Samenvatting Moleculaire biologie: Chapter 8

Samenvatting
Moleculaire biologie: Chapter 8: Major shifts in bacterial transcription
1
Sigma factor switching
Als een bacterie wordt geïnfecteerd door een faag, dan zal dit ertoe lijden dat de transcriptie van de
gastheer wordt ondermijnd. Dit gebeurd zodat de faag de machinerie van de cel kan gebruiken om zijn
eigen genen tot expressie te brengen. Dit proces van faag genexpressie is tijdsafhankelijk. De genen
van de faag zullen in verschillende fasen worden afgeschreven. In de eerste fase zullen de vroege faag
genen tot expressie komen, gevolgd door de genen van de later fasen. Tegen dat de infectie de laatste
fase bereikt zal de gastheer genexpressie zo goed als stilgevallen zijn. Deze gigantische verschuiving
in het expressiepatroon zou niet verklaard kunnen worden met het operon mechanisme. Het wordt tot
stand gebracht door fundamentele veranderingen aan te brengen in het RNA-polymerase zelf.
Een andere grote verschuiving in het expressiepatroon doet zich voor tijdens de sporulatie in bacteriën
zoals B.subtilis. Hier worden genen die nodig zijn in de vegetatieve groeifase uitgeschakeld, en andere
sporulatie specifieke genen worden aangeschakeld. Deze verschuiving wordt wederom veroorzaakt
door een verandering in het RNA-polymerase.
Ook als bacteriën onder stress komen te staan zal dit lijden tot een verschuiving in expressie.
Bacteriën reageren op veranderingen in de omgeving door globale veranderingen aan te brengen in het
genexpressiepatroon. Deze worden veroorzaakt door veranderingen in het transcriptiepatroon, dat
mogelijk wordt gemaakt door wijzigingen aan te brengen in het RNA polymerase zelf. Deze
verandering zal gebeuren door het gebruik van een andere sigma factor.
1.1 Faag infectie
Welk deel van het RNA polymerase is de logische kandidaat om de specificiteit van het enzyme te
wijzigen. In hoofdstuk is bewezen dat de σ factor de specificiteit van het RNA polymerase bepaalde.
Een wijziging in σ is dus het meest waarschijnlijke om de specificiteit van het polymerase te wijzigen.
Experimenten toonden aan dat dit het correcte antwoord op deze vraag was. Deze experimenten zijn
niet uitgevoerd met E.coli en de faag T4, maar met B.subtilis en de faag SPO1. SPO1 heeft een groot
genoom, met een tijdsafhankelijk expressiepatroon dat er als volgt uitziet: in de eerste 5 minuten
komen de vroege genen tot expressie; gevolgd door de middelste genen (die tot expressie komen
tussen de 5 -10 minuten na de infectie), en ten slotte de late genen die tot expressie komen na 10
minuten tot het einde van de infectie.
Doordat de faag een groot aantal genen heeft, heeft het ook een uitgebreid mechanisme om de
expressie ervan te controleren. Dit mechanisme werkt als volgt:
Na de infectie van de gastheer zullende vroege genen tot expressie worden gebracht door het RNA
polymerase holoënzym (met de σ factor van de gastheer) van de gastheer. Dit is noodzakelijk daar
SPO1 geen eigen RNA-polymerase bijheeft tijdens het infecteren van de cel. Het B.subtilis RNA
polymerase holoënzym komt zeer goed overeen met dat van E.coli. Het is opgebouwd uit twee grote
(β en β’), twee kleine (α) en een zeer kleine (ω) subeenheid. De σ factor is kleiner (43 kDa i.p.v. 70
kDa) dan die va E.coli. Er is nog een extra subeenheid aanwezig (δ), die de binding van het
polymerase verhinderd op niet promotor sequenties.
Eén van de genen van de vroege fase codeert voor gp28 (gen28). Gp28 associeert met het core
polymerase van de gastheer en vervangt hier de gastheer σ factor. Dit proteïne veranderd de
specificiteit van het polymerase, zodat de genen van de middelste fase worden afgeschreven, in plaats
1
van de gastheergenen en de vroege fase genen. Gp28 is dus een σ factor die twee zaken
bewerkstelligd. Het verhinderd het polymerase om gastheer genen af te schrijven en het verschuift de
expressie van de faag genen van vroege fase naar middelste fase.
De overgang van de middelste naar de late fase gebeurt op analoge wijze. In de middelste fase genen
zijn gen33 en gen34 aanwezig die coderen voor respectievelijk gp33 en gp34. Deze twee proteïnen
associëren zich en vormen zo een σ-factor die gp28 kan vervangen en zo de transcriptie van de late
fase genen op gang brengt.
De late genen bevatten de genen die instaan voor de vorming van de faagpartikels, en uiteindelijk dus
zorgen voor de cellysis.
Sporulatie
B.subtilis kan eeuwig in de vegetatieve of groeifase blijven, zolang er nutriënten in het medium
(omgeving) aanwezig zijn en dat de condities goed zijn voor groei. Als er een tekort aan nutriënten
komt, of andere ongunstige omgevingsfactoren treden op, dan zal B.subtilis endosporen vormen. Dit
zijn stevige dormante lichamen die jaren kunnen overleven en terug kunnen ontkiemen als de
omstandigheden terug gunstiger worden.
Sporulatie begint met de vorming van een polair septum tussen de dochtercellen. Dit septum zal de
cellen niet in twee gelijke cellen delen,; het polaire septum zal zond een einde gevormd worden en de
cel in twee ongelijke dochtercellen verdelen.
De genexpressie moet veranderen gedurende de sporulatie, aangezien de vegetatieve cellen een
verschillende morfologie en metabolisme hebben met de sporen. Als b.subtilis sporen vormt, dan
wordt er een gehele nieuwe set van genen geactiveerd die specifiek zijn voor de sporulatie. De
verschuiving van de vegetatieve fase naar de sporulatie gebeurd door de verandering van σ-factor. Bij
de verandering zullen er verschillende nieuwe σ factoren betrokken zijn. σF, σE, σH, σC en σK spelen
hier elk een rol bij de vervanging van de vegetatieve σA factor. De σ factoren die specifiek zijn voor de
sporulatie herkennen andere -10 en -35 boxen dan de vegetatieve. Elke van deze sporulatie σ-facoren
bind aan zijn eigen specifieke promotor sequentie. σH is de eerste σ-factor die zal verschijnen in het
sporulatie proces. Het activeert de transcriptie van een 16-tal genen waaronder spoIIR, waarvan het
genproduct de transcriptie van het gen dat codeert voor σE activeert. Beide factoren zorgen ervoor dat
de cel onvermijdelijk een spore zal vormen.
2
1.2 Genes with multiple promotors
Het verhaal van de sporulatie is een aangewezen introductie op het volgende onderwerp, namelijk
multiple promotors, omdat de sporulatie genen hiervan de eerste voorbeelden waren.
Sommige genen die tijdens de sporulatie tot expressie komen moeten gedurende verschillende fasen
(en dus bij verschillende σ facoren) tot expressie komen. Hiervoor is het noodzakelijk dat het wordt
herkend door verschillende σ factoren. Een voorbeeld van dit soort genen is spo VG, dat herkend
wordt door EσB en EσE .
Deze genen worden uitgerust met verschillende promotors, die door verschillende σ factoren worden
herkend. Dit verzekerd de transcriptie, onafhankelijk van welke σ factor er aanwezig is. Verder zorgt
het ervoor dat de graad van expressie aangepast kan worden onder de verschillende condities.
1.3 Other σ switches
Als bacteriële cellen worden blootgesteld aan een temperatuurstijging, dan zal de cel hierop reageren
met een verdedigingsmechanisme dat de heat shock response wordt genoemd. De cellen beginnen met
de aanmaak van moleculaire chaperones, die binden aan proteïnen die gedeeltelijk zijn ontvouwen
door de temperatuurstijging om ze opnieuw in hun juiste conformatie te brengen. Verder worden er
ook proteasen aangemaakt die de proteïnen die te ver ontvouwen zijn degraderen. Al de genen die
betrokken zijn bij de vorming van de proteïnen die de cel de heat shock helpen overleven worden de
heat shock genes genoemd.
Van zodra de E.coli cellen worden blootgesteld aan een temperatuurstijging (bijvoorbeeld van 37°C
naar 42°C (koorts)), zal de normale transcript ophouden, of op zijn mins verminderen. Er wordt wel
getart met de synthese van 17 nieuwe heat shock transcripten. Deze transcripten coderen voor de
moleculaire chaperones en de proteasen. Deze verschuiving in transcriptie vereist het product van het
rpoH gen, dat codeert voor σH ( of σ32 32 kDa).
De respons op de Heat shock gebeurd in minder dan een minuut, wat niet
lang genoeg voor de transcriptie en translatie van rpoH. Er zijn andere
processen die de snelle opstapeling van σH verklaren. Ten eerste wordt het
proteïne zelf gestabiliseerd door een stijgende temperatuur. Dit fenomeen
kan als volgt verklaard worden: Als de temperatuur normaal is, dan word σH
gedestabiliseerd, doordat het een complex vormt met heat shock proteins.
Als de temperatuur stijgt, dan zullen er en heleboel andere proteïnen
ontvouwen, waardoor het heat shock σH complex wordt gedestabiliseerd.
Het tweede effect van des stijgende temperatuur is op translatie niveau: door
een stijging in de temperatuur worden de secundaire structuren in de 5’ UTR
van het rpoH mRNA gedestabiliseerd, zodat het mRNA meer toegankelijk
wordt voor de ribosomen.
Als er tekorten zijn aan stikstof in het medium, dan zal een andere σ-factor
(σ54 of σN) worden geactiveerd. Deze controleert de transcriptie van genen
die coderen voor proteïnen die verantwoordelijk zijn voor het
stikstofmetabolisme. Dit is een mechanisme voor gram negatieve bacteriën
zoals E.coli die geen sporen vormen om toch te kunnen reageren op stress.
Een ander voorbeeld van zo’n stress σ factor is σS (σ38). Dit zijn allen en voorbeeld van een
fundamenteel mechanisme: Bacteriën trachten om te gaan met veranderingen in hun omgeving door
globale veranderingen in transcriptie door verschuivingen van σ-factoren.
3
Algemene transcriptie (onder
normale omstandigheden)
Als er een tekort is aan N
als medium volledig uitgeput raakt
als T abnormaal hoog is
1.4 Anti σ factors
Als aanvulling op de vervanging mechanismen van de σ factor hebben bacteriën nog een mechanisme
ontwikkeld om hun transcriptie te controleren. Dit is door gebruik te maken van anti σ factoren. Deze
proteïnen treden niet in competitie met de σ factor om het RNA polymerase te binden, maar binden
direct op σ zodat deze wordt geïnhibeerd. Een voorbeeld van een anti σ is het product van het E.coli
rsd gen. De naam van het gen is afgeleid van het feit dat het genproduct de activiteit van σ70 inhibeert
(reguleert), dat het genproduct is van tpoD. Dus rsd staat voor regulator van sigma D.
Zolang de cellen snel groeien, worden de meeste genen getranscripteerd door σ70, en wordt rsd niet
afgeschreven. Als cellen in een stress toestand komen, dan zal de groei van de cellen stoppen en
overgaan naar de stationaire fase. Op dit punt wordt een nieuwe set van stress genen geactiveerd door
een nieuwe σ-factor, σS, wat 1/3 van de totale RNA polymerase hoeveelheid bind in de cel. Dit wil dus
zegge dat ongeveer 2/3 van de totale hoeveelheid σ in de cel nog steeds σ70 is. De transcriptiegraad
van genen die worden herkend door σ70 is echter wel verlaagd met een 10-voud. Dit suggereert, dat er
naast de relatieve hoeveelheid van de verschillende σ-factoren nog iets anders een invloed heeft op de
transcriptie. Deze extra factor blijkt Rsd te zijn, dat wordt aangemaakt als de cellen overgaan naar de
stationaire fase, dan bind op σ70 en zo zijn werking verhinderd.
Sommige anti-σ factoren worden gereguleerd door anti-anti-σ factoren. Een voorbeeld hiervan is te
vinden in B.subtilis .Tijdens de sporulatie bind en inhibeert de anti-σ factor spoIIAB de activiteit van
σF en σG. Een ander proteïne spoIIAA, bind op complexen van σF/σG e, spoIIAB. Hierdoor komen de
σ-facoren los, en wordt het effect van de antiσ-factor tenietgedaan. spoIIAB kan ook optreden als antianti-anti-σ-factor door spoIIAA te fosforyleren en zo te inactiveren.
4
2
The RNA polymerase encoded in Phage T7
Faag T7 behoort tot een klasse van relatief eenvoudige E.coli fagen. Tot deze klasse behoren ook T3
en ϕII. Zij hebben een beduidend kleiner genoom DNA SPO1, en daardoor ook veel minder genen die
gereguleerd en tot expressie gebracht moeten worden. In deze fagen onderscheiden we drie transcriptie
fasen: een vroege fase die klasse I wordt genoemd, en twee late fasen, klasse II en klasse III. Eén van
de 5 klasse I genen (gen 1) is nodig om klasse II en III tot expressie te kunnen brengen. Als het wordt
gemuteerd, dan zullen enkel de genen van klasse I tot expressie worden gebracht. Het product van gen
1 is geen σ-factor zoals in de vorige gevallen, maar een RNA polymerase dat specifiek is voor de
genen van de faag. Dit polymerase schrijft specifiek de genen af van klasse II en klasse III, maar laten
de genen van klasse I volledig ongemoeid. Het mechanisme om de transcriptie te verschuiven is hier
zeer simpel. Als het faag DNA de gastheercel binnendringt, dan zal het E.coli RNA polymerase
holoënzym de vijf klasse I genen transcripteren, inclusief gen 1. Het gen 1 product is een specifiekfaag RNA polymerase dat dan de genen van klasse II en klasse III transcripteerd. Een gelijkaardig
polymerase is geïsoleerd uit T3. De promotors van deze polymerasen zijn ingebouwd in verschillende
kloneringsvectoren zoals pBluescript.
In de pBluescript vector zijn volgende zaken aanwezig:




Een ori (origin of replication initiation)
Een MCS (multiple cloning site): deze site bevat verschillende uniek herkenningssequentie
voor restrictie-enzymen. Deze zijn gelegen in het lacZ gen, zodat de blauw wit screening kan
uitgevoerd worden.
Het bevat zowel een T7 als een T3 promotor sequentie.
Een resistentiemerker (ampiciline resistentie).
5
Indien deze genen afgeschreven moeten worden, dan is het nodig dat de gebruikte stam het gen voor
het T7 en/of het T3 polymerase bevat. Dit gen kan induceerbaar gemaakt worden door het in te
bouwen na een lac promotor (inductie door IPTG). De reden hiervoor is, dat dan de mogelijke
toxische moleculen voor de cel pas tot expressie worden gebracht als er voldoende cellen aanwezig
zijn, om een hoge opbrengst te genereren voordat de cellen afsterven.
3
Infection of E.coli bij phage λ
Veel van de fagen die we tot nu toe hebben bestudeerd zijn virulente fagen. Als zij zichzelf repliceren,
dan zal dit lijden tot de dood van de gastheercel, door middel van lyse. Faag λ daarentegen is een
getemperde faag. Als faag λ een E.coli cel infecteert, dan zal hij deze cel niet noodzakelijk lyseren. In
dit opzicht is lambda veelzijdiger dan de meeste fagen.
Faag λ heeft twee mogelijke wegen om zich te reproduceren. De eerste is de lytische cyclus. Deze
cyclus is gelijk aan die van de virulente fagen en zal lijden tot de lyse van de cel. Deze begint met het
binnendringen van het faag DNA in de gastheer. Dit DNA zal dan dienen als template voor
transcriptie bij het gastheer RNA polymerase. De faag mRNA moleculen worden getranslateerd om zo
de faag proteïnen aan te maken. De faag wordt gerepliceerd en er worden nieuwe faagpartikels
geassembleerd. De infectie eindigt met de lyse van de gastheer.
In de lysogene cyclus, zal er iets totaal verschillend gebeuren. Het faag DNA dringt de cel binnen, en
zijn vroege genen worden afgeschreven en getranslateerd zoals in de lytische cyclus. Dan verschijnt er
een 27 kDa faag proteïne (λ repressor of CI) dat bind op twee faag operatoren en zo de transcriptie van
alle genen stillegt, behalve dat van cI, het gen dat codeert voor de λ-repressor. Als de lysogene cyclus
zich geeft gestabiliseerd, zal het faag DNA zich integreren in het bacterieel genoom. Deze bacterie
wordt een lysogeen genoemd en de faag een profaag. De lysogene cyclus moet niet worden
beschouwd als een nadeel voor de faag, omdat het faag DNA in de lysogeen zich repliceert samen met
het bacterieel DNA. Hierbij is het niet nodig voor de faag om faagpartikels te assembleren. Als de
omstandigheden ongunstig worden, zoals wanneer de lysogeen in contact komt met mutagene
chemicaliën of straling, dan zal de lysogene cyclus overgaan naar de lytische.
6
3.1 Lytic reproduction of phage λ
Faag λ heeft 3 transcriptiefase, de immediate early, de delayed early en de late transcription Deze drie
klassen van genen zijn opeenvolgend geordend in het faag DNA. Dit helpt de verklaring van de
regulatie van de expressie. Onderstaande figuur geeft de genetische map van faag λ weer in twee
vormen: de lineaire, zoals het DNA aanwezig is in de faagpartikels en de circulaire vorm, die het
aanneemt kort na de infectie. De circularisatie is mogelijk door een 12 base overhang aan beide einden
van het lineair genoom. Deze overhangen zijn complementair met elkaar en worden de cohesive ends
(cos) genoemd. Door de circularisatie worden al de late genen gegroepeerd die van elkaar verwijderd
waren in het lineaire genoom.
De genexpressie van faag lambda wordt gecontroleerd door verschuivingen in de transcriptie. λ
gebruikt hiervoor een mechanisme dat we hiervoor nog niet hebben gezien, namelijk antiterminatie.
De immediate early genen van de faag worden onmiddellijk na infectie afgeschreven door middel van
het RNA polymerase holoënzym van de gastheer. Er zijn slechts twee van deze genen, cro en N, die
recht na de rightward en leftward promotor, PR en PL, gelegen zijn. In dit stadium is in de lytische
7
cyclus geen repressor gebonden op de operator die de promotors vergezellen (OR en OL). De
transcriptie wordt dus niet verhinderd. Als het polymerase het einde van de immediate early genen
bereikt, zal de transcriptie worden getermineerd, daar het een terminatie sequentie tegenkomt. De
transcriptie zal stoppen kort voor de delayed early genen.
De producten van beide genen zijn belangrijk voor het verder tot expressie brengen van het λ genoom.
Het product van cro is een repressor dat de transcriptie van het λ-repressor gen, cI, inhibeert en zo de
synthese van de λ-repressor verhinderd. Dit is noodzakelijk om de andere faag genen tot expressie te
brengen, die anders door het product van cI zou worden geïnhibeerd. Het product van N is een
antiterminator, dat ervoor zorgt dat het RNA polymerase de terminator sequenties van de immeadiate
early genen kunnen genegeerd worden. Als dit gebeurd, dan komen de delayed early genen tot
expressie. Voor deze genen worden dezelfde promotors gebruikt als voor de immediate early genen.
De verschuiving in transcriptie gebeurd hier niet door een nieuwe σ factor of door een nieuw RNA
polymerase, maar door de verlenging van de transcripten die gecontroleerd worden door dezelfde
promotor.
De delayed early genen zijn belangrijk voor het voortzetten van de lytische cyclus. O en P coderen
voor proteïnen die nodig zijn om het faag DNA te repliceren. Het product van Q is een andere
antiterminator die ervoor zorgt dat de late genen tot expressie kunnen komen.
De late genen worden allen getranscripteerd in de rightward richting (met de klok mee), maar niet
vanaf PR. De promotor voor de late genen PR’ ligt juist na Q. De transcriptie vanaf deze promotor
wordt vroegtijdig beëindigd, tenzij Q tussenkomt om dit te verhinderen. Het product van N kan dat
van Q niet vervangen, daar het specifiek is voor de antiterminatie na cro en N. De late genen coderen
voor de proteïnen die het hoofd en de staart van de faag vormen, en proteïnen die zorgen voor de lyse
van de gastheer.
8
Antitermination
Hoe vervullen N en Q hun antiterminatie functionaliteit? Ze gebruiken hier beide voor verschillende
mechanismen. Onderstaande figuur geeft de genetische sites weer die N omgeven. Rechts ervan is PL
en OL gelegen. Dit is de plaats waar de letward transcriptie start. Downstream van N is de transcriptie
terminator van N gelegen, waar de transcriptie eindigt indien N niet aanwezig is.
Onderstaande figuur geeft weer wat er gebeurd indien N niet aanwezig is. Het RNA polymerase
(rooze structuur) start de transcriptie op PL en transcripteerd N voordat de terminator wordt bereikt en
het loskomt van het DNA.
In onderstaande figuur staat weergegeven wat er gebeurd in aanwezigheid van N. Het N proteïne
(paarse structuur) bindt op het transcript op de N utilization site (nut site) en interageert met een
complex van gastheer proteïnen die gebonden zijn met het RNA polymerase. Deze binding zorgt
ervoor dat het polymerase de terminator negeert en de early delayed genen begint te transcripteren.
Hetzelfde mechanisme treedt op bij de transcriptie vanaf PR, omdat er juist eenzelfde site waar
aanwezig is na cro, die ervoor zorgt dat het polymerase de terminator kan negeren.
Hoe weten we da ter gastheerproteïnen betrokken zijn bij de antiterminatie. Dit komt doordat
genetische studies hebben aangetoond dat mutaties in 4 genen van de gastheer ervoor zorgen dat de
antiterminatie niet meer goed verloopt. Deze genen coderen voor de proteïnen NusA, NusB, NusG en
het ribosomaal S10 proteïne. Het lijkt misschien vreemd dat proteïnen van de gastheer helpen bij een
proces wat uiteindelijk zal lijden tot het afsterven ervan, maar dit is juist weer een voorbeeld van hoe
een virus cellulaire processen gebruikt in zijn voordeel.
S10 zorgt in de cel mee voor proteïnen synthese. De Nus proteïnen zorgen voor antiterminatie in de
zeven rrn operons die coderen voor ribosomaal RNA en voor sommige tRNA’s. In vitro studies
9
hebben aangetoond dat NusA antiterminatie kan veroorzaken als de terminator dicht genoeg in de
buurt is van de nut site. Onderstaande figuur geeft het proteïne complex weer dat betrokken is bij
antiterminatie over een korte afstand. Het geeft aan dat N niet rechtstreeks bind op het RNA
polymerase, maar bind op NusA, dat op zijn beurt bind met het RNA polymerase. De figuur geeft ook
aan dat er twee belangrijke delen zijn in de nut site: boxA en boxB. BoxA is zeer geconserveerd tussen
verschillende nut stes, maar boxB is variabel tussen verschillende nut sites. Het transcript van boxB
bestaat uit een inverted repeat, die waarschijnlijk een stem loop vormt zoals weergegeven in
onderstaande figuur.
Het is zeer waarschijnlijk dat de antiterminatie in vivo niet zo eenvoudig is, omdat het moet gebeuren
over terminators die minstens enkele honderden base paren zijn gelegen van de nut site. Dit wordt
processieve antiterminatie, omdat de antiterminatie factoren gebonden blijven aan het polymerase over
een grote afstand in het DNA. Dit type van antiterminatie vereist meer dan de binding van N en NusA.
Het vereist ook drie andere gastheerproteïnen: NusB, NusG en S10. Deze proteïnen helpen
waarschijnlijk bij de stabilisatie van het antiterminatie complex. Onderstaande figuur geeft een
schematische voorstelling van dit complex. Het meest onverwachte dat deze figuur toont is dat het
complex interageert met het transcript van de nut site, in plaats van de nut site zelf.
antiterminator Q
p antiQ
p antiQ: als deze wordt afgeschreven samen het het
Q, dan wordt er ds RNA gevormd, wat lijdt tot RNA
afbraak en dus tot inhibitie van de expressie van Q
Q omzeild deze terminator
10
De controle van de transcriptie van de late λ-genen gebeurt ook door middel van antiterminatie, maar
met een totaal verschillend mechanisme. Onderstaande figuur geeft weer dat de Q utilization site (qut)
overlapt met de late promotor (PR’) Deze qut site overlapt ook met een site die pauzering initieert (1617 bp downstream van de transcriptie initiatie site). In tegenstelling tot het N systeem, zal Q binden op
de qut site en niet op het transcript ervan.
Als Q afwezig is, dan zal het RNA polymerase gedurende enkele minuten pauzeren aan de qut site,
juist na de transcriptie van het pauze signaal. Als het eindelijk de pauze site verlaat, dan zal het RNA
polymerase verder transcripteren tot aan de terminator, waar de transcriptie van de late genen
vroegtijdig wordt afgebroken.
Als Q aanwezig is, dan zal dit het gepauzeerde complex herkennen en binden op de qut site. Q bind
dan op het polymerase en wijzigt de structuur op zo een manier dat de terminator wordt genegeerd, en
zo de late genen worden afgeschreven. Het polymerase waarop Q gebonden is blijkt de vorming van
een hairpin te inhiberen in het RNA juist achter het polymerase en zo de terminator activiteit. Q kan
antiterminatie veroorzaken zonder de tussenkomst van andere proteïnen, maar met de tussenkomst
van NusA is het proces efficiënter.
3.2 Establishing Lysogeny
De delayed early genen zijn niet enkel noodzakelijk voor de lytische cyclus, maar ook voor het
bewerkstelligen van de lysogene cyclus. Ze helpen dit te bewerkstelligen op twee manieren: (1)
Sommige producten van de delayed early genes zijn noodzakelijk om het faag DNA te integreren in
het bacteriële genoom, wat een vereiste is voor lysogenie. (2) De producten van cII en cIII laten de
transcriptie van cI toe en daardoor de productie van de λ repressor, de centrale component in de
lysogene cyclus.
11
Twee promotoren controleren cI: PRM en PRE. PRM staat voor promotor for repressor maintenance.
Deze promotor wordt gebruikt als de lysogene cyclus is bewerkstelligd, om de toevoer van repressor
te garanderen en zo de lysogene toestand te bewaren. Het heeft de vreemde eigenschap dat deze
promotor zijn eigen product (de repressor) nodig heeft om geactiveerd te worden. Dit impliceert dat
deze pormotor niet gebruikt kan worden om lysogenie te bewerkstelligen. Hiervoor worden de andere
promotor PRE (promotor for repressor establishment) gebruikt. PRE ligt rechts van PR en cro. De
transcriptie gebeurt naar links door cro en dan door cI. PRE laat toe om repressor aan te maken voordat
er een repressor molecule aanwezig is. Daar de transcriptie in de linkse richting door cro gaat wordt er
een polycistronische boodschap bekomen met een sense boodschap voor cI die zal worden
getranslateerd en een antisense boodschap voor cro, dat zal zorgen voor interferentie met het sense
mRNA van cro en zo hiervan de translatie inhiberen. Dit zorgt mee voor de bewerkstelliging van
lysogenie. cII stimuleert de transcriptie van een leftward promotor (PantiQ) die in Q gelegen is. Door
deze “achterwaartse” transcriptie zorgt ervoor dat er antisense Q mRNA wordt gevormd dat de
aanmaak van Q blokkeert, waardoor lysogenie wordt bevorderd.
PRE heeft sommige specifieke eisen om in werking te kunne treden. Het heeft namelijk -10 en -35
boxen die zeer slecht gelijkend zijn op de consensussequentie die wordt herkend door het E.coli RNA
polymerase. Het is inderdaad niet mogelijk om de genen die achter deze promotor gelegen zijn tot
expressie te brengen met enkel het RNA polymerase (in vitro). Het product van cII (CII) helpt echter
het RNA polymerase te binden op deze zeer ongebruikelijke promotor sequentie. Het product van cIII
is ook betrokken bij het bewerkstelligen van lysogenie. Zijn effect hierop is minder direct. CIII
verhinderd de afbraak van CII door cellulaire proteasen. De producten van de delayed early genen
werken samen om lysogenie te bewerkstelligen door PRE en PI te activeren.
3.3 Autoregulation of the cI gene during lysogeny
Zodra de λ repressor is aangemaakt, zal deze binden als een dimeer op de λ operators OR en OL. Dit
heeft een tweedelig effect: (1) de repressor inhibeert de verdere vroege transcriptie en zo dus de
lytische cyclus. Vooral het uitschakelen van cro is belangrijk, daar Cro zal optreden als inhibitor van
de repressor. (2) de repressor stimuleert zijn eigen synthese. Onderstaande figuur geeft weer hoe de
zelf activatie in zijn werk gaat. De sleutel hierin is dat OR en OL zijn verdeeld in 3 delen, die elk een
repressor kunnen binden. De OR site is meer interessant voor de repressor om op te binden, daar deze
de expressie reguleert van zowel cI als cro. De drie binding sites in OR worden OR1, OR2 en OR3
genoemd. Er is een verschil in affiniteit tussen de verschillende bindingssites. OR1 heeft een groter
affiniteit dan OR2 en OR3. De binding van repressor aan OR1 en OR2 is coöperatief, wat wil zeggen
datals er een repressor dimeer bind aan OR1 dit de binding van een repressor dimeer op OR2 zal
induceren. Er is geen coöperatieve werking tussen OR1 en OR3.
De repressor is een dimeer, dat is opgebouwd uit twee identieke subeenheden. Elke subeenheid heeft
twee domeinen, die elk een eigen taak hebben. Het aminoterminaal domein zorgt voor de binding van
het DNA, terwijl het carboxy terminaal domein zorgt voor de repressor-repressor interactie, die
12
dimeristatie en coöperatieve binding mogelijk maakt.
Zodra er repressor dimeren zijn gebonden op OR1 en OR2 , zal de repressor gebonden op OR2 (dicht inde
buurt van PRM) de binding van het polymerase beïnvloeden. Dit zal er toe lijden dat er op PREM geen
polymerase meer zal binden, maar op PRM. Dit lijdt er ook toe dat er geen CII en CIII met wordt
aangemaakt, en CI dus niet meer tegen proteasen zal beschermd worden. Dit is echter geen probleem,
daar lysogenie als is opgetreden en er slechts een lagere concentratie aan repressor nodig is om dit te
onderhouden. Er zal nog steeds een kleine hoeveelheid CI worden aangemaakt totdat OR3 door
repressor wordt bezet. De reden dat dit kan gebeuren is dat cI kan worden getranscripteerd vanaf PRM.
Van zodra de concentratie aan repressor hoog genoeg is, zal OR3 worden bezet. Hierna zal er een
dynamisch evenwicht worden ingezet, waarbij soms OR3 bezet zal zijn en er geen repressor meer
worden aangemaakt. Van zodra de concentratie daalt, zal er terug repressor worden aangemaakt totdat
OR3 terug bezet is.
Deze beïnvloeding is mogelijk doordat alle sequenties overlappen
CI doet ook dienst als activator voor transcriptie vanaf PRM.
13
Door binding op OR1 en OR2, kan er
enkel worden afgeschreven vanaf PRM
Bij hoge repressor Conc., bind repressor
op OR3 => geen verdere synthese
De λ repressor schakelt alle early genen uit door de vorming van een repressor octameer, waardoor
OL1 en OL2 en OR1 en OR2 met elkaar verbonden worden door middel van de vorming van een lus.
Door deze lus kan er een andere tetrameer binden op OR3 en OL3. Dit resulteert in de repressie van PRM.
Gedurende de lysogene cyclus zal er enkel λ tot expressie komen en kan er geen extra (lytische)
infectie met een nieuwe faag λ optreden (de nieuwe faag zal na het binnenkomen onmiddellijk
repressor gebonden krijgen, en dus niet kunnen integreren in het genoom of de lytische cyclus
doorlopen).
14
3.4 Determing the fate of a λ infection: lysis or lysogeny
Wat bepaald dat een λ infectie lytisch of lysogeen verloopt. De balans tussen beide cyclussen is zeer
fragiel, waardoor het meestal onmogelijk is om te voorspellen welke weg er gekozen zal worden.
Ondersteuning voor deze bewering komt van een studie waarbij het uitzicht van E.coli cellen werd
bekeken na de infectie door λ. Als er nieuwe faagpartikels worden aangebracht op een petriplaat die
volledig begroeid is met E.coli cellen, dan zullen zij de bacteriën infecteren. Als er een lytische cyclus
optreed, dan zullen de gerepliceerde fagen zich verspreiden en de naburige cellen infecteren. Na een
paar uren, zullen er zones op de plaat ontstaan met verminderde bacteriële groei. Deze worden plaques
genoemd. Als de infectie 100% lytisch is, dan zouden deze zones helder, omdat alle gastheercellen
afgestorven zouden zijn. Dit is echter niet het geval, de plaques zijn troebel, wat de aanwezigheid van
lysogenen impliceert. Dit betekent dat zelfs in een zeer lokale zone zoals een plaque er sommige
cellen worden gelyseerd en andere lysogenen worden.
Laat ons even volgende vraag stellen: waarom worden de lysogenen niet geïnfecteerd door een andere
λ faag en zo in de lytische cyclus gebracht. Het antwoord hierop is, dat als een nieuwe faag de
lysogeen binnendringt, er voldoende repressor in de cel aanwezig is om te binden op het nieuwe faag
DNA en zo de expressie ervan te voorkomen. Daardoor kunnen we zeggen dat de lysogeen immuun is
voor superinfectie door een faag met dezelfde controle regio of immuniteitsregio.
Nu terug naar het eigenlijke probleem. We hebben gezien dat sommige cellen in de lytische cyclus
terecht komen en dat sommige in de lysogene terecht komen. De cellen binnenin een plaque zijn alle
genetisch identiek, net zoals de fagen; dus de keuze heeft geen genetische oorzaak. Het lijkt
daarentegen een race tussen cI en cro. De race wordt in elke geïnfecteerde cel opnieuw doorlopen, en
de winnaar bepaald de pathway van de geïnfecteerde cel. Als cI de winnaar is, dan zal er lysogenie
optreden, als cro wint dan treed er de lytische cyclus op.
Er zijn argumenten voor deze hypothese: als cI erin slaagt om zich te laten transcripteren, dan zal dit
er toe lijden dat er repressor wordt aangemaakt. Als er voldoende van wordt aangemaakt, dan zal deze
binden op OR en OL en zo de verdere transcriptie van de vroege genen verhinderen, en zo de
transcriptie van de late genen, die zouden zorgen voor replicatie en lysis. Aan de andere kant als er
voldoende Cro is aangemaakt, zal dit proteïne de transcriptie van cI verhinderen. Dit proces lijkt op
een schakelaar.
15
De sleutel in de mogelijkheid van Cro om cI te blokkeren ligt in het feit dat het affiniteit vertoont voor
de λ-operators. Cro bind op zowel OR en OL. De affiniteit voor de drie delen van de operatoren is juist
het tegenovergesteld van die van CI. In plaats van 1,2 en dan drie te binden, bind CI eerst drie,
gevolgd dor 2 en dan door 1. Zodra Cro bind op OR3 zal de transcriptie vanaf PRM stoppen, daar deze
overlappend is met OR3. In andere woorden, Cro treedt op als repressor voor cI. Als de concentratie
aan Cro zich verder opbouwt, dan zullen alle operatoren worden gebonden, en zo zal de transcriptie
van vroege genen vanaf PR en PL worden verhinderd. Dit resulteert erin dat CII en CIII niet meer
worden aangemaakt. Zonder deze proteïnen kan PRE niet functioneren en zal er geen CI worden
aangemaakt. Het uitschakelen van de vroege genen is vereist voor de lytische cyclus. Indien deze te
lang tot expressie komen zullen zij de lytisch cyclus vroegtijdig afbreken.
Maar wat bepaald nu of cI of cro de race wint. Dit gebeurd zeker niet ad random. De belangrijkste
factor lijkt de concentratie van het cII product. Hoe hoger de concentratie aan CII is in de cel, hoe
waarschijnlijker het zal zijn dat de cel de lysogene cyclus zal doorlopen.
Het eerste wat CII doet is het activeren van PRE, en zo het de lytische cyclus tegenwerken doordat er
antisense RNA wordt gemaakt voor het mRNA van cro. Wat reguleert de concentratie van CII. We
hebben al gezien dat CIII CII beschermt tegen protease. Als er echter een zeer hoge concentratie aan
proteasen in de cel aanwezig is, dan kan dit het effect van CIII teniet doen. Zulke hoge concentraties
aan proteasen komen voor als de omgevingsomstandigheden goed zijn (zoals bijvoorbeeld in een zink
medium). Als de cel zich in stress situaties bevind (zoals tekorten aan voedingsstoffen), dan zal de
concentratie aan proteasen laag zijn. Dus uithongering van de cel lijkt de lysogene cyclus te
bevoordelen.
Uit recente studies blijkt echter dat cellen die lyseren groter zijn dan lysogene cellen, zodat de keuze
voor welke cyclus er gevolgd wordt minder willekeurig lijkt. De reden waarom groter cellen eerder de
lytische cyclus doorlopen is nog niet geweten. Mogelijkheden zijn celdeling; lokale
omgevingsfactoren, …
16
3.5 Lysogen induction
Eerder werd al vermeld dat een lysogeen kan geïnduceerd worden door behandeling met mutagene
chemicaliën en straling. Het achterliggende mechanisme is het volgende: E.coli reageert op
omgevingsomstandigheden die lijden tot DNA schade door een set genen te activeren waarvan de
collectieve activiteit SOS response wordt genoemd. Eén van deze genen (het meest belangrijke) is
recA. Het product van dit gen (RecA) zorgt voor recombinatie herstel bij beschadigd DNA, wat
gedeeltelijk zijn nut verklaard bij de SOS response. Omgevingomstandigheden activeren een tweede
activiteit in RecA. Het wordt dan een coprotease dat een latente protease activiteit in de λ repressor
stimuleert. Dit protease knipt de repressor twee zodat het loskomt van de operators. Zodra dit gebeurd
zal er transcriptie vanaf PR en PL starten. Eén van de eerste genen die wordt afgeschreven is cro, wat er
toe lijdt dat de aanmaak van repressor wordt geïnhibeerd. De lysogene cyclus is afgebroken en de
lytische cyclus zal starten. Λ zou geen repressor hebben ontwikkeld die zichzelf zou laten vernietigen
door RecA als het hem geen voordeel zou opleveren. Als er potentiële DNA schade kan optreden, dan
gaat de faag liever over naar de lytische cyclus om zo aan het gevaar te kunnen ontsnappen.
17