Lies Franssens 3de bach chemie- minor biochemie

Lies Franssens 3de bach chemie- minor biochemie
Lauran Reyniers 3de bach biochemie – minor verbreding
Verslag Synthese-oefening bio-informatica en modelling :
Vraag 1
Kinases zijn enzymen die de aanhechting van een fosfaatgroep van ATP aan het substraat
katalyseren. Het stabiliseren van de negatieve ladingen van de fosfaatgroepen gebeurt met
divalente metaalionen zoals Mn2+ of Mg2+.
Kinases omvatten een grote groep van enzymes die onderscheiden kunnen worden
naarlang de specifiteit voor het substraat. Voorbeelden van subgroepen binnen de kinases
zijn: proteïne kinases, polynucleotide kinases, creatine kinases,...
Deze enzymes spelen vaak een rol in signaaltransductiewegen. Hierbij kan een afwijking
in de kinase activiteit leiden tot verstoringen in de fosforyleringsbalans wat ziekte als
gevolg kan hebben. Hierdoor vormen de kinases een belangrijk doelwit bij het bestrijden
van ziektes.
Referenties :
-
Biochemistry door R. H. Garrett en C. M. Grisham, derde editie, 2005
http://igitur-archive.library.uu.nl/dissertations/2005-0316-013150/sam.pdf.
Vraag 2
In de onderstaande tabel en grafiek worden het aantal gepubliceerde kinasen per jaar
weergegeven.
67
1999
70
300
2000
77
250
2001
95
2002
101
2003
138
2004
141
50
2005
208
0
2006
241
Aantal publicaties
1998
200
150
100
1998 1999 2000
2001 2002 2003
2004 2005 2006
Jaartal
Figuur 1 : tabel en grafische voorstelling van het aantal kinase publicaties per jaar
Er is een duidelijke toename waar te nemen bij het vergelijken van het aantal publicaties
per jaar. Dit is in overeenstemming met het alsmaar belangrijker worden van kinases in het
onderzoek.
Vraag 3 :
A. ANP (Phosphoaminophosphonic Acid Adenylate Ester )
B. Er werd een zuurstofatoom van de fosfaatgroep bij ATP vervangen door een
stikstofatoom. Dit zorgt ervoor dat de hydrolyse die door het kinase wordt
gekatalyseerd veel trager opgaat (N is minder elektronegatief dan O). Hierdoor is
het mogelijk om kristalstructuren van het enzyme met het daaraan gecoördineerde
substraat te bekomen.
C. Mg 402 wordt gecoördineerd door :
1
2
3
Asp 186/OD1, afstand: 2,80 Å
Asp 186/OD2, afstand: 2,87 Å
ANP 501/O2B, afstand : 2,07 Å
Mg 401 wordt gecoördineerd door :
1.
2.
3.
4.
ANP 501/O1G, afstand 2,09 Å
ANP 501/O2A, afstand 2,21 Å
Asn 172/OD1, afstand 2,69 Å
Asp 186/OD2, afstand 2,61 Å
D. Qian, K.C., Wang, L., Hickey, E.R., Studts, J., Barringer, K., Peng,
C., Kronkaitis, A., Li, J., White, A., Mische, S., Farmer, B.
Vraag 4 :
In een eerste stap worden de 2 kinases automatisch gefit. Vervolgens wordt een manuele fit
van ATP en de inhibitor 4SP uitgevoerd. (zie figuur 2)
Figuur 2 : Fit van ATP en 4SP
ATP is in staat om via 2 N-atomen een waterstofbrug aan te gaan met het kinase. Deze zijn
met het O-atoom van Glu81 en met het N-atoom van Leu83. De bindingslengten zijn
respectievelijk 2,90 en 2,86. (zie figuur)
De inhibitor 4SP daarentegen is in staat om met 3 verschillende residu’s van het proteïne
H-bruggen te vormen.
Deze zijn :
- N2 van 4SP met O van Leu 83, bindingslengte 2,58 Å
- N9 van 4SP met O van Glu 81, bindingslengte 2,96 Å
- N26 van 4SP met O van Asp 86, bindingslengte 2,95 Å
- O24 van 4SP met N van Asp 86, bindingslengte 3,18 Å
Deze extra H-brug is mogelijk omdat 4SP in vergelijking met ATP een extra 6-ring bezit
met daaraan een amide-groep die met zijn N- en O-atoom nog 2 extra waterstofbruggen
kan vormen. Hierdoor is de binding aan het kinase sterker bij 4SP.
Onderstaande figuren geven de waterstofbruggen weer.
Figuur 4 : weergave van de H-bruggen tussen ATP en het kinase
Figuur 5: weergave van de H-bruggen van 4SP met het kinase
Naast waterstofbruggen zijn er tussen de inhibitor en het ezyme ook interacties tusssen
polaire en apolaire groepen. Het vergelijken van deze interacties tussen ATP en 4SP toont
eveneens aan dat de affiniteit van het kinase voor 4SP groter is. Onderstaande figuur geeft
een overzicht weer van alle interacties tussen 4SP en het kinase.
Figuur 6: Overzicht van alle interacties tussen 4SP en het kinase
Tenslotte werd in Pymol een figuur opgemaakt die een algemeen beeld geeft van de
affiniteit van een ligand voor een bepaald enzyme. Bij het vergelijken van de figuren van
ATP en 4SP is duidelijk te zien dat de affiniteit van 4SP groter is. De inhibitor past veel
beter in de actieve site en heeft meer gunstige interactiemogelijkheden.
Figuur 6 : Overzicht van interacties tussen links ATP en rechts 4SP en een kinase
Vraag 5 :
1.
2.
NH2
O
NH2
O
S
S
O
O
NH
NH
N
HN
N
N
N
N
HN
N
N
N
OH
NH2
NS(=O)(=O)c1ccc(cc1)Nc2cc(nc3ncnn23)NC4CCC(N)CC4
NS(=O)(=O)c1ccc(cc1)Nc2cc(nc3ncnn23)Nc4ccc(O)cc4
3.
O
HO
O
S
NH2
N
N
HN
N
N
N
NS(=O)(=O)c1ccc(cc1)N(c5ccc(O)cc5)c2cc(nc3ncnn23)NC4
CCC(N)CC4
NH2
Zoals te zien is in figuur 7, is de eerste structuur aanwezig in het kristal 2C6L.
Het inactieve molecule is het 2de. Dit kan worden verklaard door het feit dat het centrale
N-atoom drie bindingen heeft, waardoor dit in tegenstelling tot de 2 andere moleculen,
geen acceptor meer is voor een waterstofbrug. De bijkomstige ring (met een pijl
aangegeven) zorgt ervoor dat het molecule conformationeel niet meer zo goed past in het
proteïne.
Figuur 7 : Voorstelling van het kristal 2CL6 met ligand
De alingment van de SMILES notatie kan als volgt worden voorgesteld :
NS(=O)(=O)c1ccc(cc1)N---------------------c2cc(nc3ncnn23)NC4CCC(N)CC4
NS(=O)(=O)c1ccc(cc1)N(c5ccc(O)cc5)c2cc(nc3ncnn23)NC4CCC(N)CC4
NS(=O)(=O)c1ccc(cc1)N---------------------c2cc(nc3ncnn23)Nc4ccc(O)cc4
Vraag 6 :
In een eerste figuur warden het actieve en het inactieve kinase op elkaar gesuperponeerd.
De actieve vorm is voorgesteld in het groen, de inactieve in het rood.
Figuur 7 : Actieve (groen) en inactieve (rood) vorm van een kinase
Bij de overgang van inactieve vorm naar actieve vorm vindt er een conformatieverandering
plaats waarbij een loop, de activatieloop genoemd, wegklapt en op die manier het substraat
de actieve site kan benaderen.
Deze verandering kan worden geïnduceerd door de fosforylatie van een tyrosine residu in
de loop gelegen. (dit residu is blauw gekleurd in figuur 7)
Deze fosforylatie zorgt ervoor dat er nu meer repulsie is met de fenylalanine residus waar
het vooreerst hydrofobe interacties mee had.
Het scharnierpunt bestaat uit een geconserveerde sequentie Asp-Phe-Gly (donkerblauw
gekleurd en mt blauwe pijl aangeduid op figuur 7). Een mogelijke verklaring voor de
aanwezigheid van het glycine residu is dat dit aminozuur met als restgroep een H-atoom
het meest flexibele aminozuur is. Hierdoor zal dit residu weinig hinder ondervinden bij het
roteren.
Vraag 7:
In een eerste stap werd de sequentie van het humaan LRRK2 opgezocht.
Vervolgens kan in “SMART” opgezocht worden welke uit welke domeinen dit bestaat.
Figuur 8 : SMART analyse van LRRK2
Op figuur 8 zijn de verschillende domeinen weegegeven. De introns zijn als lineaire
stukken voorgesteld. De blauwe rechthoeken stellen transmembraan segmenten voor. Deze
zijn rijk aan leucine, vandaar de naam LLR = leucine rich repeats. De driehoeken acheraan
coiled coils en de paarse figuren stellen segmenten voor met een lage complexiteit.
Oefening 8 :
Onderstaande figuur is een weergave van het bekomen model voor het kinase met de
verschillende mutanten als spheres aangeduid.
Figuur 9 : Voorstelling van het model met de mutaties als spheres aangeduid
Uit het Ramachandran Plot kan worden afgeleid hoeveel aminozuren een verkeerde
conformatie hebben in het model. Bij dit model zijn er 14 residu’s die in de verboden
zone’s liggen.
Het aantal residu’s is redelijk groot waardoor er kan besloten worden dat het model
eventueel nog verder kan worden aangepast.
Deze residu’s zijn :
-
Asp 14
Asp 4
Gly 94
Gln 102
Gly 32
Val 44
Ser 30
Gly 160
Arg 134
Gly 232
Gly 175
Phe 18
Ala 151
Glu 43
Figuur 10 : Ramachandran plot van het model
Om een algemeen beeld te krijgen van het model, kunnen we het wild type kinase in Pymol
vergelijken met het bekomen model. (Hiervoor werd eerst een fit van beide proteïnes
uitgevoerd in spdbv.) Hieruit kan worden besloten dat de meeste secuandaire structuur
( α-helices en β-platen) zijn behouden. De loops die de verschillende secundaire stucturen
verbinden daarentegen, zijn wel af en toe verschillend. Deze zijn op onderstaande figuur in
het wit omcirkeld.
Figuur 11 : Fit van het wild type kinase en het bekomen model
De mutaties die in het model zijn uitgevoerd hebben wel degelijk een invloed op de
activatiecyclus van het kinase. Het komt namelijk voor dat er hydrofobe residu’s in de core
van het enzyme worden uitgewisseld voor polaire residu’s. Dit zorgt voor spanningen en
repulsie in het inwendige van het enzyme waardoor het een conformatieverandering
ondergaat en inactief wordt.