Samenvatting PhD thesis Annelien Everaert Bacteriële infecties zijn
advertisement
Samenvatting PhD thesis Annelien Everaert Bacteriële infecties zijn één van de grootste oorzaken van ziekte en sterfte, en respiratoire infecties behoren momenteel tot de top 10 van belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd. Het Burkholderia cepacia complex of Bcc is een complex van 20 nauw gerelateerde opportunistische Gram-negatieve bacteriën. Bcc species zijn belangrijke humane pathogenen in patiënten met mucoviscidose (CF), waarvan Burkholderia cenocepacia en Burkholderia multivorans de Bcc species zijn die meest frequent geïsoleerd worden uit CF longen. Chronische Bcc infecties kunnen een snelle achteruitgang in longfunctie veroorzaken, eventueel met sterfte als gevolg, en behandelingsopties zijn beperkt omwille van hun intrinsieke resistentie tegen verschillende beschikbare antibiotica. Het voornaamste doel van mijn werk was het evalueren van twee nieuwe strategieën om Bcc infecties aan te pakken, waaronder de ‘nonmevalonaat pathway’ voor biosynthese van isoprenoïden en combinatiebehandeling met βlactam antibiotica en β-lactamase inhibitoren. De ‘nonmevalonaat pathway’ is een potentieel target voor de ontwikkeling van nieuwe antibiotica tegen multidrug-resistente bacteriën. Fosmidomycine en FR900098 zijn actieve inhibitoren van DXR, het tweede enzym in de ‘nonmevalonaat pathway’, van verschillende bacteriën maar hebben slechts beperkte activiteit op volledige bacteriële cellen. Bijgevolg hebben reeds verschillende onderzoekers pogingen ondernomen om opname in de cel te verhogen via de aanmaak van fosmidomycine analogen met gemodificeerde fysicochemische eigenschappen. Het eerste doel was de bepaling van in vitro antibacteriële activiteit van fosmidomycine, FR900098 en nieuwe analogen tegen bepaalde bacteriële pathogenen, en de identificatie van resistentie mechanismen tegen deze inhibitoren. MIC experimenten toonden aan dat de in vitro antibacteriële activiteit van de meeste inhibitoren laag is, met MIC-waarden > 250 µM. Enkel ritanserine, een inhibitor van het vijfde enzym IspF, was in staat om planktonische en sessiele groei te inhiberen van twee P. acnes stammen, drie Mycobacterium stammen en verschillende Bcc stammen. Bovendien suggereren onze data dat resistentie slechts in beperkte mate wordt veroorzaakt door de activiteit van efflux pompen. Literatuur beschrijft dat de voornaamste oorzaak beperkte cellulaire opname is door een lage membraanpermeabiliteit, doch konden wij deze hypothese niet aantonen in deze studie. Ten tweede trachtten we om de essentialiteit te bepalen van dxr en ispD, het tweede en derde enzym van de ‘nonmevalonaat pathway’, in B. cenocepacia via het aanmaken van conditionele ‘knock-down’ mutanten. Derhalve gebruikten we plasmide pSC200 dat een rhamnose-induceerbare promotor integreert in het chromosomaal DNA en zo de expressie van een bepaald gen beheerst. We slaagden erin om een rhamnose-induceerbare conditionele dxr mutant van B. cenocepacia K56-2 aan te maken, maar bovenstaande techniek bleek niet geschikt voor de aanmaak van een ispD mutant. Onze experimenten toonden aan dat expressie van dxr belangrijk is voor planktonische en biofilm groei van Samenvatting PhD thesis Annelien Everaert B. cenocepacia K56-2, maar niet essentieel. Bovendien nam in vitro antibacteriële activiteit van ceftazidime en aztreonam toe met een factor 16 en 8, respectievelijk, wanneer dxr was uitgeschakeld. Overigens toonden onze data van een C. elegans in vivo infectiemodel aan dat voldoende hoge expressieniveaus van dxr nodig zijn voor optimale virulentie van B. cenocepacia K56-2. Tenslotte lijkt dxr ook belangrijk te zijn voor de metabolisatie van bepaalde koolstofbronnen in B. cenocepacia K562, waaronder D-galactonaat dat noodzakelijk is voor de biosynthese van D-glyceraldehyde-3-fosfaat (startproduct van de ‘nonmevalonaat pathway’). Samenvattend kunnen we stellen dat DXR een belangrijke rol speelt in verschillende fysiologische processen in B. cenocepacia waardoor dit een interessant target is voor de ontwikkeling van antibacteriële therapie tegen B. cenocepacia. Bcc species zijn intrinsiek resistant aan allerhande β-lactam antibiotica en deze resistentie wordt vooral veroorzaakt door efflux pompen, wijzigingen in pencilline-bindende eiwitten of de productie van βlactamase enzymen. In het derde hoofdstuk wouden we daarom onderzoeken of β-lactamase inhibitoren (clavulaanzuur, sulbactam, tazobactam en avibactam) in staat zijn om de in vitro antibacteriële activiteit van β-lactam antibiotica tegen Bcc species te herstellen. Clavulaanzuur bleek geen effect te hebben op de in vitro activiteit, maar toevoeging van sulbactam, tazobactam of avibactam aan ceftazidime, amoxicilline, cefoxitine, cefepime of aztreonam gaf aanleiding tot een minstens viervoudige daling in MIC-waarden tegen sommige Bcc stammen. Vervolgens observeerden we ook dat het effect van β-lactamase inhibitoren op β-lactamase activiteit zowel stam- als antibioticum afhankelijk is, wat suggereert dat resistentie tegen β-lactam antibiotica veroorzaakt wordt door zowel β-lactamases als door niet-β-lactamase-gerelateerde resistentiemechanismen. Dit werk toont dus aan dat de ‘nonmevalonaat pathway’ een mogelijk target is voor ontwikkeling van nieuwe antibiotica tegen infecties met B. cenocepacia, als de permeabiliteitsproblemen van mogelijke inhibitoren kunnen worden aangepakt. Daarenboven kan ook de combinatie van β-lactam antibiotica met β-lactamase inhibitoren een nieuwe methode bieden voor therapie tegen Bcc bacteriën, waarbij het belangrijk is om elke klinische situatie individueel te beoordelen.
