University of Groningen Polyamide synthesis by hydrolases Schwab

University of Groningen
Polyamide synthesis by hydrolases
Schwab, Leendert Willem
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to
cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
2010
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Schwab, L. W. (2010). Polyamide synthesis by hydrolases Groningen: s.n.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the
author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately
and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the
number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Download date: 18-07-2017
Samenvatting Enzymen zijn katalysatoren die in de natuur reacties versnellen onder milde reactieomstandigheden (waterige omgeving en lage temperaturen) met een hoge regio‐ chemo‐ en enantioselectiviteit. Deze combinatie van eigenschappen maakt enzymen interessante katalysatoren voor toepassing in organische synthese reacties. Niet alleen worden enzymen toegepast om conventionele katalysatoren te vervangen maar ook zijn nieuwe omzettingen mogelijk geworden. Vanwege milieuproblematiek is er een toenemende vraag naar processen die de druk op het milieu verlagen. Het gebruik van enzymen als alternatief voor conventionele katalysatoren is één van de vele ontwikkelingen die hier een bijdrage aan kan leveren door een verlaging van het energiegebruik en een reductie van het aantal reactiestappen. Om de enzymen succesvol te kunnen gebruiken in oplosmiddelen anders dan water worden enzymen gestabiliseerd door ze op een oppervlak te hechten. Met stabiele enzympreparaten zijn al vele soorten polymeren gesynthetiseerd. Er is echter weinig bekend over de synthese van polyamiden met deze katalysatoren. Het onderzoek in dit proefschrift is gericht geweest op het evalueren van twee enzymen in een aantal reacties om polyamides te synthetiseren. Uitgangspunt zijn twee hydrolases waarvan bekend is dat ze amide bindingen kunnen vormen. Candida antarctica lipase B (Cal‐B) in hoofdstukken 2 en 3 en Carica papaya protease papaine in de hoofdstukken 4 en 5. Hoofdstuk 2. In dit hoofdstuk wordt de ring opening polymerisatie van β‐
propiolactam met behulp van Candida antarctica lipase B geïntroduceerd. Het ontstane poly‐β‐alanine is gekarakteriseerd met 1H‐NMR spectroscopie en MALDI‐
ToF massa spectrometrie. Het drogen van het enzym vereist optimalisatie. Als te weinig water wordt verwijdert denatureert het enzym en na teveel drogen deactiveert het enzym doordat kristalwater verwijderd wordt dat nodig is voor een actieve conformatie. De reactieomstandigheden die tot de hoogste opbrengst leiden met het hoogste gemiddelde Dp zijn een polymerisatie in tolueen bij 55 °C voor een periode van 96 uur. De optimale droogcondities voor het enzym zijn 24 uur drogen bij ongeveer 50 °C boven P2O5 en gereduceerde druk. Het is aanlokkelijk te denken dat de polymerisatie van β‐propiolactam via een soortgelijk reactie mechanisme verloopt als de polymerisatie van poly ε‐
caprolacton. Dit reactiemechanisme veronderstelt de vorming van een ‐ 117 – hydroxyzuur door hydrolyse van het lacton als tussenstap. In het geval van β‐
propiolactam komt dat neer op de vorming van het aminozuur β‐alanine. Met verscheidene experimenten wordt aangetoond dat het β‐propiolactam het enige monomeer is in de vorming van poly‐β‐alanine. De stof β‐alanine wordt niet door het enzym herkend als monomeer voor de polymerisatie. Dit maakt het hoogst onwaarschijnlijk dat deze stof gevormd in een tussenstap. Slechts door hydrolyse van het monomeer kan β‐alanine gevormd worden. Gebasseerd op het experimentele werk uit dit hoofdstuk is een reactiemechanisme ontwikkeld door Iris Baum werkzaam in de groep van Prof. dr. Fels aan de universiteit van Paderborn met welke we een nauwe samenwerking onderhouden. De belangrijkste noviteit t.o.v. het “lacton‐mechanisme” is het gebruik van een katalytisch water molecuul waarmee een geactiveerd lactam wordt gevormd. Hoofdstuk 3. Polyamides kunnen ook gevromd worden uit een condensatie reactie tussen diesters en diamines. Het enzym Cal‐B kan deze reactie katalyseren. De reactie tussen dimethyladipaat en diethylene triamine wordt gevolgd met IR‐
spectroscopie door te kijken naar de vorming van amide bindingen. De condensatiereactie blijkt ook te verlopen zonder enzym toe te voegen, daarom bestaat de gemeten amide vorming in aanwezigheid van het enzym uit een gekatalyseerd en een niet‐gekatalyseerd deel. De enzymatische bijdrage aan de polycondensatie is bepaald door de amide vorming te vergelijken met een reactie zonder toegevoegd enzym. Met name bij lage temperaturen (kamertemperatuur en 7 °C) levert het enzym een grote bijdrage aan de productie van het polyamide. Bij 60 °C is dit anders, hier blijkt dat de enzymatische bijdrage aan de amide vorming lager is dan de amide vorming door de niet gekatalyseerde reactie. De metingen zijn gedaan met twee diesters (dimethyladipaat en diethyladipaat) en vier verschillende diamines (1,4‐butanediamine, 4,9‐dioxa‐1,12‐dodecanediamine en diethylene triamine). Bij het gebruik van een diethyladipaat is de bijdrage van het enzym aan de polyamide vorming aanzienlijk groter dan bij het gebruik van dimethyladipaat. Dit kan verklaard worden met de grotere “leaving group ability” van het methanol molecuul. De niet gekatalyseerde reactie verloopt minder snel als de “leaving group” slechter is (ethanol i.p.v methanol). De enzymatische reactie wordt niet beïnvloed door de verandering van het diester. Bij het gebruik van verschillende diamines blijkt dat de bijdrage van het enzym het grootst is als butanediamine wordt gebruikt, gevolgd door 4,9‐dioxa‐1,12‐
dodecanediamine en diethylenetriamine. Hoofdstuk 4 Met papaine zijn verschillende copolymeren (2 tot 4 monomeren) gemaakt van tyrosine, fenylalanine, leucine en tryptofaan. ‐ 118 – Uit de MALDI‐ToF massa spectra wordt een gedetaileerd beeld verkregen van de samenstelling van de reactieproducten. Analyse van de spectra geeft een verdeling van de ketenlengte van de polymeren en voor elke ketenlengte een verdeling van de aminozuursamenstelling. Uit de hoeveelheid residuen van elk aminozuur in de gemiddelde keten wordt een reactiviteit afgeleid voor die aminozuren. De gemiddelde ketenlengte van de homopolymeren wijst op een reactiviteit van de aminozuren in de volgorde (Tyr > Leu > Phe > Trp). Wanneer copolymeren worden gemaakt met twee en drie aminozuuresters is deze volgorde Leu > Tyr > Phe > Trp. In het algemeen kan gesteld worden dat lange ketens veel leucine bevatten en weinig tryptofaan daarnaast is gevonden dat tyrosine iets reactiever is dan fenylalanine. Ketens die veel fenylalanine bevatten, zijn in het algemeen korter en dat wijst op een slechtere oplosbaarheid. Het is een aanbeveling dat naar de oorzaak van de geobserveerde reactiviteitsverschillen nader onderzoek wordt verricht. De meeste aandacht moet daarbij uitgaan naar de oplosbaarheid van monomeer en polymeer in het reactiemedium en de selectiviteit van het enzym in synthese reacties. Hoofdstuk 5 Papaine kan ook worden gebruikt om aminozuren te koppelen aan diamines die normaal gesproken niet in de omgeving van het enzym voorkomen. Hiervoor zijn beschermde aminozuuresters gebruikt in combinatie met lineaire en aromatische diamines. De esters van N‐carbobenzoxy beschermd glycine, ‐leucine en ‐phenylalanine zijn gebruikt in combinatie met 1,4‐butanediamine, 1,6‐hexanediamine en o‐,m‐,p‐
fenyldiamine en benzylamine. Monoamides worden gevormd tussen de aromatische diamines en de beschermde aminozuuresters. Alifatische diamines konden niet door papaine gekoppeld worden. Hoewel de selectiviteit van het enzym voor de verschillende amines kan verschillen is het niet duidelijk waar de preferentie voor aromatische amines vandaan komt. Voor toekomstig onderzoek wordt aanbevolen verder te zoeken naar oplosbare amines zodat polymeren gesynthetiseerd kunnen worden. Daarnaast kan onderzocht worden wat de selectiviteit voor aromatische amines bepaald in de active site van het enzym. ‐ 119 –