Yewdell, M.E. Frankel &R. Webster, 1981. Antigenic structure of influenza virus haemagglutinin defined by hybridoma antibodies. Nature (London) 290: 713-717.
Geysen, H.M., R.H. Meloen &S.J. Barteling, 1984.Useof peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid. Proceedings of the National Academy of Sciences USA81:
3998-4002.
Geysen, H.M., S.J. Rodda &T.J. Mason, 1986.A priori delineation of a peptide which mimics a discontinuous antigenic determinant. Molecular Immunology 23: 709-715.
Gezondheids-enwelzijnswet voor dieren.TweedeKamer 16447.In 1985ingediend alsGezondheidswet voor
Dieren. Gewijzigd voorstel in 1986-87. Derde nota van wijziging in 1988.
Gezondheidsraad, 1986.Monoclonale antistoffen: toepassingen bij demens.Eersteadviesinzake deinvivo
toepassing van monoclonale antistoffen bij de mens op beperkte schaal. No. 1986/21.
Ghosh, S.&A.M. Campbell, 1986.Multispecific monoclonal antibodies. Immunology Today 7: 217-222.
Goeddel, D.V., D.G. Kleid, F.Bolivar, H.L. Heyneker, D.G. Yansura, B.Créa, T. Hirose, A. Kraszewski, K.
Itakura &A.D. Riggs, 1979. Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human
insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences 76: 106-110.
Gossler, A., T. Doetschman, R. Korn, E. Serfling &R. Kemler, 1986.Transgenesis by means of blastocystderived embryonic stem cell lines. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 83:
9065-9069.
Goto, K., Y.Kajihara, S. Kosaka, M. Koba, Y.Nakanishi &K. Ogawa, 1988.Pregnancies after co-culture
of cumulus cells with bovine embryos derived from in vitro fertilization of in vitro matured follicular
oocytes. Journal of Reproduction and Fertility 83: 753-758.
Graaf, J. de, 1972. Elementair begrip van de ethiek. Bohn, Haarlem. 79 p.
Groot, A., 1984.Simulatiemetbehulpvanstochastische modellen vanfokstrategieën ineen rundveepopulatie met embryotransplantatie. Scriptie Vakgroep Veefokkerij, Landbouwuniversiteit, Wageningen.
LITERATUUR
Grosveld, F.,G.B.van Assendelft, D.R. Graves&G. Kollias, 1987.Position-independent, high-level expression of the human 0-globin gene in transgenic mice. Cell 51:975-985.
Haaijman, J.J., C. Deen, C.J.M. Kröse, J.J. Zijlstra, J. Coolen & J. Radi, 1984. Monoclonal antibodies
in immunocytology: jungle of pitfalls. Immunology Today 5: 5 6 - 5 8 .
Hadas, E. &G. Theilen, 1987.Production of monoclonal antibodies. The effect of hybridoma concentration on the yield of antibody-producing clones. Journal of Immunological Methods 96: 3 - 6 .
Hammer, R.E., V.G.Pursel, C E . Rexroad, R.J. Wall, D.J. Bolt, K.M. Ebert, R.D. Palmiter &R.L. Brinster,
1985. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by micro-injection. Nature (London) 315:
689-683.
Hammer, R.E., V.G. Pursel, C E . Rexroad, R.J. Wall, D.J. Bolt, R.D. Palmiter & R.L. Brinster, 1986.
Genetic engineering of mammalian embryos. Journal of Animal Science 63: 269-278.
Handyside, A., M.L. Hooper, H.H. Kaufman &I. Wilmut, 1987.Towardsthe isolation of embryonal stem
cell lines from the sheep. Roux's Archives of Developmental Biology 196: 185-190.
Hansel, W.&E.M. Convey, 1983.Physiology of the estrous cycle.Journal of Animal Science 57: 404-424.
Helentjaris, T., M. Slocum, S. Wright, A. Schaefer & J. Nienhuis, 1986. Construction of genetic linkage
maps in maize and tomato using restriction fragment length polymorphisms. Theoretical and Applied
Genetics 72: 761-769.
Helmond, F.A., A. Aarnink, &C.P.J. Oudenaarden, 1986. Periovulatory hormone profiles in relation to
embryonic development and mortality inpigs.In:J.M. Sreenan&M.G. Diskin (Eds):Embryonic mortality in farm animals. Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, p. 119-125.
Hoeven, F.A. van der, M.P. Cuijpers & P. de Boer, 1985. Karyotypes of 3 or 4-day-old pig embryos after
short in-vitro culture. Journal of Reproduction and Fertility 75: 593-597.
Hogle, J.M., M. Chow &D.J. Filman, 1985. Three-dimensional structure of poliovirus at 2.9 Â resolution.
Science (N.Y.) 229: 1358-1365.
Houwers, D.J. &J. Schaake Jr., 1987.An improved ELISA for the detection of antibodies to maedi-visna
and caprine arthritis-encephalitis virus, employing monoclonal antobodies in a novel one-step blocking
concept. Journal of Immunological Methods 98: 151-154.
Hudson, L.&F.C Hay, 1980.Practical immunology. Blackwell Scientific Publications, Oxford, UK. 359p.
Hunter, R.H.F., 1967.The effects of delayed insemination on fertilization and early cleavage in pigs. Journal of Reproduction and Fertility 31: 433-444.
Itakura, K., T. Hirose, R. Créa &A.D. Riggs, 1988.Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin. Science (N.Y.) 198: 1056-1063.
IWTS-Nota, 1984.Integratie van wetenschap entechnologie inde samenleving. Kamerstuk 18421. Ministerie v. Onderwijs & Wetenschappen, Den Haag.
Jaehner, D., H. Kirsten, R. Mulligan &R. Jaenisch, 1985.Insertion of thebacterial gpt gene into the germ
line of mice by retroviral infection. Proceedings of the National Acadamy of Sciences USA 82:
6927-6931.
Jaenisch, R., 1988. Transgenic animals. Science (N.Y.) 240: 1468-1474.
Jeffreys, A.J., 1985.Hypervariable 'mini-satellite' regions in human DNA. Nature (London) 314: 6 7 - 7 3 .
Joyner, A.L., W.C. Skarnes &J. Rossant, 1989.Production of a mutation in mouse En-2-gene by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature (London) 338: 153-156.
Kascer, H. &J.A. Burns, 1979.Molecular democracy: who sharesthecontrols? Biochemical SocietyTransactions 7: 1149-1160.
Katsuki, M., M. Sato,M. Kimura, M. Yokoyama, K.Kobayashi &T.Nomura, 1988.Conversion of normal
behaviour to shiverer by myelin basic protein antisense cDNA in transgenic mice. Science (N.Y.)241:
593-595.
Kennett, R.H., 1979. Cell fusion. Methods in Enzymology 58: 345-359.
Klinman, N.R., J.L. Press, N.H. Sigal&P.J. Gearhart, 1976.The acquisition of the Bcellspecificity repertoire: the germ-line theory of predetermined permutation of genetic information. In: A.J. Cunningham
(Ed.): The generation of antibody diversity: a new look. Academic Press, New York. p. 127-149.
Knapp, S.J. &W.C.Bridges, 1989.Molecular marker linkagemaps applied tothegeneticanalysis of quanti-
165
166
LITERATUUR
tative traits. XII Eucarpia Congress, Göttingen, p. 51-67.
Knudsen, K.A., 1985. Proteins transferred to nitrocellulose for use as immunogens. Analytical Biochemistry 147: 285-288.
Köhler, G. &C. Milstein, 1975.Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature (London) 256: 495-497.
Koprowski, H. & T. Wiktor, 1980. Monoclonal antibodies against rabies virus. In: R.H. Kennett, T.J.
McKearn & K.B. Bechtol (Eds): Monoclonal antibodies. Plenum Press, New York. p. 335-351.
Kornet, D.J., 1987. Biologische taxa als natuurlijke soorten. Eburon, Delft. 76 p.
Kruip, Th.A.M., 1988. Voortplanting bij dieren wordt meer en meer mensenwerk. Veeteelt 5: 1155-1157.
Kruip,Th.A.M., 1989.Veefokkerij naSymmen-40:nieuwefase ineeneeuwenlangproces.Veeteelt6:26- 27.
Kruip, Th.A.M. &Th.H. van Beneden, 1987.In Utrecht zijn bouwstenen voor fertiliteitstest stier gebruiksklaar. Veeteelt 4: 554-555.
Kruip, Th.A.M. &Th.H. van Beneden, 1988.Runderembryo's hoeven nog maar even tegast te zijn bij het
schaap. Veeteelt 5: 680-681.
Lafon, M.,T.J. Wiktor &R.I.MacFarlan, 1983.AntigenicsitesontheCVSrabiesvirusglycoprotein: analysis with monoclonal antibodies. Journal of General Virology 64: 843-851.
Lander, E.S. & D. Botstein, 1989. Mapping mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP
linkage maps. Genetics 121: 185-199.
Lane,R.D., 1985.Ashort-duration polyethyleneglycolfusion technique for increasingproduction of monoclonal antibody-secreting hybridomas. Journal of Immunological Methods 81:223-228.
Lane, D. & H. Koprowski, 1982. Molecular recognition and the future of monoclonal antibodies. Nature
(London) 296: 200-202.
Lathe, R., A.J. Clark, A.L.Archibald, J.O. Bishop, P.Simons&I.Wilmut, 1986.Novelproducts from livestock. In: C. Smith, J.W.B. King & J.C. McKay (Eds): Exploiting new technologies in animal breeding:
genetic developments. Clarendon Press, Oxford, UK. p. 91-102.
Lawson, R.A.S., R.A. Parr & L.P. Cahill, 1983. Evidence for maternal control of blastocyst growth after
asynchronous transfer of embryos to the uterus of the ewe. Journal of Reproduction and Fertility 67:
477-483.
Leese, H.J., M.A.K. Hooper, R.G. Edwards & M.J. Ashwood-Smith, 1986. Uptake of pyruvate by early
human embryos determined by a non-invasive technique. Human Reproduction 1: 181-182.
Levy, R., P. Stratte, M. Link, D.G. Maloney, A. Oseroff & R.A. Miller, 1984. Monoclonal antibodies to
human lymphocytes. In: R.H. Kennett, K.B.Bechtol &T.J. McKearn (Eds):Monoclonal antibodies and
functional cell lines: progress and applications. Plenum Press, New York. p. 193-214.
Lindl, T., 1988. Monoklonale Antikörper: In Vitro- und In Vivo-Produktion sowie Tierschutzrelevante
Aspekte. Forum Mikrobiologie, 7 - 8 / 8 8 : 310-318.
Lindner, G.M. & R.W. Wright Jr., 1983. Bovine embryo morphology and evaluation. Theriogenology 20:
407-416.
Lo,M.M.S.,T.Y. Tsong,M.K. Conrad, S.M. Strittmatter, L.D.Hester&S.H.Snyder, 1984.Monoclonal antibody production by receptor-mediated electrically induced cell fusion. Nature (London) 310: 792-794.
Lord, J.M., L.M. Roberts, P.E Thorpe & E.S. Vitetta, 1985. Immunotoxins. Trends in Biotechnology 3:
175-179.
Lu, K.H., I. Gordon, M. Gallagher & H. McGovern, 1987. Pregnancy established in cattle by transfer of
embryos derived from invitro fertilisation of oocytes matured invitro. Veterinary Record 121:259-260.
Mansour, S.L., K.R. Thomas & M.R. Capecchi, 1988. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse
embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. Nature
(London) 336: 348-352.
Margulies, D.H., W. Cieplinski, B. Dharmgrongartama, M.L. Gefter, S.L. Morrison, T. Kelly & M.D.
Scharff, 1977.Regulation of immunoglobulin expression in mouse myeloma cells. Cold Spring Harbor
Symposia on Quantitative Biology 41: 781-791.
Markette, K.L.,G.E.SeidelJr.&R.P.Eisden, 1985. Estimation of embryonic lossesinbovineembryo profiles and returns to estrus. Theriogenology 23: 45-62.
LITERATUUR
Marston, J.H. &M.C. Chang, 1964. The fertilizable life of ova and their morphology following delayed
insemination in mature and immature mice. Journal of Experimental Zoology 155: 237-252.
Maskell, D., F.Y. Liew, K. Sweeney, G. Dougan & C. Hormaeche, 1986. Attenuated Salmonella thyphimurium as live oral vaccines and carriers for delivering antigens to the secretory immune system. In: F.
Brown, R.M. Chamnock &R.A.Lerner(Eds):Vaccines86.Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, N.Y. 213 p.
Matthew, W.D. &P.H. Patterson, 1983.The production of a monoclonal antibody that blocks the action
of a neurite outgrowth-promoting factor. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 48:
625-631.
McKelvey,W.A.C.,J.J. Robinson&R.P.Altken, 1985.Theevaluationof alaproscopicinsemination technique in ewes. Theriogenology 24: 519-535.
Meisen, A.G.M, van, 1987. Biotechnologie en ethiek. Tijdschrift voor Diergeneeskunde 112: 88-97.
Menge, A.C., D.E. Richter &R.K. Naz, 1983. Dissecting the fertilization process with monoclonal antibodies against sperm. Journal of Reproductive Immunology 5 (Suppl.): 7 - 8 .
Meulen, J. van der, KA. Helmond &C.P.J. Oudenaarden, 1988.Effect of flushing of blastocysts on days
10-13onthelife-span ofthecorpora luteainthepig.Journal of Reproduction andFertility 84:157-162.
Milstein, C. &A.C. Cuello, 1984. Hybrid hybridomas and the production of bi-specific monoclonal antibodies. Immunology Today 5: 299-304.
Miyahara, M., H. Nakamura &Y.Hamaguchi, 1984. Colcemid treatment of myeloma prior to cell fusion
increases the yield of hybridomas between myeloma and splenocyte. Biochemical Biophysical Research
Communications 124: 903-908.
Mohr, L.R. &A.O.Trounson, 1980.The useof fluorescein diacetate toassessembryo viability inthe mouse.
Journal of Reproduction and Fertility 58: 189-196.
Moor, R.M., J.C. Osborn & I.M. Crosby, 1985. Gonadotrophin induced abnormalities in sheep oocytes
after superovulation. Journal of Reproduction and Fertility 74: 167-172.
Moreau, J.F., D.D. Donaldson, F.Bennett, J. Witek-Glannotti, S.C.Clark &G.G. Wong, 1988. Leukaemia
inhibitory factor isidentical to the myeloid growth factor human interleukin for DA cells. Nature (London) 336: 690-692.
Morein, B.,B.Sundquist, S.Höglund, K.Dalsgaard &A. Osterhaus, 1984.Iscom,anovelstructure for antigenic presentation of membrane proteins from enveloped viruses. Nature (London) 308: 457-459.
Morrison, S.L., 1985. Transfectomas provide novel chimeric antibodies. Science (N.Y.) 229: 1202-1207.
Müller, C E . &K. Rajewsky, 1983.Isolation of immunoglobulin class switch variants from hybridoma lines
secreting anti-idiotype antibodies by sequential sublining. Journal of Immunology 131: 877-881.
Mullins, D.E., F.W. Bazer & R.M. Roberts, 1980. Secretion of a progesterone-induced inhibitor of plasminogen activator by the porcine uterus. Cell 20: 865- 872.
Nancarrow, CD., K.A.Ward &J.D.Murray, 1988.The future for transgenic livestock inAustralian agriculture. Australian Journal of Biotechnology 2: 39-44.
Ness, J. van, U.K. Laemmli &D.E. Pettijohn, 1984. Immunization in vitro and production of monoclonal
antibodiesspecific toinsolubleand weakly immunogenic proteins.Proceedingsof theNational Academy
of Sciences USA 81:7897-7901.
Neuberger, M.S., G.T. Williams &R.O. Fox, 1984. Recombinant antibodies possessing novel effector functions. Nature (London) 312: 604-608.
Nicholas, F.W.&C Smith, 1983. Increased rates of genetic change in dairy cattle by embryo transfer and
splitting. Animal Production 36: 346-353.
North, J.R., 1985. Immunosensors: antibody-based biosensors. Trends in Biotechnology 3: 180-187.
Nose, M. & H. Wigzell, 1983. Biological significance of carbohydrate chains on monoclonal antibodies.
Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 6632-6636.
Nota Rijksoverheid en Dierenbescherming, 1981.Tweede Kamer der Staten Generaal, zitting 1981, 16996,
nr. 2, Den Haag.
NRLO-Studierapport 14c, 1983.Ontwikkelingen in het moleculair en celbiologisch onderzoek ten behoeve
van de dierlijke productie. Nationale Raad voor Landbouwkundig Onderzoek, Den Haag.
167
168
LITERATUUR
NRLO-Studierapport 14e, 1984. Dierlijke biotechnologie. Nationale Raad voor Landbouwkundig Onderzoek, Den Haag.
NRLO-Studierapport 14h, 1985.Monoclonale antilichamen in het landbouw- en diergeneeskundig onderzoek. Tijdschrift voor Diergeneeskunde 110: 813-866.
Oirschot, J.T.van, D.J. Houwers, H.J. Rziha &P.J.L.M. Moonen, 1986.Development of an ELISA for detection of antibodies to glycoprotein I of Aujeszky's disease virus: a method for the serological differentiation between infected and vaccinated pigs. Journal of Virological Methods 22: 191-206.
O'Neill, C , 1985. Examination of the causes of early pregnancy-associated thrombocytopenia in mice.
Journal of Reproduction and Fertility 73: 567-577.
Order, S.E., 1982.Monoclonal antibodies: potential role in radiation therapy and oncology. International
Journal for Radiation Oncology in Biology and Physics 8: 1193-1201.
Osterhaus, A.D.M.E.&F.G.C.M.UytdéHaag (Eds), 1990.Idiotype networks inbiology and medicine. Elseviers Science Publishers, Amsterdam
Osterhaus, A.D.M.E., A.L. van Wezel, T.G. Hazendonk, F.G.C.M. UytdeHaag, J.A.A.M. van Asten &B.
van Steenis, 1983. Monoclonal antibodies to polioviruses: comparison of intra-typic strain differentiation of poliovirus type 1 using monoclonal antibodies versus cross-absorbed antisera. Intervirology 20:
129-136.
Palmiter, R.D. & R.L. Brinster, 1986. Germline transformation of mice. Annual Reviews of Genetics 20:
465-499.
Palmiter, R.D., R.L. Brinster, R.E. Hammer, M.E. Trumbauer, M.G. Rosenfeld, N.C. Birnberg & R.M.
Evans, 1982. Dramatic growth of mice that develop from eggs micro-injected with metallothioneingrowth hormone fusion genes. Nature (London) 300: 611-615.
Parham, P., M.J. Androlewicz, F.M. Brodsky, N.J. Holmes & J.P. Ways, 1982. Monoclonal antibodies:
purification, fragmentation and application tostructural and functional studiesof class IMHC antigens.
Journal of Immunological Methods 53: 133-173.
Parrish, J.J., J.L. Susko-Parrish, M.L. Leibfried-Rutledge, E.S.Critser, W.H. Eyestone &N.L.First, 1986.
Bovine in vitro fertilization with frozen-thawed semen. Theriogenology 25: 591-600.
Perry, M.M., 1988. A complete culture system for the chick embryo. Nature (London) 331: 7 0 - 7 2 .
Pinkert, CA., V.G.Pursei, K.F. Miller, R.D. Palmiter &R.L. Brinster, 1987.Production of transgenic pigs
harboring growth hormone (MTbGH) or growth hormone releasing factor (MThGRF) genes. Journal
of Animal Science 65 (Suppl. 1):260.
Poljak, R.J., 1975. X-ray diffraction studies of immunoglobulin. Advances in Immunology 21: 1-33.
Posillico, E.G., 1986.Micro-encapsulation technology for large-scale antibody production. Biotechnology
4: 114-117.
Potter, M., 1977. Antigen-binding myeloma proteins of mice. Advances in Immunology 25: 141-211.
Pursei, V.G., R.G. Campbell, K.F. Miller, R.R. Behringer, R.D. Palmiter & R.L. Brinster, 1988. Growth
potential of transgenic pigs expressing a bovine growth hormone gene. Journal of Animal Science 66
(Suppl. 1):267.
Pursei, V.G., C E . Rexroad, D.J. Bolt, K.F. Miller, R.J. Wall, R.E. Hammer, C A . Pinkert, R.D. Palmiter
&R.L. Brinster, 1987.Progress on gene transfer in farm animals. Veterinary Immunology and Immunopathology 17: 303-312.
Putten, G.van, 1988.Technicaldevelopments, ethicalconsiderations and behavioural problems. In:V.Carter&H. Carter (Eds):Farm animal protection - thepractical wayforward. Proceedings of the4th European Conference on the Protection of Farm Animals, Brussels.
Putten, H. van der, F.M. Botteri, A.D. Miller, M.G. Rosenfeld, H. Fan, R.M. Evans & LM. Verma, 1985.
Efficient insertion of genes into the mouse germ line via retroviral vectors. Proceedings of the National
Acadamy of Sciences USA 82: 6148-6152.
Reading, C.L., 1982. Theory and methods for immunization in culture and monoclonal antibody production. Journal of Immunological Methods 53: 261-291.
Regan, T., 1984. The case for animal rights. Routledge & Kegan Paul, London. 425 p.
Renard, J.P.,Y.Menezo&Y.Heyman, 1982.Alternative teststo assessviability of bovine embryos.Therio-
LITERATUUR
genology 17: 106.
Rendel, J.M. &A. Robertson, 1950. Estimation of genetic gain in milk yield by selection in a closed herd
of dairy cattle. Journal of Genetics 50: 1-8.
Reuveny, S.,D.Velez,J.D.MacMillan &L.Miller, 1986.Factors affecting cellgrowth and monoclonal antibody production in stirred reactors. Journal of Immunological Methods 86: 53-59.
Rexroad, C E . & V.G. Pursel, 1988. Status of gene transfer in domestic animals. Proceedings of the 11th
International Congress on Animal Reproduction and Artificial Insemination, Dublin, Vol. 5: 28-35.
Rexroad, C E . , R.R. Behringer, D.F. Bolt, K.F. Miller, R.D. Palmiter &R.L. Brinster, 1988. Insertion and
expression of a growth hormone fusion gene in sheep. Journal of Animal Science 66 (Suppl. 1):267.
Rifkin, J., 1984. Algeny. Penguin, New York. 298 p.
Rimmelzwaan, G.F., J. Groen, N. Juntti, J.S.Teppema,F.G.C.M.UytdeHaag &A.D.M.E. Osterhaus, 1987.
Purification of infectious canine parvovirus from cell culture by affinity chromatography with monoclonal antibodies. Journal of Virological Methods 15: 313-322.
Rodwell, J.D., P.J. Gearhart & F. Karush, 1983. Restriction in IgM expression. IV. Affinity analysis of
monoclonal anti-phosphorylcholine antibodies. Journal of Immunology 130: 313-316.
Roitt, I., J. Brostoff & D. Male, 1985. Immunology. Gower Medical Publishing, Londen.
Rollin, B.E., 1981.Animal rights and human morality. Prometheus, New York. 182p.
Rollin, B.E., 1986.'TheFrankenstein thing':themoralimpact ofgeneticengineering of agricultural animals
on society and future science. In: W.W. Evans &A. Hollaender (Eds.): Genetic engineering of animals.
Plenum Press, New York/London, p. 285-297.
Roo, G. de, 1988.Studies on breeding schemes in aclosed pigpopulation. Proefschrift Landbouwuniversiteit, Wageningen. 163 p.
Rozemond, H., 1989. Hominum animaliumque saluti. Tijdschrift Diergeneeskunde 114: 6 3 - 7 5 .
Salter, D.W.,E.J. Smith, S.H. Hughes, S.E. Wright, &L.B.Crittenden, 1987.Transgenic chickens: insertion
of retroviral genes into the chicken germ line. Virology 157: 236-240.
Sanders, J.P.M. &H. Slijkhuis, 1986.De omzetting van varkensdrijfmest in voedergrondstoffen. Octrooiaanvraag.
Schilling, E., H. Niemann, S.P. Cheng &H.H. Doepke, 1979.DAPI: a further fluorescence test for diagnosing the viability of early cow and rabbit embryos. Zuchthygiene 14: 170-172.
Schönherr, O.T.&P.T.J.A. vanGelder, 1987.Cultureof animal cellsinhollow fibre dialysissystems. Animal
Cell Biotechnology 3: 338-355.
Schönherr, OX, P.T.J.A. van Gelder, P.J. van Hees, A.M.J.M. van Os &H.W.M. Roelofs, 1987.A hollow
fibre dialysis system for the in vitro production of monoclonal antibodies replacing in vivo production
in mice. Developments in Biological Standardization 66: 211-220.
Shaver, E.L. &R. Yanagimachi, 1978.The effect of in vitro storage of hamster sperm on fertilization and
early development. Gamete Research 1: 235-245.
Shulman, M., C D . Wilde & G. Köhler, 1978.A better cell line for making hybridomas secreting specific
antibodies. Nature (London) 276: 269-270.
Simons, J.P. & R.B. Land, 1987. Transgenic livestock. Journal of Reproduction and Fertility Suppl. 34:
237-250.
Simons, J.P., M. McClenaghan &A.J. Clark, 1987.Alteration of thequality of milk byexpression of sheep
beta-lactoglobulin in transgenic mice. Nature (London) 328: 530-532.
Simons, J.P., I. Wilmut, A.J. Clark, A.L. Archibald, J.O. Bishop, & R. Lathe, 1988. Gene transfer into
sheep. Biotechnology 6: 179-183.
Sjögren-Janson, E. & S. Jeansson, 1985. Large-scale production of monoclonal antibodies in dialysis
tubing. Journal of Immunological Methods 84: 359-364.
Smith, C. & S.P. Simpson, 1986. The use of genetic polymorphism in livestock improvement. Journal of
Animal Breeding and Genetics 103: 205-217.
Smith, C , T.H.E. Meeuwissen & J.P. Gibson, 1987. On the use of transgenes in livestock improvement.
Amimal Breeding Abstracts 55: 1-10.
Smith, A.G., J.K. Heath, D.D. Donaldson, G.G. Wong, J. Moreau, M. Stahl&D. Rogers, 1988. Inhibition
169
170
LITERATUUR
of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature (London) 336:
688-690.
Soller, M. &J.S. Beckmann, 1982. Restriction fragment length polymorphisms and genetic improvement.
2nd World Congress on Genetics Applied to Livestock Production (Madrid) 6: 396-404.
Soller, M. & J.S. Beckmann, 1983.Genetic polymorphism in varietal identification and genetic improvement. Theoretical and Applied Genetics 67: 2 5 - 3 3 .
Sonderegger, A., 1978. 'Der Mensch hat vor dem Tier keinen Vorrang' (Prediger 3,19). Die Fragwürdigkeit
industrieller Tierhaltung. In: D.W. Fölsch (Ed.): The ethology and ethics of farm animal production.
Birkhäuser Verlag, Basel/Stuttgart.
Spira, G., A. Bargellesi, JrL. Teillaud &M.D. Scharff, 1984.The identification of monoclonal class switch
variants by sib selection and an ELISA assay. Journal of Immunological Methods 74: 307-315.
Spitz, M., L. Spitz, R. Thorpe & E. Eugui, 1984. Intrasplenic primary immunization for the production
of monoclonal antibodies. Journal of Immunological Methods 70: 3 9 - 4 3 .
Stähli, C., T. Staehelin, & V. Miggiano, 1983. Spleen cell analysis and optimal immunization for highfrequency production of specific hybridomas. Methods in Enzymology 92: 26-36.
Stam, P., 1986. The use of marker loci in selection for quantitative characters. In: C. Smith, J.W.B. King
&J.C. McKay (Eds): Exploiting new technologies in animal breeding: genetic developments. Clarendon
Press, Oxford, UK. p. 170-182.
Stam, P., 1987. Marker genes in selection. Animal Genetics 18(Suppl. 1): 97-99.
Steinitz, M.,G.Klein, S.Koskimies & 0 . Mäkelä, 1977.EBvirus-induced Blymphocyte celllines producing
specific antibody. Nature (London) 269: 420-422.
Sugasawara, R.J., B.E. Cahoon & A.E. Karu, 1985. The influence of murine macrophage-conditioned
medium on cloning efficiency, antibody synthesis, and growth rate of hybridomas. Journal of Immunological Methods 79: 263-275.
Talhammer, J. & J. Freund, 1985. Passive immunization: a method of enhancing the immune response
against antigen mixtures. Journal of Immunological Methods 80: 7-13.
Tanksley, S.D., M.A. Mutschler &C M . Rick, 1987.Linkage map of thetomato (Lycopersicon esculentum)
(2n = 24). In: S.J. O'Brien (Ed.): Genetics maps 1987,a compilation of linkage and restriction maps of
genetically studied organisms. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.p. 654- 669.
Taylor, J. &E. Paoletti, 1988.Pox viruses aseukaryotic cloning and expression vectors: future medical and
veterinary vaccines. Progress in Veterinary Microbiology and Immunology 4: 197-217.
Templeton, A.A., P.van Look, R.E. Angell, R.J. Aitken, M.A. Lumsden &D.T.Baird, 1986.Oocyte recoveryand fertilization rates in women at various times after administration of hCG. Journal of Reproduction and Fertility 76: 771-778.
Thomas, A.A., R.J. Woortmeyer, W. Puyk & S.J. Barteling, 1988. Antigenic sites on foot-and-mouth
disease virus type A10. Journal of Virology 62: 2782-2789.
Tilley, S.A., L.A. Eckhardt, K.B. Marcu & B.K. Birshtein, 1983. Hybrid 7 2 b - 7 2 a genes expressed in
myeloma variants: evidence for homologous recombination. Proceedings of the National Academy of
Sciences USA 80: 6967-6971.
Tonegawa, S., 1983. Somatic generation of antibody diversity. Nature (London) 302: 575-581.
Tucker, E.M., S.W. Clarke & L. Metenier, 1987. Murine bovine hybridomas producing monoclonal alloantibodies to bovine red cell antigens. Animal Genetics 18: 29-39.
Urbain, J., M. Wikler, J.D. Franssen &C. Collignon, 1977. Idiotypic regulation of the immune system by
the induction of antibodies against anti-idiotypic antibodies. Proceedings of the National Academy of
Sciences USA 74: 5126-5130.
UytdeHaag, F.G.C.M., H. Bunschoten, K. Weijer & A.D.M.E. Osterhaus, 1986. From Jenner to Jerne:
towards idiotype vaccines. Immunological Reviews 90: 93-113.
Verhoog, H. &M.B.H. Visser, 1987.Derolvanethiek enbeleid indebescherming van landbouwhuisdieren.
Vakgroep Theoretische Biologie, Leiden.
Visser, M.B.H. &H. Verhoog, 1986. De eigenwaarde van dieren en het dierenrecht. Filosofie &Praktijk 7:
113-131.
LITERATUUR
Vize,P.D.,A.E.Michalska, R.Ashman, B.Lloyd, B.A. Stone,P.Quinn, J.R.E. Wells&R.F.Seamark, 1988.
Introduction of a porcine growth hormone fusion gene into transgenic pigs promotes growth. Journal
of Cell Science 90: 295-300.
Vleck, L.D.van, 1986.Technology and animal breeding: applications and challenges for dairy cattle breeding. Proceedings of the 3rd World Congres on Genetics Applied to Livestock Production. Lincoln,
Nebraska, p. 8 8 - 9 3 .
VoogdvanderStraaten, W.A.de, 1987.Biotechnologie, nieuwestijl.Tijdschrift Diergeneeskunde 112:3-8.
Vries, P.de.,R.S.van Binnendijk, P.van der Marel, A.L. van Wezel, H.O.Voorma, B.Sundquist, EG.C.M.
UytdeHaag &A.D.M.E. Osterhaus, 1988.Measles virus fusion protein presented in iscom induces haemolysis inhibiting and fusion inhibiting antibodies, virus specific T cellsand protection in mice. Journal
of General Virology 69: 549-559.
Wagner, T.E., 1985.The role of gene transfer in animal agriculture and biotechnology. Canadian Journal
of Animal Science 65: 539-552.
Wall, R.J., 1989. Use of transgenic animals in animal improvement. Animal Genetics 20: 325-327.
Wall, R.J., V.G. Pursel, R.E. Hammer &R.L. Brinster, 1985.Development of porcine ova that were centrifuged to permit visualization of pronuclei and nuclei. Biology of Reproduction 32: 645-651.
Ward, K.A., I.R.Franklin, J.D.Murray, CD. Nancarrow, K.A. Raphael, N.W.Rigby, C R . Byrne, B.W.Wilson &C.L. Hunt, 1986.The direct transfer of DNA by embryo micro-injection. Proceedings of the 3rd
World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. Lincoln, Nebraska, p. 6 - 2 1 .
Webb, R., R.B. Land, N. Pathiraja &B.A. Morris, 1984. Passive immunisation against steroid hormones
inthefemale. In:D.B.Crighton (Ed):Immunological aspectsofreproduction inmammals. Butterworths,
London, p. 475-499.
Weiler, J.I., 1986. Maximum likelihood techniques for the mapping and analysis of quantitative trait loci
with aid of genetic markers. Biometrics 42: 627- 640.
Weiler, J.I., 1987.Mapping and analysis of quantitative trait loci in Lycopersicon (tomato) with the aid of
genetic markers using approximate maximum likelihood methods. Heredity 59: 413-421.
Wensvoort, G., C. Terpstra, J. Boonstra, M. Bloemraad &D. van Zaane, 1986. Production of monoclonal
antibodies against swine fever virus and their use in laboratory diagnosis. Veterinary Microbiology 12:
101-108
Wieghart, M., J. Hoover, S.H. Choe, M.M. McGrane, F.M. Rottman, R.W. Hanson &T.E. Wagner, 1988.
Genetic engineering of livestock: transgenic pigs containing a chimeric bovine growth hormone
(PEPCK/bGH) gene. Journal of Animal Science 66 (Suppl. 1):266.
Wiel, D.F.M, van de &W. Koops, 1986. Development and validation of an enzyme immunoassay for progesterone in bovine milk or blood plasma. Animal Reproduction Science 10:201-213.
Williams, R.L., D.J. Hilton, S. Pease, T.A. Willson, C.L. Stewart, DP. Gearing. E.F. Wagner, D. Metcalf,
N.A. Nicola & N.M. Gough, 1988. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental
potential of embryonic stem cells. Nature (London) 336: 684-687.
Wilmut, I.&D.I. Sales, 1981. Effect of an asynchronous environment on embryonic development in sheep.
Journal of Reproduction and Fertility 61: 179-184.
Wilmut, I., D.I. Sales&C.J. Ashworth, 1986.Maternal and embryonic factors associated with prenatal loss
in mammals. Journal of Reproduction and Fertility 76: 851-864.
Xu, K.P., T. Grève, H. Callesen & P. Hyttel, 1987. Pregnancy resulting from cattle oocytes matured and
fertilized in vitro. Journal of Reproduction and Fertility 81:501-504.
Yelton, D.E. &M.D. Scharff, 1982.Mutant monoclonal antibodies with alterations in biological function.
Journal of Experimental Medicine 156: 1131-1148.
Zaane, D. van, 1984. Use of monoclonal antibodies in virus diagnosis. In: M.S. McNulty &J.B. McFerran
(Eds): Recent advances in virus diagnosis. Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht.
Zaane, D. van, 1987.Vijfjaar monoclonale antistoffen bij het Centraal Diergeneeskundig Instituut. Tijdschrift voor Diergeneeskunde 112: 264-270.
Zaane, D.van &J. IJzerman, 1984. Monoclonal antibodies against bovine immunoglobulins and their use
in isotype-specific ELISA's for rotavirus antibody. Journal of Immunological Methods 72: 427-441.
171
r
172 LITERATUUR
Zee,R.vander,W. vanEden,R.H.Meloen,A.Noordzij&J.D.A.vanEmbden, 1989. Efficient mapping
and characterization of aT-cellepitope bythe simultaneous synthesis of multiple peptides. European
Journal of Immunology 199:43-47.
Ziegler, A., 1980.Monoclonal antibodies as tools in hematology. Blut 41: 1-10.
Zimmer,A.&P.Gruss, 1989. Production ofchimaericmicecontainingembryonicstem(ES)cellscarrying
a homoeobox Hoxl.1 allele mutated byhomologous recombination. Nature (London) 338:150-153.
Uitgebreide inhoudsopgave
1 Biotechnologie bij landbouwhuisdieren A.J. van der Zijpp, E. Egberts
en T. van der Lende
1.1 Inleiding
1.2 Voortplantingstechnologie
1.3 Hybridomatechniek
1.4 Recombinant-DNA-technologie
2 Endocrinologie van de bronstcyclus en de vroege dracht F.A. Helmond
2.1 Inleiding
'
2.2 Bronstcyclus
2.2.1 Interactie tussen hypothalamus, hypofyse en ovarium
2.2.2 Folliculaire groei en ontwikkeling
2.2.3 Folliculaire steroïdsynthese
2.2.4 Oestradiol-17/3, bronstgedrag, LH-piek en ovulatie
2.2.5 Corpus luteum functie
2.3 Vroege dracht
2.3.1 Maternale herkenning van de dracht
2.3.1 Embryonale ontwikkeling
3 Ontwikkeling van superovulatietechnieken in relatie tot embryotransplantatie S.J. Dieleman
3.1 Inleiding
3.2 Normale follikelontwikkeling bij het rund
3.3 Follikelontwikkeling na stimulatie met PMSG
3.4 Embryo-opbrengst na verschillende superovulatechnieken
3.5 Conclusie
4 Belang van het synchroon zijn van embryo en uterus bij embryotransplantatie T. van der Lende
4.1 Inleiding
4.2 Uteriene milieu gedurende de vroege dracht
4.3 Invloed van een asynchroon intra-uterien milieu op de embryonale
ontwikkeling
4.4 Donor-recipiënt-of embryo-recipiënt-synchronisatie?
4.5 Conclusie
1
1
2
2
3
8
8
8
8
9
11
13
13
15
15
17
18
18
20
25
26
27
28
28
28
29
31
32
173
174
UITGEBREIDE INHOUDSOPGAVE
5 Embryoproduktie in vitro Th.A.M. Kruip
5.1 Inleiding
5.2 Eicelwinning bij het rund
5.3 Van onrijpe eicel tot embryo in vitro
5.3.1 Eicelwinning
5.3.2 Eicelrijping in vitro
5.3.3 In-vitro capacitatie van sperma en in-vitro fertilisatie
5.3.4 Embryo-ontwikkeling tot het blastocyststadium
5.3.5 Kwaliteitsbeoordeling van embryo's
5.3.6 Micromanipulaties
5.3.7 Sexen en karyotyperen
5.3.8 Diepvriezen van embryo's
5.4 Conclusie
6 Kwaliteitsbeoordeling van eicellen en embryo's P. de Boer en
M.L. Boerjan
6.1 Inleiding
6.2 Oorsprong en variatie
6.2.1 Eicelrijping en ovulatie
6.2.2 Spermatozoa als een oorzaak van embryovariatie
6.2.3 Condities rond de bevruchting
6.2.4 Toestand van de maternale tractus
6.3 Celbiologische kapstokken om de variatie tussen embryo's aan op
te hangen
6.3.1 Genotype van het embryo en de variatie in overlevingskans
6.3.2 Variatie in celaantal tijdens de vroeg-embryonale ontwikkeling
6.3.3 Functionele variatie binnen groepen embryo's, anders dan tot
uitdrukking komend in het celaantal
6.4 Non-agressieve kleurmethoden om embryokwaliteit te voorspellen
6.5 Conclusie
7 Embryoproduktie en embryomanipulatie in een foktechnisch
perspectief / . Jansen
7.1 Inleiding
7.2 Waarde toegevoegde informatie
7.3 Alternatieve fokprogramma's
7.4 Toetsbedrijven
7.5 Sexen van embryo's
7.6 Klonen
7.7 Conclusie
33
33
33
34
34
35
35
36
36
37
38
38
39
40
40
41
41
42
42
42
43
43
44
45
45
46
47
47
48
49
50
51
52
52
UITGEBREIDE INHOUDSOPGAVE
8 Fundamentele aspecten en toepassingsgebieden van de hybridomatechniek E. Egberts, A. Schots en W.B. van Muiswinkel
8.1 Inleiding
8.2 Serologie
8.3 Principe van antilichaamvorming
8.4 Monoklonale antilichamen
8.5 Hybridomatechnologie
8.6 Conditionering van de donor
8.7 Fusieproces
8.8 Screening en selectie van hybridoma's
8.9 Produktie van monoklonale antilichamen
8.10 Toepassing van monoklonale antilichamen
8.11 Modificatie van monoklonale antilichamen
8.12 Conclusies
9 Monoklonale antistoffen en diagnostiek D. van Zaane
9.1 Inleiding
9.2 Antigeendetectie
9.3 Antilichaamdetectie
9.4 Overige diagnostische toepassingen
9.5 Epiloog
10 Toepassing van monoklonale antistoffen in de
voortplanting P. Booman
10.1 Inleiding
10.2 Diagnostiek
10.3 Beïnvloeding van fysiologische processen
10.4 Fundamenteel onderzoek
10.5 Conclusie
11 Toepassing van monoklonale antistoffen bij het gebruik van
biologische produkten in de geneeskunde A.D.M.E. Osterhaus en
P. de Vries
11.1 Inleiding
11.2 Toepassing van monoklonale antilichamen bij de ontwikkeling
van biologische produkten
11.2.1 Definitie en selectie van immunogene structuren voor
vaccinbereiding
11.2.2 Anti-idiotype-vaccins
11.2.3 Gebruik van monoklonale antistoffen in vivo
11.3 Toepassing van monoklonale antistoffen bij de produktie van
biologische produkten
175
53
53
53
54
56
57
58
60
62
63
64
65
69
70
70
71
72
75
76
77
77
77
80
83
83
85
85
85
85
86
87
88
176
UITGEBREIDE INHOUDSOPGAVE
11.4 Toepassing van monoklonale antistoffen bij de controle van
biologische produkten
11.5 Conclusie
12 Van monoklonale antistoffen tot veterinaire farmaca J.Th. Gielen
12.1 Inleiding
12.2 Marktanalyse
12.3 Ontwikkelingskosten
12.4 Karakterisering van de MCA
12.5 Produktie van MCA's
12.5.1 In-vivo produktie
12.5.2 In-vitro produktie
12.6 Zuivering
12.7 Farmaceutische vormgeving
12.8 Kwaliteitscontrole
12.9 Klinisch onderzoek en registratie
88
90
91
91
91
92
93
93
93
94
96
96
97
97
13 Nucleïnezuren en genetische manipultie R.C. van den Bos en
A. van Kammen
13.1 Inleiding
13.2 Structuur en eigenschappen van nucleïnezuren
13.3 Structuur van DNA
13.4 Afmetingen en vormen van DNA
13.5 DNA-replicatie
13.6 Structuur en functie van RNA
13.7 RNA-synthese (DNA-transcriptie)
13.8 Promoter en terminator
13.9 Hybridisatie
13.10 Biosynthese van eiwitten
13.11 Eukaryote genen zijn gespleten
13.12 Principe van de recombinant-DNA-techniek
13.13 Koppeling van DNA-fragmenten
13.14 Veel gebruikte vectoren
13.15 Onderscheid tussen genomische klonen en cDNA-klonen
13.16 Selectie en identificatie van recombinant-DNA
13.17 Expressie van recombinant-DNA
13.18 Mutagenese van recombinant-DNA
98
98
98
101
102
103
104
105
106
107
108
108
109
113
114
116
117
117
119
14 RFLP in de fokkerij P. Stam
14.1 Inleiding
14.2 Nuttig gebruik van RFLP's
14.2.1 Afstammingscontrole, identificatie en diagnostiek
14.2.2 Gebruik als marker in selectieprogramma's
14.3 Conclusies
120
120
122
122
122
125
UITGEBREIDE INHOUDSOPGAVE
15 Nieuwe strategieën voor de ontwikkeling van veterinaire
vaccins A.L.J. Gielkens
15.1 Inleiding
15.2 Voor- en nadelen van levende en gedode vaccins
15.3 Moderne benaderingen voor de bereiding van vaccins
15.3.1 Recombinant-DNA-vaccins
15.3.2 Synthetische vaccins
15.3.3 Levende vaccins en recombinant-vaccins
15.4 Conclusie
16 Transgene landbouwhuisdieren A.L. Archibald
16.1 Inleiding
16.2 Technologie voor genoverdracht (transfectie)
16.2.1 Micro-injectie
16.2.2 Retrovirale vectoren
16.2.3 Embryonale stamcellen
16.3 Transgene landbouwhuisdieren
16.3.1 Varkens
16.3.2 Rundvee
16.3.3 Schaap
16.3.4 Pluimvee
16.4 Welke genen zullen de produktie verhogen?
16.5 Zijn er alternatieve aanwendingsgmogelijkheden voor transgene
landbouwhuisdieren?
16.6 Transgene landbouwhuisdieren in de fokkerij
16.7 Toekomst
16.8 Conclusie
16.9 Verantwoording
17 Industriële ontwikkelingen van de recombinant-DNA-technologie voor
de veehouderij J.P.M. Sanders
17.1 Inleiding
17.2 Produkten uit het dier
17.2.1 Insuline
17.2.2 Chymosine/stremsel
17.2.3 Expressie van chymosine in Kluyveromyces
17.2.4 Mest
17.3 Produktieverhogende middelen (naar het dier)
17.3.1 Antibiotica en probiotica
17.3.2 Vaccins en diagnostica
17.3.3 Aminozuren en plantenveredeling
17.3.4 Groeihormoon
177
126
126
126
127
127
128
130
131
132
132
132
133
134
135
135
136
137
137
138
139
140
141
142
142
143
144
144
145
145
146
146
147
148
148
148
149
150
178
UITGEBREIDE INHOUDSOPGAVE
18 Ethiek en biotechnologie in de veehouderij H. Verhoog
18.1 Inleiding
18.2 Normatieve ethiek
18.3 Ethiek en mens-dier-relatie
18.4 Ethische problemen met betrekking tot de moderne
biotechnologie
152
152
153
154
Literatuur
161
Uitgebreide inhoudsopgave
173
155