bij Daphnia magna
advertisement
Methodeontwikkeling voor de subcellulaire fractionatie van cadmium en de effecten van metaalstress op de reproductie en DNA-methylatie bij Daphnia magna I Voorwoord Een wetenschappelijke studie is nooit het werk van één persoon. Dit is het moment om alle personen te bedanken die het mogelijk hebben gemaakt deze thesis tot een goed einde te brengen. Eerst en vooral wil ik mijn stagebegeleider Michiel Vandegehuchte bedanken voor zijn professionele begeleiding, ondersteuning en voor het praktische werk rond de DNAmethylatie. Het was aangenaam samenwerken. Mijn promotor An Dermaux zou ik willen bedanken voor de feedback en het nalezen van het eindwerk. Dankzij Prof. Colin Janssen, die deze stage heeft aangeboden, en Kathelijne Velghe die de aanzet heeft gegeven tot deze stage heb ik kunnen werken aan dit boeiend onderzoek. I’m very grateful to Mbounou Souffo, who cultered Daphnia magna for his toxicity tests. I could always use his culture for my experiments. Thanks for culturing the Daphnia all those months! Zonder de hulp van Emmy, Leen, Gisèle, Marc, Jill en Guido bij “de kweek” en andere experimenten in het labo zou dit eindwerk nooit geworden zijn tot wat het nu is. Bedankt! Mijn dank gaat ook uit naar mijn ouders, die mij altijd gesteund hebben. Ze hebben dit werk nagelezen en wilden ook wel eens weten waar hun zoon ganse dagen aan zat te werken. De realisatie van dit eindwerk heb ik ook te danken aan hun steun en motivatie, die ze gedurende al de jaren van mijn studies hebben gegeven. Ten slotte gaat mijn dank uit naar vrienden, kennissen en klasgenoten voor hun steun tijdens mijn studies. II Copyright De auteur en de promotoren geven de toestemming deze thesis te raadplegen en te kopiëren enkel voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht en de verplichting expliciet de bron te vermelden bij het citeren van delen uit dit eindwerk. The author and the promoter give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to copyright laws, more specifically the source must be extensively given when using parts or results of this thesis. III Inhoud Voorwoord .....................................................................................II Inhoud.......................................................................................... IV Lijst van afkortingen ...................................................................... VI Lijst van tabellen en figuren .........................................................VIII 1 Literatuurstudie...................................................................... 1 1.1 Inleiding .....................................................................................................1 1.2 Metalen: cadmium en nikkel. ........................................................................3 1.2.1 Inleiding ..............................................................................................3 1.2.2 Classificatie ..........................................................................................3 1.3 Speciatie en biobeschikbaarheid van metalen .................................................5 1.3.1 Inleiding ..............................................................................................5 1.3.2 Speciatie en biobeschikbaarheid.............................................................5 1.4 Het modelorganisme: Daphnia magna ...........................................................8 1.4.1 Inleiding ..............................................................................................8 1.4.2 Beschrijving .........................................................................................9 1.4.3 Voorkomen en ecologie ....................................................................... 10 1.4.4 Anatomie en fysiologie ........................................................................ 10 1.4.5 Voortplanting en levenscyclus .............................................................. 12 1.4.6 Modelorganisme ................................................................................. 15 1.5 Acclimatisatie en adaptatie ......................................................................... 17 1.5.1 Inleiding ............................................................................................ 17 1.5.2 Verwerving van tolerantie.................................................................... 17 1.6 Toxiciteit en essentialiteit van metalen......................................................... 22 1.6.1 Inleiding ............................................................................................ 22 1.6.2 Essentiële metalen..............................................................................22 1.6.3 Niet-essentiële metalen ....................................................................... 23 1.6.4 Cadmium en nikkel ............................................................................. 24 1.7 Opname en excretie van metalen ................................................................ 25 1.7.1 Inleiding ............................................................................................ 25 1.7.2 Transport van metalen ........................................................................ 26 1.7.3 Opname van metalen.......................................................................... 28 1.7.4 Excretie van metalen........................................................................... 29 1.8 Subcellulaire verdeling van metalen............................................................ 31 1.8.1 Inleiding ............................................................................................ 31 1.8.2 Liganden............................................................................................ 34 1.8.3 Metallothioneïne ................................................................................. 34 1.8.4 Antioxidant enzymen........................................................................... 41 1.8.5 Andere metaalbindende proteïnen........................................................ 42 1.8.6 Organellen en granulen ....................................................................... 43 1.9 De invloed van stress op het epigenoom...................................................... 47 1.9.1 Inleiding: de epigenetica ..................................................................... 47 1.9.2 Structuur van DNA en chromosomen.................................................... 51 1.9.3 Genoom versus epigenoom ................................................................. 53 1.9.4 DNA-methylatie ..................................................................................58 IV 2 Materiaal en methoden..........................................................76 2.1 Reproductietest ......................................................................................... 76 2.1.1 Materiaal............................................................................................ 76 2.1.2 Opstellen van de watervlocultuur ......................................................... 76 2.1.3 Staalname voor fysico-chemische analyse ............................................. 79 2.1.4 De reproductietest ..............................................................................79 2.2 Bepaling interne cadmiumconcentratie bij Daphnia magna ............................ 83 2.2.1 Schema en materiaal .......................................................................... 83 2.2.2 Bepaling van totale cadmiumbelasting .................................................. 85 2.2.3 Subcellulaire verdeling van cadmium .................................................... 88 2.3 Bepaling DNA-methylatie dmv AIMS-protocol ............................................... 93 2.3.1 AIMS-techniek .................................................................................... 93 2.3.2 Materiaal............................................................................................ 94 2.3.3 Methode ............................................................................................ 96 3 Resultaten en bespreking ....................................................102 3.1 Reproductie............................................................................................. 102 3.1.1 Inleiding .......................................................................................... 102 3.1.2 Fysico-chemische analyse.................................................................. 102 3.1.3 Bespreking resultaten reproductietest................................................. 103 3.1.4 Statistische analyse reproductietest.................................................... 106 3.1.5 Besluit ............................................................................................. 113 3.2 Verdeling van cadmium in de subcellulaire fracties en totale metaalbelasting 115 3.2.1 Inleiding .......................................................................................... 115 3.2.2 Bespreking ....................................................................................... 115 3.2.3 Besluit ............................................................................................. 116 3.3 DNA-methylatie bij Daphnia magna ........................................................... 117 3.3.1 Inleiding .......................................................................................... 117 3.3.2 Schema ........................................................................................... 118 3.3.3 Effecten van metaalstress op DNA-methylatie ..................................... 118 3.3.4 Besluit ............................................................................................. 119 4 Besluit ................................................................................120 5 Referentielijst ....................................................................... XI 6 Bijlagen .................................................................................. I Bijlage 1: Tabel werkelijke metaalconcentraties in opstelling aquaria........................... I Bijlage 2: Tabellen met reproductiegegevens ..........................................................III P-generatie.......................................................................................................III F1-generatie.................................................................................................... VII Bijlage 3: Tabellen met gemeten cadmiumconcentraties ........................................ XIV Bijlage 4: Modellen voor de verdeling van metalen en inductie van MT......................XX Bijlage 5: Subcellulaire fractionatie...................................................................... XXII Bijlage 6: Methionine ‘pathway’ ................................................................... XXIII V Lijst van afkortingen AAS: Atomaire Absorptie Spectrum AIMS: Amplification of Intermethylated Sites ATP: Adenosinetrifosfaat BDM: Biological Detoxified Metal BLM: Biotic Ligand Model Bp: Basepaar CAT: Catalase CpG: C: cytosine, p: fosfaat, G: guanine CTCF: CCCTC-binding factor DNA: Desoxyribonucleïnezuur DNMT: DNA-methyltransferasen, enzym dat methylgroepen op DNA (cytosine) plaatst dNTP: Deoxyribonucleotide Triphosphate DOC: Dissolved Organic Carbon EC10: Effect concentratie 10% EC50: Effect concentratie 50% EDTA: Ethyleendiaminetetra-acetaat EINECS: European Inventory of Existing Commercial Chemical Substances F: Generaties na de P-generatie. GC-gehalte: Het gehalte guanine+cytosine dat een DNA sequentie bezit GFAAS: Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry GR: Glutathion Reductase GSH: Glutathion GST: Glutathion-S-transferase H: Histon HAT: Histonacetyltransferasen, enzym dat acetylgroepen op histonen kan plaatsen HDAC: Histondeacetylasen, enzym dat histonen kan deacetyleren HDP: Heat Denatured Proteins HMT: Histonmethyltransferase HMW: High Molecular Weight HSP: Heat Stable Proteins ICP: Inductive Coupled Plasma VI IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry K: Lysine LC50: Letale Concentratie 50% LMW: Low Molecular Weight LPO: Lipide Peroxidase MBD: Methylbindingsdomein MBP: Methylbindingsproteïne MeCP: Methyl-CpG bindende proteïne MS: Massaspectrometrie MTLP: Metallothionein-like proteïn MRE: Metal-regulatory elements MRG: Metal-rich granule MRF: Metal-regulatory factors MSF: Metal Sensitive Fractions MT: Metallothioneïne MTF: Metal-responsive transcription factor NOEC: No Observable Effect Concentration OCEE: Optimal Concentration range for Essential Elements OD: Optische Densiteit OECD: Organisation for Economic Cooperation and Development PCR: Polymerase Chain Reaction P-generatie: Oudergeneratie, moederdieren waarmee een test wordt opgestart Pg: Picogram RNA: Ribonucleïnezuur SAH: S-adenosyl homocysteine SAM: S-adenosyl methionine SmaI: Restrictie-enzyme afkomstig van Serratia marcescens SOD: Superoxide Dismutase Sp 1: Transcription factor specificity protein 1 TAM: Trophically Available Metals Taq: Hittestabiele enzyme geïsoleerd uit de thermofiele bacterie Thermophilus aquaticus. TBARS: Thiobarbituric Acid Reactive Substances TOC: Total Organic Carbon XmaI: restrictie-enzyme afkomstig van Xanthomonas malvacearum VII Lijst van tabellen en figuren Figuur 1.1: speciatie van metalen in aquatische systemen (Millero, 2001; Mungkung et al, 2001, Soto et al., 2003).......................................................................................6 Figuur 1.2: classificatie van Daphnia magna in het Dierenrijk: Daphnia (Ctenodaphnia) magna Straus 1820, Daphnia O. F. Müller 1785 [genus], Ctenodaphnia Dybowski & Grochowski 1895 [subgenus] (Fauna Europaea, 2000a). .......................................8 Figuur 1.3: morfologie en anatomie van Daphnia magna (Barnes, 1980; NOAA, 2004).....9 Figuur 1.4: de rusteieren of ephippia. a) 2 eieren in diapauze b) resten van de broedkamer (Falco & Moreno, n.d.) ................................................................... 13 Figuur 1.5: de voortplantingscycli van Daphnia magna: de seksuele en de aseksuele voortplanting (Daphnia Genomics Consortium, 2005b) ......................................... 14 Figuur 1.6: samenvattend schema met de verantwoordelijke groepen van stressoren, typen stress en hun effecten op de cellulaire functies........................................... 20 Figuur 1.7: schematische voorstelling van de fysiologische en genetische effecten van metaalstress (Korsloot et al, 2004). .................................................................... 21 Figuur 1.8: de dosis-respons curve van de essentiële en niet-essentiële metalen (Soto et al., 2003). ........................................................................................................ 23 Figuur 1.9: oorzaken van de verschuiving en verschillen in OCEE (Vangheluwe et al., 2003)............................................................................................................... 23 Figuur 1.10: de verschillende transportwegen waarlangs bivalente metaalionen de cel kunnen binnenkomen (Soto et al., 2003). ........................................................... 27 Figuur 1.11: de opname en excretie van stoffen in/uit het lichaam van organismen vertoont dikwijls bovenstaand universeel patroon. ............................................... 29 Figuur 1.12: hypothetische relatie tussen chronische metaalblootstelling en subcellulaire metaalverdeling: (A) initiële bescherming van metaalgevoelige compartimenten tot een drempelwaarde, (B) lineaire accumulatie in de metaalgevoelige compartimenten, zonder drempelwaarde (Harrison et al, 2006)...................................................... 32 Figuur 1.13: een ecotoxicologisch taartdiagram toont de verdeling van de subcellulaire compartimenten gebaseerd op de biologische significantie van de subcellulaire fracties............................................................................................................. 33 Figuur 1.14: metaalclusters in MT : vier en drie atomen van cadmium (Cd) zijn respectievelijk gecoordineerd in een α- en β- cluster van MT (Klaassen et al., 1999). ....................................................................................................................... 37 Figuur 1.15: de verschillende routes van de intracellulaire verspreiding van metalen en de relatie met de inductie van MT. .......................................................................... 39 VIII Figuur 1.16: een model van het netwerk van moleculen in een CaMgP2O7 granule (Simkiss & Taylor, 1994) ................................................................................................ 44 Figuur 1.17: schematische voorstelling van de invloed van het milieu op het genoom (Akhtar, & Cavalli, 2005). .................................................................................. 47 Figuur 1.18: een moleculaire voorstelling van de structuur van een nucleosoom............ 50 Figuur 1.19: de structuur van DNA: basen: adenine, thymine, cytosine en guanine. Verder nog het deoxyribose en de fosfaatgroep die de ruggengraat van het DNA vormen (Ball, 2006). ..................................................................................................... 51 Figuur 1.20: de verschillende niveau’s van DNA-condensatie (Sperling, 2005). .............. 52 Figuur 1.21: puntmutatie van cytosine en gemethyleerd cytosine (Sperling, 2005)......... 57 Figuur 1.22: de drie verschillende gemethyleerde basen die tot op heden zijn ontdekt. .. 58 Figuur 1.23: de reactiestappen voor C5-cytosine methyltransferase gebaseerd op een mechanisme voor thymidylaat synthase en tRNA-(uracil-5) methyltransferase........ 59 Figuur 1.24: biochemische reacties bij methylatie van DNA.......................................... 60 Figuur 1.25: het DNA-methylatieproces: ‘de novo’ methylatie, ‘maintenance’ methylatie en demethylatie (Sperling, 2005) ............................................................................ 61 Figuur 1.26: processen die het DNA-methylatiepatroon veranderen of behouden........... 62 Figuur 1.27: schematische voorstelling van de interacties tussen proteïnen, die verantwoordelijk zijn voor het behoud van de sterke condensatie van het chromatine (heterochromatine) in de meeste eukaryoten (Frigola, 2005). ............................... 63 Figuur 1.28: de verspreiding van de belangrijkste cytosine methyltransferase families in eukaryoten. De kleurschaal onderaan de figuur heeft aan welke methyltransferasen (families) voorkomen in het proteoom van de organismen (Goll & Bestor, 2005). ... 64 Figuur 1.29: het mechanisme van de onderdrukking van de transcriptie door DNAmethylatie. ....................................................................................................... 66 Figuur 1.30: DNA-methylatie en histonenmethylatie bij vertebraten werken samen in de onderdrukking van expressie van genen. ............................................................ 67 Figuur 1.31: modellen voor het effect van DNA-methylatie op genexpressie. Ongemethyleerd DNA worden voorgesteld door halve cirkels en gemethyleerd DNA als volle zwarte cirkels (Easwaran, 2003). ........................................................... 68 Figuur 1.32: DNA-methylatie bij invertebraten (insecten)............................................. 72 IX Figuur 2.1: opstelling van kweekaquaria .................................................................... 77 Figuur 2.2: opstelling van een reproductietest ............................................................ 80 Figuur 2.3: schematische voorstelling van de reproductietest ....................................... 82 Figuur 2.4: schema van de praktische uitvoering van de bepaling van het metaalgehalte in het volledige organisme en in de verschillende subcellulaire fracties. ..................... 83 Figuur 2.5: schematische voorstelling van de verschillende fracties. ............................ 91 Figuur 2.6: schematisch voorstelling van de AIMS techniek met van links naar rechts 1, 2 en 3 extra nucleotiden (bovenop de sequentie van de adaptoren) (Frigola et al., 2002)............................................................................................................... 94 Figuur 3.1: de werkelijke metaalconcentraties in het M4-medium bij de opgestelde reproductietest. .............................................................................................. 103 Figuur 3.2: de reproductie van de P-generatie over 16 dagen, inclusief sterfte. ........... 104 Figuur 3.3: de reproductie van de P-generatie over 16 dagen, exclusief sterfte. .......... 104 Figuur 3.4: de reproductie van de F1-generatie over 4 dagen, inclusief sterfte. ........... 105 Figuur 3.5: de reproductie van de F1-generatie over 4 dagen, exclusief sterfte............ 106 Figuur 3.6: box plots van de reproductie in blanco en 180 µg/l Cd, inclusief sterfte (links) en exclusief sterfte (rechts). ............................................................................ 107 Figuur 3.7: box plots van de reproductie in blanco en 250 µg/l Cd, inclusief sterfte (links) en exclusief sterfte (rechts). ............................................................................ 107 Figuur 3.8: box plots van de reproductie in blanco en 372 µg/l Ni, inclusief sterfte (links) en exclusief sterfte (rechts). ............................................................................ 108 Figuur 3.9: box plots van de reproductie van D. magna in blanco en 180 µg/l Cd, inclusief sterfte (links) en exclusief sterfte (rechts). ........................................................ 109 Figuur 3.10: box plots van de reproductie van D. magna in blanco en 250 µg/l Cd, inclusief sterfte (links) en exclusief sterfte (rechts). ........................................... 110 Figuur 3.11: box plots van de reproductie van D. magna in blanco en 372 µg/l Ni, inclusief sterfte (links) en exclusief sterfte (rechts). ........................................................ 110 Figuur 3.12: box plot van de reproductie in blanco en 372 µg/l Ni, inclusief sterfte (links) en exclusief sterfte (rechts). ............................................................................ 111 Figuur 3.13: box plot van de reproductie in blanco en 372 µg/l Ni, inclusief sterfte (links) en exclusief sterfte (rechts). ............................................................................ 111 X Figuur 3.14: box plot van de reproductie in blanco en 372 µg/l Ni, inclusief sterfte (links) en exclusief sterfte (rechts). ............................................................................ 112 Figuur 3.15: schematische voorstelling van de verschillende generaties van Daphnia magna waarbij de DNA-methylatie zou onderzocht worden................................. 118 Figuur 3.16: gel met in de tweede laan de contaminatieband..................................... 119 Tabel 1.1: basale concentraties van MT’s in Daphnia magna uit ongecontamineerde biotopen (Amiard et al., 2006). .......................................................................... 36 Tabel 1.2: schematische voorstelling van de verschillende functies van methylatie beschreven bij invertebraten en vertebraten........................................................ 74 Tabel 2.1: samenstelling van het M4 medium. De samenstelling van het standaardmedium M7 is ook in de tabel terug te vinden. ................................................................. 78 Tabel 3.1: pH, O2-gehalte, hardheid en temperatuur van de media in de opgestelde aquaria .......................................................................................................... 102 Tabel 3.2: berekende p-waarden uit de t-test voor twee onafhankelijke steekproeven. 108 Tabel 3.3: berekende p-waarden met een t-test van de reproductiegegevens van de F1generatie (blanco en verschillende metaalconcentraties) .................................... 112 Tabel 3.4: berekende p-waarden met een t-test van de reproductiegegevens van de F1generatie (blanco’s F1-generatie). .................................................................... 113 XI 1 Literatuurstudie 1.1 Inleiding De Europese inventaris van chemische handelsstoffen (EINECS) bevat ruim 100 000 stoffen en dit aantal neemt elk jaar toe. Vele van deze stoffen komen terecht in het milieu, waardoor er een risico ontstaat voor het evenwicht van ecosystemen, het milieu en de volksgezondheid. Een groep stoffen die in verhoogde concentraties in het milieu terechtkomen zijn de metalen. Metalen vormen een zeer diverse familie, die moeilijk te definiëren zijn en een sterk verschillende toxische werking vertonen. Verschillende metalen zijn natuurlijke sporenelementen in aquatische ecosystemen, maar de achtergrondniveaus in het milieu zijn toegenomen. Gebieden met een hoge densiteit aan industrie, landbouw en mijnen hebben te lijden onder een toenemende immissie van metalen. Metalen vinden hun weg naar aquatische ecosystemen door directe lozingen, atmosferische depositie en erosie door regenwater, waardoor de aquatische organismen aan verhoogde concentraties worden blootgesteld. De implicaties naar de biodiversiteit en genetische verscheidenheid in populaties is groot. Veel aquatische en mariene organismen worden gebruikt voor menselijke doeleinden. De metalen komen zo ook in onze voedselketen terecht. Het opstellen van milieukwaliteitsnormen gebaseerd op fundamenteel onderzoek is dus een noodzaak. Een fundamentele wetenschappelijke basis voor normen vereist de kennis van de impact van tolerantiemechanismen op ecotoxicologische proeven. Het belangrijkste doel van deze studie is dan ook om een beter inzicht te verkrijgen in de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de detoxificatie van metalen en het verwerven van tolerantie. Tolerantie wordt verworven door adaptatie of acclimatisatie, waarbij genen en genproducten, zoals eiwitten een zeer belangrijke rol spelen. De genetische component van een verhoogde tolerantie vereist de expressie van bepaalde genen. Volgens Charles Darwin, de grondlegger van de evolutietheorie, zullen door natuurlijke selectie enkel die organismen overleven die genetisch het best zijn aangepast aan veranderingen van hun omgeving. De best aangepaste organismen hebben de hoogste overlevingskansen en zullen ook meer en beter aangepaste nakomelingen produceren. Deze nakomelingen zullen dan een steeds groter deel uitmaken van de populatie. De laatste jaren krijgen ook andere theorieën steeds meer aanzien in de wetenschap. Er wordt onder andere veel onderzoek gevoerd naar de erfelijkheid van verworven eigenschappen. 1 Evolutionaire pre-darwinistische ideeën over de overerving van verworven kenmerken werden al door Jean-Baptiste Lamarck in de 18e eeuw naar voor gebracht (Pray, 2004). Deze ideeën werden echter nooit algemeen aanvaard en zijn sinds de tijd van Charles Darwin in de vergetelheid geraakt. In een nieuwe vorm krijgen de ideeën van JeanBaptiste Lamarck terug aanzien, namelijk in de epigenetica. Volgens de epigenetica kan de expressie van genen gewijzigd worden zonder dat er veranderingen optreden in de basensequentie van het DNA en zijn deze wijzigingen erfelijk. De DNA-methylatie is het langst bestudeerde en best begrepen epigenetisch mechanisme. Het lijkt erop dat het genoom gemakkelijker methylgroepen kan opnemen dan dat het zijn basensequentie wijzigt (Pray, 2004). De epigenetische mechanismen stellen een organisme in staat snel te reageren op veranderingen in het milieu. De vorderingen op het vlak van het epigenetisch onderzoek geven steeds meer aanwijzingen van het belang van DNAmethylatie. DNA-methylatie zorgt ervoor dat organismen in staat zijn zich te verdedigen tegen stress, doordat DNA-methylatie de genexpressie kan reguleren en daarmee de eiwitsynthese. Onder invloed van stress zullen genen geactiveerd worden voor de synthese van allerlei macromoleculen. Enkele specifieke eiwitten zijn belangrijke metaalbindende macromoleculen. Het belangrijkste eiwit is metallothioneïne (MT), een cysteïnerijke proteïne die grote hoeveelheden metaal kan binden. Ander proteïnen zijn: phytochelatine, katalase, glutathion, ferrin,… De eiwitten worden in de cel opgenomen, getransporteerd en uitgescheiden door verschillende organellen. Lysosomen, granulen, vesiculen, peroxisomen en vacuolen zijn de voornaamste organellen die een rol vervullen in de detoxificatie van metalen. Subcellulaire fractionatie van metalen in aquatische invertebraten zegt veel over interne processen, die voorkomen tijdens de metaalaccumulatie, en kan belangrijke informatie bevatten over metaaltoxiciteit en – tolerantie. Het doel van ecotoxicologisch onderzoek is het monitoren, voorspellen van effecten van toxicanten op cellen, weefsels, organismen, populaties, gemeenschappen en ecosystemen. Het doel van deze studie is de effecten van metaalstress bij Daphnia magna Straus te onderzoeken. De effecten van cadmium en nikkel op de reproductie en DNA-methylatie worden bestudeerd. Verder wordt ook de subcellulaire verdeling van cadmium onderzocht. Kennis van deze processen levert een bijdrage aan een betere risicobeoordeling van deze stoffen. 2 1.2 Metalen: cadmium en nikkel. 1.2.1 Inleiding Het begrip zware metalen wordt op heel wat verschillende manieren gedefinieerd. In een rapport van de IUPAC (Duffus, 2002) worden cadmium en nikkel tot de zware metalen gerekend. Enkele veel gebruikte parameters zijn: zware metalen hebben een dichtheid groter dan 5000 kg/m3, een hogere atoommassa dan 40 g/mol en een atoomnummer hoger dan 20. Dit zijn slechts enkele van de vele definities voor zware metalen. Het gebruik van de term zware metalen wordt beter vermeden, want de verschillende definities kunnen de chemische en biologische mechanismen niet verklaren. Interessanter is het om de metalen van het periodiek systeem te verdelen naargelang hun buitenste subschillen (s-,p-,d-,f- orbitalen). Cadmium en nikkel behoren beide tot het d- blok van het periodiek systeem. Deze metalen kunnen zowel een redoxkarakter hebben, als een affiniteit voor de vorming van complexen. Deze eigenschappen liggen aan de basis van de katalytische werking in enzymreacties. De interactie van metalen met levende organismen wordt gedomineerd door de eigenschappen van de metaalionen. Metaalionen hebben een positieve lading en gedragen zich bijgevolg als een Lewiszuur. Een Lewiszuur is een molecule die kan fungeren als elektronenacceptor. Hierbij bepalen de eigenschappen van de elektronenacceptor de mogelijkheden voor de selectieve binding aan liganden. 1.2.2 Classificatie Metalen kunnen onderverdeeld worden in drie klassen (Duffus, 2002): - Klasse 1: “harde metalen” (sterke lewiszuren): lage polariseerbaarheid, voorkeur voor de vorming van complexen met niet-gepolariseerde liganden, vb. liganden met zuurstofgroepen. De binding in deze complexen, is voornamelijk de ionbinding vb. Ca, K, Na. - Klasse 2: “zachte metalen” (zwakke lewiszuren): de metaalionen verkiezen om te binden met polariseerbare, zachte liganden, vb. liganden met zwavelgroepen. Hierbij worden covalente bindingen gevormd vb. Au, Ag, Pt. - Klasse 3: intermediaire metalen met eigenschappen van klasse 1 en 2 (‘borderline metals’). Ze zullen dus binden aan S- en O-groepen en ook aan Pgroepen in liganden. vb. Ni, Cd, Zn. 3 Nikkel en cadmium behoren beide tot de groep van de ‘borderline metals’ (Miller et al., 1992). Er dient wel opgemerkt te worden dat cadmium in het grensgebied zit tussen de “zachte metalen” en de ‘borderline metals’. Volgens sommige auteurs behoort cadmium tot de “zachte metalen” (Duffus, 2002). De bovenstaande indeling in drie klassen op basis van het Lewiszuurkarakter maakt het mogelijk om de werking van de metalen in verschillende biochemische processen te verklaren. Volgens verschillende auteurs (Duffus, 2002; Simkiss, 1981; Soto et al., 2003) bestaat er een bepaalde affiniteit tussen “zachte” en “harde” metalen en verschillende functionele groepen. Voor “zachte” metalen geldt onderstaande reeks, terwijl de reeks net omgekeerd is voor “harde” metalen. S>N>O “Harde metalen” vormen stabiele verbindingen met zuurstofliganden, bijvoorbeeld fenolof carboxylgroepen in humus- en fulvozuren. “Zachte metalen” binden het liefst met zwavelliganden, bijvoorbeeld in cysteïnerijke eiwitten. ’Borderline metals’ binden met verschillende liganden, waaronder stikstof in tetrapyrrolen en sulfidegroepen in cysteïnerijke eiwitten (Duffus, 2002). Veel van deze ‘borderline metals’ worden tot de sporenelementen of micronutriënten gerekend. Het zijn elementen die slechts in kleine hoeveelheden via voedsel worden opgenomen voor een goed metabolisme. Een aantal ‘borderline metals’ behoren ook tot de niet-essentiële metalen. “Zachte metalen” en enkele ‘borderline metals’ binden zoals eerder vermeld vooral aan zwavelgroepen. Deze eigenschap is van groot belang voor de biochemische processen in de cel, omwille van de eerder vermelde cysteïnerijke eiwitten die een belangrijke rol spelen in de detoxificatie van metalen. 4 1.3 Speciatie en biobeschikbaarheid van metalen 1.3.1 Inleiding De metingen van metalen in het milieu zijn niet altijd even gemakkelijk te interpreteren (Soto et al., 2003). Vooral voor de ecotoxicologie is het belangrijk om de relatie te kennen tussen de metaalconcentraties in het milieu en het effect ervan op de organismen in het gecontamineerde ecosysteem. Metalen komen onder verschillende vormen of ‘species’ voor in het milieu. Deze ‘species’ kan men indelen naargelang de isotopen, oxidatiestatus en complexen. De oxidatiestatus en complexen bepalen in sterke mate de biobeschikbaarheid van het metaal. De biobeschikbaarheid wordt onder andere bepaald door: het type metaal, fysico-chemische factoren en het metaalregulerend vermogen van het organisme. De biobeschikbaarheid zegt veel over de toxiciteit van een metaal (Chapman et al, 2003). 1.3.2 Speciatie en biobeschikbaarheid De speciatie van metalen houdt de transformatie en distributie van metalen in (fig. 1.1). Het belang van speciatie van metalen is tweeledig (Millero,2001): 1) Biochemische cyclus van metalen: bioaccumulatie, bioconcentratie, biobeschikbaarheid en toxiciteit. 2) Geochemische cyclus: transport, adsorptie en precipitatie van metalen. De metaalconcentratie in het milieu is niet de enige factor die de metaalbelasting van aquatische organismen bepaalt. De metaalaccumulatie in organismen wordt bepaald door verschillende abiotische en biotische factoren (Millero, 2001; Mungkung et al, 2001, Soto et al., 2003). De geleidbaarheid, zuurtegraad, hardheid, alkaliniteit, redoxpotentiaal, temperatuur, zuurstofgehalte, synergisme en antagonisme tussen metalen (kationen), de oplosbaarheid en de aanwezigheid van anorganische of organische liganden zijn belangrijke abiotische factoren. Precipitatie, sedimentatie, adsorptie en filtratie zijn ook van groot belang in natuurlijke milieus (fig. 1.1). De speciatie en de toxiciteit van metalen in aquatisch milieu kan voorspeld worden door het gebruik van modellen (Vangheluwe et al., 2003), zoals het Biotic Ligand Model (BLM). 5 vrij metaalion precipitatie Metaal oplosbare complexen met organische liganden oplosbare complexen met inorganische liganden adsorptie: • adsorptie/coprecipitatie op ijzer/mangaanoxiden •ionuitwisseling •adsorptie op klei, silicaten, andere mineralen •adsorptie op organische liganden Figuur 1.1: speciatie van metalen in aquatische systemen (Millero, 2001; Mungkung et al, 2001, Soto et al., 2003) Veel biotische factoren staan in direct verband met de abiotische, toch zijn het metabolisme (homeostasis) en afgeleide biotische parameters, zoals de groei en de reproductie van groot belang als parameters voor de bepaling van de metaaltoxiciteit. De binding van metalen in weefsels kan ingedeeld worden in 2 groepen (Harrison et al, 2006): 1) Fysiologisch inerte bindingsplaatsen: accumulatie van metalen zonder de verstoring van de celfuncties. 2) Fysiologisch actieve bindingsplaatsen: directe of indirecte schade aan het celmetabolisme. Directe schade kan optreden doordat de bindingsplaats overeenkomt met een membraangebonden enzym of co-enzym. 6 Tot categorie één behoren de meeste belangrijke macromoleculen die mee verantwoordelijk zijn voor de detoxificatie van een overmaat aan metalen in de cel. Tot categorie twee behoren veel metallo-enzymen. Metallo-enzymen hebben een specifiek metaal nodig als co-enzym om te functioneren. Een vreemd metaal kan bij een overmaat de plaats innemen van het specifieke metaal. Dit leidt tot celtoxiciteit. De meeste metaalionen in weefsels zijn bivalente kationen. Ze kunnen voorkomen als vrije metaalionen of gecomplexeerd zijn aan verschillende liganden. ‘Borderline metals’ kunnen binden aan (Soto et al., 2003): 1) thiol, hydroxyl, carboxyl, imidazol en aminoresten van proteïnen. 2) NH en C=O groepen van proteïnen. 3) O en N elektrondonoren van heterocyclische basen. 4) hydroxylgroepen van (de)oxyribose in nucleosiden. 5) fosfaatgroepen van nucleotiden in nucleïnezuren. 6) specifieke eiwitten voor bepaalde metalen. Ten gevolge van de verschillende atoomnummers en elektronegativiteit van metalen (bepalen het Lewiszuurkarakter), zal de voorkeur voor de verschillende klassen van liganden sterk variëren. Reactieve liganden zullen geïnduceerd, gemetaboliseerd en uitgescheiden worden, waarbij de omzet en de beschikbaarheid uiteindelijk de concentratie van de metalen bepaalt in de cellulaire compartimenten (Soto et al, 2003). De accumulatie van metalen in weefsels is in hoge mate afhankelijk van verschillende metabolische processen (metalen kunnen niet gemetaboliseerd worden in de strikte zin) die plaatsvinden in specifieke celtypen in doelweefsels/organen (Beaty et al, 2002). De meeste van deze processen staan in verband met de deelname van het eiwit MT en lysosomen in de intracellulaire regulatie van metalen (Soto et al, 2003; Stanley, 2003). Verhoogde synthese van het eiwit MT is geassocieerd met een toegenomen capaciteit om metalen te binden en toegenomen bescherming tegen metaaltoxiciteit. Bovenstaande fracties worden nog uitgebreid besproken in deze studie. 7 1.4 Het modelorganisme: Daphnia magna 1.4.1 Inleiding De stam van de geleedpotigen (Arthropoda) uit het dierenrijk (Animalia) bevat ongeveer 5 tot 10 miljoen soorten. Het is één van de meest diverse en talrijke groepen binnen de Metazoa. Tot de geleedpotigen behoren ook de Crustacea, deze groep telt op zijn beurt nog eens 39000 gekende taxa met een immense verscheidenheid in morfologie. Het is de talrijkste en meest diverse groep in aquatische ecosystemen, terwijl terrestrische ecosystemen worden gedomineerd door de hexapoda (voornamelijk insecten). Eén van de verste takken binnen de Crustacea is de klasse Branchiopoda (fig. 1.2) waarbinnen de orde van de Cladocera ligt (fig. 1.2). Daphnia magna behoort tot de Cladocera. De Cladocera worden ook wel watervlooien genoemd. Deze groep van kleine Crustacea of kreeftachtigen hebben hun naam te danken aan hun uiterlijk en de schokkerige voortbeweging doorheen het water. Figuur 1.2: classificatie van Daphnia magna in het Dierenrijk: Daphnia (Ctenodaphnia) magna Straus 1820, Daphnia O. F. Müller 1785 [genus], Ctenodaphnia Dybowski & Grochowski 1895 [subgenus] (Fauna Europaea, 2000a). 8 In figuur 1.2 is de taxonomische indeling van Daphnia magna terug te vinden (Fauna Europaea, 2000a). In Europa leven 25 soorten watervlooien (Fauna Europaea, 2000b) die behoren tot het genus Daphnia, waarvan 9 soorten in België leven. Het genus Daphnia wordt door sommige auteurs opgedeeld in het subgenus Daphnia en Ctenodaphnia. De volledige wetenschappelijke naam is Daphnia (Ctenodaphnia) magna. 1.4.2 Beschrijving Daphnia magna is een vrij grote soort. Het sexueel dimorfisme tussen mannetjes en wijfjes is het meest opvallend door het verschil in grootte. Mannetjes zijn hoogstens 3 mm lang, terwijl de vrouwtjes maximaal tot 7 mm lang worden. Ze verschillen verder nog in de vorm van ondermeer de antennen, de kop, het rostrum en de carapax (Barnes, 1980). De habitustekening (fig. 1.3) toont het typische uiterlijk van een vrouwtje. Daphnia magna kan gemakkelijk onderscheiden worden van andere soorten (Schaefer, 2000; The Royal BC Museum, 1994; University of Guelph, 1996; Fryer, 1991). Het is de enige soort met een dorsale vernauwing van het postabdomen, waarbij de postabdominale tandenrij onderbroken is. Figuur 1.3: morfologie en anatomie van Daphnia magna (Barnes, 1980; NOAA, 2004). De bruine pijl heeft de diagnostische vernauwing van het postabdomen aan. 9 1.4.3 Voorkomen en ecologie Daphnia magna is sterk eurytoop. Ze hebben hierdoor een wijde geografische verspreiding. Het verspreidingsgebied beslaat het gehele Palearctisch gebied, een deel van het Nearctisch en het Ethiopisch gebied (The Royal BC Museum, 1994). Watervlooien zijn een belangrijke en onmisbare schakel in aquatische ecosystemen (Lavens & Sorgeloos, 1996). Ze consumeren voornamelijk algen en bacteriën (fytoplankton), maar ook protozoa, rotifera en detritus behoren tot het opgenomen voedsel. Daphnia magna is zelf het voornaamste voedsel voor verschillende predatoren. De predatoren behoren tot de vertebraten (planktivore vissen) en invertebraten (Notonecta sp., Chaoborus sp., e.a.). Verder kan de populatiedynamiek van Daphnia magna sterk onderhevig zijn aan bacteriën, fungi en microsporidia. De bacterie Pasteuria ramosa is een belangrijke sporenvormende endoparasiet van Daphnia magna (Mitchell et al., 2004). 1.4.4 Anatomie en fysiologie Alle Crustacea hebben een uitwendig skelet (exoskelet). Het uitwendige skelet van Daphnia magna bestaat uit een tweedelige carapax (fig. 1.3), deze zit rond de thorax en het abdomen en is opgebouwd uit verschillende lagen weefsel. De calciumverbindingen en chitine in de weefsels zorgen voor de sterkte van de carapax (O’Brien et al., 1991). Metalen zullen bij vele ongewervelden gedeeltelijk door het exoskelet migreren of zich vastzetten voor ze zich verspreiden in het organisme. Metalen kunnen via verschillende opnameroute’s in de carapax terechtkomen en daarbij binden aan proteïnen. De carapax kan op deze manier een vrij grote hoeveelheid metaal accumuleren. De carapax is niet elastisch, daarom zal groei enkel mogelijk zijn door de carapax regelmatig te vernieuwen door een grotere. Het vervellingsproces gaat gepaard met het vernieuwen van de cuticula. Dit proces wordt ook wel ecdysis genoemd, omdat het voorkomt bij alle Ecdysozoa, waaronder Daphnia magna. Gedurende de ontwikkeling zijn er verschillende vervellingsstadia, waarbij de cuticula van de carapax telkens opnieuw wordt gevormd. De regulatie van calcium in vele Crustacea is dan ook een uitdaging door de hoog gemineraliseerde cuticula. Bij elke vervelling wordt er opnieuw kalk ingebouwd in de cuticula onder de vorm van calciumcarbonaat en calciumfosfaat. Sommige metalen, zoals cadmium, kunnen in competitie gaan met calcium op specifieke bindingsplaatsen, omdat beide metalen duidelijk dezelfde ‘pathway’ volgen. 10 Metalen opgenomen via het darmstelsel of de kieuwen van Crustacea kunnen langs allerlei wegen opgenomen en uitgescheiden worden. Weefsels in de buurt van het darmstelsel blijken meer metalen op te slaan dan andere weefsels. De hepatopancreas (syn. verteringsklier of middendarmklier) en de carapax blijken belangrijke opslagplaatsen voor metalen te zijn. Watervlooien zijn ‘filter feeders’, die door snelle bewegingen van de vijf thoracale poten (fig. 1.3) een waterstroom creëren doorheen de carapax. Uit deze waterstroom wordt dan de nodige zuurstof en voedsel gehaald. Voordat het voedsel en de zuurstof de mond bereikt, zullen ze worden gefilterd door de lange haren en setae (fig. 1.3) op de thoracale poten. We kunnen Daphnia magna beschouwen als een aselecte “filter feeder” (Lavens & Sorgeloos, 1996). Ze prefereren fytoplankton, maar ze zullen alle gesuspendeerde deeltjes opnemen die gefilterd kunnen worden (> 0,45 µm). Men heeft ook ontdekt dat ze bij voedselschaarste overgaan tot het opnemen van deeltjes (bacteriën, algen, protozoa, rotifera,…) uit het sediment (Gillis et al, 2005). In de mond wordt het voedsel vermengd met orale secreties en gaat verder naar de darm. Vanuit de centrale darm wordt het voedsel opgenomen in het lichaam. Bij Daphnia pulex (Schultz & Kennedy, 1976) is een studie gedaan naar de structuur van het spijsverteringsstelsel (fig. 1.3). Het verteringskanaal bij watervlooien bestaat uit een buisvormige voordarm, een middendarm (mesenteron) met een paar smalle diverticula en een korte einddarm. De structuur van de voordarm en einddarm zijn gelijk. Beide zijn gevormd uit een kubusachtig epitheelweefsel omgeven door een chitineachtige intima. De middendarm bestaat uit eenvoudig epitheelweefsel gelegen bovenop de basal lamina. De basal lamina is omgeven door spiraalvormig spierweefsel. De structuur en functie van deze weefsels zijn van belang bij de opname van metalen in de cellen. De stoffen die niet opgenomen worden, zullen na enige tijd via de darm terug uitgescheiden worden. Metalen die niet worden opgenomen, kunnen tot meer dan 6 uur in het darmstelsel blijven (Gillis et al, 2005). Metalen worden niet enkel via het water opgenomen, maar ook gedeeltelijk via het voedsel. Fysiologisch is Daphnia magna goed aangepast aan minder gunstige omstandigheden, dit is noodzakelijk voor de kolonisatie van geschikte leefgebieden. In een zuurstofarme omgeving kan Daphnia magna zelf hemoglobine aanmaken. Ze zijn ook in staat ongunstige perioden te overleven, doordat er zich dan resistente ruststadia ontwikkelen (ephippia) (Mitchell et al., 2004). Ephippia kunnen door allerlei dieren worden meegenomen (passieve dispersie). De rusteieren zullen zich ontwikkelen, als ze in gunstige leefgebieden terechtkomen. In deze gebieden kunnen zich dan grote populaties ontwikkelen. 11 1.4.5 Voortplanting en levenscyclus De reproductie bij Daphnia magna verloopt via cyclische parthenogenese (fig. 1.5). Bij deze vorm van voortplanting wordt de parthenogenetische voortplanting afgewisseld met perioden van seksuele voortplanting (Lavens & Sorgeloos, 1996; Falco & Moreno, n.d.; Mitchell et al., 2004). Vooral de omgevingscondities bepalen de wijze van voortplanting. Parthenogenetisch reproductie neemt voortdurend plaats bij gunstige condities. Daphnia magna zal overgaan op seksuele reproductie als het leefgebied ongunstig wordt. Genetische factoren spelen ook een belangrijke rol in de reproductie (Carvalho & Hughes, 1983). Parthenogenese heeft als voordeel dat de reproductie sneller verloopt, waardoor een populatie snel kan groeien. De populatie bestaat uit genetisch identieke individuen en is dus veel gevoeliger voor veranderingen in het milieu. Natuurlijke selectie is hier geen selectief proces. Seksuele voortplanting zorgt voor meer genetische diversiteit in een populatie, doordat er reductiedeling/meiose plaatsvindt. Bij de meiose worden de chromosomen verdeeld over twee nieuwe dochtercellen. De willekeur van de meiose zorgt ervoor dat het resultaat van elke reductiedeling anders is. Niet alleen de chromosomenparen worden onafhankelijk van elkaar over de dochtercellen verdeeld, ook binnen chromosomenparen vindt recombinatie van genen plaats door crossing-over. De hogere genetische diversiteit bij seksuele voortplanting zorgt ervoor dat door natuurlijke selectie de genetisch sterke individuen overleven bij ongunstige en snelle veranderingen van de omgeving. Tijdens de seksuele voortplanting worden ook ephippia of rusteieren gevormd. Deze rusteieren zijn de overlevingvorm van Daphnia magna. In diapauze kunnen ze zo ongunstige perioden overleven. Tijdens de parthenogenetische aseksuele reproductie bestaat de populatie uitsluitend uit vrouwelijke individuen. Onbevruchte diploïde eicellen in de broedkamer groeien uit tot de identieke individuen (vrouwtjes). De eicellen ontwikkelen zich in het ovarium (fig. 1.3), daarna verplaatsen ze zich naar de broedkamer (fig. 1.3). De celdeling van de eicellen verloopt volledig mitotisch (Zaffagnini, 1987). Door de mitose zullen de vrouwtjes telkens identieke dochters produceren (klonen). De volledige ontwikkeling van eicel tot embryo zal 2 à 3 dagen duren bij kamertemperatuur. De ontwikkeling tot adult organisme verloopt via een aantal vervellingen. In de broedkamer zullen de onvolwassen Daphnia magna zich al ontwikkelen. De duur van de ontwikkeling van nauplius tot adult is sterk afhankelijk van de temperatuur en voedsel (Mitchell, 2004; Pennak, 1989). Het duurt 11 dagen bij 10°C en 2 dagen bij 25°C. Gedurende deze periode zullen ze 4 tot 5 12 vervellingsstadia doormaken voor ze volwassen en geslachtsrijp zijn (Zaffagnini, 1987; Pennak, 1989). Daphnia magna zal overgaan op seksuele reproductie door negatieve prikkels vanuit de omgeving. Uit onderzoek (Carvalho & Hughes, 1983; Zaffagnini, 1987) volgen enkele negatieve prikkels: tekort aan nutriënten kaïromonen (predatorspecifieke stoffen) droogte kortere perioden licht lage temperaturen hoge populatiedensiteit. Figuur 1.4: de rusteieren of ephippia. a) 2 eieren in diapauze b) resten van de broedkamer (Falco & Moreno, n.d.) De overgang van aseksuele reproductie naar seksuele reproductie wordt gekenmerkt door de productie van mannetjes. De mannetjes ontstaan ook via parthenogenese en zijn dus genetisch identiek aan de vrouwtjes (Zaffagnini, 1987). De geslachtsbepaling is dus niet genetisch vastgelegd, want de negatieve omgevingscondities induceren de ontwikkeling van mannetjes. Deze condities leiden ook tot de ontwikkeling van rusteieren of ephippia (Arbačiauskas, 2004). Deze ephippia (fig. 1.4) ontwikkelen zich uit haploïde eieren. De vrouwtjes leggen haploïde eieren die door de mannetjes bevrucht dienen te worden om verdere ontwikkeling mogelijk te maken. Eén paar haploïde eieren zullen na de bevruchting ontwikkelen tot een ephippia. In de broedkamer worden de rusteieren gevormd uit de broedkamerwand (fig. 1.3 & 1.4). De broedkamerwand verandert in een donkere, dikke wand (verschillende lagen membranen). Deze getransformeerde 13 broedkamerwand vormt het kapsel waarin de rusteieren verpakt zitten. De ephippia ontwikkelen zich altijd tot vrouwelijke individuen (Winsor & Innes, 2002) en komen vrij na de vervelling van het moederdier. Figuur 1.5: de voortplantingscycli van Daphnia magna: de seksuele en de aseksuele voortplanting (Daphnia Genomics Consortium, 2005b) 14 1.4.6 Modelorganisme Volgens onderzoek (Daphnia Genomics Consortium, 2005b) zijn Daphnia magna en andere soorten van het genus Daphnia om verschillende redenen interessante modelorganismen: • Gedurende bijna drie eeuwen wordt het genus Daphnia al bestudeerd in de taxonomie, fysiologie en limnologie. Ze worden dan ook gebruikt bij veel nationale en internationale gestandaardiseerde testen. • Elk jaar worden honderden ‘papers’ geschreven, waarin soorten Daphnia sp. als proeforganisme worden gebruikt. • Ze komen voor in bijna alle zoetwaterecosystemen. Daphnia speelt een sleutelrol in deze ecosystemen, als zoöplankton. Ze vormen een schakel tussen producenten en hogere consumenten. Ze voeden zich met fytoplankton en vormen zelf een belangrijke voedselbron voor predatoren, zoals vissen. Ze worden beschouwd als ‘keystone species’. • De levenscyclus is ideaal voor experimenten op stressrespons. De reproductie is korter dan bij de meeste andere eukaryotische modelorganismen. Ze zijn eenvoudig te kweken in kleine volumes medium en bereiken het adult stadium in 5-10 dagen, hierdoor is onderzoek mogelijk naar adaptatie en acclimatisatie binnen een korte tijdspanne. • Door de asekuele parthenogenetische voortplanting (klonale voortplanting) is het mogelijk om constante klonale lijnen te produceren en interindividuele genetische verschillen uit te sluiten. De parthenogenetische voortplanting biedt de mogelijkheid om de responsen van verschillende klonale lijnen op te volgen en zo nauwkeuriger • de toxische werking van een stof te achterhalen. De grenzen van populaties zijn duidelijk en bestaan uit een groot aantal individuen. 15 • Ze hebben een klein genoom, Daphnia magna heeft 20 chromosomen of 10 paar chromosomen (Colbourne, 1999). De volledige sequentie van het mitochondriaal genoom van Daphnia pulex is gekend sinds 1999 (Crease, 1999). Onlangs werd de ‘shotgun’ sequentie van het volledige genoom in kaart gebracht (Indiana University, 2006). Het onderzoek naar het volledige genoom van Daphnia magna werd recent opgestart. De moleculaire fylogenie van het genus Daphnia maakt vergelijking mogelijk met andere genomen. De grote database van de fruitvlieg Drosophila • melanogaster vereenvoudigt daarbij het genoomonderzoek. Zoöplankton is in het bijzonder gevoelig voor stress vanuit het milieu. Daphnia magna is bijvoorbeeld heel gevoelig voor cadmium. • Doordat Daphnia transparant zijn gedurende de hele levenscyclus, is het mogelijk om de genexpressie in bepaalde specifieke weefsels te bestuderen. • De rusteieren (ephippia) die worden geproduceerd tijdens de seksuele voortplanting kunnen voor lange perioden bewaard blijven. Onderzoek naar stress door antropogene verontreinigingen wordt bij verschillende organismen uitgevoerd. Buiten Daphnia magna worden daarvoor nog andere modelorganismen gebruikt, waaronder: fruitvliegen, gistcellen en muizen. De vraag kan gesteld worden waarom er zoveel onderzoek wordt gevoerd op deze dieren en wat het belang is voor de mens. Naast het feit dat het ideale levende laboratoria zijn, zoals eerder besproken, kan één belangrijk aspect niet onbesproken blijven. De biochemische processen in verschillende organismen lijken dikwijls zeer sterk op elkaar, ondanks hun verre verwantschap en sterk verschillend uiterlijk. Ze consumeren allemaal voedsel en zetten het voedsel om in dezelfde chemische moleculen, nodig voor de groei en de reproductie. De biochemische processen op cellulaire en moleculaire schaal zijn zo vergelijkbaar, doordat heel veel genen in de genomen overeenkomst vertonen met elkaar. Processen onderzocht in lichaamscellen van fruitvliegen, e.a. kunnen ook teruggevonden worden bij de mens en andere organismen. Dit onderzoek levert dus een bijdrage aan de toxicologische kennis bij mens en dier. 16 1.5 Acclimatisatie en adaptatie 1.5.1 Inleiding Populaties blootstellen aan metalen zorgt voor stress. Elke verandering in de leefomgeving van een organisme kan tot stress leiden, vooral als deze veranderingen elkaar snel opvolgen of de leefomgeving van een organisme sterk verandert. Stress kan zowel een natuurlijke, als een menselijke oorsprong hebben en kan op verschillende niveaus schadelijke effecten hebben: ecosystemen, populaties, individuen, organen, weefsels en cellen. De effecten van stress weerspiegelen zich in de levenscyclus van de organismen: ontwikkeling, groei, leeftijd, overleving en reproductie. Stress is geen absoluut gegeven. Een extreem stressvolle omgeving voor het ene organisme, kan een gunstige leefomgeving zijn voor een ander organisme. Stress moet dus gedefinieerd worden naargelang de niche van een bepaalde soort (Korsloot et al, 2004). Organismen onderhevig aan metaalstress kunnen een verhoogde resistentie aan deze toxicanten ontwikkelen (Cullis, 1999; Harrison et al, 2006). Het is vanzelfsprekend dat organismen gemakkelijker resistentie ontwikkelen aan metalen die van nature voorkomen en deel uitmaken van hun evolutieve ontwikkeling, dan aan metalen van menselijke oorsprong. 1.5.2 Verwerving van tolerantie Er zijn twee mechanismen (fig. 1.7), die een organisme in staat stellen zich aan te passen aan veranderingen in zijn milieu (Cullis, 1999; Madlung, 2004). Ten eerste kan tolerantie zich ontwikkelen door individuele blootstelling aan metalen. Het proces wordt fysiologische acclimatisatie genoemd (fig. 1.7). Een organisme verkrijgt een zekere graad van tolerantie na blootstelling aan subletale hoeveelheden van een toxische stof. De blootstellingstijd en de stadia van de levenscyclus zijn hierbij van groot belang. De verkregen tolerantie zal echter niet doorgegeven worden aan de nakomelingen. Als organismen in staat zijn zich fysiologisch aan te passen aan negatieve omgevingscondities, is het mogelijk dat ze gedurende verschillende generaties overleven. Na een bepaalde periode onder deze condities is het mogelijk dat door wijzigingen in het genoom, de telkens verworven fysiologische aanpassingen leiden tot de ontwikkeling van genetisch tolerante organismen door natuurlijke selectie. Dit tweede mechanisme is de genetische adaptatie (fig. 1.7). De genetische variatie tussen de individuen in een populatie zal over een lange blootstellingsperiode bepalend 17 zijn voor de tolerantieontwikkeling door natuurlijke selectie voor een gemiddeld hoger tolerantieniveau. De eigenschappen van de tolerantie worden doorgegeven aan de nakomelingen. De natuurlijke selectie kan echter alleen doorgaan in een grote populatie over een lange tijdsperiode. Een aanvaardbare verklaring voor het op korte tijd optreden van adaptatie bij organismen is hiermee niet gegeven. In een recent verleden zijn wetenschappers tot de conclusie gekomen, dat theorieën over de erfelijkheid van verworven karakteristieke eigenschappen terug serieus genomen kunnen worden. Uit onderzoek blijkt dat organismen over één generatie de expressie van het genoom kunnen wijzigen en cruciale eigenschappen om te overleven doorgeven aan de nakomelingen. Dit mechanisme maakt een snelle adaptatie, zonder natuurlijke selectie mogelijk. In deze studie zal dit verder nog uitgebreid aan bod komen. Onderzoek (Calow & Sibly, 1990) heeft aangetoond, dat twee nauw verwante soorten of individuen van éénzelfde soort een sterk verschillende fitness kunnen vertonen. De fitness is het relatieve vermogen van een organisme of populatie om genen aan de volgende generaties over te dragen. De fitness is afhankelijk van het milieu waarin ze voorkomen en hun tolerantievermogen. Acclimatisatie is een energetisch kostelijk proces, dat de fitness kan reduceren. Bij adaptatie zijn er echter veelal geen extra energetische kosten. Het individu dat tolerantiemechanismen heeft ontwikkeld en daarbij een hogere metabolische kost heeft onder alle omstandigheden, zal in het nadeel zijn bij gunstige omgevingscondities. De metabolische kost is veel hoger, terwijl de overlevingskansen even hoog zijn als bij het niet-tolerante individu. In een verontreinigde omgeving zal het tolerante individu dezelfde overlevingskansen behouden, terwijl de overlevingskansen van het niet-tolerante individu zeer klein zijn. Metaaltolerantie kan mogelijks leiden tot een gereduceerde genetische diversiteit of een energetische kost. Er zijn veel redenen waarom een organisme zou acclimatiseren of adaptatie zou ondergaan: strategieën om toegang te krijgen tot nieuwe energiereserves, het vermijden of verminderen van competitie met andere soorten door een grotere beschikbaarheid van voedselbronnen in metaalverontreinigde gebieden, het vermijden van predatie en het verhogen van de overlevingskansen van de nakomelingen. Acclimatisatie en adaptatie zijn dus normale reacties van een organisme om de grenzen van zijn ecologische niche te wijzigen en om zijn kansen op overleven en zich voort te planten te maximaliseren (fig. 1.9). 18 De ontwikkeling van genetisch tolerante organismen (door wijzigingen in het genoom en natuurlijke selectie over verschillende generaties) als reactie op langdurige stress moet over volgende eigenschappen beschikken om adaptief voordelig te zijn (Cullis, 1999): 1. Het mechanisme wordt alleen geactiveerd als normale fysiologische reacties niet meer mogelijk zijn. Hiervoor is een bepaalde prikkel nodig. 2. De wijzigingen van het genoom moeten worden vertaald in fenotypische variaties. 3. De effecten van de veranderingen moeten voordelig zijn voor het organisme zelf en moeten kunnen worden doorgegeven aan de volgende generatie. 4. De wijzigingen moeten omkeerbaar zijn. 5. De wijzigingen moeten stabiel zijn en gelimiteerd in hun omvang. Naast de genetische overdracht van tolerantie zijn maternale effecten van groot belang voor de ontwikkeling van het fenotype van de nakomelingen (Arbačiauskas, 2004). Het moederdier kan namelijk de verhoogde tolerantie van de nakomelingen beïnvloeden door het meegeven van grotere reserves en metalen via de dooier. Maternale effecten kunnen gedefinieerd worden als de pre- en postnatale invloeden van een moederdier op de nakomelingen. In deze studie wordt verder geen aandacht geschonken aan de maternale effecten. 19 Stressor Type stress Primaire effecten Secundaire effecten Proteotoxische stress - Schade aan nieuwe polypeptiden - Denaturatie van proteïnen/enzymen - Veranderingen in covalente bindingen - Schade aan ionpomp/kanaal van het celmembraan. - Synthese van veel voorkomende proteïnen - Vorming aggregaten - Schade aan membranen en filamenten - Verstoring van enzymatische functies - Verstoring van ion homeostasis - Wijzigingen in de redoxstatus - Inhibitie van de respiratieketen, ATPsynthese en metabolische cyclussen. Oxidatieve stress Oxidatie van proteïnen, enzymen en lipiden Metaalstress Wijzigingen in covalente bindingen - Inhibitie van enzymatische functies Genotoxische stress Oxidatie van nucleotiden en enzymen - Vorming van DNAadditieproducten - Schade aan DNA structuren - Inhibitie van ‘DNArepair’ systemen Tertiaire effecten - Toename van proteolysis (afbraak van eiwitten) - Verstoring van de structurele eenheid - Verhindering van de normale eiwitsynthese - Inductie van stressenzymen, antioxidanten, metallothioneïnen en MFO enzymen - Overgang naar anaëroob energiemetabolisme - Overgang naar andere metabolische processen - Cytotoxische effecten en toename van lipolytische (vetafbrekende) activiteit Metalen - Verstoring van genetische processen en celcyclus processen - Oedema (accumulatie van een overmaat lymfe bij vertebraten) - Apoptosis (gecontroleerde celdood)/necrosis (spontane celdood) of terugkeer naar homeostasis (celdood en celproductie of mitosis zijn in evenwicht) - tumorigenisis/kanker Figuur 1.6: samenvattend schema met de verantwoordelijke groepen van stressoren, typen stress en hun effecten op de cellulaire functies. De primaire effecten spelen zich af op moleculair niveau. De secundaire effecten zijn de schade aan celstructuren en processen en de tertiaire effecten zijn de gevolgen van deze schade. Schade door stress kan herstelbaar zijn, gedeeltelijk herstelbaar of onomkeerbaar. Het uiteindelijke effect van stress is afhankelijk van de ernst en de reactie van de cel. Er zijn drie fasen te onderscheiden van de aanval van een stressor tot de finale effecten: (1) biochemische reacties (vooral primaire effecten), (2) effecten op intracellulaire processen (secundaire) en (3) gehele impact op homeostasis (tertiair) (Korsloot et al, 2004). 20 Metaalstress Fysiologische weg Genetische weg Acclimatie door: Sequestratie Binden aan geïnduceerd metallothioneïne Adaptatie door: Excretie Versterking van MTgen(expressie) Selectie op genvariabiliteit voor metallothioneïneregu latie Compartimentalisatie Toename in basale MTgenexpressie Verworven tolerantie aan metalen. Overerfbare tolerantie aan metalen Figuur 1.7: schematische voorstelling van de fysiologische en genetische effecten van metaalstress (Korsloot et al, 2004). Organismen hebben gedurende de evolutie verschillende defensiemechanismen (fig. 1.6) tegen stress ontwikkeld (Korsloot et al., 2004): - stressproteïnen vb. heat shock proteïnen (HSP), vooral de HSP70-familie blijkt geactiveerd te worden bij invertebraten onder metaalstress (Köhler et al, 1992). - antioxidanten vb. het enzyme glutathion - metallothioneïne (MT) vb. MT-I - Mixed Function Oxigenase (MFO): vooral de cytochroom P450 klasse van enzymen is van belang voor de MFO reactie. Het is een detoxificatiemechanisme voor organische xenobiotische stoffen vb. insecticiden. - basal signal transduction system: systeem voor het omzetten van extracellulaire signalen naar het intracellulaire milieu. Dit signaal activeert dan op een specifieke plaats in de cel defensiemechanismen. In deze studie worden de belangrijkste defensiemechanismen tegen metaalstress besproken, namelijk de synthese van het eiwit metallothioneïne en antioxidant enzymen. 21 1.6 Toxiciteit en essentialiteit van metalen 1.6.1 Inleiding De toxiciteit van een metaal wordt hoofdzakelijk bepaald door de concentratie aan vrije metaalionen, die op hun beurt afhankelijk zijn van de oplosbaarheid van de metalen en de hoeveelheid liganden in de cel (AbdAllah, 2003; Soto et al, 2003). 1.6.2 Essentiële metalen Een tekort aan essentiële metalen of sporenmetalen leidt tot pathologische schade of bepaalde wijzigingen in het lichaam van organismen. Dit proces is gelukkig omkeerbaar. Bij een voldoende hoge metaalconcentratie zullen de effecten weer verdwijnen. Essentiële metalen zijn in bepaalde hoeveelheden nodig voor het metabolisme, want ze vormen een belangrijk bestanddeel van proteïnen en enzymen die instaan voor een aantal cellulaire functies: groei, assimilatie, dissimilatie en reproductie. Volgende metalen worden beschouwd als essentiële metalen: Cu, Co, Cr, Zn, Ni, Fe, Mn, Mg, Mo en Se. Het optimale concentratiegebied kan nauw of wijd zijn. Voor elk organisme en voor elk essentieel element bestaat een ‘Optimal Concentration range for Essential Elements’ (OCEE) (Oller et al., 2003). Binnen het OCEE of optimum (fig. 1.8) kan het organisme voldoen aan haar metabolische behoefte. De omstandigheden zijn optimaal om alle functies te vervullen. OCEE is gekoppeld aan de natuurlijke biobeschikbare concentratie van het element in de natuurlijke habitat van de soort en wordt bepaald door de homeostatische capaciteit van de soort. Deze zorgt voor de actieve regulatie van de interne concentratie van het essentieel metaal en zorgt ervoor dat de optimale beschikbare concentratie van het essentieel metaal behouden blijft onder de variërende externe omstandigheden. Deze homeostatische regulatie heeft echter zijn beperkingen. Wanneer de externe biobeschikbare concentratie van het essentieel metaal te hoog of te laag wordt, zal de homeostatische capaciteit niet volstaan en zal respectievelijk toxiciteit of deficiëntie optreden (fig. 1.8). De optredende metaalstress heeft dan allerlei effecten (fig. 1.6) 22 Figuur 1.8: de dosis-respons curve van de essentiële en niet-essentiële metalen (Soto et al., 2003). Figuur 1.9: oorzaken van de verschuiving en verschillen in OCEE (Vangheluwe et al., 2003). Alle metalen zijn uiteindelijk potentieel toxisch. Niet-essentiële toxische metalen volgen dikwijls dezelfde ‘pathways’ van chemische sterk gelijkende essentiële metalen. Hierin schuilt een groot gevaar voor het celmetabolisme. 1.6.3 Niet-essentiële metalen Niet-essentiële metalen zijn binnen een bepaald concentratiegebied niet schadelijk voor een organisme (fig. 1.8). Er is een zekere drempelwaarde. Bij overschrijding van de drempelwaarde veroorzaken niet-essentiële metalen toxische effecten. De biobeschikbaarheid van het element in de natuurlijke habitat van de soort en de 23 homeostatische capaciteit van de soort bepaalt bij vele organismen de concentratie aan niet-essentiële metalen in het organisme. 1.6.4 Cadmium en nikkel Uit de literatuur (Muyssen, 2004; Stanley, 2003; Soto et al, 2003; Duffus, 2002) blijkt dat cadmium en nikkel een verschillend effect hebben op de fysiologie van organismen. Het metaal nikkel wordt tot de essentiële voedingselementen gerekend. Deficiëntie bij een tekort aan nikkel treedt frequent op bij terrestrische vertebraten. Bij aquatische organismen is de essentialiteit van nikkel minder duidelijk. Er is nog steeds geen metalloenzym met nikkel als co-factor ontdekt bij vertebraten en invertebraten. De actieve regulatie van nikkel in verschillende aquatische organismen laat enkel vermoeden dat nikkel essentieel is. Enkel bij cyanobacteriën, fytoplankton en enkele hogere planten is duidelijk aangetoond dat nikkel een essentieel element is (Muyssen, 2004). Het metaal cadmium wordt beschouwd als een niet-essentieel voedingselement. De concentraties aan cadmium moeten dus onder een bepaalde drempelwaarde blijven, opdat er geen toxische effecten zouden optreden. Bij de meeste invertebraten blijken de lichaamsconcentraties van cadmium niet actief gereguleerd te worden (Demuynck et al., 2004). De hoeveelheid cadmium die kan binnendringen in het weefsel bepaalt uiteindelijk de toxiciteit van het metaal. De hoeveelheden van metalen die teruggevonden worden in weefsels, laten iets merkwaardig zien. De hoeveelheden liggen meestal een stuk hoger dan nodig voor de verzadiging van de enzymatische bindingsplaatsen. Deze overmaat van metalen in weefsels suggereert een soort van regulatie en detoxificatie in de cel, want deze overmatige accumulatie van metalen zou normaal leiden tot cellulaire toxiciteit. Om de accumulatie van toxische metalen te overleven, zullen biochemische en fysiologische detoxificatieprocessen geactiveerd worden, zoals: excretie, specifieke bindingen in granulen, organellen en cellulaire liganden, enz… Doorheen de evolutie hebben zich systemen ontwikkeld in organismen, die de opname en de controle van het selectieve gebruik van essentiële micronutriënten mogelijk maken. Het is interessant om op te merken dat essentialiteit een relatief begrip is. Van de volgende metalen is de essentialiteit reeds aangetoond: Fe, Mn, Mg, Co, Cu, Zn, Mo, Se, Cr, Ni, V en Cd. Uit deze lijst blijken nikkel en cadmium essentieel te zijn voor één of meerdere organismen. Cadmium is namelijk essentieel voor sommige mariene diatomeeën (Chapman et al, 2003). Men kan besluiten dat voor elke soort de lijst aan essentiële micronutriënten anders is. 24 1.7 Opname en excretie van metalen 1.7.1 Inleiding In het dierenrijk is er doorheen de evolutie een grote verscheidenheid in de anatomie van organismen ontstaan. De inname en opname van metalen is in zekere mate soortspecifiek, doordat bij elk organisme direct en indirect verschillende weefsels blootgesteld worden met andere celeigenschappen. De migratie van metalen tot in de cel kan dus niet eenduidig beschreven worden (Foulkes, 2000). De relatie tussen de metaalconcentraties in het milieu en de metaalconcentraties in weefsels van organismen kan in beeld gebracht worden door beide te analyseren (Ravera, 2001; Soto et al., 2003). De biomonitoring van aquatische milieu’s aan de hand van metaalaccumulerende organismen is hiervan een voorbeeld. Het sterk variërende vermogen van aquatische organismen om metalen te accumuleren in het lichaam bemoeilijken kwantitatief onderzoek. De nettobalans tussen metaalopname en metaaluitscheiding bepaalt de opslag van metalen in het lichaam (Ravera, 2001; Soto et al., 2003). Aquatische organismen verschillen in strategie bij de opname van metalen. De strategie kan variëren van een sterke netto accumulatie tot een sterke regulatie van de metaalbelasting in het lichaam. Dit houdt in dat sterke netto accumulatoren bijna geen metalen uitscheiden, terwijl bij een goede regulator tot een bepaalde hoogte geen significante verschillen zijn waar te nemen in metaalbelasting van het lichaam, zelfs bij blootstelling aan hoge concentraties metalen. Deze verschillen zijn voor een groot deel (epi)genetisch bepaald. Enkele specifieke mechanismen van opname en excretie van metalen bij Daphnia magna werden reeds besproken in hoofdstuk 3. In dit hoofdstuk worden enkele algemene principes besproken. 25 1.7.2 Transport van metalen Vooraleer metalen binden aan moleculen in de cel zullen ze door het celmembraan van de cel moeten migreren (Soto et al., 2003; Pirow et al., 1999). Bivalente metaalionen kunnen via verschillende transportwegen de cel binnenkomen: 1) Eerst moet een metaal door de beschermende polysaccharide of glycoproteïne laag. Deze laag komt voornamelijk bij bacteriën voor en bestaat uit grote moleculen met functionele groepen. De geïoniseerde functionele groepen zorgen ervoor dat de laag negatief geladen is bij neutrale zuurtegraad. De (bivalente) metaalionen zijn positief geladen en verplaatsen zich gemakkelijk doorheen deze laag. Bij gewervelden en ongewervelden zullen de cellen van epitheelweefsel eerst in contact komen met opgenomen metalen. De cellen in het epithelium bevatten geen laag van polysacchariden of glycoproteïnen. 2) Bij gewervelden en ongewervelden zal het metaal zich eerst verplaatsen doorheen het cytoplasmamembraan of celmembraan van de cel. Het celmembraan bestaat uit een dubbele fosfolipidenlaag. Verder bevat het membraan ook allerlei typen proteïnen, glycolipiden en cholesterol. Het cytoplasmamembraan is semi-permeabel. Het zijn de transportproteïnen en ionkanalen die het transport van metaalionen vereenvoudigen. Het transport van stoffen doorheen het celmembraan gaat via diffusie (passief transport) of actief transport. De opname van metaalionen zal voornamelijk via actief transport plaatsvinden (fig. 1.10). 26 Verschillende transportwegen zijn (Soto et al., 2003): - transport door niet-specifieke membraanproteïnen (fig. 1.10) - transport door intrinsieke proteïnen van het celmembraan, waardoor metaalionen selectief passeren (fig. 1.10) - endocytosis (fig. 1.10) Figuur 1.10: de verschillende transportwegen waarlangs bivalente metaalionen de cel kunnen binnenkomen (Soto et al., 2003). Metalen worden blijkbaar doorheen celmembranen getransporteerd door een aantal complexe mechanismen (fig. 1.10). Ondanks het feit dat deze mechanismen in verschillende cellen (weefsels) veel gelijkenis vertonen, zijn er specifieke significante verschillen in competitie met andere metalen, de binding aan transporteiwitten, enz… (Foulkes, 2000). 27 1.7.3 Opname van metalen Wanneer een stof is opgenomen door een organisme, wordt een fractie ervan gemetaboliseerd en gebruikt voor de fysiologische behoeften (vb. energiebron, groei, reproductie) of geaccumuleerd in sommige weefsels en een deel wordt terug uitgescheiden. Door de opname van verschillende stoffen kan de lichaamsconcentratie van deze stoffen in aquatische organismen vele malen hoger liggen dan de concentratie van deze stoffen in hun leefmilieu. De uiteindelijke concentratie van een stof in een organisme is het resultaat van vele variabelen, zoals: de concentratie van de stof in het water/voedsel, de fysisch-chemische vorm, de doorlaatbaarheid van celmembranen, type en hoeveelheid voedsel, fysiologische gezondheid en karakteristieken van de omgeving. Ze hebben allen invloed op het organisme en de vorm van de verontreiniging. Beide opnameroutes (via water en voedsel) zijn belangrijk en worden sterk beïnvloed door biologische en omgevingsfactoren (Ravera, 2001). De bijdrage van beide opnameroutes aan de totale metaalaccumulatie varieert sterk naargelang het organisme. Organische en anorganische liganden komen talrijk voor. Metalen gebonden aan liganden zullen minder gemakkelijk migreren door celmembranen (Foulkes, 2000; Ravera, 2001). Verschillende metalen en andere stoffen zijn geconcentreerd in sommige specifieke organen of weefsels, deze worden “kritische” organen en weefsels genoemd (Beaty et al, 2002; Ravera, 2001). Metalen zullen bijvoorbeeld accumuleren in de carapax en de hepatopancreas bij verschillende Crustacea. Men kan met de kennis van de verspreiding van metalen in verschillende organen bepalen in welk orgaan het effect van het metaal zich eerst zal voordoen (Ravera, 2001). Eenmaal binnengedrongen in de cel binden metalen aan een grote variëteit van bestaande liganden. Deze zorgen voor het behoud van een intern gerichte diffusiegradiënt en voorkomen de verspreiding van metalen in de cel. Op deze manier, blijft de gradiënt behouden. De mate van intracellulaire accumulatie van metalen wordt bepaald door het aantal en de bindingkarakteristieken van de beschikbare metaalliganden en hun beschikbaarheid. Metaalopname kan verbeterd worden door de synthese van metaalbindende proteïnen en door metaalaccumulerende granulen en lysosomen. Bij onderzoek van metaalopname bij kreeften (Ahearn, 1994) werd vastgesteld dat cadmium een competitieve inhibitor is van calcium. De noodzakelijke opname van calcium voor de vorming van het exoskelet wordt hierdoor sterk belemmerd. 28 1.7.4 Excretie van metalen Uit een studie van Lasenby & Van Duyn (2004) blijkt dat zink en cadmium bij de kreeftachtige Mysis relicta voor een belangrijk deel wordt verwijderd met de vervellingen en dat het aantal vervellingen toeneemt bij blootstelling aan cadmium en zink. Ook andere Crustacea, vooral de Malacostraca accumuleren polluenten in het exoskelet en verwijderen deze ook met het vervellen van het exoskelet of carapax. Vele Crustacea ondergaan zo een periodieke detoxificatie tijdens het vervellen, wat verschillende keren gedurende de levenscyclus voorkomt (Ravera, 2001). Ook bij Daphnia magna kunnen metalen verwijderd worden met het vervellen van de carapax, daarnaast is er natuurlijk ook excretie van metalen op cellulair niveau. Lysosomen, vesicleblaasjes, peroxisomen en vacuolen zijn betrokken bij de cellulaire excretie van metalen. Figuur 1.11: de opname en excretie van stoffen in/uit het lichaam van organismen vertoont dikwijls bovenstaand universeel patroon. Metalen en andere polluenten zullen vanuit het milieu opgenomen worden en zich in het lichaam opstapelen. Uitgaande van een constante concentratie aan polluenten in het milieu en het organisme dat leeft in een fysiologische ‘steady state’, zal de polluentconcentratie in het organisme toenemen overeenkomend met een logistische curve. In figuur 1.11 wordt de opname en het verlies van fosfor in de zoetwaterslak Viviparus ater weergegeven (Ravera, 2001). De curve toont hetzelfde patroon als een populatiegroeicurve van populaties die leven in een milieu met gelimiteerde voedselbronnen (fig. 1.11). De groei zal in dit geval ook beperkt zijn. 29 Volgende zones (fig. 1.11) kunnen onderscheiden worden (Ravera, 2001): 1) De polluentconcentratie in het organisme neemt traag toe, maar wel in een versnellende fase (± 0-2 dagen). 2) Snelle toename van polluentconcentratie, een exponentiële curve wordt benaderd (± 2-8 dagen). 3) De polluentconcentratie neemt steeds minder toe om uiteindelijk constant te blijven. Het evenwichtspunt komt overeen met een concentratie van het polluent in het organisme en dat in het milieu. De maximumconcentratie bereikt door het organisme varieert niet over de tijd (in theorie), als de condities van het organisme en deze van zijn milieu constant worden gehouden (± 8-15 dagen). 4) In tegenstelling tot vorige zones, is er nu een continu afname van de polluentconcentratie in het milieu. Het lichaam van het organisme reageert hierop met enige vertraging en uiteindelijk zal er een overeenkomstige vermindering aan polluenten in het organisme zijn. Hetzelfde effect is waar te nemen bij het overzetten van gecontamineerde organismen in een niet-verontreinigde omgeving of als de massa van het organisme sterker groeit dan de opnamehoeveelheid van het polluent of ‘biological dilution’. In het begin is er een snel verloop van het polluentverlies uit het lichaam (±0-2 dagen), daarna vermindert en vertraagt het verlies volgens een opwaarts concaaf hyperbolisch patroon (±2-5 dagen). Dit patroon is het resultaat van de verschillende omzettingstijden van de verschillende biochemische compartimenten welke de polluenten binden (fig. 1.11). Compartimenten met een korte afbraaktijd zullen in eerste instantie natuurlijk een grotere bijdrage leveren aan de excretie van polluenten (a), dan compartimenten met een gemiddelde (b) of lange omzettingstijd (c) . De kinetiek van zowel polluentopname en –verwijdering door organismen vertoont hetzelfde patroon voor verschillende stoffen en diersoorten, terwijl de mate van opname en excretie afhankelijk zijn van de karakteristieken van het organisme, alsook van het polluent en het milieu. Daarbij is het nog interessant om op te merken dat de tijd nodig om de hoogste lichaamsconcentratie te bereiken, meestal zeer kort is in vergelijking met de tijd nodig om dezelfde polluenten via excretie te verwijderen als het organisme wordt overgezet naar een niet-verontreinigd milieu (Ravera, 2001). 30 1.8 Subcellulaire verdeling van metalen 1.8.1 Inleiding In elk fylum van het dierenrijk komen verschillende mechanismen voor die verantwoordelijk zijn voor de subcellulaire fractionatie van de metalen. Uit een studie (Stanley, 2003) blijkt dat er drie detoxificatiemechanismen kunnen onderscheiden worden voor metaalionen in invertebraten: - Specifieke, oplosbare liganden die complexen vormen met metaalionen, de belangrijkste is MT. - Compartimentalisatie van metalen in membraangelimiteerde vesiculen of lysosomale organellen. - De vorming van een onoplosbare neerslag, zoals Ca/Mg of Ca/S granulen waarin de metaalionen zijn gebonden. Deze mechanismen vertonen een verschillende graad in effectiviteit voor de detoxificatie van metalen, zowel in verschillende organismen, als in verschillende celtypen in hetzelfde organisme. Men kan de fracties van de metalen in de cel ook indelen op basis van de locatie van de metalen in de cel. Men onderscheidt proteïnen die vrij in het cytoplasma voorkomen en proteïnen in verschillende organellen van de cel (lysosomen, vacuolen). De proteïnen in het cytoplasma, waaronder MT, zijn eerder beschikbaar voor de binding van metalen. Veel organellen staan in voor de opname, opslag, transport en excretie van metalen. Deze metalen zijn dikwijls gebonden aan eiwitten. De indeling van bindingsplaatsen in fysiologisch inerte en fysiologisch actieve, wordt ook teruggevonden in de fracties (fig. 1.12) en compartimenten van de cel (Harrison et al., 2006; Wallace & Luoma, 2003). De compartimenten kunnen voorgesteld worden in een taartdiagram (fig. 1.13). Metalen gebonden aan MT of granulen behoren tot het ‘biological detoxified metal’ compartiment (BDM). Dit compartiment bevat de fysiologisch inerte fracties. Hier tegenover staat het compartiment van de fysiologisch actieve ‘metal-sensitive fractions’ (MSF). Hiertoe behoren organellen en hittegevoelige enzymen. De relatieve verhoudingen van BDM en MSF variëren tussen soorten. Een hogere proportie van MSF zal leiden tot een hogere gevoeligheid voor metaaltoxiciteit. 31 Figuur 1.12: hypothetische relatie tussen chronische metaalblootstelling en subcellulaire metaalverdeling: (A) initiële bescherming van metaalgevoelige compartimenten tot een drempelwaarde, (B) lineaire accumulatie in de metaalgevoelige compartimenten, zonder drempelwaarde (Harrison et al, 2006). 32 De subcellulaire fracties kunnen nog op een tweede manier worden ingedeeld: in hittegevoelige proteïnen, hittestabiele proteïnen en onoplosbare fracties (Giguère et al., 2006; Shi & Wang, 2004; Tsui & Wang, 2005). Veel enzymen behoren tot de hittegevoelige proteïnen. Hittestabiele proteïnen zijn voornamelijk MT en nauwverwante proteïnen. Tot de onoplosbare fracties behoren cellulaire resten (nuclei, celmembranen, bindweefsel en intacte cellen), metaalrijke granulen en organellen. De ‘biological detoxified metal’ fracties bestaan onder andere uit hittestabiele eiwitten, terwijl de ‘metalsensitive’ fracties voor een groot deel bestaan uit hittegevoelige enzymen. Figuur 1.13: een ecotoxicologisch taartdiagram toont de verdeling van de subcellulaire compartimenten gebaseerd op de biologische significantie van de subcellulaire fracties. Subcellulaire fracties die potentieel gevoelig zijn aan metaalblootstelling (organellen en enzymen) worden tot het subcellulaire compartiment ‘metal-sensitive fractions’ of MSF gerekend. De fracties die betrokken zijn bij de metaaldetoxificatie (MT en MRG) zijn de ‘biologically detoxified metal’ of BDM. Fracties die metalen bevatten die duidelijk beschikbaar zijn voor predatoren (organellen, enzymen en MT) zijn de ‘trophically available metals’ of TAM (Wallace & Luoma, 2003). De metaalconcentratie in weefsels van organismen neemt toe met het trofisch niveau in een gecontamineerd ecosysteem. Aan de basis van dit fenomeen ligt de eigenschap van metalen om te accumuleren in weefsels. Op cellulair niveau is het interessant om te kijken welke fracties nu precies beschikbaar zijn voor predatoren. Metalen in MT, enzymen en organellen blijken tot de ‘trophically available metals’ te behoren (Cain et al., 2006; Wallace & Luoma, 2003). 33 1.8.2 Liganden De belangrijkste en meest voorkomende liganden in de cel zijn de eiwitten of proteïnen. Eiwitten of peptiden die een belangrijke rol spelen in de regulatie van metalen in de cellen van invertebraten werden opgedeeld in twee klassen. Verder onderzoek heeft een derde klasse aan het licht gebracht (Vatamaniuk et al., 2001): - MT’s: bestaande uit verschillende families van kleine cysteïnerijke peptiden. - Antioxidant enzymen, voornamelijk glutathion: een tripeptide met een thiolaatgroep (GSH, gamma-Glu-Cys-Gly). - Phytochelatine: phytochelatine is verantwoordelijk voor de detoxificatie van metalen in planten en fungi. De proteïne is zoals MT een metaalbindende polypeptide. Recent onderzoek (Vatamaniuk et al., 2002) heeft voor het eerst aangetoond dat het ook voorkomt en een essentiële rol speelt in de detoxificatie van metalen bij een invertebraat, namelijk de nematode Caenorhabditis elegans. Het enzyme phytochelatinsynthase staat in voor de synthese van het gelijknamige eiwit/peptide phytochelatine. De synthese gebeurt in de cel uit glutathion en nauwverwante thiolaten. Later zijn ook phytochelatine synthase coderende basensequenties gevonden in het genoom van andere invertebraten, wel nog niet in de hogere invertebraten van de orde Crustacea en Mollusca. 1.8.3 Metallothioneïne Historie Metallothioneïne (MT) staat eigenlijk voor een superfamilie van metaalbindende proteïnen (Klaassen et al., 1999; Amiard et al., 2006). In 1957 werd MT voor het eerst aangetoond in een lever van een paard. Tegenwoordig is MT geïsoleerd uit veel groepen eukaryoten, waaronder vertebraten en invertebraten. Het is nu bekend dat MT in organismen uit alle takken van het dierenrijk voorkomt. Een MTLP of ‘metallothionein-like proteïn’ werd voor het eerst geïsoleerd uit de mossel Mytilus edulis door Noël Lambot in 1976 (Stanley, 2003). De laatste decennia werd MT verder gekarakteriseerd en geïsoleerd uit een hele reeks invertebraten, waaronder aquatische invertebraten uit de ordes Crustacea, Mollusca en Annelida. Onder de Crustacea werden MT’s en MTLP’s gevonden bij veel verschillende soorten, waaronder Daphnia magna (Amiard et al., 2006). 34 Het aantal publicaties over MT en MTLP’s in aquatische invertebraten is groot en neemt jaarlijks toe. Ondanks de vele studies is er nog steeds onenigheid over o.a. de fysiologische rol van MT en hun gebruik als biomarker in monitoringsprogramma’s (Amiard et al., 2006). Synthese van metallothioneïne De synthese van MT wordt geïnduceerd door de aanwezigheid van metalen (Amiard et al., 2006; Cobbett & Goldsbrough, 2002; Hensbergen, et al., 1999; Klaassen et al., 1999; Roesijadi, 1994). Het concentratieniveau van deze metaalbindende proteïnen in weefsels wordt sterk beïnvloed door veranderingen in milieucondities, zoals temperatuur, zuurstofgehalte in het water en de seizoenen. Metalen kunnen, in tegenstelling tot organische verontreinigingen, de productie van MT induceren bij mosselen. Onderzoek bij gewervelden (vissen, zoogdieren) toont aan dat MT wel geïnduceerd wordt door organische stoffen (Klaassen & Liu, 1998). De verplaatsing van metaalionen doorheen het celmembraan activeert de synthese van apothioneïnen, die de metaalionen cheleren. Bij verschillende onderzochte invertebraten is aangetoond dat er een zekere tijdsperiode zit tussen het tijdstip van blootstelling en de productie van MT. Het lichaam van een organisme reageert niet direct op hoge concentraties metalen en eerst zullen andere macromoleculen instaan voor de detoxificatie van metalen in de cel. MT beschermt celstructuren van niet-specifieke binding van metaalkationen en de detoxificatie van een overmaat aan metalen in de cel (Amiard et al., 2006). De niet-specifieke metaalbinding zorgt onder andere voor de inactivatie van enzymen, waardoor bepaalde celfuncties stilvallen (Amiard et al., 2006; Demuynck et al., 2004). Uit een studie (Bardsley et al., 1974) blijkt dat ook stoffen die metaalionen cheleren kunnen zorgen voor de inhibitie van enzymen. Er worden twee rollen aan MT toegekend (Amiard et al., 2006; Roesijadi, 1994): - Deze proteïnen vormen een niet-toxisch zink- en koperreservoir. Zo is de beschikbaarheid van deze metalen verzekerd voor de synthese van metalloenzymen - Reductie van de niet-specifieke binding van niet-essentiële metalen in de cel en bescherming tegen celtoxiciteit. 35 Weefsels direct betrokken bij metaalopname, opslag en excretie hebben een hogere MTsynthesecapaciteit. In aquatische organismen is deze proteïne teruggevonden in de hepatopancreas en in de filterorganen (kieuwen, setae) van Crustacea (Amiard et al., 2006). Het basisniveau van MT of (MTLP’s) in Crustacea van ongecontamineerde milieu’s is hieronder weergegeven (tabel 1.1). Tabel 1.1: basale concentraties van MT’s in Daphnia magna uit ongecontamineerde biotopen (Amiard et al., 2006). Soort Weefsel Concentratie (mg g−1 dw of ww) Daphnia magna volledig organisme? 1.8 ± 0.7 b b 109 Cd/haemoglobine assay. Studies van Daphnia magna onder laboratoriumcondities tonen aan dat MT of MTLP wordt geïnduceerd bij blootstelling aan cadmium. Deze waarnemingen heeft men nog niet kunnen bevestigen onder veldcondities (Amiard et al., 2006). Bij Crustacea uit zoetwater en marien milieu, waaronder Daphnia magna, is in respons op cadmiumblootstelling (100 µg l−1 tot 10 mg l−1) een inductie van MT geobserveerd na 2– 24 uur (Amiard et al., 2006). Structuur MT is een proteïne/polypeptide, voor een groot deel bestaande uit het aminozuur cysteïne. Alle cysteïnegroepen zijn betrokken bij de chelatie van de metalen, door de vorming van metaalthiolaatbindingen. Cysteïne bindt metaalionen door het afsplitsen van het aan het zwavelatoom gebonden waterstofatoom. Er vormt zich een covalente binding tussen het zwavelatoom en het metaalatoom. In totaal kunnen 7 bivalente metalen (vb. Zn, Cd,…) of 10-12 univalente metalen (vb. Cu, Ag,…) binden aan MT (fig. 1.14.). De metalen zijn georganiseerd in 2 clusters en in elke cluster zullen aangrenzende metaalionen hetzelfde thiolaat (zwavel) ligand delen (Klaassen et al., 1999). 36 Figuur 1.14: metaalclusters in MT : vier en drie atomen van cadmium (Cd) zijn respectievelijk gecoordineerd in een α- en β- cluster van MT (Klaassen et al., 1999). MT zorgt ervoor dat de hoeveelheid vrije metaalionen laag blijft in de cel. Het gedrag van MT wordt bepaald door de chemische eigenschappen van de thiolgroep. De MT’s zijn bijna nooit verzadigd door één metaal. Cu, Zn, Cd, Hg, Ag en Ni zijn de meest courante metalen die binden in één van beide clusters van de molecule thioneïne. Polymorfisme blijkt opvallend belangrijker bij invertebraten dan bij vertebraten. Variaties in moleculaire massa werden ook geobserveerd, dit suggereert de aanwezigheid van monomerische en dimerische vormen. MT heeft enkele specifieke karakteristieken (Amiard et al., 2006): 1) laag moleculair gewicht: 6000-7000 Da1 (LMW-pool). 2) bevat 58 (tot 74) aminozuren. 3) gedeeltelijke dissociatie in de cel. 4) behoud van stabiliteit bij hoge temperaturen. 5) hoog gehalte aan metalen en zwavel. 6) samenstelling van aminozuren met hoog cysteïne gehalte (18-20 cysteïne aminozuren), afwezigheid van aromatische aminozuren en histidine. 7) polypeptide met een unieke aminozurensequentie, vooral wat betreft de plaatsing van cysteïne. 8) spectroscopische eigenschappen typisch voor de karakteristieke metaalthiolaatgroepen. 9) unieke aminozuur sequentie: Cys-X-Cys (X staat voor een willekeurig aminozuur). 1 Dalton (Da) is een eenheid van moleculair gewicht, hierbij is 1 dalton gelijk aan 1 atomaire massa-eenheid en deze is weer gedefinieerd als 1/12 van de massa van een neutraal 12C atoom. 37 Affiniteit en classificatie MT heeft een grote affiniteit voor “zachte metalen” metalen en “borderline metals” met een karakter van “zachte metalen”. De affiniteit is bepaald door het hoge cysteïnegehalte (rijk aan SH, >30%), dit maakt de vorming van stabiele thiolaatgroepen mogelijk. Door de eigenschappen van cadmium als “zacht metaal” vertoont het een grote affiniteit voor MT. Men heeft ‘in vitro’ volgende afnemende affiniteit vastgesteld in MT’s (Amiard et al., 2006; Vasak, 1991): Hg2+ > Cu+, Ag+, Bi3+ Cd2+ > Pb2+ > Zn2+ > Co2+ Hieruit kan worden afgeleid dat bijvoorbeeld het essentiële element zink zijn bindingsplaats kan verliezen aan een reeks toxische metalen, waaronder cadmium. MT is nog steeds de enige gekende biochemische molecule die van nature hoge gehaltes cadmium bevat, ook de essentiële elementen zink en koper komen veel voor in MT. MT komt voornamelijk voor in het celvocht van het cytoplasma, maar kan ook aanwezig zijn in de nucleus en de lysosomen van de cel. Volgens Fowler et al. (1987) en Kojima (1991) kunnen MT’s onderverdeeld worden in drie groepen: - Klasse I: Deze bevatten de polypeptiden met locaties van cysteïne gelijkaardig aan de polypeptide MT-1B uit paarden. Tot deze klasse behoren naast het MT van zoogdieren, ook deze van de Crustacea, Pisces en de Mollusca. Tot deze klasse behoort dus het MT in Daphnia magna. - Klasse II: Deze bevatten de vormen die slechts verre overeenkomst vertonen met de vorm van Klasse I en o.a. aangetroffen werden bij gisten en nematoden. - Klassse III: gamma-glutamylcysteinyl bevattende polyisopeptiden worden ondergebracht in deze klasse, dit type MT werd reeds geïsoleerd uit planten en micro-organismen. Recent werd een andere indeling opgesteld, gebaseerd op de fylogenetische relatie tussen verschillende diergroepen en de gelijkenis van de aminozuursequentie. Dit wordt hier niet verder besproken. 38 Intracellulaire verspreiding van metalen en inductie van MT Figuur 1.15: de verschillende routes van de intracellulaire verspreiding van metalen en de relatie met de inductie van MT. In de niet geïnduceerde toestand (A), zal de synthese van MT laag liggen. Dit is het basale metabolisme van de metaalregulatie. Metaalafhankelijke transcriptie wordt geregeld door interacties van ‘metal-regulatory factors’ (MRF) en ‘metal-regulatory elements’ (MRE). In hogere eukaryoten is een actieve MRF gekend, die wordt geïnhibeerd door een transcriptionele inhibitor, die enkel vrijkomt door de aanwezigheid van vrije zinkionen. Andere metalen zullen MT induceren door de verplaatsing van zink van intracellulaire bindingsplaatsen in L1 (metaalbindend ligand ‘nonthionein pool’ of lysosoom) naar het cytoplasma. Dit maakt extra zink beschikbaar voor interactie met de inhibitor. Verhoogde metaalinflux (B) zal zorgen voor de inductie van thioneïne, doordat er steeds meer zink vrijkomt en door het verhoogde transport van metalen naar MT. De directe binding aan MT spaart andere celstructuren van de effecten van metalen. MT zal deelnemen aan de metaaluitwisselingsreacties, waarbij essentiële metalen worden vrijgegeven en toxische metalen worden gebonden die eerst gebonden waren aan metaalgevoelige enzymen (‘nonthionein pool’) L1. Andere metaalbindende celstructuren, waaronder granulen, lysosomen en vesiculen in aquatische organismen behoren ook tot L1 (Roesijadi, 1994). 39 Er werd een model (Roesijadi, 1994) van de MT-inductie opgesteld (fig. 1.15). Het werd bekomen uit de huidige kennis van de regulatie van MT genexpressie en de adaptatie van aquatische organismen. De inductie van MT gaat samen met de transriptie en translatie (eiwitsynthese) van de gelijknamige genen. Informatie geassocieerd met een toename in cellulaire inhoud van metalen wordt overgedragen aan MT-genen door metaalactieve transcriptiefactoren. Deze transcriptiefactoren binden aan specifieke metalen, waarna ze de expressie van MT-genen initiëren. Dit resulteert in een samenloop van gebeurtenissen, geassocieerd met transcriptie, eiwitsynthese van apothionein, en het binden van deze laatste aan metaalionen om MT te vormen. De inductie van MT is sterk variabel en verschilt zowel sterk tussen soorten, als binnen eenzelfde soort. Bij MT zijn er vier verschillende isovormen van MT-genen: MT-I, MT-II, MT-III en MT-IV. MT-I en MT-II komen tot expressie in alle weefsels bij verschillende soorten eukaryoten. Ze zijn in deze weefsels slechts in kleine aantallen aanwezig onder normale condities. De expressie van MT-III is beperkt tot de glutamaat in neuronen in de hersenen van zoogdieren en MT-IV is terug te vinden in de epitheelcellen van de huid, darmstelsel en tong. De veel voorkomende MT-I en MT-II worden beschouwd als belangrijke regulatoren van het cellulaire detoxificatiemechanisme, waarbij metalen en vrije radicalen worden gebonden. Een variëteit aan stoffen, waaronder metalen, vrije radicalen en andere stressoren zijn sterke inductoren en zorgen voor een verhoogde regulatie van de MTgenen (Ghoskal et al., 2000). De transcriptiefactor MTF-1 reguleert de transcriptie van het MT-gen tijdens de eiwitsynthese door specifiek te binden aan een aantal MRE’s of ‘metal responsive elements’ die zich in de promotor/enhancer regio bevinden van een aantal metaal- en stressrespons genen. MTF-1 is een zinkresponsproteïne die de transcriptie van MT-genen controleert in vele cellen. Transcriptiefactoren binden aan DNA-sequenties, geven signalen aan de cel om de eiwitsynthese uit te voeren. ‘Zinc-finger’ transcriptiefactoren werden al goed bestudeerd en zijn de meest voorkomende familie van transcriptiefactoren in verschillende genomen, met meer dan 1000 gekende vormen. Vele cellulaire proteïnen, zoals de enzymen DNA en RNA polymerase samen met de transcriptiefactoren (Sp 1, MTF1,…) hebben zink nodig voor hun optimale activiteit (Zeng et al., 1991). MT kan functioneren als zinkdonor en als zinkacceptor en daarbij de activiteit controleren van deze belangrijke regulerende eiwitten. Verder kunnen metalen verdeeld worden van thioneïne naar de lysosomen. De lysosomen werken als minder reactieve opslagplaatsen. Ze kunnen degradatieproducten bevatten 40 van MT’s, waarbij ze werken als finale opslagplaats van gedegradeerde MT’s en andere metaalbindende proteïnen. Lysosomen en andere blaasjes in de cel, reduceren de toxiciteit van metalen door metaalionen via exocytose en excretie te verwijderen uit het lichaam. De rol van MT in de tolerantieontwikkeling (adaptatie en acclimatisatie) aan metaalstress is cruciaal en levert een grote bijdrage in de werking van aquatische ecosystemen, in termen van biomassa, ecosysteemstructuur en functie. In bijlage 4 zijn nog enkele modellen terug te vinden van de verdeling van metalen en de inductie van MT. 1.8.4 Antioxidant enzymen Antioxidant enzymen beschermen de inhoud van cellen (DNA, RNA, proteïnen) tegen oxidatieve stress. Om de schadelijke effecten van de pro-oxidant activiteit van metalen in het algemeen te voorkomen, zullen antioxidant enzymen een beschermende functie vervullen in verschillende weefsels. De redoxbalans van een gezonde cel is in evenwicht. Deze balans wordt bepaald door de aanwezigheid van pro-oxidanten (radicalen, reactieve zuurstofvormen,…) ten opzichte van de antioxidanten. Antioxidanten zijn alle elementen die de cel tegen de pro-oxidanten beschermen. Door de aanwezigheid van externe stressfactoren wordt dit evenwicht verstoord en treedt “oxidatieve stress” op. Bij blootstelling aan metalen, bepalen de biobeschikbaarheid, de accumulatie en de toxiciteit van metalen sterk de activiteit van de vrije metaalionen of de onstabiele metaalcomplexen. In eerste instantie zal het eiwit thioneïne slechts een ondergeschikte rol spelen in het binden van metaalionen en zullen metalen binden aan antioxidant enzymen, waaronder glutathion. Het duurt een zekere periode voor de concentratie aan MT hoog genoeg is om een overmaat aan vrije metaalionen te binden. Glutathion (GSH of g-glutamylcysteinylglycine) is één van de belangrijke antioxidant enzymen in het lichaam van vele eukaryoten. GSH is een thiolrijk enzyme dat de meest voorkomende redoxbuffer is in eukaryotische cellen (Prakash & Rao, 1995). GSH komt in veel hogere concentraties voor dan MT. De meeste cellen kunnen geen glutathion opnemen, maar ze kunnen wel de basisaminozuren opnemen. De basisaminozuren zijn: cysteïne, cysteïnylglycine en g-glutamylcysteïne. Deze aminozuren worden door de cel gebruikt voor de synthese van GSH. Het glutathion (GSH)/glutathion-S-transferase (GST) systeem is een algemeen mechanisme voor detoxificatie van allerlei polluenten. Naast GSH zijn er nog een aantal antioxidant enzymen (Barata et al., 2005, Cervera et al., 2003; Dierickx, 1984; Praknash & Rao, 1995): katalase (CAT), glutathion reductase (GR), glutathion-S-transferase (GST), thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), 41 superoxide dismutase (SOD), glutathion-peroxidase (GSH-Px), lipide peroxidase (LPO), e.a. Ze worden in verhoogde concentratie teruggevonden bij invertebraten bij blootstelling aan metalen. Antioxidant enzymen komen ook voor bij Daphnia magna. De activiteit van de belangrijkste antioxidant enzymen, waaronder CAT, SOD, GSH-Px en LPO werden vastgesteld door metingen van TBARS. Men toonde aan dat de leeftijdsgebonden afname van overlevingskansen samengaat met een toename in oxidatieve stress en oxidatieve schade. De toename van oxidatieve stress met de leeftijd bij Daphnia magna heeft aanwijzingen voor een toename van de vorming van lipide peroxiden en het verlies van de belangrijkste antioxidant enzymen. De afbraak van het antioxidant verdedigingsmechanisme draagt vermoedelijk direct bij aan de oxidatieve stress, lipide peroxidatie van celmembranen en een afname in overlevingskansen (Barata et al., 2005). Vele studies duiden op het grote belang van cellulaire defensiesystemen als biomerkers bij ecotoxicologische studies en de biomonitoring van soorten in verontreinigde milieus (Vasseur & Leguille, 2004). 1.8.5 Andere metaalbindende proteïnen Uit onderzoek blijkt dat MT en in mindere mate antioxidantenzymen de belangrijkste eiwitten zijn ter bescherming van de cel tegen toxische metalen, toch is het belang van enkele andere cytosolische proteïnen niet te verwaarlozen. De verschillende eiwitten waarin metalen nog aanwezig kunnen zijn in een organisme, zijn (Stanley, 2003; Vijver et al, 2004): - actieve centra van functionele proteïnen (hemoglobine, hemocyanine,…) - actieve centra van enzymen (cytochromen, SOD,…) - LMW-proteïnen (zinkvingerproteïnen, taurine, lysine, ATP,…) - HMW-proteïnen - transport- en opslageiwitten (albumine, ferritin, macroglobuline,…) Naast eiwitten zijn metalen ook terug te vinden in LMW-organische zuren (bijvoorbeeld citraat). De metaalbindende macromoleculen die zorgen voor de opslag van metalen in de cel, dragen bij tot het vergroten van de capaciteit van de totale metaalbelasting door meer metaalionen te binden. De meeste van deze proteïnen worden voortdurend gesynthetiseerd en afgebroken. De synthese van macromoleculen zorgt voor een buffer op de metaalconcentratie in de cel (Stanley, 2003). 42 1.8.6 Organellen en granulen Granulen Bij vertebraten zijn detoxificatieprocessen vooral afhankelijk van de metaalbindende capaciteit van MT, terwijl er voornamelijk twee mechanismen belangrijk zijn voor de detoxificatie van metalen bij invertebraten (Stanley, 2003). Naast MT spelen namelijk biomineralisatieprocessen een belangrijke rol. Biomineralisatie is vooral gekend door de structuren die ontstaan tijdens dit proces. Schelpen en andere vormen van het harde uitwendige skelet van ongewervelden zijn de bekendste voorbeelden. Minder gekend zijn de intracellulaire granulen. Ze worden teruggevonden in alle grote groepen invertebraten en zijn voornamelijk aanwezig in organen met verterings-, excretie- en opslagfuncties (Soto et al., 2003). Uit onderzoek (Vijver et al, 2004; Wallace et al, 2003) blijkt dat granulen de belangrijkste rol spelen bij langdurige blootstelling van een organisme aan metalen. Bij acute blootstelling blijkt vooral MT de cel te beschermen tegen metaaltoxiciteit. Granulen kunnen in en buiten de cellen teruggevonden worden, toch zijn het voornamelijk intracellulaire granulen en slechts zelden extracellulaire. Specifieke granulen verschillen van cel tot cel, waardoor bepaalde metalen zullen binden in verschillende celtypen. Er zijn twee vormen te onderscheiden in metaalbindende granulen (Stanley, 2003): - Granulen die betrekking hebben op lysosomale systemen voor hun vorming. - Granulen die gevormd zijn uit onoplosbare neerslagen van metalen. De twee vormen van granulen kunnen nog eens onderverdeeld worden in groepen, gebaseerd op hun verschillende locatie, compositie en structuur (Simkiss & Taylor, 1994; Soto et al., 2003; Stanley, 2003). 1) Granulen die het carbonaatanion bevatten, ook koolstofgranulen genoemd, worden meestal teruggevonden in het bindweefsel en zijn over het algemeen van belang bij de opslag en immobilisatie van calcium en in mindere mate magnesium. Ze worden gevormd in het Golgi-apparaat. Transitiemetalen worden weinig tot niet geïncorporeerd in de granulen. Verder zouden ze verantwoordelijk zijn voor de ionregulatie en pH-schommelingen van het lichaamsvocht in organismen. 43 2) Een groot aantal ongewervelden en gewervelden heeft cellen die intracellulaire granulen van amorfe CawMgx(PO4)2 of CayMgz(P2O7) produceren. Deze granulen worden ook wel fosfaatgranulen genoemd en zouden werken als plaatsen voor de opslag en detoxificatie van metaalionen (fig. 1.16). Naast calcium, kunnen er ook granulen voorkomen die magnesium, kalium, mangaan, ijzer of zink bevatten. Het zijn membraangebonden granulen met opvallende concentrische ringen. Ze komen in verschillende weefsels voor en bevatten veel liganden met zuurstofgroepen (fig. 1.16). Dit verklaart hun affiniteit voor bovengenoemde “harde” metalen en ook wel ‘borderline metals’ met het karakter van “harde” metalen, zoals zink. In (zeer) kleine hoeveelheden komt ook wel eens een “zacht” metaal voor, zoals cadmium ( Simkiss & Taylor, 1994; Soto et al., 2003; Stanley, 2003). De granulen zijn meestal amorf van structuur en sterk gehydrateerd. Men kan ook spreken van anorganische granulen, want ze bestaan voor het grootste deel uit anorganisch materiaal. Ze bevatten naast metalen, ook een groot deel water en een kleine hoeveelheid organische componenten. Figuur 1.16: een model van het netwerk van moleculen in een CaMgP2O7 granule (Simkiss & Taylor, 1994) 44 3) Granulen bestaande uit meer dan één anion komen ook veel voor. Deze typen granulen vallen uiteen in twee groepen: a. Granulen bestaande uit carbonaat, oxalaat en fosfaat b. Granulen bestaande uit fosfor, zwavel en chloor De eigenschappen van de verschillende moleculen in de granulen bepalen hun functie in de cel. 4) Het laatste type van granulen en waarschijnlijk de belangrijkste naar detoxificatie van verschillende ‘borderline’ metalen en “zachte” metalen zijn de zwavelgranulen. Men vermoedt dat deze granulen sterk gerelateerd zijn aan metaalbindende proteïnen, zoals MT. De zwavelgranulen zijn membraangebonden. De voornaamste gebonden kationen zijn: koper, zink, cadmium en kwik. De granulen bevatten geen concentrische ringen en ze blijken een andere oorsprong te hebben dan de hierboven beschreven carbonaat- en fosfaatgranulen. Een hypothese stelt dat zwavelgranulen degradatieproducten van MT bevatten, als gevolg van de lysosomale activiteiten in de cel. Intracellulaire granulen die werden onderzocht bij vele invertebraten blijken lysosomaal van oorsprong te zijn. Sommige granulen worden ook beschouwd als tertiaire lysosomen of restlichamen. Lysosomen Lysosomen zijn membraangebonden organellen in het cytoplasma van de cel. Ze worden in alle eukaryote cellen teruggevonden. Ze bevatten ongeveer 40 verschillende enzymen (Beukema, 2005), waaronder zure hydrolasen (pH 5). Deze hydrolasen katalyseren de hydrolysereacties in het lysosoom, waarmee allerlei moleculen worden afgebroken. Naast de vertering en afbraak van intracellulaire componenten (macromoleculen en niet functionerende organellen), zal het lysosoom een hoofdrol spelen in de intracellulaire vertering van componenten die via endocytose in het lysosoom worden getransporteerd, waaronder metaalionen. Metalen kunnen in vrij grote hoeveelheden voorkomen in lysosomen, daar zijn ze vooral gebonden aan zwavelhoudende moleculen, zoals gedegradeerde MT’s en zwavelgranulen. Slechts zelden zijn er ook granulen met zuurstofgroepen, zoals fosfaat- of koolstofgranulen aanwezig in lysosomen. Lysosomen die verteringsenzymen bevatten, ontstaan in de buurt van het Golgi-apparaat, waar ze zich afsplitsen van het endoplasmatisch reticulum. Deze organellen worden primaire 45 lysosomen genoemd. Snel na de vorming van de primaire lysosomen, versmelten zij met fagosomen, vesiculen of vacuolen. Zij vormen dan secundaire lysosomen. Het is het secundaire lysosoom dat een vrij lage zuurtegraad (pH 5) heeft en waar het verteringsproces in gang wordt gezet door verteringsenzymen. Eenmaal de activiteit van de verteringsenzymen stopt, worden deze lysosomen beschouwd als tertiaire lysosomen. Deze tertiaire lysosomen vormen dan opslagplaatsen van onverteerbare resten van organellen/membranen, proteïnen, vetten en metalen. Een belangrijke rol is weggelegd voor lipofuschin. Het is een lipoproteïne met een hoog gehalte aan cross-links. Zij accumuleren in lysosomen en worden beschouwd als het eindproduct van de fysiologische afbraak van het eigen celmateriaal (Stanley, 2003). De belangrijkste componenten van lipofuschin zijn: proteïnen (30-70%), vetten (20-50%), carbohydraten (4-7%) en sporen van metalen. Deze waarden zijn gebaseerd op analyses van het weefsel van zoogdieren (Stanley, 2003). Vacuolen Voor enkele invertebraten, waaronder enkele bivalven, gastropoden en de zoetwaterslak Bellamia unicolor (AbdAllah, 2003) werd aangetoond dat het toxische effect geïnduceerd door een acute of chronische blootstelling aan lethale of sublethale concentraties van metaalverontreinigingen enkele histopathologische gevolgen heeft. Eén van de belangrijke histopathologische kenmerken is de toename van het voorkomen van vacuolen in weefsels waar metalen worden geaccumuleerd. Vacuolen zijn vergelijkbaar met lysosomen. Ze vervullen gelijkaardige functies, zoals het behoud van een balans tussen productie en degradatie van verschillende celstructuren. Ze nemen allerlei kleine moleculen en organellen op, die kunnen ze transporteren en degraderen in de cel. In vacuolen treedt autofagocytose op. Autofagocytose is een normaal degradatieproces in alle eukaryotische cellen. Het proces wordt gestimuleerd door allerlei stressfactoren vanuit het milieu. Celsterfte wordt tegengegaan door de vorming van vacuolen, die toxische moleculen binden uit het cytoplasma. Na het opnemen van stoffen uit het cytoplasma, zal het vacuolemembraan versmelten met een lysosoom. De inhoud zal in het lysosoom gedegradeerd worden en de gevormde macromoleculen gerecycleerd. De bijdrage van andere organellen (mitochondrieën, golgi-apparaat, ribosomen,…) aan de detoxificatie van metalen in de cel is te verwaarlozen of nog niet grondig onderzocht en wordt daarom niet verder besproken. 46 1.9 De invloed van stress op het epigenoom 1.9.1 Inleiding: de epigenetica Lang werd gedacht dat het milieu slechts een beperkte rol speelde in de ontwikkeling van organismen, namelijk op fysiologische niveau (acclimatisatie). Uit recente studies (Akhtar & Cavalli, 2005; Bombail et al, 2004; Gilbert, 2005; Mandrioli, 2004; Watson & Goodman, 2002) blijkt dat het milieu een belangrijke invloed heeft op het genoom. Het genoom van organismen zou zo zijn geëvolueerd dat het reageert op zijn omgeving. De omgeving zou instructieve mogelijkheden hebben en het uiteindelijke fenotype mee bepalen. De zoektocht naar de mate waarin organismen zijn voorgeprogrammeerd, dan wel gevormd zijn onder invloed van de omgeving, begon al in de oudheid. Aristoteles (384-322 v. Chr.) geloofde in epigenese: de ontwikkeling van een op zichzelf staand levend organisme vanuit het ongevormde. In een werk van 1894, ‘The Biological Problem of Today: Preformation or Epigenesis?’, wordt al melding gemaakt van een relatie tussen de ontwikkeling van organismen en het milieu. De term ‘epigenesis’ werd hier ook voor het eerst gebruikt (Gilbert, 2005). De term epigenetica zoals we die nu kennen werd voor het eerst gebruikt door Conrad Hal Waddington in 1942 (Akhtar & Cavalli, 2005; Haig, 2004; NoE, 2006). Waddington stelde dat het fenotype van een organisme wordt gevormd door de interactie tussen het vaststaande genotype waarover ieder organisme beschikt en de omgeving waar het zich in bevindt. Figuur 1.17: schematische voorstelling van de invloed van het milieu op het genoom (Akhtar, & Cavalli, 2005). 47 De epigenetische gencontrole heeft een belangrijke impact op verschillende biologische processen (fig. 1.17). De implicaties voor de landbouw, biologie, geneeskunde zullen in de toekomst steeds duidelijker worden (Akhtar, & Cavalli, 2005). De epigenetica is nog steeds een relatief nieuwe tak binnen de moleculaire biologie. Epigenetici zoeken en onderzoeken nog volop fenomenen die tot het domein van deze wetenschappelijke discipline behoren. Genetische studies naar de variatie in fenotypes, zoals de oogkleur van de fruitvlieg Drosophila melanogaster en X-chromosoom inactivatie bij zoogdieren, behoren tot de eerste onderzoeken binnen de epigenetica (Wade & Archer, 2006). De epigenetica staat nog in haar kinderschoenen en dat is terug te vinden in de verschillende definities waarmee de epigenetica wordt omschreven. Sommige definities zijn zeer algemeen en omvatten alle mechanismen die leiden tot de fenotypische expressie van het genotype. Andere definities beschouwen de moderne epigenetica als de studie van de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor modificaties in de genexpressie zonder dat de DNA-sequentie wordt gewijzigd. Deze definitie wordt nog specifieker omschreven als een set van omkeerbare overerfbare wijzigingen in genexpressie, die voorkomen in afwezigheid van wijzigingen in de genoomsequentie. De wijzigingen in genexpressie worden overgeërfd en zijn stabiel doorheen alle mitotische en meiotische delingen (Bombail et al, 2004; Field et al., 2004; Gilbert, 2005; Watson & Goodman, 2002; Weinhold, 2006). De epigenetische informatie is zeer stabiel, want naast het behoud van de epigenetische informatie na mitosis of meiosis, blijft de epigenetische informatie ook behouden na het overzetten van de nucleus naar een andere eicel tijdens het klonen (Wade & Archer, 2006). Een belangrijk kenmerk van de epigenetica is het ongewijzigd blijven van de basensequentie van het DNA (genotype), dit staat in contrast met de genetica (Bombail et al., 2004). De genetica bestudeert de erfelijkheid van genetische informatie die gebaseerd is op het verschil in genoomsequentie. De veranderingen in genexpressie kunnen spontaan gebeuren als respons op omgevingsfactoren. De epigenetische erfelijkheid kan verantwoordelijk zijn voor de verschuiving van patronen van genexpressie en daarbij optreden als buffer tegen veranderingen geïnduceerd door het milieu. De epigenetische erfelijkheid kan dan bijdragen tot de micro-evolutie bij organismen, dit stelt enkele ideeën uit de genetica en de evolutietheorie van Darwin in vraag. Evolutie zou dus niet enkel gebaseerd zijn op willekeurige mutatie en natuurlijke selectie (Watson & Goodman, 2002). Epigenetica wordt soms ook beschreven als de modificatie van histoneneiwitten en de DNA-methylatie (Mandrioli & Borsatti, 2005; 48 Watson & Goodman, 2002). Beide epigenetische mechanismen komen voor in het genoom van eukaryotische organismen. - De histonenmodificatie: Vier histoneiwitten (H2A, H2B, H3 en H4) vormen samen het nucleosoom. Een structuur die wordt gebruikt om het DNA in de kern te verpakken (Sperling, 2005; NoE, 2006). DNA zit gewikkeld rond deze histonen (fig. 1.18). De verschillende typen histonen zijn kleine proteïnen, gekenmerkt door een proteïnekern met histonenstaarten. Het zijn vooral deze histonenstaarten die van belang zijn in epigenetische mechanismen. De histonenstaarten zijn het onderwerp van verschillende typen DNA-modificaties. Deze modificaties bestaan uit de toevoeging of verwijdering van chemische verbindingen, zoals acetyl-, methyl- , fosfaatgroepen en ubiquitylgroepen aan histonencomplexen. Deze veranderingen wijzigen de aard van het nucleosoom, waardoor het chromatine meer ‘open’ of meer ‘gesloten’ is, wat een invloed heeft op de transcriptie van genen. Het chromatine is namelijk opgebouwd uit de nucleosomen (fig. 1.18). De sterke opvouwing van het DNA in de nucleosomen en vervolgens in structuren van hogere orde maakt het mogelijk zeer veel DNA te verpakken in de celkern. Er is euchromatine en heterochromatine. Heterochromatine is sterk gecondenseerd, terwijl euchromatine veel minder compact is. Actieve genen bevinden zich bijna uitsluitend in een regio van euchromatine. Er zijn aanwijzingen dat een specifieke combinatie van histonmodificaties als een code kan worden gelezen, waardoor bijvoorbeeld te zien is of het betrokken gen uit of aan zou moet staan (Seitz, 2004). Naast histonmodificaties zijn er ook histonvarianten. Dit zijn histonen met specifieke eigenschappen, die bijvoorbeeld helpen om het nucleosoom meer ‘open’ of ‘gesloten’ te maken. Naast de vier basishistonen is er ook nog de familie van de histonen H1/H5. Deze groep van histonen heeft een belangrijke rol bij het reguleren van het samenpakken van nucleosomen. Histonmodificaties en histonvarianten zijn centrale spelers in epigenetische processen bij alle organismen. 49 Figuur 1.18: een moleculaire voorstelling van de structuur van een nucleosoom. Het DNA (rood) is gewikkeld rond een kern van acht histonen (blauw). Beide vormen samen het nucleosoom. Het complex wordt bij zoogdieren samengehouden door het histon H1 of H5 (geel). De chromatinevezel wordt verder opgevouwen tot een dikkere vezel, ook wel de solenoïd (30 nm) genoemd (Seitz, 2004). - DNA-methylatie: De additie of verwijdering van methylgroepen op DNA, vooral daar waar de base cytosine voorkomt. De methylatie van DNA is zeker even belangrijk als de histonenmodificatie. Het is het best onderzochte en gekende epigenetische mechanisme. In deze studie wordt de DNA-methylatie nog uitgebreid besproken. Ondanks de schemerzones binnen de epigenetica zijn er een groeiend aantal onderzoeksgegevens, die steeds sterkere aanwijzingen geven dat epigenetische factoren een kritische rol spelen in het normaal functioneren van het genoom. De voortdurende interactie tussen het epigenoom en zijn omgeving zorgt ervoor dat de normale functie van het genoom gemakkelijk verstoord kan geraken onder invloed van milieustress. In deze studie wordt vooral het effect van milieustress op de DNA-methylatie van het genoom bestudeerd. Uit onderzoek (Bird, 2002; Field et al, 2004; Mandrioli, 2004; Mandrioli & Borsatti, 2005) blijkt echter dat de verschillende epigenetische processen onomstotelijk met elkaar verbonden zijn. Het is daarom onmogelijk om de processen afzonderlijk te beschouwen. De effecten van milieustress op het epigenoom zijn dan ook complex. 50 1.9.2 Structuur van DNA en chromosomen Voordat dieper wordt ingegaan op de DNA-methylatie is het noodzakelijk in het kort de structuur van DNA en chromosomen te bespreken. Het DNA is een macromolecule (dubbele helix) opgebouwd uit enkele specifieke basiseenheden. Een enkele DNA-streng kan worden beschouwd als een biopolymeer. De monomeereenheden (nucleotiden) bestaan uit (fig. 1.19): - een heterocyclische base: o een purine (adenine of guanine) o een pyrimidine (thymine of cytosine) - een pentose: (deoxy)ribose - een fosfaatgroep Figuur 1.19: de structuur van DNA: basen: adenine, thymine, cytosine en guanine. Verder nog het deoxyribose en de fosfaatgroep die de ruggengraat van het DNA vormen (Ball, 2006). 51 DNA en histonen vormen op verschillende niveau’s de zeer compacte structuur van het chromosoom (fig. 1.20). Figuur 1.20: de verschillende niveau’s van DNA-condensatie (Sperling, 2005). 52 1.9.3 Genoom versus epigenoom Genoom en epigenoom Het genoom is al het genetische materiaal in een chromosoomset. De cellen van eukaryoten zijn meestal diploïd. Ze hebben twee chromosomen van hetzelfde type en daarom bevatten ze eigenlijk twee genomen. Het epigenoom is de verzameling van epigenetische kenmerken van een organisme, zoals het genoom de verzameling is van genetische kenmerken. In tegenstelling tot het genoom is het epigenoom niet statisch en kan het veranderen met de tijd. Op basis van hun economisch belang zal in de nabije toekomst het genoom van verschillende soorten Crustacea ontrafeld worden, waaronder enkele garnaalsoorten. Vele economisch belangrijke soorten zijn echter minder goede kandidaten voor onderzoek. Het kleine genoom van Daphnia biedt hier voordelen. De haploïde genoomgrootte van Daphnia sp. is bijvoorbeeld ongeveer tienmaal kleiner dan het genoom van enkele commerciële garnalen Penaeus sp. Het onderzoek bij kleine genomen kan sneller en beter gereproduceerd worden. De volledige sequentie van vier geleedpotigen is momenteel gekend en nog zeven andere genomen staan op het punt de eerste vier te vervoegen in de rij van gesequenceerde genomen. Apis mellifera, Anopheles gambiae, Drosophila melanogaster en Bombyx mori behoren allen tot de insecten en bevatten daardoor slechts een fractie van de genetische diversiteit binnen de geleedpotigen. De fylogenetische positie van de kreeftachtigen (Crustacea) ligt het dichtst bij de klasse van de insecten (Insecta). De genoomsequentie van de verschillende insecten kan een grote bijdrage leveren aan het onderzoek van het genoom en epigenoom van Daphnia magna (Daphnia Genomics Consortium, 2003). De werking van DNA-methylatie bij vertebraten is goed gekend, terwijl de kennis van DNA-methylatie bij invertebraten nog steeds controversieel is (Field et al, 2004; Mandrioli, 2004; The Honeybee Genome Sequencing Consortium, 2006; Wang et al., 2006). Het onderzoek van het genoom van de honingbij (Apis mellifera) heeft een aantal belangrijke nieuwe inzichten opgeleverd. Het goed onderzochte genoom van de fruitvlieg Drosophila melanogaster vertoont slechts weinig gemethyleerd DNA, terwijl bij Apis mellifera een volledig functioneel CpG methylatiesysteem werd teruggevonden. Uit analyses bij Apis mellifera blijkt dat de methylatie van cytosinen bijna uitsluitend in CpG-sequenties voorkomt. Buiten deze sequentie is DNA-methylatie extreem zeldzaam of niet bestaand. Dit is totaal in tegenstelling met andere insecten (Field et al, 2004; Mandrioli, 2004; Wang et al, 2006). Wetenschappers veronderstellen dat DNA-methylatie 53 wijdverspreid is in insecten en Drosophila sp. gezien kunnen worden als een goed instrument voor het begrip van nog niet geëxploreerde evolutieve aspecten van genoomregulatie. De gedetecteerde DNA-methylatie bij Apis mellifera is gelimiteerd tot de coderende DNA-regionen. Bij alle insecten ligt het percentage gemethyleerde cytosinen een stuk lager in vergelijking met vertebraten. De bevindingen uit het genoomonderzoek leren ons veel bij over hoe DNA-methylatie kan geëvolueerd zijn doorheen de tijd. Onderzoek naar het epigenoom van organismen zal veel complexer zijn dan de ontrafeling van het genoom. Elk organisme heeft slechts één genoom, maar het epigenoom is in elk celtype (weefsel) verschillend. Grootte van het genoom Slechts een klein deel van de genen van het volledige genoom blijkt actief te zijn. De epigenetica zou het mechanisme zijn achter de nauwkeurige controle van de expressie van een klein deel van de genen. Het genoom van vele organismen wordt gekenmerkt door een overweldigende hoeveelheid ‘junk DNA’, niet-coderend DNA, ruis van repetitieve elementen, introns en transposons. Transposons werden lang beschouwd als nutteloos, maar blijken in recent onderzoek van groot belang in de evolutie. De interactie van transposons met het genoom en het milieu stuurt mee de translatie van genen en zo het fenotype. In vele organismen staan transposons onder epigenetische controle (Biémont & Vieira, 2006). Voor het genetisch materiaal dat onder epigenetische controle staat zijn twee hypothesen opgesteld (Regev et al, 1998) die een verklaring kunnen geven van de verspreiding en de sterkte van DNA-methylatie in organismen. Ten eerste staat DNA-methylatie in verband met de grootte van het genoom. Invertebraten hebben meestal een klein genoom met weinig repetitieve basensequentie, daardoor is de DNA-methylatie als inactivator van de genexpressie minder noodzakelijk, wat het lage gehalte aan gemethyleerd DNA bij vele invertebraten kan verklaren. Ten tweede staat DNA-methylatie in verband met de ontwikkeling. Invertebraten met een korte levensduur produceren minder celmateriaal, waardoor ze minder gebruik maken van DNA-methylatie. Het mutagene karakter van DNA-methylatie (fig. 1.20) zorgt ervoor dat de DNA-methylatie een onstabiel mechanisme is voor het behoud van de activiteit van de genen tijdens de celdeling. De natuurlijke selectie zou de DNA-methylatie dan geëlimineerd of gereduceerd hebben in invertebraten. 54 CpG dinucleotiden Cytosinen (deoxycytidinen) waarbij het 3’ koolstofatoom is gebonden aan het 5’ koolstofatoom van guaninen (deoxyguanosinen) via een fosfo-di-esterbinding worden CpG dinucleotiden genoemd. Hierbij staat de p voor de fosfaatbinding tussen beide nucleotiden. CpG komt voor in alle genomen van eukaryoten en prokaryoten. De CpG-sequentie blijkt bij de meeste organismen het doel te zijn van de DNA-methylatie, daarnaast worden ook de cytosinen in de sequenties CpT, CpC en CpA gemethyleerd (Field et al, 2004; Mandrioli, 2004; Volpe, 2004). Bij vertebraten en vooral bij zoogdieren worden bijna uitsluitend CpG dinucleotiden gemethyleerd, slechts zelden zijn er andere sequenties betrokken bij de DNA-methylatie. Er is slechts een laag percentage cytosinen gemethyleerd, maar van de cytosinen in CpG sequenties is bij sommige zoogdieren tot meer dan 90% gemethyleerd (Field et al, 2004; Mandrioli, 2004). De CpG-sequenties bij vertebraten komen in clusters op het genoom voor. De resterende clusters die niet zijn gemethyleerd worden de CpG-eilanden genoemd (Wojciechowski, 2005). Ook bij invertebraten is slechts een laag percentage cytosinen gemethyleerd, maar in tegenstelling tot vertebraten blijkt DNA-methylatie zich niet te beperken tot CpG sequenties en is slechts een laag percentage gemethyleerd. De CpG sequenties komen ook niet in clusters voor, dit verklaart de afwezigheid van CpG eilanden bij invertebraten (Bombail et al., 2004; Field et al, 2004; Mandrioli, 2004, Simmen et al, 1998). De regio’s met erg veel ongemethyleerde CpG sequenties of CpG eilanden worden teruggevonden in promotorsegmenten van genen bij vertebraten. Deze eilanden worden gedefinieerd als genoomsequenties van meer dan 200 baseparen, die een hoog CG gehalte en een hoge frequentie aan CpG sequenties hebben (Wojciechowski, 2005). Bij verschillende organismen is het percentage van gemethyleerde cytosinen bepaald: 30% bij planten, 0-10% bij insecten, 10% bij vissen en amfibieën en 5% bij zoogdieren en vogels. Het niveau van DNA-methylatie op 5-methylcytosine blijkt dus sterk te variëren naargelang de diergroep (Bombail et al., 2004; Field et al., 2004; Mandrioli, 2004). Sommige invertebraten, zoals de kooluil (Mamestra brassicae), hebben een hoog percentage gemethyleerde cytosinen (10%) vergelijkbaar met sommige vertebraten. De aanwezigheid van CpG eilanden werd nog niet vastgesteld, maar CpG sequenties blijken wel het doel van DNA-methylatie te zijn in dit genoom (Field et al, 2004; Mandrioli, 2004). Het beperkte onderzoek van het genoom en epigenoom bij invertebraten, ten opzichte van het aantal soorten en de diversiteit laat niet toe algemene conclusies te trekken. De rol van CpG sequenties en eilanden bij invertebraten is dan ook speculatief. 55 Vele gekende effecten van DNA-methylatie zijn geassocieerd met CpG-eilanden (Santos et al, 2005). De meeste CpG-eilanden blijven ongemethyleerd in gedifferentieerde cellen en ook tijdens de ontwikkeling in de meeste weefsels. De vraag blijft hoe deze eilanden weerstaan aan DNA-methylatie. Er zijn enkele hypothesen (Santos et al, 2005). (1) Een proteïne bindt aan DNA en verhindert zo de binding van DNMT’s. Een dergelijke blokkerende proteïne moet nog worden aangetoond bij vertebraten en invertebraten. (2) Het chomatine heeft op bepaalde locaties een specifieke structuur door histonenmodificaties, waardoor er geen methylatie van CpG-sequenties kan optreden. (3) Er treedt specifieke demethylatie op van CpG sequenties. Dit is enkel aangetoond bij planten. Er is aangetoond dat de hyper/hypomethylatie van CpG-eilanden kan geïnduceerd worden door chemische stoffen, wat abnormaliteiten in celgroei kan veroorzaken met celsterfte tot gevolg (Santos et al, 2005). In de lichaamscellen van de mens maakt m5C ongeveer 1% uit van het totale aantal DNA-basen, waarbij 3-4% van de cytosinen of 70-80% van alle CpG dinucleotiden in het genoom zijn gemethyleerd (Ehrlich & Wang, 1981; Santos et al, 2005). De methylatiestatus van de CpG eilanden blijkt te kunnen wijzigen en is van groot belang in verschillende biologische functies. Ze zouden ook een goede indicator zijn van waar een gen precies begint, omdat in vele genomen meer dan 50% van de promotor-regio’s geassocieerd is met CpG-eilanden. De CpG eilanden komen, als gevolg van de evolutie, vooral voor in de omgeving van promotor-regio’s van de huishoudgenen (Santos et al, 2005). Deze genen zijn betrokken bij de basisfuncties nodig voor het levensonderhoud van een cel. Er treedt dan ook een continue transcriptie en translatie op van deze huishoudgenen. De CpG sequenties zijn ook het doel van mutaties. Cytosine in een CpG dinucleotide kan gemethyleerd worden en bij toevallige deaminatie van deze gemethyleerde cytosine treedt een puntmutatie op (fig. 1.21), waarbij de base thymine ontstaat. Bij de deaminatie van cytosine, zal het gevormde uracil herkend en verwijderd worden door ‘DNA repair’ enzymen (fig. 1.21). Uracil wordt verwijderd van het DNA door uracil glycosylase, maar thymine ontstaan uit de deaminatie van m5CpG wordt niet efficiënt verwijderd en kan mutageen zijn. Het veroorzaakt namelijk een G/T ‘mismatch’. Bij genomen met een hoog gehalte aan gemethyleerde CpG’s kan zo een groot deel van de CpG’s verloren gaan. Tijdens de evolutie zijn meer dan 75% van de CpG dinucleotiden verloren gegaan, vermoedelijk onder invloed van bovenstaand reactiemechanisme. Dit verklaart waarschijnlijk het voorkomen van de CpG-eilanden (Santos et al, 2005; Sperling, 56 2005; Wojciechowski, 2005). Het is door de puntmutatie van gemethyleerd cytosine naar thymine, dat de basen A/T zeer veel voorkomen in verhouding tot de andere basenparen (The Honeybee Genome Sequencing Consortium, 2006; Wang et al., 2006). Er wordt verondersteld dat de basensequentie naar een A/T rijke compositie evolueert. Figuur 1.21: puntmutatie van cytosine en gemethyleerd cytosine (Sperling, 2005). 57 1.9.4 DNA-methylatie In deze studie spitsen we ons toe op de DNA-methylatie. De DNA-methylatie is de covalente additie van een methylgroep op een heterocyclische base van het DNA, meestal de base cytosine (fig. 1.23). Sinds de ontdekking in 1948 heeft de “vijfde” base C5methylcytosine (m5C) veel opzienbarende inzichten verworven, vooral op het vlak van zijn fysiologische significantie (Santos et al, 2005). Gemethyleerde basen Er kunnen verschillende basen gemethyleerd worden: N6-methyladenine (m6A), N4methylcytosine (m4C) of C5-methylcytosine (m5C). (fig. 1.22) Figuur 1.22: de drie verschillende gemethyleerde basen die tot op heden zijn ontdekt. Door het vermoedelijk evolutieve karakter van het epigenetische systeem verloopt de methylatie van het DNA verschillend bij eukaryoten en prokaryoten. Bij prokaryoten vinden we m4C terug, terwijl bij eukaryoten en sommige prokaryoten voornamelijk m5C en m6A terug te vinden zijn (Hattman, 2005; Aguirre-Arteta, A.M., 2000). We kunnen deze vormen van DNA-methylatie in twee klassen opdelen. Een eerste klasse van gemethyleerde basen vormen de cytosinen met een methylgroep op koolstofatoom C5 58 (m5C). De andere klasse bestaat uit gemethyleerde basen, waarbij de methylatie plaatsgrijpt op een exocyclisch stikstofatoom van cytosine (m4C) of adenine (m6A). (fig. 1.22). In deze studie beperken we ons tot de eukaryoten en meer specifiek de invertebraten. Uit onderzoek (Mandrioli, 2004; Field et al., 2004) blijkt dat m5C in heel wat genomen van invertebraten voorkomt. Andere typen DNA-methylatie worden niet gerapporteerd (Mandrioli, 2004). Figuur 1.23: de reactiestappen voor C5-cytosine methyltransferase gebaseerd op een mechanisme voor thymidylaat synthase en tRNA-(uracil-5) methyltransferase. Een cysteïnethiol van het enzyme valt aan op koolstof 6 van cytosine en vormt een intermediair, waarbij het DNA-enzyme covalent gebonden is. Het resulterende carbanion op koolstof 5 van cytosine wordt aangevallen door de methylgroep van SAM (AdoMet) met de vorming van een covalente binding met de methylgroep, waarbij SAH (AdoHcy) wordt geëlimineerd. Tijdens de reactie wordt SAM dus omgezet in SAH. Eliminatie van de geconjugeerde gebeurt door weghalen van het proton van C5 door een base (B:) resulterend in het verkrijgen van 5-methylcytosine. Het waterstofatoom op de C5 wordt afgesplitst als H+ (Aguirre-Arteta, A.M., 2000). Biochemische reacties en DNA-methylatie DNA-methyltransferasen zorgen voor het verloop van de methylatie door het katalyseren van de overgangsreactie van de methylgroep van S-adenosyl-L-methionine naar de desbetreffende heterocyclische base (fig. 1.23). De methylgroep bindt covalent aan de base en S-adenosyl-L-methionine wordt omgezet naar S-adenosyl-L-homocysteine (fig. 1.24.) (RPI, 2006). De biochemische methionine ‘pathways’ (bijlage 6) zijn cruciaal voor de DNA-methylatie. 59 Figuur 1.24: biochemische reacties bij de methylatie van DNA (1) adenosine wordt overgedragen naar methionine met de vorming van S-adenosylmethionine (SAM), (2) De methylgroep op het sulfoniumion in SAM is zeer reactief, door de positieve deellading van het zwavelatoom. Door deze eigenschap werkt SAM als methyldonor. Een methylgroep kan overgedragen worden naar een base van het DNA, bijvoorbeeld cytosine. S-adenosylhomocysteïne (SAH) wordt gevormd als de methylgroep van SAM overgedragen wordt op een acceptor. (3) SAH wordt gehydroliseerd tot homocysteïne en adenosine. (4) Methionine wordt gevormd doordat een methylgroep van N5methyltetrahydrofolaat wordt overgedragen op homocysteïne, deze reactie wordt gekatalyseerd door methioninesynthase (RPI, 2007). Er zijn twee typen DNA-methylatie (Watson & Goodman, 2002): ‘de novo’ methylatie en ‘maintenance’ methylatie. Het DNA-methylatiepatroon kan ook een reprogrammering ondergaan, waarbij methylgroepen worden verwijderd van het DNA. De verwijdering van methylgroepen wordt uitgevoerd tijdens de demethylatie (fig. 1.25). Bij ‘de novo’ methylatie wordt ongemethyleerd DNA gemethyleerd door een specifieke methyltransferase (Sperling, 2005; Watson & Goodman, 2002). ‘De novo’ methylatie zou bij zoogdieren en planten enkel plaatsvinden na andere epigenetische modificaties. DNAmethylatie zou enkel genen aanpakken die al onderdrukt zijn door andere mechanismen, zoals de hypoacetylatie en methylatie van histonen. De bijdrage van de DNA-methylatie zou in dat geval mogelijks de stabilisatie van de inactivatie zijn (Barzotti et al., 2006; Heard et al., 2001; Mandrioli, 2004; Mandrioli & Borsatti, 2005; Santos et al., 2005). 60 Figuur 1.25: het DNA-methylatieproces: ‘de novo’ methylatie, ‘maintenance’ methylatie en demethylatie (Sperling, 2005) Het DNA-methylatiepatroon zal gedurende de vele celdelingen tijdens de ontwikkeling van een organisme niet verloren gaan. Er is een mechanisme dat zorgt voor het behoud van het methylatiepatroon, namelijk de ‘maintenance’ methylatie. Dit mechanisme is een postreplicatieve enzymatische verandering. Het herstel van het methylatiepatroon treedt dus op na de DNA-replicatie (fig. 1.25, 1.26). Tijdens de DNA-replicatie zal het DNApolymerase ongemethyleerd cytosine synthetiseren en inbouwen op de complementaire guanine. Dit leidt tot een afname van gemethyleerd DNA. Na de DNA-replicatie wordt het DNA-methylatiepatroon volledig hersteld door specifieke DNA-methyltransferasen. DNAmethylatie op asymmetrische locaties moet opnieuw ‘de novo’ uitgevoerd worden na elke DNA-replicatiecyclus (Sperling, 2005; Aguirre-Arteta, 2000). (fig. 1.25). Het behoud van het normale methylatiepatroon (geen hyper/hypomethylatie), dus ook tijdens de reprogrammering bij celdifferentiatie, is een cruciale factor voor een normale ontwikkeling en het behoud van de gedifferentieerde status van een cel (Watson & Goodman, 2002). Het methylatiepatroon kan ook terug verwijderd worden van het DNA door demethylatie (fig. 1.25, 1.26). Dit proces is nog niet goed gekend. Er zijn twee mechanismen bekend voor de demethylatie, passieve demethylatie en actieve demethylatie (Bird, 2002; Easwaran, 2003). 61 Het proces van passieve demethylatie resulteert in de geleidelijke afname van gemethyleerd DNA door de afwezigheid van ‘maintenance’ methylatie bij elke DNAreplicatie. Actieve demethylatie is onafhankelijk van de DNA-replicatie en wordt gestuurd door enzymen (Bird, 2002; Easwaran, 2003). Figuur 1.26: processen die het DNA-methylatiepatroon veranderen of behouden. In vertebraten treedt DNA-methylatie hoofdzakelijk op in CpG dinucleotiden, hier voorgesteld door CG. Methylgroepen zijn voorgesteld door m. Nieuwe methylatiepatronen worden verkregen door het proces van de novo methylatie (links). Bestaande methylatiepatronen kunnen verwijderd worden door demethylatie (rechts). Tijdens de DNA-replicatie (midden) zal de nieuwe gesynthetiseerde DNA-streng (dunne lijn) ongemethyleerd zijn, terwijl de oorspronkelijk DNA-streng (dikke lijn) het methylatiepatroon behoudt. Het methylatiepatroon van de oorspronkelijke streng wordt gekopieerd op de dochterstreng door ‘maintenance’ methyltransferasen (DNMT1) (Pray, 2004; Easwaran, 2003). Proteïnen en DNA-methylatie In deze studie worden enkel de proteïnen bestudeerd, die nauw betrokken zijn bij de DNA-methylatie. Deze proteïnen zijn voor hun functie opnieuw afhankelijk van een reeks proteïnen. Het zijn complexe proteïne-proteïne interacties, waarvan enkele cruciaal zijn. De kennis van de rol van DNA-methylatie in de regulatie van de genexpressie is snel toegenomen de laatste jaren, door de karakterisatie van een steeds toenemend aantal nieuwe proteïnen betrokken bij dit proces. De belangrijkste functie van de eiwitten is vermoedelijk een wijziging in de compactheid van chromatine (genexpressie). 62 Uit studies (Bombail et al., 2004; Frigola, 2005) blijken er zeker zes klassen van eiwitten nodig te zijn voor het verdichten van chromatine en nog een hele reeks minder gekende proteïnen (fig. 1.27): 1) DNA-methyltransferasen (DNMT) 2) DNA remodelleringsenzymen, energie van ATP hydrolyse wordt gebruikt voor het hermodelleren van chromatine. 3) Histon acetyltransferasen (HAT) 4) Histon deacetylasen (HDAC) 5) Histon methyltransferasen (HMT) 6) Methylbindingsproteïnen (MBP) Figuur 1.27: schematische voorstelling van de interacties tussen proteïnen, die verantwoordelijk zijn voor het behoud van de sterke condensatie van het chromatine (heterochromatine) in de meeste eukaryoten (Frigola, 2005). 63 DNA-methyltransferasen Verschillende publicaties (Easwaran, 2003; Goll & Bestor, 2005; Mandrioli, 2004; Santos et al, 2005) vermelden dat de DNA-methyltransferasen in verschillende families kunnen worden ingedeeld (fig. 1.28). De families van DNA-methyltransferasen (DNMT’s) zijn belangrijke katalysatoren van de DNA-methylatie en ze worden teruggevonden bij prokaryoten en eukaryoten. De eukaryotische DNMT’s kunnen gegroepeerd worden in 5 families: DNMT1, DNMT2, DNMT3, Masc 1 (enkel bij fungi), and CMT (chromomethylase, enkel bij planten). De families Masc 1 en CMT zijn nog niet teruggevonden (fig. 1.28) bij invertebraten (Easwaran, 2003). Figuur 1.28: de verspreiding van de belangrijkste cytosine methyltransferase families in eukaryoten. De kleurschaal onderaan de figuur heeft aan welke methyltransferasen (families) voorkomen in het proteoom van de organismen (Goll & Bestor, 2005). 64 De DNMT1, DNMT2 en DNMT3 enzymen en coderende genen zijn bij dieren variërend van gist tot zoogdieren behouden gebleven doorheen de evolutie (Field et al, 2004; Mandrioli, 2004; Mandrioli & Borsatti, 2005). Ze hebben elk een andere functie, waarbij volgende functies reeds zijn vastgesteld (Goll & Bestor, 2005; Mandrioli, 2004; Santos et al, 2005; Watson & Goodman, 2002): DNMT1 enzymen binden het liefst aan hemigemethyleerd DNA, ze zijn verantwoordelijk voor het behoud van het methylatiepatroon na elke DNAreplicatie. DNMT2 enzymen lijken sterk op de prokaryotische DNMT enzymen. De functie van deze enzymen is nog steeds onduidelijk. Ze zouden verantwoordelijk zijn voor de methylatie van de CpA en CpT dinucleotiden, in plaats van de CpG dinucleotiden. DNMT3 enzymen zijn een familie bestaande uit DNMT3A en DNMT3B enzymen. Zij zijn hoofdzakelijk verantwoordelijk voor ‘de novo’ methylatie van DNA. Het enzyme DNMT3L zorgt voor het behoud van maternale ‘genomic imprinting’. Deze methyltransferase is slechts onlangs teruggevonden in het proteoom2 van een invertebraat, namelijk Apis mellifera. Overige enzymen De overige enzymen zijn zeker even belangrijk voor de epigenetische status van het genoom, maar ze zijn niet altijd direct betrokken bij de DNA-methylatie. De basensequentie mCpG resulteert in het inactiveren van een gen of genen die in de buurt liggen, doordat MBP’s (MBD, MeCP,…) binden aan bepaalde mCpG sequenties die op hun beurt HDAC’s aantrekken (fig. 1.29, 1.30). Deze eiwitten en nog heel wat andere zijn betrokken bij de deacetylatie van histonen, de verandering in structuur van het chromatine en het verhinderen van de transcriptie van het naburige gen (fig. 1.30). Histonen bestaan uit een compact opgevouwen globulair domein en een N-terminaal domein dat zich buiten het nucleosoom bevindt. De histonstaart (N-terminale domeinen) en de kern van het histon zijn beide het doel van posttranslationele modificaties. HMT zijn verantwoordelijk voor de selectieve methylatie van H3K9. Deze methylatie blijkt uit 2 Proteoom: de gehele verzameling van proteïnen die in een organisme, cel of biologisch systeem kunnen voorkomen, ook wel de proteïnepopulatie genoemd. 65 onderzoek noodzakelijk voor de binding van heterochromatinebindingsproteïne 1 (HP1), die H3K9-methylatie relateert aan de vorming van heterochromatine en het stilleggen van de genexpressie. De acetylatie van histonen wordt uitgevoerd door HAT’s. Het is een omkeerbaar proces, waarbij HDAC’s de tegenspelers zijn. Hyperacetylatie van histonen treedt op waar er transcriptie van genen plaatsvindt, terwijl hypogeacetyleerde histonen terug te vinden zijn waar de genexpressie wordt onderdrukt. Genonderdrukking gaat gepaard met de deacetylatie van histonen (verwijderen van acetylgroepen van Nterminale domeinen van histonen), waardoor heterochromatine wordt gevormd. Ten gevolge van de heterochromatinestructuur kunnen de transcriptiefactoren niet meer binden aan de promotorregio (transcriptionele inhibitie). De acetylatie van lysine door HDAC’s zorgt voor de vorming van euchromatine en de activatie van de genexpressie. De verschillende histonenmodificaties op verschillende aminozuren kunnen elkaar beïnvloeden door samen te werken of elkaars werking te inhiberen. Het geheel van modificaties vormt de zogenaamde histonencode. De activiteit van deze enzymen en DNA kan rechtstreeks of onrechtstreeks geïnhibeerd worden door metalen (fig. 1.6), waardoor de DNA-methylatie wordt verstoord. Figuur 1.29: het mechanisme van de onderdrukking van de transcriptie door DNA-methylatie. Een deel van nucleosomaal DNA wordt getoond met alle gemethyleerde CpG sequenties (rode bolletjes). De transcriptiefactor (groene bol) kan niet binden aan zijn herkenningsplaats, als het DNA gemethyleerd is op de herkenningplaats. Vele transcriptiefactoren worden geïnactiveerd door DNA-methylatie, ook de aangrenzende element proteïnen CTCF. Enkele eiwitcomplexen met affiniteit voor methylatie, zijn: MeCP2 (een methyl-CpG bindende proteïne), MeCP1 complex, MBD1 en het Kaiso eiwitcomplex (Bird,2002). 66 Figuur 1.30: DNA-methylatie en histonenmethylatie bij vertebraten werken samen in de onderdrukking van expressie van genen. De rode lijn stelt een DNA-streng voor. In een DNA-streng komen regelmatig CpG dinucleotiden voor, hier aangeduid door de letter Cm en G. De DNA-streng zit ook rond een histoneneiwit (gele ovaal) gerold. Dit vormt dus een complex van DNA en histonen. Het eind van een histoneneiwit heeft een staart van aminozuurresten met een lengte die afhankelijk is van het type histon. Deze kan functioneren als aankoppelplaats voor andere eiwitten of enzymen. De rode lijn boven het rechter histoneneiwit in elke tekening stelt de lysine 9 histon H3 staart (H3K9) voor. In de initiële fase zullen DNA-methyltransferasen (DNMT) methylgroepen adderen op DNA (3), enkel en alleen op chromatine dat gemethyleerd is op lysine 9 van het H3 histon (H3K9) en bindt het heterochromatine eiwit 1 (HP1)3 (2). De methylatie op H3 wordt gekatalyseerd door een histonmethyltransferase (HMT) (1) en histon deacetylasen (HDAC) (1). HDAC zorgt voor de verwijdering van acetylgroepen tijdens de reactie (1). De directe fysische link die hier geïdentificeerd is tussen DNMT (3) en het HMT-HP1 systeem verzekert dat de methylatiestatus op histon H3 direct het DNA-methylatiepatroon beïnvloedt. In een tweede stap (4) zal het genereren van gemethyleerd DNA door het DNMT (3) de binding mogelijk maken van methylbindingsproteïne (MBP) (4) aan het DNA. Daar tegenover staat dat MBP (4) zal zorgen voor de associatie en het bevorderen van de histonenmethylatie op H3K9 (1). Dit sequentieel proces van het koppelen van DNA met histonenmethylatie is boeiend, want het suggereert dat DNA-methylatie ook zorgt voor een positieve terugkoppeling door de methylatie van histonen te vergemakkelijken. Hierbij worden de twee vormen van epigenetische transcriptieonderdrukking versterkt en wordt een zichzelf in stand houdende epigenetische cyclus gecreërd. Dit resulteert in een lange termijn transcriptionele repressie (Mandrioli & Borsatti, 2005). 3 HP1: Het eiwit HP1 dat zich bindt aan pericentrisch heterochromatine en telomeren is onmisbaar voor het markeren, verlengen en transcriptioneel inactiveren van telomeren. HP1 is ook betrokken bij de expressie van diverse genen in euchromatine-gebieden tijdens de ontwikkeling. 67 Functies van DNA-methylatie DNA-methylatie speelt een belangrijke rol tijdens de ontwikkeling, celdifferentiatie, groei, X-chromosoom inactivatie, genomische ‘imprinting’, tumorigenesis en transposoninactivatie (Bird, 2002). Op cellulair niveau is verlies van gemethyleerd DNA in verband gebracht met apoptosis, de inactivatie van het X-chromosoom, de chromosomale stabiliteit en de organisatie van de chromosomen. Volgens een studie (Field et al., 2004) zou de diversiteit in functies kunnen wijzen op een nog onbekende hogere functionele rol van DNA-methylatie. 1) Inhibitor of activator van de transcriptie: Er is een sterke correlatie tussen DNAmethylatie en de onderdrukking van de genexpressie bij vertebraten en planten. Recente studies bij invertebraten wijzen echter op een functie van DNA-methylatie als activator van de transcriptie (Bird, 2002; Mandrioli, 2004; Mandrioli & Borsatti, 2005). De DNAmethylatie kan de transcriptie op 3 manieren (fig. 1.31) onderdrukken (Easwaran, 2003): - (A) DNA-methylatie voorkomt rechtstreeks de binding van een transcriptiefactor (TF) en daarmee de transcriptie. - (B) Een meer voorkomend fenomeen is het indirecte effect door competitie van een TF met methyl-CpG-bindingsproteïnecomplexen (MeCP1 en 2) voor bindingsplaatsen. De binding van een TF wordt verhinderd en er treedt dus geen transcriptie op. - (C) Het belangrijkste model. Het MeCP2 complex bindt histonendeacetylasen (HDAC’s). Deze veroorzaken deacetylase van aanliggende histonen, wat leidt tot chromatinecondensatie en onderdrukking van de genexpressie (Easwaran, 2003). 2) Effect op chromatinestructuur: DNA-methylatie zorgt voor een goede stabiliteit en centromeerstructuur (Easwaran, 2003). Figuur 1.31: modellen voor het effect van DNA-methylatie op genexpressie. Ongemethyleerd DNA worden voorgesteld door halve cirkels en gemethyleerd DNA als volle zwarte cirkels (Easwaran, 2003). 68 DNA-methylatie en het milieu De epigenetische code is gevoeliger voor signalen vanuit het milieu dan de DNA-sequentie zelf, door de omkeerbaarheid van de epigenetische wijzigingen (Watson & Goodman, 2002). Zij kunnen dus op elk moment gewijzigd worden door milieufactoren. Deze kunnen een bijdrage leveren aan de ontwikkeling van abnormale fenotypes. Fysiologische reacties op bepaalde prikkels uit het milieu kunnen ook gereguleerd worden door epigenetische mechanismen (Watson & Goodman, 2002). Stressfactoren in het milieu kunnen de methylatiestatus wijzigen, waarbij de structuur van chromatine wijzigt met als gevolg de inductie van wijzigingen in genexpressie en fenotype. Verschillende stressfactoren werken anders op de epigenetische mechanismen. Deze mechanismen kennen een sterke onderlinge interactie om de genoomfunctie te beïnvloeden en de kern uit te maken van het epigenetisch “geheugen” (Biémont & Vieira, 2006). Metalen kunnen als stressfactor optreden. Ze hebben het potentieel om negatieve effecten te veroorzaken (denaturatie van eiwitten, inhibitie van enzymen, enzymatische blokkering,…), die zich kunnen uiten in een gewijzigd fenotype. Dit effect wordt dikwijls toegeschreven aan mutatie, maar het kan ook een epigenetische basis hebben. Effecten kunnen door een genotoxisch mechanisme worden veroorzaakt, of indirect door een nietgenotoxisch mechanisme (fig. 1.6). Een genotoxisch mechanisme gebruikt de stof zelf of een metaboliet in directe interactie met het DNA. Een niet-genotoxische component kan mutaties veroorzaken door een secundair mechanisme. Vier genetische mechanismen (puntmutatie, deletie, ‘rearrangement’ en amplificatie) en de twee epigenetische mechanismen (DNA-methylatie en histonenmodificatie) blijken het grootste deel van erfelijke wijzigingen in genexpressie voor hun rekening te nemen (Watson & Goodman, 2002). Een hypothese die aan populariteit wint is dat carcinogene effecten van sommige metalen worden veroorzaakt door globale en doelgerichte verstoring van DNA-methylatie. Cadmium zorgt bij ratten voor zowel hypergemethyleerd, als hypogemethyleerd DNA. Nikkel en andere transitiemetalen zullen ook veranderingen induceren in de DNAmethylatie met een verandering van de genexpressie tot gevolg (Bombail et al., 2004; Lee et al., 1998). Bij ratten (Majumder et al., 2002) werd de expressie van MT-1 genen onderdrukt bij metaalstress door methylatie van de promotor en werd geïnduceerd door zware metalen na een demethylatie door 5-azacytidine. Metaalstress zorgt hier dus voor een negatief 69 effect op het detoxificatiemechanisme. Het onderliggende mechanisme van de toxiciteit van metalen zou een wijziging in de DNA-methylatie kunnen zijn (Bombail et al., 2004, Watson & Goodman, 2002). Wijzigingen in genexpressie door epigenetische mechanismen kan tot celdood leiden. Er moet opgemerkt worden dat wijzigingen in het methylatiepatroon omkeerbaar zijn, dus epigenetische veranderingen geïnduceerd door chemische stoffen kunnen niet gelijkgesteld worden aan celtoxiciteit. DNA-methylatie zou een secundair mechanisme kunnen zijn bij het toxische effect van metalen. Een betere kennis van de potentiële effecten van metalen op het methylatiepatroon en dan specifiek bij modelorganismen voor ecotoxicologische testen (vele invertebraten) zou een rationele toediening van een bepaalde dosis en de keuze van een geschikte dosis voor de risicobeoordeling van stoffen vereenvoudigen. Het gebruik van het methylatiepatroon voor de risicobeoordeling van stoffen kan leiden tot een verbetering van de beoordeling, door (Watson & Goodman, 2002): - een snellere detectie van potentieel toxische stoffen - een betere selectie van rationele dosissen voor testen - het nauwkeuriger bepalen van het verloop van de dosis-respons curve - de selectie van meer correcte dosissen voor soort-naar-soort extrapolatie. DNA-methylatie: invertebraten versus vertebraten. Het is nu algemeen bekend dat patronen van DNA methylatie in het genoom van dieren varieert van een schijnbare afwezigheid van gemethyleerde basen tot een gehele methylatie van het genoom. Het DNA bij onderzochte invertebraten blijkt hoofdzakelijk te bestaan uit niet-gemethyleerde basen en soms een klein deel gemethyleerd DNA. Bij invertebraten is de functionele rol van DNA-methylatie nog steeds onduidelijk. Deze bevindingen staan in schril contrast met de resultaten van de onderzochte vertebraten op DNA-methylatie. Bij de vertebraten kent het genoom een sterke volledige methylatie, met uitzondering van de CpG eilanden. Hierbij zijn 60 tot 90% van de CpG dinucleotiden gemethyleerd (Barzotti et al., 2006; Regev et al., 1998; Santos et al, 2005). De aanwezigheid van 5-methylcytosine wordt gerapporteerd in verschillende invertebraten behorende tot verschillende ordes. Er zijn verschillende niveau’s van methylatie en verschillende functies gerapporteerd. Het genoom van de meeste invertebraten (Insecta, Mollusca, Echinodermata, Annelida, Priapulida, Bryozoa en Cnidaria) bestaat echter vooral uit een grote fractie met lang niet-gemethyleerd DNA en strengen van sterk gemethyleerd DNA (Mandrioli, 2004). Gezien de rol die DNA-methylatie speelt, zorgen de verschillende 70 functies van DNA-methylatie voor een duidelijk onderscheid tussen invertebraten en vertebraten. Het is daarom moeilijk om een universele functie van DNA-methylatie te definiëren in het dierenrijk. DNA-methylatie in het genoom van vertebraten neemt meestal plaats in de promotorregio van de genen. Daartegenover staan gegevens uit studies van de DNA-methylatie bij invertebraten (Field et al, 2004; Mandrioli, 2004), waar wordt aangetoond dat de methylatie van cytosine vooral ligt in de coderende sequentie. Deze vaststelling heeft een functionele betekenis, dit werd duidelijk vastgesteld bij de bladluis M. persicae. Het verlies van gemethyleerde cytosinen in esterase genen is verantwoordelijk voor een gereduceerde genexpressie. Men heeft aangetoond dat gemethyleerde cytosinen in het DNA van zoogdieren beperkt is tot symmetrische CpG sequenties op beide DNA-strengen, dit staat terug in contrast met de analyse van het DNA-methylatiepatroon bij invertebraten. Gemethyleerde cytosinen in CpG sequenties komen voor bij invertebraten, maar het zijn hoofdzakelijk cytosinen die niet voorkomen in CpG dinucleotiden die gemethyleerd zijn. Een goed voorbeeld hiervan is het goed bestudeerde modelorganisme D. melanogaster. De aanwezigheid van gemethyleerd cytosine buiten de CpG dinucleotiden wijst vermoedelijk op een rol van DNA-methylatie waarbij het behoud van het methylatiepatroon tijdens celdelingen niet noodzakelijk is (Field et al., 2004). Genexpressie onderdrukking wordt gestuurd door DNA-methylatie en een serie van DNAeiwit en eiwit-eiwit interacties (fig. 1.27). Ze beginnen telkens met de binding van methylCpG bindingsproteïnen (MBPs), gevolgd door enzymen die zorgen voor histonenmodificaties. Methylbindingsproteïnen (MBP) zijn een familie van eiwitten die zijn teruggevonden in verschillende diersoorten (Mandrioli & Borsatti, 2005). Methyl CpG bindingsdomeinen (MBD) komen voor bij verschillende leden van de MBP familie. MethylCpG bindingsproteïne 2 (MeCP2) en andere leden van de MBP-familie bezitten een goed geconserveerd domein (MBD) van 70–75 aminozuren. De initiële binding van MBPs aan gemethyleerd CpG is een kritische stap in de epigenetische regulatie van genactiviteit (fig. 1.32 & 1.33). Bij vertebraten zijn vijf MBD-proteïnegroepen (families) geïdentificeerd: MBD1, MBD2, MBD3, MBD4 en MECP2. MBD2 en MBD3 zijn de enige proteïnegroepen, waarvoor homologen zijn terug te vinden in het genoom van invertebraten. 71 Figuur 1.32: DNMT2 in insecten mist het terminale N-domein, verantwoordelijk voor de interactie van DNMT met vele andere proteïnen (A). Het terminale N-domein is wel aanwezig in DNMT1 en DNMT3. De afwezigheid van het terminale N-domein in DNMT2 voorkomt de koppeling van DNA-methylatie met histonenmethylatie. Deze twee epigenetische processen kunnen het doel zijn van verschillende genoomcompartimenten, waar zij een totaal verschillende rol kunnen spelen. Deze hypothese wordt ondersteund door gegevens rapporterend dat DNA-methylatie betrokken is bij de genexpressie in plaats van de onderdrukking van de genexpressie op euchromatische compartimenten van het genoom (B). Deze gegevens suggereren, daarvoor, de afwezigheid van een kruiselingse link tussen DNA en histonenmethylatie in insecten. (Mandrioli & Borsatti, 2005). DNA-methylatie en histonenmethylatie werken nauw samen in de onderdrukking van de chromatine-expressie (fig. 1.30), dit werd ontdekt bij planten en zoogdieren. De afwezigheid van een wederzijdse interactie tussen histonenmethylatie en DNA-methylatie in invertebraten is dan ook opmerkelijk (fig. 1.32). Deze bevinding suggereert de aanwezigheid van een unieke DNMT zonder het typische domein betrokken bij dit type interactie en past in het beeld van de verschillende functies van DNA-methylatie in invertebraten in vergelijking met planten en vertebraten (Mandrioli & Borsatti, 2005). Bij invertebraten zijn alle typen van DNMT’s geïdentificeerd sinds de ontrafeling van het genoom van de Honingbij (Apis mellifera). Uit studies (Goll & Bestor, 2005; The Honeybee Genome Sequencing Consortium, 2006; Wang et al., 2006) blijkt dat Apis mellifera de eerste Protostoma is, waarbij een volledige set functionele en actieve DNMT’s eigen aan vertebraten werd ontdekt (fig. 1.28). 72 De insecten Drosophila melanogaster, Bombyx mori, Apis mellifera en Anopheles gambiae bezitten een uniek gen dat codeert voor DNMT’s (in het bijzonder DNMT2 (fig. 1.28).verwante enzymen). In tegenstelling tot de typische eukaryotische DNMT’s, mist DNMT2 het N-terminale domein dat verantwoordelijk is voor de DNMT-interactie met talrijke andere eiwitten. Zo wordt de koppeling van DNMT2 gekatalyseerde DNAmethylatie met histonenmethylatie bij insecten geïnhibeerd (Field et al, 2004; Mandrioli, 2004; Mandrioli & Borsatti, 2005). De hypothese van de afwezigheid van een interactie van DNA-methylatie met andere epigenetische processen wordt ondersteund door de rol die DNA-methylatie speelt in insecten. Experimentele resultaten toonden aan dat gemethyleerde genen transcriptioneel actief zijn (tabel 1.2), dit kan wijzen op de afwezigheid van de correlatie tussen DNAmethylatie en geninactivatie. Bij bepaalde insecten is de actieve transcriptie beschreven van verschillende genen, zelfs als deze gemethyleerd zijn. De DNA-methylatie zou essentieel zijn voor het verzekeren van de genexpressie (Mandrioli & Borsatti, 2005). Het is interessant dat insecten geen unieke biologische modellen zijn, waar methylatie niet betrokken is in genonderdrukking. Gelijkaardige resultaten zijn verkregen in onderzoek bij andere invertebraten zoals: Strongylocentrus purpuratus, Ciona intestinalis en Branchiostoma lanceolatum (Mandrioli, 2004; Mandrioli & Borsatti, 2005; Tweedie et al, 1997). De huidige analyse toont aan dat, indien de histonenmethylatie en DNA-methylatie mechanismen beide aanwezig zijn in vertebraten en invertebraten, enkel histonenmethylatie een evolutieve behoudende rol speelt in de geninactivatie. DNAmethylatie vervult daarentegen verschillende functies in verschillende taxa. Alles wijst erop dat DNA-methylatie en histonenmethylatie in invertebraten het doel zijn van verschillende genomische compartimenten. Ze hebben daar verschillende en tegenovergestelde effecten. In invertebraten is daarom een verlies vastgesteld aan interactie tussen de twee epigenetische mechanismen (Mandrioli & Borsatti, 2005). DNA-methylatie werkt als voorkeurssubstraat voor specifieke bindingsproteïnen die andere proteïnen nodig hebben (fig. 1.27). Bij enkele invertebraten is aangetoond dat DNA-methylatie niet de genexpressie onderdrukt, maar net zorgt voor de activatie van specifieke genen (gerapporteerd bij bladluizen) of de transcriptie van ‘imprinted’ allelen (gerapporteerd voor schildluizen) (Barzotti et al., 2006; Field et al, 2004; Mandrioli, 2004) en dus niet de onderdrukking van specifieke transposons of gemethyleerde genen. De studie van de structuur en de functie van MBD is van groot belang voor het begrip van het epigenoom van invertebraten (Mandrioli & Borsatti, 2005). 73 Tabel 1.2: schematische voorstelling van de verschillende functies van methylatie beschreven bij invertebraten en vertebraten. Het plusteken duidt aan dat DNA-methylatie bij invertebraten een positief effect heeft op de genexpressie en de ‘imprinting’ van genen. Bij vertebraten duidt het minteken aan dat DNA-methylatie net het tegenovergestelde effect heeft. DNA-methylatie zorgt verder voor de onderdrukking van de transpositie (transposons) bij vertebraten, terwijl DNA-methylatie geen effect heeft op de transpositie bij invertebraten. Het belang van DNA-methylatie tijdens de ontwikkeling van vertebraten (gene silencing) werd duidelijk aangetoond. De rol van DNA-methylatie op de ontwikkeling bij invertebraten staat nog niet helemaal vast. Bij sommige soorten is gemethyleerd DNA gelimiteerd tot de eerste fase van de ontwikkeling en afwezig in weefsel van adulten. Bij andere soorten is gemethyleerd DNA teruggevonden in alle stadia van de levenscyclus en zowel in lichaamscellen, als voortplantingscellen (Mandrioli, 2004; Mandrioli & Borsatti, 2005). INVERTEBRATEN VERTEBRATEN Transcriptie + - Imprinting + - Transpositie / - ? of +/- - Ontwikkeling, groei Om de rol van de DNA-methylatie beter te begrijpen in het kader van de adaptatie van organismen aan polluenten is het van belang om alle facetten van het proces te begrijpen (Bird, 2002; Mandrioli, 2004). We kunnen besluiten dat (tabel 1.2): - Eenzelfde functie van DNA-methylatie bij planten en vertebraten en de overeenkomsten in ontwikkelingsstoornissen bij sterk verschillende eukaryoten heeft bijgedragen tot de hypothese, dat de functie van DNA-methylatie niet verloren is gegaan doorheen de evolutie. - Onderzoek bij invertebraten deze hypothese niet ondersteunt. De onderdrukking van de genexpressie door DNA-methylatie blijkt niet voor te komen onder de invertebraat-vertebraat grens en de functie van DNA-methylatie als bescherming van het genoom tegen transposons blijkt niet voor het genoom van invertebraten te gelden (tabel 1.2). Het epigenoom is soortspecifiek en slechts zelden is er een algemeen patroon in het epigenoom te vinden in eenzelfde fylogenetische groep invertebraten. De verschillende eigenschappen van DNA-methylatie in insecten zijn uniek en werpen een ander licht op dit epigenetisch proces. DNA-methylatie in insecten is ook een nieuwe materie voor de studie van de functie en de evolutie van dit fenomeen. De welbekende rol van DNA-methylatie als onderdrukker van de genexpressie bij vertebraten blijkt bij de tot op heden onderzochte insecten niet 74 behouden te zijn. De huidige onderzoeksgegevens wijzen op een andere functie van DNA-methylatie bij insecten, namelijk een verdedigingsmechanisme tegen mobiele elementen (transposons). Vermoedelijk heeft de DNA-methylatie bij nauwverwante diergroepen een gelijkaardige functie. - Het verschil in overeenkomstige genen tussen de reeds gesequenceerde genomen van insecten bevestigen de snellere genoomevolutie bij insecten, dan bij vertebraten (The Honeybee Genome Sequencing Consortium, 2006; Wang et al., 2006). Deze vaststelling is vermoedelijk ook geldig voor andere invertebraten. Tevens kan de snellere evolutie van het genoom (zorgt voor grotere verscheidenheid) samengaan met een snelle evolutie van het epigenoom. Men kan zo misschien hypothetisch de verscheidenheid in de werking van epigenomen verklaren. - Er is een hypothese die wijzigingen in DNA-methylatie relateert aan wijzigingen in genexpressie en de ontwikkeling van een diversiteit in alle organismen, zo zou de DNA-methylatie aan de basis kunnen liggen van de oorsprong van multicellulariteit. - Er zijn verschillende en tegenovergestelde effecten op de genexpressie. De onregelmatigheden zouden veroorzaakt kunnen worden door de proteïnen die interageren met gemethyleerd DNA en niet door het gemethyleerd DNA zelf. - DNA-methylatie is een zeer flexibel epigenetisch mechanisme. Dit mechanisme zou altijd actief zijn geweest tijdens de evolutie om verschillende functies in verschillende taxa uit te voeren. 75 2 Materiaal en methoden 2.1 Reproductietest 2.1.1 Materiaal Aquaria (3 l en 5 l) (fig. 2.1) Afdekplaat (fig. 2.1) Pasteurpipet + kunststofdarm CdCl2.H20 en NiCl2.6H20 pH-meter, O2-meter, testkits (hardheid), thermometer 10 ml spuit + 0,45 µm filter PE bekers of glazen flesjes (40 ml) + bak (fig. 2.2) Mechanische teller Wierenmix M4-medium Zeven (500 tot 1400 µm) AAS-buisjes 10 ml Pipetten van 0,5-10 µL, 1-5 µL, 40-200 µL, 200-1000 µL, 1-50 ml, 2-100 ml (Finn, Eppendorf) Rekje voor buisjes van 10 ml Gedeïoniseerd water Pipettips: 0,5-10 µL, 1-5 µL, 40-200 µL, 200-1000 µL, 1-50 ml, 2-100 ml (Finn, Eppendorf) Wegwerphandschoenen (latex) (VWR) 2.1.2 Opstellen van de watervlocultuur In alle experimenten wordt Daphnia magna Straus als proeforganisme gebruikt. Er wordt gebruik gemaakt van kloon K6 afkomstig uit een vijver in Kiel (Antwerpen). Al meer dan 10 jaar wordt deze kloon onder gecontroleerde omstandigheden in het laboratorium gekweekt. Betrouwbare resultaten zijn enkel te verkrijgen als de watervlocultuur onder strikt gestandaardiseerde en zo optimaal mogelijke omstandigheden wordt gekweekt. 76 Figuur 2.1: opstelling van kweekaquaria De proeforganismen worden verdeeld over 4 aquaria. Er wordt een standaard aangehouden van 100 Daphnia per liter medium. Voor de test worden per generatie volgende aquaria opgesteld (fig. 2.1): - 3 aquaria (inhoud 5 l) gevuld met 4 l medium - 1 aquarium (inhoud 3 l) gevuld met 2 l medium Het medium (tabel 2.1) is het gestandaardiseerde M4 medium (Elendt & Bias, 1990; OECD, 1996). Het wordt gebruikt voor het kweken van Daphnia magna in de aquaria en de opgezette reproductietest. Alle gekweekte Daphnia magna worden dagelijks van voedsel voorzien met een mengsel van de algen Pseudokirchneriella subcapitata (syn. Selenastrum capricornutum) en Chlamydomonas reinhardtii in de verhouding 3:1. De hoeveelheid voedsel is ook afhankelijk van de leeftijd van de Daphnia magna. Wekelijks wordt de hoeveelheid voedsel met de helft vermeerderd. Er wordt gezorgd voor een constant drooggewicht algen per ml voedsel. Alle experimenten worden opgestart met juveniele vrouwelijke Daphnia magna van 77 minder dan 24 uur oud. De experimenten worden uitgevoerd in een gethermostatiseerde ruimte van 20°C. Er wordt een licht/donker cyclus aangehouden van 16 uur licht en 8 uur donker. Het medium wordt licht belucht en tweemaal per week vernieuwd. De beluchting gebeurt via een kunstofdarm en een glazen pasteurpipet met een wattenprop, hierdoor verkrijgt men een lichte bellenbeluchting. De oplossingen van de metalen met de gewenste concentraties van cadmium en nikkel worden bereid door respectievelijk het oplossen van een stockoplossing van CdCl2.H20 (250 mg/l Cd2+) en NiCl2.6H20 (1506,63 mg/l Ni2+). De uiteindelijke concentraties zijn: 0 µg/l, 180 µg/l Cd2+, 250 µg/l Cd2+en 372 µg/l Ni2+. Er wordt ook voorzien in een voorraad medium per testconcentratie. Tabel 2.1: samenstelling van het M4 medium. De samenstelling van het standaardmedium M7 is ook in de tabel terug te vinden. 78 2.1.3 Staalname voor fysico-chemische analyse Er zijn enkele parameters van het medium die regelmatig dienen gecontroleerd te worden: zuurstofgehalte, temperatuur, pH, hardheid, lichtregime, lichtintensiteit, (TOC en COD). Voor en na verversen van de aquaria wordt een 10 ml spuit + 0,45 µm filter gebruikt voor het nemen van stalen van 10 ml. Deze worden bewaard in analysebuisjes in een koelkast op 10°C om later de werkelijke metaalconcentratie van het medium te bepalen door middel van de AAS. 2.1.4 De reproductietest De primaire doelstelling van de proef is het evalueren van het effect van chemische stoffen op de reproductie van Daphnia magna. De test wordt opgestart met vrouwelijke Daphnia magna van minder dan 24 uur oud. Er wordt een concentratiereeks opgesteld. Hiervoor wordt de teststof opgelost in een gestandaardiseerd medium. Van elke concentratie zijn er 10 replica’s. De test duurt ongeveer 2-3 weken. Gedurende de test worden dagelijks de nakomelingen geteld per individu. Het is ook belangrijk te kijken naar de mortaliteit van het moederdier en de tijd tot de productie van de eerste nakomelingen. Andere stofafhankelijke effecten kunnen ook onderzocht worden. De groei is een goede indicator voor de intracellulaire effecten 79 van een toxische stof. De LC5O, NOEC,… en andere parameters van acute toxiciteitstesten, bij Daphnia magna van dezelfde oorsprong, zijn van groot belang voor het bepalen van de testconcentraties waaraan ze blootgesteld worden tijdens de reproductietest. Op basis van toxiciteitstesten en modellen, bijvoorbeeld BLM, worden de testconcentraties vastgelegd. Voor deze reproductietest worden de organismen blootgesteld aan de volgende concentraties: 0 µg/l, 180 µg/l Cd2+, 250 µg/l Cd2+en 372 µg/l Ni2+ (fig. 2.3). In de aquaria worden dezelfde concentraties aangehouden, zodat beide opstellingen vergelijkbaar zijn. Het recipiënt waarin de Daphnia magna gedurende de test worden gehouden moet chemisch inert zijn. Figuur 2.2: opstelling van een reproductietest 80 Voor de eerste testreeksen met de P-generatie organismen wordt gebruik gemaakt van bekers uit polyethyleen (fig. 2.2). Zo werden er 4 testreeksen met 10 replica’s opgesteld (fig. 2.2). Voor de F1-reeksen wordt overgeschakeld op het gebruik van glazen recipiënten. Er werden bij de test met F1-organismen zeven testreeksen opgesteld: vier testreeksen waarbij de organismen onder dezelfde condities werden gehouden (fig. 2.3) en 3 blancoreeksen van organismen die vooraf zijn blootgesteld aan nikkel of cadmium (fig. 2.3). De metaaloplossingen worden opgeslagen in dezelfde grote tonnen uit kunststof, als voor de aquaria. De eerste generatie Daphnia magna moeten afkomstig zijn van gezonde moederdieren. Ze mogen geen tekenen van stress vertonen (hoge sterfte, aanwezigheid van mannelijke dieren en ephippia of rusteieren, vertraging op het tijdstip van het eerste broedsel, verkleuring van dieren). De proeforganismen moeten afkomstig zijn van moederdieren die gekweekt worden onder dezelfde condities als die waaronder de test wordt uitgevoerd. De organismen zijn afkomstig van de hoofdkweek van het laboratorium en verkeerden in goede conditie. Het is belangrijk de eigenschappen van het M4-medium te kennen, vooral de hardheid en de chelatiecapaciteit hebben een grote invloed op de toxiciteit van de toegevoegde metalen. Het M4-medium bevat de chelerende stof EDTA. Voor cadmium is aangetoond dat de toxiciteit lager ligt in aanwezigheid van EDTA. Hiervoor zijn modellen ontwikkeld om de uiteindelijke toxische vrije metaalionconcentratie te kennen. Proeforganismen worden individueel gehouden, één per testbeker, met 40 ml per beker. Voor semi-statistische testen moeten minstens 10 proeforganismen individueel gehouden worden in elke testconcentratie en in blanco medium. Het voorziene voedsel zou moeten gebaseerd zijn op de hoeveelheid organische koolstof die aan elk moederdier moet worden toegediend. Hoeveelheden tussen 0.1 en 0.2 mg C/Daphnia/dag zijn voldoende om het aantal nakomelingen hoog te houden. Elke week wordt de hoeveelheid voedsel vermeerderd met de helft, zoals bij de “kweek” in de aquaria. Dezelfde lichtcyclus van 16 uur licht met een intensiteit niet hoger dan 15-20 Em-2s-1. De temperatuur van het testmedium moet binnen de grenzen van 18-22 °C zijn, dit wordt bereikt door het kweken van de organismen in een geacclimatiseerde ruimte van 20°C. Er wordt gestreefd naar een constante temperatuur om de effecten op het metabolisme te minimaliseren. De testreeksen worden niet belucht gedurende het experiment, terwijl de aquaria waarin Daphnia magna wordt gekweekt, wel belucht worden via het centrale beluchtingssysteem. 81 Er wordt getracht om de concentratie van de metalen zo te kiezen dat mortaliteit vermeden wordt, omdat bij hoge sterfte de aard van de test niet meer past bij de beoogde doelstellingen van de reproductietest. Het medium wordt minstens 2x per week ververst, omdat cadmium en nikkel niet 100% stabiel zijn in het medium en de excretieproducten van Daphnia magna de samenstelling van het medium beïnvloeden. De nakomelingen van elk proeforganisme worden dagelijks geteld en verwijderd uit de testbeker. De mortaliteit onder de nakomelingen of niet ontwikkelde eitjes wordt ook bijgehouden. Tijdens de test worden de concentraties van de teststof op regelmatige basis bepaald. Het totale aantal nakomelingen per ouderdier wordt berekend op het einde van de test. Als blijkt dat het ouderdier sterft tijdens de test of het proefdier is een mannetje, dan moet dit aangegeven worden in de analyse van de reproductietest. Het broedsel wordt dagelijks geteld en verwijderd om dubbeltellingen te vermijden. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een lichtbak en een pipet van 10 ml. Het tellen van de juveniele Daphnia magna gebeurde bij het overbrengen van de organismen naar een verzamelbak. Bij hoge aantallen wordt soms gebruik gemaakt van een mechanische teller. P: 0 µg/l g/L Cd2+ F1: 0 µg/l Cd2+ P: 250 µg/l Cd2+ F1: 0 µg/l Cd2+ F1: 250 µg/l Cd2+ P: 180 µg/l Cd2+ F1: 180 µg/l Cd2+ F1: 0 µg/l Cd2+ P: 372 µg/l Ni2+ F1: 372 µg/l Ni2+ F1: 0 µg/l Ni2+ Figuur 2.3: schematische voorstelling van de reproductietest 82 2.2 Bepaling interne cadmiumconcentratie bij Daphnia magna 2.2.1 Schema en materiaal Kweken van D. magna in standaardmedium M4 + Cd2+ Gut-clearance + verwijdering metalen van carapace + afzeven te analyseren organismen Invriezen van D. magna met vloeibare stikstof (-70°C) (vermijden van stress) Organismen drogen in droogstoof 40°C-60°C + bepalen drooggewicht. Ontdooien & homogeniseren in NaCl-oplossing (0,9%). Subcellulaire fractionatie (4 of 5 fracties) Destructie in 14 N HNO3 Gedestrueerde D. magna + blanco + spike-oplossing + referentieplankton Destructie (of aanzuren) van celmateriaal met 14N HNO3 in elke fractie + homogenaat + blanco + spike-oplossing + referentieplankton Spectroscopische analyse (GFAAS, ICP-MS) Figuur 2.4: schema van de praktische uitvoering van de bepaling van het metaalgehalte in het volledige organisme en in de verschillende subcellulaire fracties. 83 Het benodigde materiaal: 14 N HNO3 Wierenmix M4-medium Na2EDTA-oplossing Zeven Vloeibare stikstof -70°C Aluminiumfolie/parafilm Dessicator Plastic pestle Ijs en ijsverbrijzelaar (Waring) Hettich Microcentrifuge (Mikro 200R) Beckman Ultracentrifuge (L7-55) Buisjes voor destructie van 10 ml Buisjes voor destructie van 1,5 en 2 ml (Eppendorf) Warmwaterbad (Memmert) Diepvries -20°C Pipetten van 0,5-10 µL, 1-5 µL, 40-200 µL, 200-1000 µL, 1-50 ml, 2-100 ml (Finn, Eppendorf) Petrischaal Rekje voor buisjes van 1,5 en 2 ml (VWR) Rekje voor buisjes van 10 ml Bigedeïoniseerd water, bereid in HQ5-machine Pipettips: 0,5-10 µL, 1-5 µL, 40-200 µL, 200-1000 µL, 1-50 ml, 2-100 ml (Finn, Eppendorf) Wegwerphandschoenen (latex) (VWR) Droogoven (Heraeus) Balans (Mettler) of micro-balans (Sartorius) Microgolfoven GFAAS (Varian) ICP-MS (Varian) 84 2.2.2 Bepaling van totale cadmiumbelasting De metaalconcentratie in Daphnia magna wordt bepaald door de destructie van de organismen in HNO3 (fig. 2.4). Voordat de destructie wordt uitgevoerd, worden de organismen eerst op een passende wijze behandeld, zodat de werkelijke interne concentraties kan worden bepaald. De organismen worden 6 à 8 uur in een controlemedium met proper voedsel gehouden om cadmium uit het darmstelsel te krijgen dat afkomstig is van voedsel dat mogelijks cadmium heeft opgenomen uit het medium (Gillis et al., 2005). Hierna worden de organismen 20 minuten in 5 mM Na2EDTA-oplossing gehouden om metalen van de carapax te halen (fig. 2.4). De organismen worden verzameld door het medium met organismen over een zeef te gieten. De maaswijdte van de zeef is afhankelijk van de leeftijd en de grootte van de organismen. Nadien worden de organismen gespoeld met bigedesioniseerd water over de zeef. Overtollig water wordt verwijderd met een papieren doek, om te voorkomen dat de organismen aan elkaar kleven en moeilijk van elkaar te scheiden zijn. De organismen worden dan ingevroren (N2 bij -70°C). De organismen worden gedroogd in de droogstoof. Hiervoor brengt men de organismen met een spatel over op een stukje aluminiumpapier of parafilm. Het stukje aluminiumpapier of parafilm wordt in een petrischaal gebracht en gelabeld met: concentratie, naam, datum, staaltype en aantal. De droogtijd hangt af van de temperatuur, meestal wordt gedroogd bij temperaturen tussen 40°C en 60°C. Bij deze temperaturen is na één dag alle vocht verwijderd uit de organismen. De gedroogde organismen worden dan in een dessicator geplaatst om ze af te koelen tot op kamertemperatuur (fig. 2.4). De gedroogde organismen worden zo nauwkeurig mogelijk gewogen en er worden zo weinig mogelijk organismen per meetstaal gewogen. De totale massa moet bij wegen een aanvaardbare fout hebben. Eerst wordt het aluminiumpapiertje of parafilm+organismen gewogen, daarna worden de organismen overgebracht in een AAS-buisje. Nu kan het stukje aluminiumpapier of parafilm worden gewogen. Het totale gewicht kan dan gedeeld worden door het aantal organismen, om het gemiddelde gewicht per organisme te bepalen. Het gewenste aantal organismen wordt dan in AAS-buisjes gebracht. Er wordt steeds met dezelfde balans gewerkt om afwijkingen te vermijden. De organismen worden vervolgens gedestrueerd. De detectielimieten hangen af van de biomassa en van de hoeveelheid volume die wordt toegevoegd. Dit dient voor elk 85 experiment geoptimaliseerd te worden. Er wordt een reeks met verschillende aantallen Daphnia magna gedestrueerd om een goed detecteerbare metaalconcentratie te bepalen. Er wordt onder de trekkast gewerkt omwille van het gebruik van sterke zuren. Volgende werkwijze werd gevolgd (fig. 2.4): 1) Aan de organisme(n) in de AAS-buisjes (met een inhoud van 10 ml) wordt 1 ml 14N HNO3 toegevoegd . De organismen moeten volledig onder het zuur zitten. Pipetten worden vooraf gecontroleerd en eventueel gekalibreerd. Er wordt gewerkt met HNO3 van NORMATOM-kwaliteit, daarom dient het zuur uit een metaalvrije maatbeker te worden genomen (vooraf gespoeld met 1% HNO3). 2) De AAS-buisjes (gaatjes prikken in dekseltjes) worden met organisme(n)+zuur geplaatst in een rekje en het rekje in het daarvoor voorziene doosje. Het doosje wordt gesloten. 3) De stalen worden in de microgolfoven geplaatst en volgend programma wordt doorlopen: 4 minuten 90W, 4’ 160W, 4’350W en 4’500W. Het programma wordt niet volledig doorlopen indien de hoeveelheid staal in het buisje klein is. De dekseltjes mogen niet openspringen. Regelmatig tussen de verschillende stappen controleren of de organismen reeds gedestrueerd zijn. De pauzes tussen de verschillende stappen moeten wel zo kort mogelijk gehouden worden om sterke afkoeling en opwarming te vermijden => opspattend zuur. Het programma wordt gestopt als er voortdurend dekseltjes openspringen en er worden extra gaatjes geprikt in dekseltjes. Hierna kan men verder destrueren, eventueel terug op een lager vermogen bij sterke afkoeling. 4) Voorzichtig wordt nu het doosje geopend onder de trekkast (gevaarlijke, zeer zure dampen). Handschoenen dragen. 5) Wanneer de damp weg is, kan gecontroleerd worden of de destructie goed verlopen is. Dit is zo als er een heldere oplossing bekomen wordt (m.a.w. als er geen weefseldeeltjes meer zichtbaar zijn). Als dit niet het geval is, wordt eventueel nog langer en/of op een hoger percentage gedestrueerd. 86 6) Als de oplossing afgekoeld is, wordt het zuur verdund met bi-gedesioniseerd water (BiDI). 7) Aan elk buisje wordt 9 mL BiDI toegevoegd. Tijdens het destructieprogramma kan een deel van het zuur verdampen, daarom wordt het staal na het afkoelen opgezogen met een micropipet (ev. 1000 µl). De hoeveelheid staal wordt dan verdund tot 10% HNO3 wordt bekomen. 8) Met de oplossing van 10% HNO3 wordt ook de standaardreeks voor gedestrueerde stalen aangemaakt. 9) Eventueel worden nieuwe dopjes op de buisjes gedraaid. De stalen worden aangeboden voor analyse. 10) Kwaliteitscontrole: - Blanco wordt meegenomen en het volledige protocol wordt doorlopen - “Recovery of spikes”. Er wordt een gekende hoeveelheid Cd toegevoegd aan 10% HNO3. Volledig protocol wordt doorlopen. - De detectie- en kwantificatielimieten voor Cd in 10% HNO3 worden bepaald. - Een analyse van de matrixeffecten bij oven-AAS. 11)Referentie: er wordt referentieplankton meegenomen in het protocol. Bij elke destructiereeks, dient bij voorkeur een referentie meegenomen te worden. Deze referentie moet dezelfde procedures doorlopen als de te meten weefsels. 87 2.2.3 Subcellulaire verdeling van cadmium In deze studie wordt gebruik gemaakt van preparatieve centrifugatie om pellets van fijne deeltjes, cellulaire organellen en macromoleculen te scheiden en neer te slaan. Er wordt specifiek gebruik gemaakt van differentiële centrifugatie. Een scheidingstechniek in gebruik bij preparatieve ultracentrifugatie. Door het centrifugeren scheiden we een homogenaat bij elke centrifugestap in twee fracties: een pellet van zware moleculen en het resterende supernatans. Men kan de pellet resuspenderen en hercentrifugeren om een zuiver preparaat van de zwaarste deeltjes te bekomen, maar 100% scheiding is niet mogelijk. Uit het resterende supernatans kunnen de iets lichtere deeltjes opnieuw gecentrifugeerd worden tot een pellet. Opeenvolgende centrifugaties en toenemende centrifugale krachten maken het mogelijk de deeltjes met verschillende grootte gedeeltelijk te isoleren en te zuiveren. Voor het scheiden van de fracties worden twee toestellen gebruikt: Hettich Microcentrifuge “Mikro 200R” Beckman Ultracentrifuge “L7-55” Van de drie type rotoren die er bestaan, wordt gebruik gemaakt van de ‘swinging bucket rotors’ voor de ultracentrifuge en van ‘vaste hoek rotoren’ voor de microcentrifuge. 88 In deze studie werd eerst een aangepast protocol opgesteld voor de subcellulaire fractionatie van cadmium, gebaseerd op verschillende methoden (Selck, 2004; Giguère et al., 2006; Wallace et al., 1998; Wallace et al., 2003). Sommige studies (Giguère et al., 2006) onderscheiden drie fracties: - onoplosbare: cellulaire rest(afval)stoffen, metaalrijke granulen en organellen - HSP of HDP: ‘heat sensitive proteins’ of ‘heat denatured proteins’ - MT(LP)-fractie: metallothioneïnen en ‘metallothionein-like’ proteinen, hittestabiele proteïnen Andere studies (Selck, 2004) onderscheiden vier of vijf fracties: - ‘debris’ fractie: weefsel/celdeeltjes, celmembranen, granulen. Granulen kan men als aparte fractie afscheiden uit de ‘debris’ fractie. - mitochondriale fractie: mitochondria, peroxisomen en lysosomen - microsomale fractie: plasmamembraan, fragmenten van endoplasmatisch reticulum, Golgi-apparaat, ribosomale pellet - cytosolische fractie: enzymen/proteïnen, granulen (glycogeen granulen). o HDP ‘heat denatured proteins’: enzymen, e.a. o HSP ‘heat stable proteins’: metallothioneïnen, e.a. De verschillende fracties worden gescheiden op volgende manier (fig. 2.4): De te analyseren organismen worden snel ingevroren met vloeibare stikstof van -70°C. De afbraak van celmembranen wordt daardoor bevorderd en men voorkomt dat de organismen nog onderhevig zijn aan stress. Enkele organismen (5 tot 20 ex.) worden overgebracht in een eppendorfbuisje. Van dit analysestaal worden enkele replica’s voorzien. Aan de organismen in de eppendorfbuisjes wordt 300 µl ijsgekoeld NaCl 0,9% (w/v) (standaard isotonische zoutoplossing om osmotische druk in het celmateriaal te vermijden) toegevoegd. Met een plastic pestle worden de organismen/weefsels gehomogeniseerd in de eppendorfbuisjes. Steeds uitvoeren bij ±4°C. Bij het achterblijven van stukken weefsel op de pestle kan deze gespoeld worden met een gekende hoeveelheid van de 0,9% NaCl-oplossing. Op deze manier gaat er geen 89 analysestaal verloren. Er wordt 50 µl van elk homogenaat overgebracht in nieuwe eppendorfbuisjes. Volgende fracties worden verkregen door differentiële centrifugatie van de resterende 250 µl van het homogenaat (fig. 2.5): 1 Een pellet van ‘debris’ (P1) wordt verkregen door centrifugatie bij 1000 x g voor 10 minuten met de microcentrifuge “Mikro 200R” bij 4°C. 2 Eventueel kan men uit de ‘debris’ fractie nog een pellet (P2) van granulen neerslaan (Giguère et al., 2006): (1) resuspensie van pellet P1 in 0,5 mL BiDi (ultrapuur water) (2) verhitten van de suspensie bij 100°C voor 2 minuten (3) toevoegen van 0,5 ml NaOH 1N (4) opnieuw verhitten bij 6070°C voor 1 u (5) centrifugatie bij 10.000 x g voor 10 minuten bij 20°C met de microcentrifuge “Mikro 200R”. De debris zit dan in het supernatans (S2). 3 Mitochondrien: uit S1 wordt bij 9000 x g voor 20 minuten en bij 4°C een pellet (P3) verkregen met de microcentrifuge “Mikro 200R”. 4 Microsomale en cytosolische fractie: 105.000 x g voor 60 minuten met de ultracentrifuge “L7-55” bij 4°C. De cytosolische fractie wordt als supernatans (S4) gescheiden van microsomale/lysosomale pellet (P4). 5 HDP en HSP: de cytosolische fractie wordt gesplitst in HSP en HDP door verhitting van het supernatans (S4) op 80°C voor 10 min. Men dient het supernatans af te koelen op ijs voor één uur. Dit is noodzakelijk om een goede scheiding te krijgen tussen HSP en HDP. Centrifugatie bij 50.000 x g voor 10 min. bij 4°C met ultracentrifuge “L7-55”. De hittestabiele proteïnen blijven in het uiteindelijke supernatans (S5) en de gedenatureerde proteïnen vormen een pellet (P5). Na elke centrifugestap wordt het supernatans overgebracht naar een nieuw eppendorfbuisje en de pellet wordt aangezuurd met 14 N HNO3. Het aangezuurde staal wordt dan verdund tot de gewenste concentratie, opdat deze kan gemeten worden met GFAAS of ICP-MS. 90 Homogenaat P1: debris S1: supernatans P3: mitochondriën P2: granulen (MRG) S2: cellulaire debris P4: microsomen, lysosomen P5: HDP (enzymen) S3: supernatans S4: cytosol S5: HSP (metallothioneïnen) Figuur 2.5: schematische voorstelling van de verschillende fracties. Van de verschillende fracties (pellets) en het homogenaat kan nu de metaalconcentratie worden bepaald. De aangezuurde stalen worden daarvoor eerst gedestrueerd: 1) Microgolfoven: De destructie verloopt onder de trekkast. Er wordt gewerkt volgens het protocol voor de bepaling van de totale metaalbelasting. 1 ml 14 N HNO3 (NORMATOM) toevoegen per 10 organismen. Staal moet volledig onder salpeterzuur zitten. Eppendorfbuisjes worden goed afgesloten en het rekje voor de eppendorfbuisjes kan eventueel verpakt worden in parafilm (vermijden van openspringende deksels). Het eppendorfrekje met de eppendorfjes wordt geplaatst in de voorziene doos. De doos wordt gesloten. Microgolfovenprogramma doorlopen: 4’ 90W, 4’ 160W, 4’ 350W en 4’ 500W. Dit programma zorgt voor een geleidelijke en zachte opwarming van de stalen. De doos wordt geopend en er wordt gekeken of de destructie goed is verlopen, als de destructie slecht is verlopen, wordt het staal verder gedestrueerd op een groter 91 vermogen. Na de destructie dienen de stalen af te koelen en worden de stalen verdund met BiDi-water 10 % HNO3. 2) Warmwaterbad (Kahle et al., 2003; Sokolova et al., 2005): - Warmwaterbad wordt ingesteld op 80°C en het waterpeil wordt afgeregeld. - Er wordt ook hier voorzien in 1 ml 14 N HNO3 (NORMATOM) per 10 organismen. Staal dient volledig onder salpeterzuur te zitten. - De eppendorfjes worden in het warmwaterbad geplaatst in het voorziene rek. De stalen worden voor 3 u gedestrueerd. Als de destructie goed is verlopen laat men de stalen langzaam afkoelen. - De stalen worden verdunnd met BiDi-water tot 10% HNO3. Het finale supernatans wordt aangezuurd tot 10% HNO3, dus hier gebeurt geen destructie in de microgolfoven. Het referentieplankton wordt ook gedestrueerd volgens bovenstaande werkwijze. Aangezuurde stalen worden bewaard bij 10°C, zo wordt verlies van staal en metaaladsorptie in de buisjes beperkt. Stalen zijn klaar voor analyse. Spectrometrische analyse (ICP-AES, GFAAS, vlam-AAS): a) Fracties en homogenaat b) Blanco c) Spike-oplossing d) Referentiestaal De glazen fles met referentiemateriaal (Quevauviller et al, 1993) bevat 5 g gevriesdroogd poeder van plankton (CRM 414) en een kleine PTFE bal. De PTFE-bal vereenvoudigt de homogenisatie van het poeder. Voor het openen van de fles moet deze geschud worden gedurende 5 minuten, opdat het materiaal opnieuw homogeen zou zijn. Nadien laat men de gesloten fles voor 10 minuten staan, om het materiaal gesuspendeerd in de ‘head space’ te laten bezinken. Het analytische staal voor analyse wordt genomen van het materiaal zoals bekomen na voorgaande stappen. De correctie voor drooggewicht wordt gemaakt door een staal te nemen van 100 mg en dit te drogen in een oven op ±100°C voor 3 tot 4 uur. Een blanco wordt ook meegenomen in de analyse. Na openen van de fles wordt deze bewaard in de dessicator om vochtopname te voorkomen. 92 2.3 Bepaling DNA-methylatie dmv AIMS-protocol 2.3.1 AIMS-techniek De AIMS-techniek (DNA methylation assessment by Amplification of Inter-Methylated Sites) is gebaseerd op methylatiegevoelige enzymen in combinatie met adaptoren waarop primers zijn ontwikkeld. Men kan deze DNA fragmenten uitgebreid met extra nucleotiden dan amplificeren met PCR. Hierbij wordt een reproduceerbaar patroon bekomen. Het doel is de bepaling van de CpG methylatiestatus van DNA (Frigola et al., 2002; Ongenaert, 2005). Dit protocol is gebaseerd op (Frigola et al., 2002). Volgend voorbeeld verduidelijkt de werking van het AIMS-protocol (fig. 2.6) 1. Genomisch DNA (volle lijn) dat in dit voorbeeld 7 CCCGGG sites bevat, waarvan er 3 niet gemethyleerd zijn (witte blokjes) en 4 wel (zwarte blokjes), wordt behandeld met een methylatiegevoelig enzym SmaI dat stompe eindjes creëert (het knipt enkel niet gemethyleerde CCCGGG sites). 2. De tweede digestie wordt uitgevoerd met het methylatie-ongevoelige enzym XmaI dat ‘sticky’ eindjes maakt met CCGG enkelstrengige overhang. Zo worden de gemethyleerde sites gekenmerkt. 3. De adaptoren worden geligeerd aan deze sticky eindjes, waarna DNA fragmenten die worden geflankeerd door twee adaptoren worden geamplificeerd door middel van PCR met primers die specifiek binden op de adaptoren, uitgebreid met één of meer additionele nucleotiden die arbitrair gekozen worden. 4. Zo wordt een beperkt aantal sequenties bekomen van ~ 200 tot ~ 2000 bp. In dit voorbeeld wordt dit geïllustreerd voor 1, 2 en 3 additionele nucleotiden. 93 XmaI Figuur 2.6: schematisch voorstelling van de AIMS techniek met van links naar rechts 1, 2 en 3 extra nucleotiden (bovenop de sequentie van de adaptoren) (Frigola et al., 2002). 2.3.2 Materiaal DNA-suspensie, v.b. als extractie met een PureGene kit TE-buffer: 10 mM Tris (Trizma base, Sigma), 1 mM EDTA (Na2EDTA, Fluka), pH 7.0 – 8.0 in autoclaaf bigedeïoniseerd water. Ijs en ijsverbrijzelaar (“Waring”) Hettich Microcentrifuge “Mikro 200R” Buisjes voor Microcentrifuge van 1,5 ml, gesterilizeerd (Eppendorf) Nanodrop (labMET) Warmwaterbad “Memmert” of thermoblok voor microcentrifugebuisjes Diepvries -20°C Pipetten van 1-5 µL, 40-200 µL, 200-1000 µL (Finn, Eppendorf) Methylatiegevoelige restrictie-enzymen SmaI, 2000 eenheden (New England Biolabs, via Westburg B.V.) Geleverd samen met NEBuffer 4. Vortex (MS1 Minishaker, IKA) 94 Methylatie-ongevoelige restrictie-enzymen XmaI, 500 eenheden (New England Biolabs) Geleverd met NEBuffer 4 en BSA (Bovine Serum Albumin). Rekje voor microcentrifugebuisjes (VWR) Adaptoren: MCF (5’-CCGGTCAGAGCTTTGCGAAT-3’), 100 µM, 302 µg Blue (5’-ATTCGCAAAGCTCTGA-3’), 100 µM, 333 µg Oligonucleotiden geleverd door Eurogentec T4 DNA ligase, 20 000 eenheden, 400 000 eenheden/ml (New England Biolabs). Geleverd met 10x reactiebuffer. QIAquick PCR purificatiekit (Qiagen) Primers: Blue-CCGGG-ctg Ia’’ Blue-CCGGG-cta Ia Blue-CCGGG-tgg Ib, b’, b’’ Blue-CCGGG-tca Ia’ Blue-CCGGG-tg Blue-CCGGG Oligonucleotiden geleverd door Eurogentec Voor nieuwe organismen/weefsels kunnen verschillende combinaties van primers gekozen worden (v.b. Ia’’+Ib’’, Ia+Ib, Ia’+Ib’…). Voor Daphnia magna blijkt de I’’ paar of enkel de ‘Blue’ goed te werken. Taq DNA polymerase, 500 eenheden, ‘native’, met BSA (FERMENTAS GMBH) dNTP mix 10 mM elk, 1 mL (FERMENTAS GMBH) MgCl2, 25 mM, geleverd met Taq DNA polymerase (Fermentas) Bigedeïoniseerd water, bereid in HQ5-machine PCR-toestel Thermolyne Amplitron II Pipetten van 0,5-10 µL, 1-5 µL, 40-200 µL, 200-1000 µL (Finn, Eppendorf) Steriele pipettips: geautoclaveerd: 200-1000 µL en 1-200 µL tips (Finn), biopur 0.5-20 µL gecertificeerde PCR tips (Eppendorf t.i.p.s.) Wegwerphandschoenen (latex of nitril) (VWR) Autoclaaf (pbi international) Thermostatische cabine Droogoven (Heraeus) 95 2.3.3 Methode De volgende methode werd overgenomen van het laboprotocol (Vandegehuchte, 2007). Indien de concentraties van het DNA in suspensie ongekend zijn, meet men de concentratie door de optische densiteit (OD) te meten op de Nanodrop. Tussen twee stalen wordt altijd voorzichtig het pedestal schoongemaakt (beide kanten) met een Kimwipe (papieren doek). De instructies volgen weergegeven door de Nanodrop software. Er is 26 µL van de DNA-suspensie nodig om te starten, bevat 1 tot 2 µg DNA. Indien nodig, wordt de gewenste hoeveelheid DNA-suspensie gedroogd (bevat 1 à 2 µg van DNA) in de microcentrifugebuisjes in de droogoven op 40 °C voor een korte periode (het drogen wordt stopgezet wanneer de laatste vloeistof is verdwenen) en heropgelost in 26 µL van steriel bigedesioniseerd water. Indien niet, wordt het benodigde volume van de suspensie genomen (x mL) bevattende 1 tot 2 µg van DNA als DNA-bron in stap 2. Dan (26-x) ml van steriel bigedesioniseerd water toegevoegd om het gewenste volume van de DNA-suspensie te verkrijgen. NB1: 100 µl TE buffer zorgt voor ± 1h drogen 50 µl ± 30-40 min. Digestie van DNA met methylatie-gevoelige restrictie-enzymen SmaI (behoud bluntends). Het enzyme moet op ijs bewaard worden of in de diepvries. Mix: • 1-2 µg Genomic DNA 26 µL • 20 U SmaI (20U/µL) 1 µL • 10X Nebuffer4 3 µL (finale concentratie 1x buffer) -------------30 µL Men dient te mixen en een ‘spin down’ uit te voeren. Incubatie op 25°C in een warmwaterbad voor 6u. Men voert een ‘spin down’ uit en men beëindigt de reactie door incubatie van het mengsel op 65°C in een warmwaterbad voor 20 minuten. Men voert opnieuw een ‘spin down’ uit. 96 Er wordt een digestie uitgevoerd van het SmaI-gedigesteerd staal met de methylatie ongevoelige restrictie-enzyme XmaI (behoud sticky-ends). Toegevoegd: - 4U XmaI - 50x BSA (10U/µL) 0.5 µL (oplossen van 100x) 0.62 µL (finale concentratie 100µg/ml) ------------ Totaal volume 31.12 µl Er wordt gemengd en een ‘spin down’ uitgevoerd. Incubatie van het mengsel in een warmwaterbad op 37°C gedurende 16u. Men voert een ‘spin down’ uit en beëindigt de reactie door incubatie van het mengsel bij 65°C gedurende 20 minuten. Spin down. Voorbereiden adaptormengsel: Adaptoren: - MCF (5’-CCGGTCAGAGCTTTGCGAAT-3’) - Blue (5’-ATTCGCAAAGCTCTGA-3’) De optische densiteit wordt gemeten en gelijke hoeveelheden MCF en Blue (1 nmol voor elk staal, plus 0.1 keer het totale volume voor fouten bij pipetteren –de molaire verhoudingen moeten constant gehouden worden) worden geïncubeerd bij 65°C gedurende 2 minuten. Men laat het staal afkoelen tot kamertemperatuur gedurende 3060 minuten. Adaptorligatie Mix:- Gedigesteerd DNA (appr 1 µg) .....µl (totaal volume van gedigesteerd DNA –zal normaal 31.12 µL zijn) - T4 DNA ligase - Adaptoren (1:1 mengsel van Blue en MCF) .…µl - 10 mM ATP ….µl (finale conc. 1 mM) - Additionele 10x Nebuffer 4 1 µl (per µg) ….µl (behouden 1x finale conc., bedenk dat er al 3 µL is Nebuffer 4 in het gedigesteerd DNA) 97 Men mengt en voert een ‘spin down’ uit. Incubatie bij 16°C voor één nacht in de thermostatische cabine en een ‘spin down’. NB: T4 DNA ligase is geleverd met een specifieke reactiebuffer, maar ligatie kan ook worden uitgevoerd in elk van de Nebuffers van New England Biolabs, als 1 mM ATP is geleverd. Terminatiereactie door incubatie van staal bij 65°C voor 10 minuten. Opzuiveren van product van ligatie door gebruik van QIAquick PCR purificatiekit. Indien nodig, oplossen van ‘ligated’ staal tot 40 µL met BiDi water. (als er > 40 µL achter stap 3.9, wordt alles gebruikt). Men mengt het staal met 200 µL (of meer, ± 5x reactievolume) buffer PB (van kit), overzetten op QIAquick kolom. De kolom wordt in een collectiebuis geplaatst (bijgeleverd in de kit, zie kit manual) en gecentrifugeerd voor 1 minuut bij ≥ 10000 x g in een microcentrifuge (RT of 4°C). Er wordt gewassen met 750 µL PE buffer. Centrifugatie bij ≥ 10000 x g voor 1 minuut in de microcentrifuge (RT or 4°C). Lege collectiebuisjes worden vervangen door een kolom op collectiebuis. Men centrifugeert de kolom voor een additionele minuut bij ≥ 10000 x g (RT of 4°C). Men zet de kolom over naar een nieuwe 1,5 mL eppendorfbuisje, men voegt 30 µL EB buffer toe. Incubatie bij kamertemperatuur voor 1 minuut. Eluatie van het DNA door centrifugatie bij ≥ 10.000 x g voor 1 minuut in de microcentrifuge. Er wordt een additionele 30 µL EB buffer toegevoegd, men incubeert bij kamertemperatuur voor 1 minuut en centrifugeert voor elutie. Het totale volume van het staal is ~60 µL. Men meet de optische densiteit (OD) (verlies DNA bij incubatie); EB buffer als blanco nemen. 98 Men voert een PCR amplificatie van intergemethyleerde sites uit: Primers: - Blue-CCGGG-ctg Ia’’ - Blue-CCGGG-cta Ia - Blue-CCGGG-tgg Ib, b’, b’’ - Blue-CCGGG-tca Ia’ - Blue-CCGGG-tg - Blue-CCGGG Men meet de OD van primers voor de berekening van concentraties door gebruik van volgende formule: c (pmol/µl) = A260 / (0,01 x N) (N = aantal basen) Er is 4µL van een primer per staal nodig als enkel één primer is gebruikt of 2µL van primer per staal, als twee primers zijn gebruikt. Bereken de hoeveelheid van primer, die je nodig hebt en los de primers op tot ongeveer 11 pmol/µL in BiDi-water, zodat er genoeg primers zijn voor alle stalen (plus enkele µL extra voor pipetteringsfouten). Er wordt een mastermix van de PCR buffer aangemaakt, Taq DNA polymerase, dNTP-mix en MgCl2 voor de hoeveelheid staal + 2 (pipetteringsfouten). Taq wordt daarbij zoveel mogelijk bewaard in de diepvries. Op het einde zal elke 200 µL PCR-buis het volgende bevatten: X µL (ong. 1.5 µl - tenminste 6 ng) ligated DNA Indien men verschillende stalen wenst te vergelijken, moet men zeker zijn dat gestart wordt met dezelfde hoeveelheid DNA (ng) in elk staal. In dit geval neemt men 1,5 µL van het staal met de laagste DNA-concentratie en een kleiner volume van de andere stalen, zodat de totale hoeveelheid DNA in elke PCR-buis dezelfde is. 2 µL PCR buffer (Taq buffer + KCl – MgCl2,1x buffer in finale 20 µL volume) 0.5 µL Taq DNA polymerase (= 2 U?) 1 µL dNTP-mix (125 µM of each dNTP) 1.2 µL MgCl2 2 µL primer 1 (indien enkel primer is gebruikt, gebruik 4 µL van deze primer) 2 µL primer 2 99 (11.3-X) µL bidi-water (aanpassen volume volgens het DNA-volume om 20 µL in total te krijgen) Het Amplitron PCR-toestel wordt als volgt geprogrammeerd: PCR conditions primer sets I, I’, I’’: 1. 94°C - 5min 2. 94°C - 1 min (denaturatiestap) 3. Ta - 1 min (annealing temperatuur afhankelijk van de primers, 69.9 °C voor extended primers, 66.2 °C for Blue primer) 4. 72°C - 1min 15s (elongatiestap) HERHALING stap 2-4 39x 5. 72°C - 6min EINDE 4°C Uitvoeren van DNA agarosegel electroforesis of polyacrylamide gel electroforesis. Ander relevant protocol voor electroforesis en de analyse van de gel. De fragmenten met gemethylateerde cytosinen op beide einden zullen versterkt (vermenigvuldigd) zijn tijdens de PCR en zullen zichtbaar zijn als banden op de gel. Opmerkingen: Men dient het breken van DNA-strengen te voorkomen, vooral wanneer gewerkt wordt met DNA met een hoog moleculair gewicht. Er wordt voorzichtig omgeroerd. De betekenis van ‘spin down’ is centrifugeren (microcentrifuge) tot alle vloeistof zich bevindt op de bodem van de eppendorfbuisjes. Gepulseerde ‘spinning’ voor enkele seconden op 10.000 x g is voldoende. De eppendorfbuisjes moeten goed gesloten zijn bij gebruik van het warmwaterbad. Er is een zekere opwarmtijd nodig voor het warmwaterbad. Het overmatig pipetteren van DNA-stalen dient beperkt te worden. Optische densiteit (OD), wordt gemeten met de Nanodrop. Alle enzymen dienen zo lang mogelijk in de diepvries te worden bewaard. Men dient ze op ijs te bewaren, als ze uit de diepvries zijn. 100 Verschillen in intensiteit van banden tussen de blootgestelde organismen en de nietblootgestelde organismen kunnen direct op de film met het blote oog worden bestudeerd. Banden die voorkomen op de film van de blootgestelde organismen en niet op de blanco organismen worden beschouwd als hypermethylaties. Rekening houdend met het verschil in intensiteit van de banden wordt een vermindering in intensiteit van een band op de film van de gecontamineerde organismen t.o.v. de overeenkomstige band op de film van de blanco gezien als hypomethylatie. Homozygotisch verlies en genversterking kunnen ook dramatische verschillen produceren in de ‘display’ van een band. Ofschoon deze effecten slechts zelden voorkomen, moet het effect op de weergave van de banden zeker in beschouwing worden genomen. 101 3 Resultaten en bespreking 3.1 Reproductie 3.1.1 Inleiding Met als doel de effecten van metaalstress op de reproductie bij Daphnia magna te kennen werden enkele testreeksen opgesteld. De verschillende sublethale concentraties in de testreeksen waren 0 µg/l (blanco), 180 µg/l Cd, 250 µg/l Cd en 372 µg/l Ni. Om het effect van acclimatisatie en adaptatie op de reproductie te bestuderen werd een deel van de F1organismen teruggeplaatst in een blanco. 3.1.2 Fysico-chemische analyse De waarden van de verschillende mediumparameters moeten voldoen aan de vooropgestelde eisen voor het M4-medium. In tabel 3.1 zijn de verschillende parameters weergegeven. Tabel 3.1: pH, O2-gehalte, hardheid en temperatuur van de media in de opgestelde aquaria Parameter Gemiddelden Blanco 372 µg/l Ni 180 µg/l Cd 250 µg/l Cd pH 7,5 7,8 7,7 7,6 O2-gehalte 82 % 88 % 79 % 84 % Hardheid 17,5 °e 28,75 °e 21,25 °e 20 °e Temperatuur 20,2 °C 20,2 °C 20,2 °C 20,2 °C De metaalconcentraties van 180 en 250 µg/L Cd zijn bepaald uit de EC50 voor reproductie van niet geacclimatiseerde organismen, deze was 254 µg/l Cd (Muyssen & Janssen, 2004). Er werd gekozen voor deze concentraties, opdat er zeker effecten op de reproductie zouden optreden. De lagere concentraties liggen tussen de EC10 en de onderste grens van het 95% betrouwbaarheidsinterval rond de EC50. Deze concentratie werd gekozen om verder in het onderzoek na te gaan of er bij lagere concentraties en minder toxisch effect ook minder effect op methylatie zou zijn. De concentratie vrij nikkel werd bepaald aan de hand van de EC50 uit het Ni-BLM (Deleebeeck et al, 2006). De berekening met het BLM werd ingegeven in VMINTEQ om zo de totale concentratie te bepalen bij de EC50 in M4-medium. 102 Ni 372 ug/l 25 Concentratie (ug/l) Concentratie (ug/l) Blanco 20 15 10 5 0 1 2 3 Cd 4 5 6 7 380 360 340 320 300 280 1 8 2 Concentratie (ug/l) Concentratie (ug/l) 150 100 50 0 3 5 6 7 Cd 250 ug/l 200 2 4 Stalen Cd 180 ug/l 1 3 Stalen 4 5 250 240 230 220 210 200 190 180 6 Stalen 1 2 3 4 5 6 Stalen Figuur 3.1: de werkelijke metaalconcentraties in het M4-medium bij de opgestelde reproductietest. De gemeten concentratie aan metaalionen in het medium lag over het algemeen lager dan de vooropgestelde concentratie. De blanco blijkt eenmalig verontreinigd te zijn met cadmium. De schommelingen in concentraties zijn meestal beperkt gebleven (fig. 3.1). De gemeten concentraties zijn terug te vinden in bijlage 1. 3.1.3 Bespreking resultaten reproductietest P-generatie De proeforganismen in de controleblanco worden als referentie genomen. Ze worden beschouwd als organismen die niet onderhevig zijn aan metaalstress. De organismen blootgesteld aan een concentratie van 180 µg/l Cd vertonen een verminderde reproductie (fig. 3.2, 3.3 & bijlage 2). Bij een concentratie van 250 µg/l Cd is er nog een sterker effect van metaalstress waar te nemen in de sterk verlaagde reproductie (fig. 3.2, 3.3 & bijlage 2). Een verhoging van de concentratie cadmium blijkt direct een effect te hebben op het aantal nakomelingen. De blootstelling aan nikkel blijkt de sterkste invloed te hebben op de reproductie van de P-generatie (fig. 3.2, fig. 3.3 & bijlage 2). 103 Gemiddeld aantal nakomelingen/organisme Reproductie (inclusief sterfte) 60 50 Blanco Cd180 Cd250 Ni372 40 30 20 10 0 1 Blootstelling Figuur 3.2: de reproductie van de P-generatie over 16 dagen, inclusief sterfte. Gemiddeld aantal nakomelingen/organisme Reproductie (exclusief sterfte) 60 50 Blanco Cd180 Cd250 Ni372 40 30 20 10 0 1 Blootstelling Figuur 3.3: de reproductie van de P-generatie over 16 dagen, exclusief sterfte. Tijdens de reproductietest is sterfte opgetreden (zie bijlage 2). Het uitsluiten van mortaliteit onder testorganismen in de analyse van de reproductietest kan een ander beeld geven van de effecten van metaalstress. Beide situaties, inclusief en exclusief sterfte, worden geanalyseerd. De organismen blootgesteld aan nikkel vertonen naast een verlaagde reproductie, ook een verhoogde mortaliteit. De mortaliteit bij de andere testreeksen is minimaal. Inclusief de sterfte blijkt de metaalstress het grootst te zijn bij 372 µg/l Ni, terwijl dit bij het uitsluiten van sterfte uit de analyse 250 µg/l Cd is (fig. 3.2 & 3.3). 104 F1-generatie Gemiddeld aantal nakomelingen/organisme Reproductie (inclusief sterfte) 35 Blanco Cd180->Cd180 Cd180->Blanco Cd250->Cd250 Cd250->Blanco Ni372->Ni372 Ni372->Blanco 30 25 20 15 10 5 0 1 Blootstelling Figuur 3.4: de reproductie van de F1-generatie over 4 dagen, inclusief sterfte. Er is een duidelijk verschil in reproductie tussen de twee F1-testreeksen afkomstig van ouderdieren blootgesteld aan 180 µg/l Cd (fig. 3.4). Bij de F1-organismen opgekweekt in de blanco ligt de reproductie veel hoger dan bij de organismen blootgesteld aan 180 µg/l Cd. Bij de F1-organismen afkomstig van ouderdieren uit 250 µg/l Cd wordt hetzelfde patroon vastgesteld. Het verschil tussen beide F1-testreeksen is echter kleiner. Bij de F1-organismen, waarvan de P-generatie is opgekweekt in 372 µg/l Ni, ligt de reproductie van organismen uit 372 µg/l Ni hoger dan bij organismen gekweekt in blancomedium. 105 Gemiddeld aantal nakomelingen/organisme Reproductie (exclusief sterfte) 35 blanco 30 Cd180->Cd180 25 Cd180->Blanco 20 Cd250->Cd250 15 Cd250->Blanco 10 Ni372->Ni372 5 Ni372->Blanco 0 1 Blootstelling Figuur 3.5: de reproductie van de F1-generatie over 4 dagen, exclusief sterfte Uit fig. 3.4 en fig. 3.5 blijkt dat de resultaten gelijkaardig zijn in beide situaties (exclusief en inclusief sterfte). Het gemiddeld aantal nakomelingen van de overlevende organismen aan het eind van de test toont enkele opmerkelijke zaken. De reproductie van de organismen uit de testreeks van 372 µg/l Ni ligt hoog en er is geen sterfte opgetreden. De overlevende organismen gekweekt in 250 µg/l Cd hebben meer nakomelingen aan het eind van de test dan deze gekweekt in 180 µg/l Cd. Er treedt dus vrij veel sterfte op bij organismen gekweekt in 250 µg/l Cd, maar de overlevende organismen hebben meer nakomelingen. Een uitgebreide tabel met reproductiegegevens is terug te vinden in bijlage 2. 3.1.4 Statistische analyse reproductietest Er wordt een t-test voor twee onafhankelijke steekproeven uitgevoerd. Met een tweezijdige t-test kan men vaststellen of beide reeksen resultaten tot dezelfde normaalverdeling behoren of anders gezegd of de ligging en spreiding van beide reeksen dan wel of niet statistisch significant van elkaar verschillen. De p-waarde geeft hierbij aan of de verschillen dan wel of niet significant zijn. In volgende analyses wordt aangenomen dat de steekproeven significant verschillen, als p < 0,05. De gegevens worden verder voorgesteld in box plots. 106 P-generatie Box & Whisker Plot: inclusief sterfte Box & Whisker Plot: exclusief sterfte 52 54 52 50 50 48 48 46 46 exclusief sterfte inclusief sterfte 44 42 40 38 44 42 40 36 34 38 32 36 30 34 28 26 Blanco Cd180 Mean ±SE ±1,96*SE 32 Blanco Behandeling Cd180 Mean ±SE ±1,96*SE Behandeling Figuur 3.6: box plots van de reproductie in blanco en 180 µg/l Cd, inclusief sterfte (links) en exclusief sterfte (rechts). Uit de box plots (fig. 3.6) van de twee testreeksen blijkt dat het gemiddeld aantal nakomelingen bij 180 µg/l Cd lager ligt dan bij de blanco. Het aantal nakomelingen per broedsel varieert ook veel meer bij 180 µg/l Cd. De mortaliteit onder testorganismen is vrij laag. Er is een klein verschil in spreiding en het gemiddeld aantal nakomelingen door de opgetreden mortaliteit (fig. 3.6 & bijlage 2). Box & Whisker Plot: inclusief sterfte Box & Whisker Plot: exclusief sterfte 54 55 52 50 50 48 46 45 42 exclusief sterfte inclusief sterfte 44 40 38 36 34 32 40 35 30 30 28 25 26 24 22 Blanco Cd250 Mean ±SE ±1,96*SE 20 Behandeling Blanco Cd250 Mean ±SE ±1,96*SE Behandeling Figuur 3.7: box plots van de reproductie in blanco en 250 µg/l Cd, inclusief sterfte (links) en exclusief sterfte (rechts). Bovenstaande box plots van twee testreeksen laten zien dat het gemiddeld aantal nakomelingen bij 250 µg/l Cd veel lager ligt dan bij de blanco. Het aantal nakomelingen per broedsel varieert ook veel meer bij 250 µg/l Cd. De mortaliteit onder testorganismen is vrij laag. Er is een klein verschil in spreiding en het gemiddeld aantal nakomelingen door de opgetreden mortaliteit (fig. 3.7 & bijlage 2). 107 Box & Whisker Plot: inclusief sterfte Box & Whisker Plot: exclusief sterfte 55 54 52 50 50 48 45 46 44 exclusief sterfte inclusief sterfte 40 35 30 42 40 38 36 25 34 20 32 30 15 28 10 Blanco Ni Mean ±SE ±1,96*SE Mean ±SE ±1,96*SE 26 Blanco Behandeling Ni Behandeling Figuur 3.8: box plots van de reproductie in blanco en 372 µg/l Ni, inclusief sterfte (links) en exclusief sterfte (rechts). De box plots van de reproductiegegevens van de blanco en 372 µg/l Ni laten zien dat het gemiddeld aantal nakomelingen bij 372 µg/l Ni veel lager ligt dan bij de blanco. Het aantal nakomelingen per broedsel varieert ook veel meer bij 372 µg/l Ni. De mortaliteit onder testorganismen is vrij hoog. Het verschil in spreiding en het gemiddeld aantal nakomelingen is vrij groot door de opgetreden mortaliteit (fig. 3.8 & bijlage 2). Tabel 3.2: berekende p-waarden uit de t-test voor twee onafhankelijke steekproeven. INCLUSIEF STERFTE EXCLUSIEF STERFTE Groep 1: Blanco Groep 2: Cd180 Groep 1: Blanco Groep 2: Cd180 p = 0,047980 Groep 1: Blanco Groep 2: Cd250 p = 0,087481 Groep 1: Blanco Groep 2: Cd250 p = 0,000101 Groep 1: Blanco Groep 2: Ni p = 0,000168 Groep 1: Blanco Groep 2: Ni p = 0,003362 p = 0,087232 Tabel 3.2 toont de effecten van cadmium en nikkel op de reproductie bij D. magna. Er is een significante afname (p< 0,05) in de reproductie bij de opgestelde testen (180, 250 µg/l Cd en 372 µg/l Ni), als de mortaliteit wordt meegenomen in de analyse. Worden de gestorven organismen niet meegenomen in de analyse, dan is er geen significantie afname in reproductie bij blootstelling van D. magna aan 372 µg/l Ni en 180 µg/l Cd. Enkel bij 250 µg/l Cd is er dus een significant verschil in reproductie. 108 F1-generatie Zoals bij de analyse van de P-generatie werd ook hier telkens de reproductie van organismen uit de blanco als controle uitgezet ten opzichte van de organismen blootgesteld aan cadmium en nikkel. Box & Whisker Plot: exclusief sterfte 35 30 30 25 25 20 20 e x c lu s ie f s te rfte in c lu s ie f s te r fte Box & Whisker Plot: inclusief sterfte 35 15 10 15 10 5 5 0 0 -5 Blanco Cd180 Behandeling Median 25%-75% Min-Max -5 Blanco Cd180 Median 25%-75% Min-Max Behandeling Figuur 3.9: box plots van de reproductie van D. magna in blanco en 180 µg/l Cd, inclusief sterfte (links) en exclusief sterfte (rechts). De box plots in fig. 3.9 tonen onder andere het minimum, het maximum en het gemiddeld aantal nakomelingen van D. magna in de blanco en 180 µg/l Cd. De resultaten zijn van tien replica’s en laten zien dat het gemiddeld aantal nakomelingen bij 180 µg/l Cd lager ligt dan bij de controleblanco. Het aantal nakomelingen per broedsel varieert ook meer bij 180 µg/l Cd. De mortaliteit onder testorganismen is gering. Het verschil in spreiding en het gemiddeld aantal nakomelingen is te verwaarlozen (bijlage 2). 109 Box & Whisker Plot: exclusief sterfte 35 30 30 25 25 20 20 ex c lus ief s terfte inc lus ief s terfte Box & Whisker Plot: inclusief sterfte 35 15 10 15 10 5 5 0 0 -5 Blanco Cd250 Median 25%-75% Min-Max -5 Blanco Behandeling Cd250 Median 25%-75% Min-Max Behandeling Figuur 3.10: box plots van de reproductie van D. magna in blanco en 250 µg/l Cd, inclusief sterfte (links) en exclusief sterfte (rechts). De box plots in fig. 3.10 tonen onder andere het minimum, het maximum en het gemiddeld aantal nakomelingen van D. magna in de blanco en 250 µg/l Cd. De resultaten zijn van tien replica’s en laten zien dat het gemiddeld aantal nakomelingen bij 250 µg/l Cd lager ligt dan bij de controleblanco. Het aantal nakomelingen per broedsel varieert ook meer bij 250 µg/l Cd. De mortaliteit onder testorganismen is vrij groot. Het verschil in spreiding en het gemiddeld aantal nakomelingen is groot (fig. 3.10 & bijlage 2). Box & Whisker Plot: exclusief sterfte 34 32 32 30 30 28 28 ex c lus ief s terfte inc lus ief s terfte Box & Whisker Plot: inclusief sterfte 34 26 24 26 24 22 22 20 20 18 Blanco Ni Behandeling Median 25%-75% Min-Max 18 Blanco Ni Median 25%-75% Min-Max Behandeling Figuur 3.11: box plots van de reproductie van D. magna in blanco en 372 µg/l Ni, inclusief sterfte (links) en exclusief sterfte (rechts). De box plots in fig. 3.11 tonen onder andere het minimum, het maximum en het gemiddeld aantal nakomelingen van D. magna in de blanco en 372 µg/l Ni. De resultaten zijn van tien replica’s en laten zien dat het gemiddeld aantal nakomelingen bij 372 µg/l Ni hoger ligt dan bij de controleblanco. De variantie van het aantal nakomelingen per broedsel is ongeveer gelijk in beide opstellingen (fig. 3.11 & bijlage 2). 110 Box & Whisker Plot: exclusief sterfte 35 30 30 25 25 exclusief sterfte inclusief sterfte Box & Whisker Plot: inclusief sterfte 35 20 15 20 15 10 10 5 5 0 Blanco Cd180-Bl Median 25%-75% Min-Max 0 Blanco Behandeling Cd180-Bl Median 25%-75% Min-Max Behandeling Figuur 3.12: box plot van de reproductie in blanco en 372 µg/l Ni, inclusief sterfte (links) en exclusief sterfte (rechts). De box plots in fig. 3.12 tonen onder andere het minimum, het maximum en het gemiddeld aantal nakomelingen van D. magna uit de controleblanco en organismen in een blanco, afkomstig van de P-generatie blootgesteld aan 180 µg/l Cd. De resultaten zijn van tien replica’s en laten zien dat het gemiddeld aantal nakomelingen lager ligt dan in de controleblanco. De variantie van het aantal nakomelingen per broedsel is groter dan in de controleblanco (fig. 3.12 & bijlage 2). Box & Whisker Plot: exclusief sterfte 35 30 30 25 25 20 20 exclusief sterfte inclusief sterfte Box & Whisker Plot: inclusief sterfte 35 15 10 15 10 5 5 0 0 -5 Blanco Cd250-Bl Behandeling Median 25%-75% Min-Max -5 Blanco Cd250-Bl Median 25%-75% Min-Max Behandeling Figuur 3.13: box plot van de reproductie in blanco en 372 µg/l Ni, inclusief sterfte (links) en exclusief sterfte (rechts). De box plots in fig. 3.13 tonen onder andere het minimum, het maximum en het gemiddeld aantal nakomelingen van D. magna uit de controleblanco en organismen in een blanco, afkomstig van de P-generatie blootgesteld aan 250 µg/l Cd. De resultaten zijn van tien replica’s en laten zien dat het gemiddeld aantal nakomelingen lager ligt dan in de controleblanco. De variantie van het aantal nakomelingen per broedsel is groter dan in de controleblanco, maar bij de analyse “exclusief sterfte” blijkt dat de variantie in aantal nakomelingen gelijkaardig is als in de controleblanco met uitzondering van enkele uitschieters (fig. 3.13 & bijlage 2). 111 Box & Whisker Plot: inclusief sterfte Box & Whisker Plot: exclusief sterfte 35 32 30 30 25 20 ex c lus ief s terfte inc lus ief s terfte 28 15 10 26 24 22 5 20 0 -5 Blanco Ni-Bl Median 25%-75% Min-Max Median 25%-75% Min-Max 18 Behandeling Blanco Ni-Bl Behandeling Figuur 3.14: box plot van de reproductie in blanco en 372 µg/l Ni, inclusief sterfte (links) en exclusief sterfte (rechts). De box plots in fig. 3.14 tonen onder andere het minimum, het maximum en het gemiddeld aantal nakomelingen van D. magna uit de controleblanco en organismen in een blanco, afkomstig van de P-generatie blootgesteld aan 372 µg/l Ni. De resultaten zijn van tien replica’s en laten zien dat het gemiddeld aantal nakomelingen iets lager ligt dan in de controleblanco. De variantie in het aantal nakomelingen per broedsel is kleiner in beide analyses ten opzichte van de controleblanco, maar door de opgetreden sterfte zijn er uitschieters in deze analyse (fig. 3.14 & bijlage 2). Tabel 3.3: berekende p-waarden met een t-test van de reproductiegegevens van de F1-generatie (blanco en verschillende metaalconcentraties) INCLUSIEF STERFTE EXCLUSIEF STERFTE Groep 1: Blanco Groep 2: Cd180 Groep 1: Blanco Groep 2: Cd180 p = 0,000000 p = 0,000001 Groep 1: Blanco Groep 2: Cd250 Groep 1: Blanco Groep 2: Cd250 p = 0,000000 p = 0,000328 Groep 1: Blanco Groep 2: Ni Groep 1: Blanco Groep 2: Ni p = 0,320169 p = 0,320169 112 Tabel 3.4: berekende p-waarden met een t-test van de reproductiegegevens van de F1-generatie (blanco’s F1-generatie). INCLUSIEF STERFTE EXCLUSIEF STERFTE Groep 1: Blanco Groep 2: Bl-Cd180 Groep 1: Blanco Groep 2: Bl-Cd180 p = 0,024158389 p = 0,024158389 Groep 1: Blanco Groep 2: Bl-Cd250 Groep 1: Blanco Groep 2: Bl-Cd250 p = 0,004220518 p = 0,142632413 Groep 1: Blanco Groep 2: Bl-Ni Groep 1: Blanco Groep 2: Bl-Ni p = 0,356432057 p = 0,885423645 De effecten op de reproductie bij de blootstelling van de F1-generatie aan 180 µg/l Cd, 250 µg/l Cd en 372 µg/l Ni worden getoond in tabel 3.3 en 3.4. Er is een significant (p < 0,05) lagere reproductie bij organismen blootgesteld aan 180 µg/l Cd en 250 µg/l Cd. Organismen blootgesteld aan 372 µg/l Ni hebben geen significant lagere reproductie. De reproductie bij F1-organismen afkomstig van P-organismen uit 180 µg/l Cd (Bl-Cd180) is significant verschillend van de controleblanco, dit geldt ook voor (Bl-Cd250) organismen afkomstig van P-organismen uit 250 µg/l Cd (inclusief sterfte). De reproductie bij andere proefopstellingen (tabel 3.4) zijn niet significant verschillend van de controleblanco. De organismen hebben gemiddeld om de 2-3 dagen nakomelingen (bijlage 2). 3.1.5 Besluit Deze studie toont aan dat de blootstelling van Daphnia magna aan cadmium en nikkel significante effecten (p<0,05) heeft op de reproductie. De eerste generatie (P) vertoont een significant lagere reproductie in alle testreeksen met cadmium en nikkel als sterfte wordt meegerekend in de analyse. De organismen blootgesteld aan 180 µg/l Cd en 372 µg/l Ni vertonen een verlaagde reproductie die net niet significant (p<0,05) is, als de sterfte niet wordt meegerekend in de analyse. Het effect is het grootst bij blootstelling aan 372 µg/l Ni en 250 µg/l Cd. Globaal genomen zorgt metaalstress dus voor een lagere reproductie en toegenomen mortaliteit. De tweede generatie (F1) blootgesteld aan cadmium en nikkel hebben gemiddeld per broedsel meer nakomelingen (bijlage 2). De adaptatie van D. magna aan nikkel en cadmium kan aan de basis liggen van de verhoogde reproductie. De verhoogde 113 reproductie kan ook veroorzaakt zijn door het gebruik van andere testbekers uit glas, dit verklaart misschien ook de verhoogde reproductie in de controleblanco. De blootstelling van D. magna aan nikkel blijkt geen significant effect te hebben op de reproductie bij de F1-generatie ten opzichte van de controleblanco. Er zijn hiervoor enkele hypothetische verklaringen te geven. Nikkel wordt gezien als een micronutriënt, toch werd de functie van nikkel nog niet aangetoond bij invertebraten (Muyssen et al, 2004). Het is mogelijk dat de F1-organismen snel acclimatiseren of dat er adaptatie is opgetreden aan nikkel. Bij de F1-generatie organismen gekweekt in blanco’s, waarvan de ouderdieren zijn blootgesteld aan metaalstress, blijkt de reproductie nog steeds lager te liggen dan bij organismen uit de controleblanco. Het effect van de metaalstress op de ouderorganismen heeft blijkbaar gevolgen voor de reproductie bij de nakomelingen. Deze bevindingen kunnen de ontwikkeling van tolerantiemechanismen suggeren. Tolerantieontwikkeling zorgt voor een hogere metabolische kost (Calow & Sibly, 1990). De hogere metabolische kost kan onder andere zorgen voor een verminderde reproductie. 114 3.2 Verdeling van cadmium in de subcellulaire fracties en totale metaalbelasting 3.2.1 Inleiding In dit deel wordt de subcellulaire verdeling van cadmium in de weefsels van Daphnia magna bestudeerd. In een eerste fase werd een protocol opgesteld (zie materiaal en methode). Er bestaan reeds enkele protocols voor verschillende invertebraten, maar voor Daphnia magna werd er nog geen protocol opgesteld. In een tweede fase werd aan de hand van het opgestelde protocol een kwantitatieve bepaling van cadmium in de verschillende fracties gedaan. Verder werden opgekweekte organismen uit de reproductietest en later uit chronische toxiciteitstesten gebruikt voor de bepaling van het totale gehalte aan cadmium in organismen. Het protocol werd geoptimaliseerd (zie materiaal en methode). Het totale cadmiumgehalte heeft een indicatie voor het cadmiumgehalte in de subcellulaire fracties. 3.2.2 Bespreking De methode van Giguère (2006), Selck (2004) en Wallace (2003) werden gebruikt om de verschillende subcellulaire fracties te bekomen. Geen van deze methoden was volledig technisch haalbaar, daarom werd deze methoden aangepast om tot een geoptimaliseerde nieuwe methode voor Daphnia magna te komen. De eerste resultaten van de uitgevoerde experimenten met 5, 10, 15 en 20 organismen per staal leverde verschillende fracties op, maar stalen met 5 organismen leverden te weinig massa op om een HSP-fractie te kunnen afscheiden. Later bleek het wel mogelijk om een goede pellet te verkrijgen bij alle stalen van 5 tot 20 organismen. Een goede homogenisatie is hiervoor vereist, deze zorgt ervoor dat praktisch al het intracellulaire materiaal vrijkomt en kan gescheiden worden. Er dient wel opgemerkt te worden dat ongewenste schade aan organellen sneller kan optreden bij sterkere homogenisatie. Het is noodzakelijk dat steeds wordt gewerkt bij 4°C, dit zorgt voor een goede pelletvorming, tenzij anders aangegeven in het protocol. Het homogenaat, het referentieplankton en in mindere mate de debris-fractie konden met de huidige methode niet of niet volledig gedestrueerd worden, zelfs niet na enkele extra destructiestappen. Het toevoegen van meer geconcentreerd HNO3 per weefselmassa levert betere resultaten op. Er wordt gewerkt met eppendorfbuisjes van 1,5 en 2 ml 115 (enkel deze zijn te gebruiken voor centrifugatie) dit heeft zijn beperkingen. Rekening houdend met het gegeven dat ongeveer 1 ml 14 N HNO3 (NORMATOM) nodig is voor de destructie van 10 organismen (± 5 mg drooggewicht), kan men maximaal 20 organismen per staal behandelen. Uit de metingen van de metaalconcentraties moet blijken of deze steeds boven de detectielimiet zitten bij de huidige hoeveelheden materiaal in elke fractie. De methode voor het neerslaan van de granulenfractie dient nog ontwikkeld te worden. Minerale granulen worden tot op heden bijna enkel teruggevonden in mollusken (Mollusca). Minerale granulen zijn nog niet gerapporteerd in het weefsel van Daphnia magna. De gevormde pellet zou ook kunnen bestaan uit een deel van de debrisfractie. De pelletvorming en de destructie bij de lichtere fracties verliep zonder problemen. Hier stelt zich de vraag of men genoeg pellet verkrijgt. Het gehalte aan metalen kan namelijk onder de detectielimiet zitten van de GFAAS of ICP-MS. Gezien het hoge gehalte NaCl in de stalen werd een nieuwe methode ontwikkeld om de stalen te kunnen meten. Er dienden modifiers gebruikt te worden. Deze methode leverde echter geen resultaten op en werd aangepast. In een latere fase werd enkel NaCl gebruikt bij de verschillende centrifugatiestappen om de fracties te bekomen en niet om een resuspensie van de pellets te bekomen. Defecten van de GFAAS hebben geleid tot de analyse van de stalen met ICP-MS. De stalen moeten nog geanalyseerd worden. De gegevens van de analyse dienden dan vergeleken te worden met het totaal gehalte aan cadmium van organismen uit dezelfde kweekopstelling. De resultaten kunnen verder leiden tot de optimalisatie van de methode voor subcellulaire fractionatie. 3.2.3 Besluit Er zijn verschillende elementen die de interpretatie van de resultaten bemoeilijken. Enkele elementen zijn: breken van organellen, weglekken van oplosbare componenten uit organellen en overlapping tussen subcellulaire fracties (bijlage 5). De fracties bekomen tijdens de verschillende centrifugatiestappen zijn operationeel en moeten met voorzichtigheid geïnterpreteerd worden. Het is praktisch onmogelijk om de verschillende fracties volledig te scheiden door middel van centrifugatie en er is steeds overlap tussen de verschillende fracties. Doordat de fracties overlappen zullen ook de compartimenten niet volledig van elkaar gescheiden zijn. Dit heeft gevolgen voor de beoordeling van de biologische significantie van de fracties. Alle stalen dienen op dezelfde manier behandeld te worden zodat deze onderling kunnen vergeleken worden. We kunnen concluderen dat er nog verder onderzoek noodzakelijk is om tot een goed uitgewerkte methode te komen. 116 3.3 DNA-methylatie bij Daphnia magna 3.3.1 Inleiding De AIMS-techniek is één van de methoden voor de analyse van het methyloom van Daphnia magna. Er zijn twee eigenschappen die deze methode goed bruikbaar maken: 1) Aanmaken van een hoog aantal sequenties. Deze bestaan uit twee dicht bij elkaar gelegen CpG’s. 2) De mogelijkheid om de complexiteit te reduceren van de producten voor het verkrijgen van een leesbare genetische vingerafdruk. Bij het uitvoeren van het protocol wordt uiteindelijk een bandenpatroon verkregen. De methode is zo opgesteld dat het verkregen bandenpatroon gemakkelijk af te lezen is. In dit experiment werd getracht om verschillen in de DNA-methylatie te detecteren tussen de organismen blootgesteld aan metaalstress (cadmium en nikkel) en deze opgekweekt in een controleblanco. De locatie van de veranderingen is belangrijk en of het om hypomethylatie of hypermethylatie gaat. Om de erfelijkheid van de DNA-methylatie te onderzoeken werd ook een analyse uitgevoerd op organismen opgekweekt in afwezigheid van metaalstress, maar afkomstig van ouderdieren blootgesteld aan metaalstress. In fig. 3.15 is de stamboom van de onderzochte organismen weergegeven. 117 3.3.2 Schema P-generatie onderhevig aan metaalstress F1-generatie onderhevig aan metaalstress F1-generatie zonder metaalstress F2-generatie zonder metaalstress Figuur 3.15: schematische voorstelling van de verschillende generaties van Daphnia magna waarbij de DNA-methylatie zou onderzocht worden. 3.3.3 Effecten van metaalstress op DNA-methylatie Het onderzoek is nog steeds in experimentele fase. Enkele procedurestappen zijn nog steeds in uitvoering en dienen nog geoptimaliseerd te worden. Bij het uitvoeren van de PCR zijn er banden die zichtbaar worden op de gel. Deze banden zouden gerepliceerd en dus gemethyleerd DNA representeren. De banden bleken echter afkomstig te zijn van contaminatie. De contaminatie (fig. 3.16) werd later teruggevonden als DNA dat aanwezig was in de dNTP-mix (nodig voor PCR). Bij herhaling van de procedure met nieuwe dNTPmix werden geen banden meer verkregen met PCR. Het volledige protocol werd doorlopen en gecontroleerd, daaruit bleek dat de restrictie-enzymen niet knipten. Het genomisch DNA bleef zichtbaar op de gel. De restrictie verloopt pas goed, als de band verdwijnt van het “genomisch DNA”, dan verkrijgt men een “smeertje” op de agarosegel waar de geknipte stukjes zich bevinden. 118 Figuur 3.16: gel met in de tweede laan de contaminatieband. 3.3.4 Besluit Het AIMS-protocol voor de analyse van de DNA-methylatie bij Daphnia magna dient nog te worden geoptimaliseerd. Dit onderzoek kan de basis vormen voor verder onderzoek naar het volledige epigenoom van Daphnia magna en andere modelorganismen. De DNAmethylatie is slechts één van de vele epigenetische merkers. Epigenetische merkers en patronen zijn verschillend in elk weefseltype en veranderen ook doorheen de tijd. Elk individu heeft dus één genoom en een veelvoud aan epigenomen. Om meer inzicht te verwerven in het effect van metalen op het epigenoom zal men in de toekomst misschien weefselspecifiek moeten gaan werken en een tijdsreeks van analysen opstellen. Het methylatiepatroon zou ook bij invertebraten van generatie op generatie overgeërfd kunnen worden. Het is dan waarschijnlijk een mechanisme verantwoordelijk voor de adaptatie aan metaalstress. Dit staat nog volop in vraag. Enkel bij planten, gistcellen en zoogdieren is met zekerheid aangetoond dat epigenetische patronen kunnen doorgegeven worden aan volgende generaties. 119 4 Besluit Er zijn talrijke toepassingen van metalen in verschillende economische sectoren. Deze toepassingen kunnen leiden tot verhoogde concentraties van metalen in het milieu en zorgen daarbij voor metaalstress in ecosystemen. Aquatische ecosystemen zijn onderhevig aan metaalstress via directe lozingen, atmosferische depositie en erosie door regenwater. De watervlo Daphnia magna werd gebruikt als proeforganisme in de verschillende testen voor dit onderzoek. Daphnia magna wordt al zeer lang gebruikt in de ecotoxicologie en is een sleutelsoort in aquatische ecosystemen. Voor de ecotoxicologische risicobeoordeling van stoffen worden dan ook dikwijls testen opgesteld met Daphnia magna. Het doel van ecotoxicologisch onderzoek is het monitoren en voorspellen van effecten van toxicanten op: cellen, weefsels, organismen, populaties, gemeenschappen en ecosystemen. Het opstellen van milieukwaliteitsnormen gebaseerd op fundamenteel onderzoek is een noodzaak. Een fundamentele wetenschappelijke basis voor milieunormen vereist de kennis van de impact van tolerantiemechanismen. Onder labocondities werden de effecten van cadmium en nikkel op Daphnia magna bestudeerd. Acclimatisatie en adaptatie zijn twee mechanismen die kunnen leiden tot tolerantie aan metaalstress. Tolerantieontwikkeling heeft zijn weerslag op de ‘performance’ van organismen op het niveau van cellen tot ecosystemen. Ten eerste werd gekeken naar de effecten van cadmium en nikkel op de reproductie. De reproductie werd daarbij over verschillende generaties opgevolgd. Uit de resultaten blijkt dat cadmium en nikkel een duidelijk negatief effect hebben op de reproductie van de eerste generatie organismen. Bij cadmium kon daarbij ook nog eens duidelijk het negatief effect van een verhoogde concentratie worden aangetoond. Bij de tweede generatie organismen werd nog steeds een verlaagde reproductie vastgesteld bij cadmium. Verder werd ook een verlaagde reproductie vastgesteld bij organismen opgekweekt in blancomedium, maar afkomstig van ouderdieren blootgesteld aan cadmium en nikkel. Uit de resultaten blijkt ook dat er geen significant verschil is in reproductie tussen de controleblanco en de tweede generatie organismen blootgesteld aan nikkel. Een mogelijke verklaring van bovenstaande fenomenen is dat er tolerantieontwikkeling aan het metaal nikkel is opgetreden bij de tweede generatie. Tolerantieontwikkeling zorgt voor een hogere metabolische kost (Calow & Sibly, 1990). De hogere metabolische kost kan onder andere zorgen voor een verminderde reproductie. 120 Vervolgens werd gestart met het opstellen van een methode voor de subcellulaire fractionatie van cadmium. De subcellulaire fractionatie of verdeling van cadmium in de cel heeft inzicht in de interne processen van de cel. Deze kunnen belangrijke informatie bevatten over metaaltoxiciteit en –tolerantie. De accumulatie van metalen in de cellulaire fracties (membranen, organellen, granulen, enzymen en metallothioneïne) bepaalt de biologische significantie van de metalen in de cel. Metalen in organellen en enzymen kunnen toxische effecten veroorzaken, terwijl metalen in fracties betrokken bij de metaaldetoxificatie (granulen en metallothioneïne) geen toxisch werking meer hebben. Na enkele testen konden alle fracties van elkaar gescheiden worden. De bepaling van de metalen in de verschillende fracties leverde nog geen resultaten op. Er is dus nog verder onderzoek nodig om tot een bruikbaar en geoptimaliseerde methode te komen. De bepaling van cadmium in de verschillende fracties en de biologische significantie zou op termijn een belangrijke bijdrage kunnen leveren aan de risicobeoordeling van cadmium. Als laatste ging er extra aandacht naar de epigenetica, namelijk de DNAmethylatie als adaptieve factor. De vorderingen op het vlak van het epigenetisch onderzoek geven steeds meer aanwijzingen van het belang van DNA-methylatie. DNAmethylatie zorgt ervoor dat organismen in staat zijn zich te verdedigen tegen stress, doordat DNA-methylatie de genexpressie kan reguleren en daarmee de eiwitsynthese. De AIMS-techniek heeft een indicatie van het voorkomen van hypermethylatie of hypomethylatie. De techniek dient nog aangepast en geoptimaliseerd te worden voor Daphnia magna. Tot op heden werd nog niet vastgesteld of metalen een invloed hebben op de DNA-methylatie en of eventuele wijzigingen erfelijk zijn. Verder onderzoek moet het belang aantonen van de DNA-methylatie voor de risicobeoordeling van stoffen. 121 5 Referentielijst AbdAllah, A.T., On the efficiency of Some Histological Techniques as Biomarker for Heavy Metal Pollution. In Science, Technology and Education of Microscopy: an Overview (Ed. Méndez-Vilas), Fomatex: Badajoz, Spain, 2003, p. 287-296. Aguirre-Arteta, A.M., Regulation of DNA methylation during development: alternative isoforms of DNA methyltransferase, Humboldt-University Berlin, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, 2000, p. 61, Beschikbaar op World Wide Web: http://edoc.huberlin.de/dissertationen/aguirre-arteta-ana-2000-06-28/HTML/aguirre.html [30.01.2007] Ahearn, G.A., Zhuang, Z., Duerr, J. & Pennington, V., Role of the invertebrate electrogenic 2Na+/1H+ antiporter in monovalent and divalent cation transport, J. Exp. Biol., jrg.196 (1994), p. 319-335. Akhtar, A. & Cavalli, G., The Epigenome Network of Excellence, PLoS Biol, jrg.3, nr.5 (2005), p. 762-763. Amiard, J.C., Amiard-Triquet, C., Barka, S., Pellerin, J. & Rainbow, P.S., Metallothioneins in aquatic invertebrates: their role in metal detoxification and their use as biomarkers, Aquatic Toxicology, jrg.76 (2006), p. 160-202. Arbačiauskas, K., Seasonal phenotypes of Daphnia: post-diapause and directly developing offspring. J. Limn., jrg.63, nr.1 (2004), p. 7-15. Ball, M.P., DNA chemical structure, 2006, Beschikbaar op World Wide Web: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/f/f7/DNA_chemical_structure.png [31.01.2007]. Barata, C., Navarro, J.C., Varo, I., Riva, M.C., Arun, S. & Porte, C., Changes in antioxidant enzyme activities, fatty acid composition and lipid peroxidation in Daphnia magna during the aging process, Comp. Biochem. Physiol. & Biochem. Mol. Biol., jrg.140, nr.1 (2005), p. 81-90. Bardsley, W.G., Childs, R.E., & Crabbe, M.J.C., Inhibition of enzymes by metal ionchelating reagents, Biochem. J., jrg.137 (1974), p. 61-66. XI Barnes, B.D., Invertebrate zoology. 4th ed. Molt Saunders College Publishing, Philadelphia, 1980, p.1089, ISBN 0-03-056747-5. Barzotti, R., Pelliccia, F. & Rocchi, A., DNA methylation, histone H3 methylation, and histone H4 acetylation in the genome of a crustacean. Genome, jrg.49 (2006), p. 87-90. Beaty, B.J., Mackie, R.S., Mattingly, K.S., Carlson, J.O. & Rayms-Keller, A., The midgut epithelium of aquatic arthropods: a critical target organ in environmental toxicology, Environmental Health Perspectives, jrg.110, nr.6 (2002), p. 911–914. Beukema, B., Lysosomen, 1998, Beschikbaar op World Wide Web: http://www.homepages.hetnet.nl/~b1beukema/lysosomen.html [20.09.2006] Biémont, C. & Vieira, C., Junk DNA as an evolutionary force, Nature, jrg.443, nr.5 (2006), p. 521-524. Bird, A., DNA methylation patterns and epigenetic memory, Genes & Dev., jrg. 16 (2002), p. 6-21. Bombail, V., Moggs, J.G. & Orphanides G., Perturbation of epigenetics status by toxicants. Toxicology Letters, jrg. 149 (2004), p. 51-58. Cain, D.J., Buchwalter, D.B. & Luoma, S.N., Influence of metal exposure history on the bioaccumulation and subcellular distribution of aqueous cadmium in the insect Hydropsyche californica, Env. Tox. and Chem., jrg. 25, nr. 4 (2006), p. 1042-1049. Calow, P. & Sibly, R.M., A physiological basis of population processes: ecotoxicological implications. Functional Ecology, jrg. 4 (1990), p. 283-288. Carvalho, G.R. & Hughes, R.N., The effect of food availability, female culture density and photoperiod on ephippia production in Daphnia magna Straus (Crustacea: Cladocera). Freshwater Biology, jrg. 13 (1983), p. 37-46. XII Cervera, A., Maymo, A.C., Martinez-Pardo, R. & Garcera, D., Antioxidant enzymes in Oncopeltus fasciatus (Heteroptera: Lygaeidae) exposed to cadmium, Environmental Entomology, jrg.32, nr.4 (2003), p. 705-710. Chapman, P.M, Wang, F., Janssen, C.R., Goulet, R.R. & Kamunde, C.N., Conducting Ecological Risk Assessments of Inorganic Metals and Metalloids: Current Status, Hum. Ecol. Risk Assess., jrg. 9, nr. 4, 2003, p. 641-697. Cobbett, C. & Goldsbrough, P., Phytochelatins and metallothioneins: roles in heavy metal detoxification and homeostasis, Annu. Rev. Plant. Biol., jrg. 53 (2002), p. 159-182. Colbourne, J.K., A documentary on the evolutionary history of Daphnia. PhD thesis, University of Guelph, Canada, 1999, p.149. Crease, T.J., The complete sequence of the mitochondrial genome of Daphnia pulex (Cladocera: Crustacea). Gene, jrg. 233 (1999): p. 89-99 Cullis, C.A., The environment as an active generator of adaptive genomic variation, M. Dekker, H.R. Lerner (eds), Plant Adaptations to Stress Environments., New York, 1999, p. 149-160. Daphnia Genomics Consortium, DGC Projects: Genetic Maps for Daphnia pulex and D. magna. Bloomington Campus, The center for Genomics and Bioinformatics, and The Trustees of Indiana University. 2005a, Beschikbaar op World Wide Web: http://daphnia.cgb.indiana.edu/projects/geneticmaps/, [03.08.2006]. Daphnia Genomics Consortium, The DGC Projects: Compelling reasons for choosing Daphnia as a model species. Bloomington Campus, The center for Genomics an Bioinformatics, and The Trustees of Indiana University. 2005b, Beschikbaar op World Wide Web: http://daphnia.cgb.indiana.edu/people/modelsystem/ [03.08.2006]. Daphnia Genomics Consortium, Proposal to sequence the genome of Daphnia pulex, 2003, Beschikbaar op World Wide Web: http://daphnia.cgb.indiana.edu/files/papers/WhitePaper.pdf [29.10.2006]. XIII Deleebeeck, N.M., De Schamphelaere, K.A, Janssen, C.R., A bioavailability model predicting the toxicity of nickel to rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and fathead minnow (Pimephales promelas) in synthetic and natural waters, Ecotoxicol. Environ. Saf., jrg. 67, nr. 1 (2006), p. 1-13. Demuynck, S., Muchembled, B.B., Deloffre, L., Grumiaux, F. & Leprêtre, A., Stimulation by cadmium of myohemerythrin-like cells in the gut of the annelid Nereis diversicolor, The Journal of Experimental Biology, jrg. 207 (2004), p. 1101-1111. Dierickx, P.J., Glutathione S-transferase in aquatic macro-invertebrates and its interaction with different organic micropollutants, Sci Total Environ., jrg.40, nr.3 (1984), p. 93-102. Duffus, J.H., “Heavy metals”-a meaningless term? Pure Appl. Chem., jrg.74, nr.5 (2002), p. 793-807. Easwaran, H.P., 2003, A complex interplay of regulatory domains controls cell cycle dependent subnuclear localization of DNMT1 and is required for the maintenance of epigenetic information, Dissertation, Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Humboldt-Universität zu Berlin, Beschikbaar op World Wide Web: http://edoc.huberlin.de/dissertationen/easwaran-hariharan-2003-10-01/HTML/front.html#front [30.01.2007] Ehrlich, M. & Wang, R.Y., 5-methylcytosine in eukaryotic DNA, Science, jrg.212, nr.4501 (1981), p. 1350-1357. Eisler, R., Cadmium hazards to fish, wildlife and invertebrates: a synoptic review, Biological Report 85 (1.2), Contaminant Hazard Reviews, nr. 2 (1985), p. 1-30 Elendt, B.P. & Bias, W.R., Trace nutrient deficiency in Daphnia magna cultured in standard medium for toxicity testing: effects of the optimization of culture conditions on life history parameters of D. magna. Wat. Res., jrg. 24, nr.9 (1990), p. 1157-1167. Falco, M. & Moreno, O., n.d. Daphnia magna. Centre de Documentacio I Experimentacio en Ciencies I Tecnologia, Catalunya, 2000. Beschikbaar op World Wide Web: http://www.xtec.es/cdec/portada/pdf/daphnia.pdf [03.08.2006]. XIV Fauna Europaea, [website]. Database of all European land and fresh-water animals, 2000a, Beschikbaar op World Wide Web: http://www.faunaeur.org/full_results.php?id=237016 [10.08.2006]. Fauna Europaea, [website]. Database of all European land and fresh-water animals. 2000b, Beschikbaar op World Wide Web: http://www.faunaeur.org/statistics.php [10.08.2006]. Field, L.M., Lyko, F., Mandrioli, M. & Prantera, G., DNA methylation in insects. Insect Molecular Biology, jrg. 13, nr.2 (2004), p. 109-115. Forbes, V.E. & Calow, P., Population growth rate as a basis for ecological risk assessment of toxic chemicals. Phil. Trans. R. Soc. Lond., jrg. 357 (2002), p. 1299-1306. Foulkes, E.C., Transport of toxic heavy metals across cell membranes, Society for Experimental Biology and Medicine, jrg.223, nr.3 (2000), p. 234-240. Fowler B.A., Hildebrand C.E., Kojima Y. & Webb M. Nomenclature of metallothionein. Experientia Suppl., jrg. 52 (1987), p. 19-22. Frigola, J., Alteracions epigenètiques en el càncer colorectoral, Ciències Experimentals i Matemàtiques, Universitat de Barcelona, 2005, Beschikbaar op World Wide Web: http://www.tdx.cesca.es/TDX-1104105-122230/ Frigola, J., Ribas, M., Risques, R.A. and Peinado, M.A., Methylome profiling of cancer cells by amplification of inter-methylated sites (AIMS), Nucleic Acids Res., jrg. 30, nr. 7 (2002), e28 Fryer, G., Functional morphology and the adaptive radiation of the Daphnidae (Branchiopoda: Anomopoda). Philosophical Transaction of the Royal Society of London, jrg. 331 (1991), p. 1-99. Giguère, A., Campbell, P.G.C., Hare, L. & Couture, P., Subcellular partitioning of cadmium, copper, nickel and zinc in indigenous yellow perch (Perca flavescens) sampled along a polymetallic gradient, Aquatic Toxicology, jrg. 40 (2006), p. 1-12. XV Gilbert, S.F., Mechanisms for the environmental regulation of gene expression: Ecological aspects of animal development, J. Biosci., jrg. 30 (2005), p. 65-74. Gillis, P.L., et al., Daphnia need to be gut-cleared too: the effect of exposure to and ingestion of metal-contaminated sediment on the gut-clearance patterns of D. magna. Aquatic Toxicology, jrg. 71 (2005), p. 143-154. Ghoskal, K., Majumder, S., Li, Z., Dong, X. & Jacob, S., Suppression of Metallothionein Gene Expression in a Rat Hepatoma Because of Promoter-specific DNA Methylation. The Journal of Biological Chemistry, jrg. 275, nr. 1 (2000), p. 529-547. Goll M.G. & Bestor T.H., Eukaryotic cytosine methyltransferase. Ann. Rev. Biochem. jrg. 74 (2005), p. 481-514. Haig, D., The (dual) origin of epigenetics, Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, jrg. 69 (2004), p. 1-4. Harrison, R.M. & Hester, R.E., Chemicals in the Environment Assessing and Managing, Campbell, P.G.C., Chapman, P.M. & Hale, B.A. (eds.), Risk assessment of metals in the environment, University of Birmingham & University of York, UK, Issues in Environmental Science and Technology, 2006, p. 102-132. ISBN 0854042407 Hattman, S., DNA-[Adenine] Methylation in Lower Eukaryotes, Biochemistry, jrg. 70, nr. 5 (2005), p. 550-558. Heard, E., Clerc, P. & Avner, P., X-chromosome inactivation in mammals, Annu. Rev. Genet., jrg. 31 (1997), p. 571–610. Hensbergen, P.J., Donker, M.H., van Velzen, M.J.M., Roelofs, D., van der Schors, R.C., Hunziker, P.E. & van Straalen, N.M., Primary structure of a cadmium-induced metallothionein from the insect Orchesella cincta (Collembola), Eur. J. Biochem., jrg.259 (1999), p.197-203. XVI IARC, Agents reviewed by the IARC monographs Vol 1-88. 2006, Beschikbaar op World Wide Web: http://monographs.iarc.fr/ENG/Classification/Listagentsalphorder.pdf [10.08.2006]. Indiana University, Genome sequencing is for ecology, too., 2006, Beschikbaar op World Wide Web: http://newsinfo.iu.edu/news/page/normal/2796.html [10.08.2006]. Jaenisch, R & Bird, A., Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals, Nature Genetics Supplement, jrg. 33 (2003), p. 245-254. Kahle, J., Clason, B. & Zauke, G.P., Sequential determination of Cd, Cu, Pb, Co and Ni in marine invertebrates by Zeeman graphite furnace atomic absorption spectroscopy, Carl von Ossietzky Universität Oldenburg, FB Biologie (ICBM), Varian, nr. 129 (2003), p. 1-15. Klaassen, C.D., Liu, J. & Choudhuri, S., Metallothionein: An intracellular protein to protect against cadmium toxicity, Annual Reviews Pharmacology Toxicology, jrg. 39 (1999), p. 267-294. Klaassen, C.D. & Liu, J., Induction of Metallothionein as an Adaptive Mechanism Affecting the Magnitude and Progression of Toxicological Injury, Environmental Health Perspectives, jrg. 106 (1998), p. 297-300. Köhler, H.R., Triebskorn, R., Stöcker, W., Kloetzel, M. & Alberti, G., The 70 kD heat shock protein (hsp 70) in soil invertebrates: A possible tool for monitoring environmental toxicants, Archives of Environmental Contamination and Toxicology, jrg. 22 (1992), nr. 3, p. 334-338. Kojima, Y., Definitions and nomenclature of metallothioneins, Methods Enzymol., jrg. 205 (1991), p. 8-10. Korsloot, A., van Gestel, C.A.M., van Straalen, N.M. Environmental stress and cellular response in arthropods, CRC Press LLC, 2004, N.W. Corporate Blvd., Boca Raton, Florida, ISBN 0-415-32886-1. XVII Lasenby, D.C. & Van Duyn, J., Zinc and cadmium accumulation by the opossum shrimp Mysis relicta, Archives of Environmental Contamination and Toxicology, jrg. 23, nr. 2 (2004), p. 179-183. Lavens, P. & Sorgeloos, P. (Eds.), Manual on the Production and Use of Live Food for Aquaculture. FAO Fisheries Technical Paper, 1996, no. 361, Rome, FAO, p. 295. Lee, Y.W., Broday, L. & Costa, M., Effects of nickel on DNA methyltransferase activity and genomic DNA methylation levels. Mutation Research, jrg. 415 (1998), p. 213-218. Madlung, A. & Comai, L., The effect of stress on genome regulation and structure. Annals of Botany, jrg. 21 (2004), p. 1-15. Majumder, S., Ghoshal, K., Datta, J., Bai, S., Dong, X., Quan, N., Plass, C. & Jacob, S.T., Role of de Novo DNA Methyltransferases and Methyl CpG-binding Proteins in Gene Silencing in a Rat Hepatoma. J. Biol. Chem., jrg. 277, nr. 18 (2002), p. 16048-16058. Mandrioli, M., Epigenetic tinkering and evolution: is there any continuity in the role of cytosine methylation from invertebrates to vertebrates? Cell. Mol. Life Sci., jrg. 61 (2004), p. 2425–2427. Mandrioli, M. & Borsatti, F., Histone methylation and DNA methylation: a missed pas de deux in invertebrates? ISJ, jrg. 2 (2005), p. 159-161. Miller, K.W., Risanico, S.S. & Risatti, J.B., Differential tolerance of Sulfolobus strains to transition metals. FEMS Microbiology Letters, jrg. 93, nr. 1 (1992), p. 69-73. Millero, F., Speciation of metals in natural waters, Geochemical Transactions, jrg. 8, nr. 1 (2001), p. 1-8. Mitchell, S.E., Read, A.F. & Little T.J., The effect of a pathogen epidemic on the genetic structure and reproductive strategy of the crustacean Daphnia magna. Ecology Letters, jrg. 7 (2004), p. 848-858. Mungkung, R., Upatham, E.S., Pokethitiyook, P., Kruatrachue & Panichajakul, C., Effects of humic acid and water hardness on acute toxicity and accumulation of cadmium in the freshwater fish (Puntius gonionotus Bleeker), Science Asia, jrg.27 (2001), p. 157-164. XVIII Muyssen, B.T., Brix, K.V., DeForest, D.K. & Janssen, C.R. Nickel essentiality and homeostasis in aquatic organisms, Environ. Rev., jrg. 12 (2004), p. 113-131. Muyssen, B.T. & Janssen, C.R., Multi-generation cadmium acclimation and tolerance in Daphnia magna Straus, Environ. Pollut., jrg. 130, nr.3 (2004), p. 309-316. NOAA, Zooplankton – Waterfleas: Cladoceran Anatomy. Great Lakes Environmental Research Lab, Sea Grant Lakes Network, 2004, Beschikbaar op World Wide Web: http://www.glerl.noaa.gov/seagrant/GLWL/Zooplankton/Cladocera/CladoceraAnatomy.ht ml [10.08.2006]. Nordberg, G.F., General aspects of cadmium: transport, uptake and metabolism by the kidney. Environ. Health. Perspect., jrg. 54 (1984), p. 213-218. O’Brien, J.J., Kumari, S.S. & Skinner, D.M., Proteins of Crustacean Exoskeletons: I. Similarities and Differences among Proteins of the Four Exoskeletal Layers of Four Brachyurans. Biol. Bull., jrg. 181 (1991), p. 427-441. OECD, Guidelines for Testing of Chemicals. Organisation for Economic Co-Operation and Development, Paris, 1996, p.1087. Oller, A. & Bates, H., Metals in Perspective, J. Environ. Monit., jrg. 5, nr. 5 (2003), p. 95102. Ongenaert, M., Karakterisatie van kankerspecifiek gemethyleerde CpG-eilanden, Gent, Universiteit Gent, 2005, Eindwerk tot het behalen van de graad bio-ingenieur in de cel- en genbiotechnologie. Pennak, R.W., Fresh-water Invertebrates of the United States, 3th ed., John Wiley and Sons, New York, 1989, p. 628. Pirow, R., Wollinger, F. & Paul, R.J., The sites of respiratory gas exchange in the planktonic crustacean Daphnia magna: an in vivo study employing blood haemoglobin as an internal oxygen probe. The Journal of Experimental Biology, jrg. 202 (1999), p. 30893099. XIX Prakash, N.T. & Rao, K.S.J., Modulations in antioxidant enzymes in different tissues of marine bivalve Perna viridis during heavy metal exposure, Biomedical and Life Sciences, jrg. 146, nr. 2 (1995), p. 107-113. Pray, L.A., Epigenetics: Genome, meet your environment, The Scientist, jrg.18, nr. 13 (2004), p. 14-23. Quevauviller, P., Vercoutere, K., Muntau, H. & Griepink, B., The certification of the contents (mass fractions) of As, Cd, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Se, V en Zn in plankton. CRM 414, Report EUR 14558 EN, Commission of the European Communities, Community Bureau of Reference, reference materials, ISSN 1018-5593, 1993, p. 71. Ravera, O., Monitoring of the aquatic environment by species accumulator of pollutants: a review, J. Limnol., jrg. 60, nr. 1 (2001), p. 63-78. Regev, A., Lamb, M.J. & Jablonka, E., The role of DNA methylation in invertebrates: development regulation or genome defense? Mol. Biol. Evol., jrg. 15, nr. 7 (1998), p. 880891. RPI (Rensselaer Polytechnic Institute), Amino Acid Catabolism: Carbon Skeletons, 2007, Beschikbaar op World Wide Web: http://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem/MBWeb/mb2/part1/aacarbon.htm Roesijadi, G., Metallothionein Induction as a Measure of Response to Metal Exposure in Aquatic Animals, Environ. Health Perspect., jrg. 102, nr. 12 (1994), p. 91-96. Santos, K.F., Mazzola, T.N. & Carvalho, H.F., The prima donna of epigenetics: the regulation of gene expression by DNA methylation. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, jrg. 38 (2005), p. 1531-1541. Schaefer, M., Brohmer- Fauna von Deutschland. 20th ed., Quelle & Meyer, Verlag, Wiebelsheim, 2000, p. 791. Schultz, T.W. & Kennedy, J.R., The fine structure of the digestive system of Daphnia pulex. (Crustacea: Cladocera), Tissue Cell., jrg. 8, nr. 3 (1976), p. 479-490. XX Seitz, S., Connecting the histone acetyltransferase complex SAS-I to the centromere in S. cerevisiae, Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Humboldt-Universität zu Berlin, PhD thesis, 2004, p.87, Beschikbaar op World Wide Web: http://edoc.huberlin.de/dissertationen/seitz-stefanie-2004-10-20/HTML [31.01.2007] Selck, H. & Forbes, V.E., The relative importance of water and diet for uptake and subcellular distribution of cadmium in the deposit-feeding polychaete, Capitella sp. I., Mar. Environ. Res., jrg. 57, nr. 4 (2004), p. 261-279. Shi, D. & Wang, W.X., Understanding the differences in Cd and Zn bioaccumulation and subcellular storage among different populations of marine clams, Environ. Sci. Technol., jrg.38, nr.2 (2004), p. 449-456. Simmen, M.W., Leitgeb, S., Clark, V.H., Jones, S.J.M. & Bird, A., Gene number in an invertebrate chordate, Ciona intestinalis, PNAS, jrg. 95 (1998), p. 4437-4440. Simkiss, K., Cellular discrimination processes in metal accumulating cells, Journal of Experimental Biology, jrg. 94, (1981), p. 317-327. Simkiss, K. & Taylor, M.G., Calcium magnesium phosphate granules: atomistic simulations explaining cell death, Journal of Experimental Biology, jrg. 190, nr. 1 (1994), p. 131-139. Sokolova, I.M., Ringwood, A.H. & Johnson, C., Tissue-specific accumulation of cadmium in subcellular compartments of eastern oysters Crassostrea virginica Gmelin (Bivalvia: Ostreidae), Aquat. Toxicol., jrg.74, nr.3 (2005), p. 218-228. Soto, M., Marigómez, I. & Cancio, I., Biological aspects of metal accumulation and storage. Bilbo, Basque Country: University of the Basque Country, Faculty of Science and Technology, Zoology and Animal Cell Biology Department., Cell Biology and Histology Laboratory, 2003, Beschikbaar op World Wide Web: http://www.ehu.es/europeanclass2003/biological_aspects_of_metal_accu.htm [10.08.2006]. Sperling, S., DNA methylation: Regulatory regions: promoter-enhancer, Max Planck Institute, 2005, p. 47. XXI Stanley, F.J., Studies on the metal-containing granules in the mussels, Mytilus galloprovincialis and Velesunio angasi. PhD Doctor of Philosphy at Murdoch University. 2003, p. 182. NoE (The Epigenome Network of Excellence), Cartoon History, 2006, Beschikbaar op World Wide Web: http://epigenome.eu/en/1,22,569 [01.12.2006]. The Honeybee Genome Sequencing Consortium, Insights into social insects from the genome of the honeybee Apis mellifera, Nature, jrg. 443, nr. 26 (2006), p. 931-949. The Royal BC Museum, Living Landscapes: Cladocerans of the Thompson-Okanagan Region. British Columbia, 1994, Beschikbaar op World Wide Web: http://www.livinglandscapes.bc.ca/thomp-ok/cladocerans/daphniidae.html [10.08.2006]. Tsui, M.T.K & Wang, W.X., Influences of maternal exposure on the tolerance and physiological performance of Daphnia magna under mercury stress, Environmental Toxicology and Chemistry, jrg. 24, nr.5 (2005), p. 1228-1234. University of Guelph, Genus: Daphnia, The Cladoceran Website. Guelph, Canada, 1996, Beschikbaar op World Wide Web: http://www.cladocera.uoguelph.ca/taxonomy/daphnia/default.htm [12.08.2006]. Vandegehuchte, M., DNA methylation assessment by Amplification of Inter-Methylated Sites (AIMS), 2007, p. 13. Vangheluwe, M., Van Sprang, P., Verdonck, F., Heijerick, D., Versonnen, B., Vandenbroele, M. & Van Hyfte, A., Introduction and Background, Metals Environmental Risk Assessment Guidance (MERAG), 2005, p. 1-84, Beschikbaar op World Wide Web http://www.euras.be/assets/files/MERAG/MERAG.pdf Vasak, M., Metal removal and substitution in vertebrate and invertebrate metallothioneins. In: Riodan, J.F., Vallee, B.L. (Eds.), Methods in Enzymology Metallochemistry B, jrg. 205 (1991), p. 452–458. Vasseur, P. & Leguille, C., Defense systems of benthic invertebrates in response to environmental stressors, Environmental Toxicology, jrg.19 (2004), nr.4, p. 433-436. XXII Vatamaniuk, O.K., Bucher, E.A., Ward, J.T., Rea, P.A., A new pathway for heavy metal detoxification in animals: phytochelatin synthase is required for cadmium tolerance in Caenorhabditis elegans. J Biol Chem, jrg. 276 (2001), p. 20817–20820. Vatamaniuk OK, Bucher EA, Rea PA, Worms take the ‘phyto’ out of ‘phytochelatins’. Trends Biotechnol., jrg. 20 (2002), p. 61–64. Vijver, M.G., van Gestel, C.A.M., Roman, P.L., van Straalen, N.M., Peijnenburg, W.J.G.M., Internal metal sequestration and its ecotoxicological relevance: a review. Env. Sci. & Tech., jrg. 38 (2004), p. 4705-4712. Volpe, P., The language of methylation in Genomics of Eukaryotes, Biochemistry (Biokhimiya), jrg. 70, nr. 5 (2005), p. 584-595. Wade, P.A. & Archer, T.K., Epigenetics environmental instructions for the genome, Environmental Health Perspectives, jrg. 114, nr. 3 (2006), p. A140-141. Wallace, W.G., Lee, B.G. & Luoma, S.N., Subcellular compartmentalization of Cd and Zn in two bivalves I. Significance of metal-sensitive fractions (MSF) and biologically detoxified metal (BDM), Mar. Ecol. Prog. Ser., jrg. 249 (2003), p. 183-197. Wang, Y., Jorda, M., Jones, P.L., Maleszka, R., Ling, X., Robertson, H.M., Mizzen, C.A., Peinado, M.A. & Robinson, G.E., Functional CpG methylation system in a social insect, Science, jrg. 314, nr. 5799 (2006), p. 645-647. Watson, R.E. & Goodman, J.I., Epigenetics and DNA methylation come of age in toxicology. Toxicological Sciences, jrg. 67 (2002), p. 11-16. Weinhold, B., Epigenetics: The Science of Change. Environmental Health Perspectives, jrg. 114, nr. 3 (2006), p. 160-167. Winsor, G.L. & Innes, D.J., Sexual reproduction in Daphnia pulex (Crustacea: Cladocera): observations on male mating behaviour and avoidance of inbreeding. Freshwater Biology, jrg. 47 (2002), p. 441-450. XXIII Wojciechowski, M.F., DNA methylation and the analysis of CpG islands in genomes, 2005, Beschikbaar op World Wide Web: http://math.la.asu.edu/~andrzej/teachold/351Spr05/teach/mw1.pdf Wright, D.A., Cadmium and calcium interactions in the freshwater amphipod Gammarus pulex, Freshwater Biology, jrg. 10, p. 123-133. Zaffagnini, F., Reproduction in Daphnia . Daphnia (Peters R.H. en de Bernardi R.), Mem. Ist. Ital. Idrobiol., jrg. 45 (1987), p. 245-284. Zeng, J., Vallee, B.L. & Kagi, J.H.R., Zinc Transfer from Transcription Factor IIIA Fingers to Thionein Clusters. Proceedings of the National Academy of Sciences, jrg. 88 (1991), p. 9984-9988. XXIV 6 Bijlagen Bijlage 1: Tabel werkelijke metaalconcentraties in opstelling aquaria 1% HNO3 (v/v) Normapur Staal ID Bl Ni Cd 1 Cd 2 bl ni Cd 1 Cd 2 Ni voor Bl voor Ni Bl testreeks F1 Cd1 bl testreeks F1 Cd2 bl testreeks F1 Cd 2 voor Cd 1 voor Bl voor Ni voor Cd 1 na Bl na Cd 2 na Ni na Bl voor Ni voor Datum 23/08 23/08 23/08 23/08 31/08 31/08 31/08 31/08 31/08 31/08 04/sep 04/sep 04/sep 04/sep 04/sep 04/sep 04/sep 04/sep 04/sep 04/sep 04/sep 08/sep 08/sep Verdunning 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Verwachte Conc. (µg/L) 0 372 180 250 0 372 180 250 372 0 0 0 0 250 180 0 372 180 0 250 372 0 372 Gemeten Conc. (µg/L) 0,1 355,5 163,8 229,5 0,3 366,2 174,3 241,7 371,1 21,5 19,5 6,8 9 239,7 178,6 0,9 355,5 184,8 0,9 216,6 366,2 0,3 369,1 I Cd 1 voor Cd 2 voor Bl F1 na Ni F1 na Cd 1 F1 na Cd 2 F1 na Bl na Ni na Cd 2 na Cd 1 na Bl F1 voor Cd 1 F1 voor Ni F1 voor Cd 2 F1 voor Cd 2 F1 na Bl F1 na Ni F1 na Cd 1 F1 na Bl F1 voor Ni F1 voor Cd 1 F1 voor Cd 2 F1 voor Bl F1 na Cd 1 F1 na Ni F1 na Cd 2 F1 na 08/sep 08/sep 06/sep 06/sep 06/sep 06/sep 08/sep 08/sep 08/sep 08/sep 12/sep 12/sep 12/sep 12/sep 12/sep 12/sep 12/sep 12/sep 13/sep 13/sep 13/sep 13/sep 13/sep 13/sep 13/sep 13/sep 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 180 250 0 372 180 250 0 372 250 180 0 180 372 250 250 0 372 180 0 372 180 250 0 180 372 250 182,6 205,3 0,4 336,9 156,5 221,9 0,4 321,3 205,1 140,9 0,4 147,2 335 215,1 226,6 0,2 337,9 153,1 0,4 353,5 158,8 235,4 0,1 152,6 342,8 240 II Bijlage 2: Tabellen met reproductiegegevens P-generatie Blanco Dag 1 Datum 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Inclusief gestorven organismen Totaal aantal nakomelingen 472 Gemiddeld per organisme 47,2 30/aug 0 0 0 7 0 0 0 0 0 4 2 3 31/aug 01/sep 0 6 0 8 3 0 0 0 0 6 0 9 0 9 0 9 0 7 0 0 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 03/ 09 10 INCLUSIEF EXCLUSIEF 02/sep sep 04/sep 05/sep 06/sep 07/sep 08/sep /sep /sep 11/sep 12/sep 13/sep 14/sep STERFTE STERFTE 9 0 0 7 0 10 0 13 0 45 45 9 0 0 9 0 9 0 15 0 50 50 11 0 9 0 0 10 10 0 0 43 43 9 11 0 0 11 11 0 0 12 61 61 7 0 11 0 0 13 12 0 0 49 49 6 0 0 10 0 12 0 12 0 49 49 7 0 0 10 0 11 0 11 0 48 48 8 0 0 11 0 12 0 0 8 48 48 5 0 0 10 0 13 0 0 0 35 35 9 0 9 0 0 11 11 0 0 44 44 standaard standaard deviatie deviatie Exclusief gestorven organismen 6,5625 6,5625 IDEM IDEM III Cd180 Dag 1 Inclusief gestorven organismen 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 03/ 09 10 INCLUSIEF EXCLUSIEF 02/sep sep 04/sep 05/sep 06/sep 07/sep 08/sep /sep /sep 11/sep 12/sep 13/sep 14/sep STERFTE STERFTE 8 0 0 8 0 9 0 13 0 42 42 9 0 0 8 0 9 0 12 0 45 45 8 0 0 8 0 12 16 0 0 52 52 8 0 0 8 0 9 0 6 0 35 35 9 0 12 0 0 12 13 0 0 52 52 7 0 0 9 0 11 0 9 0 44 44 2 0 0 1 0 7 0 d d 10 4 0 6 0 0 12 0 12 0 34 34 7 0 0 0 8 12 0 0 7 38 38 0 5 0 0 5 5 0 0 0 18 18 standaard standaard deviatie deviatie 13,7113 10,5 Exclusief gestorven organismen Totaal aantal nakomelingen 370 Gemiddeld per organisme 37 Totaal aantal nakomelingen 360 Gemiddeld per organisme 40 Datum 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2 3 30/aug 31/aug 01/sep 0 0 4 0 0 7 0 0 8 0 0 4 0 6 0 0 0 8 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 3 4 IV Cd250 Dag 1 Datum 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2 3 30/aug 31/aug 01/sep 0 0 8 0 0 6 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 5 0 0 0 7 0 0 6 0 0 5 0 0 8 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 03/ 09 10 INCLUSIEF EXCLUSIEF STERFTE 02/sep sep 04/sep 05/sep 06/sep 07/sep 08/sep /sep /sep 11/sep 12/sep 13/sep 14/sep STERFTE 4 0 0 7 0 2 0 0 0 21 21 6 0 0 2 2 2 0 0 0 18 18 5 0 7 0 0 7 7 0 0 31 31 5 0 10 0 0 10 9 0 0 40 40 6 0 7 8 0 7 0 12 0 47 47 10 0 0 0 0 10 0 0 0 25 25 6 0 0 7 0 6 0 0 0 26 26 8 0 0 11 0 8 0 d d 33 4 0 0 9 0 8 0 6 0 32 32 5 0 0 8 0 8 0 0 0 29 29 standaard standaard deviatie deviatie Inclusief gestorven organismen Exclusief gestorven organismen Totaal aantal nakomelingen 302 Gemiddeld per organisme 30,2 Totaal aantal nakomelingen 269 Gemiddeld per organisme 29,888889 8,625543461 9,08906547 V Ni Dag 1 Datum 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2 3 30/aug 31/aug 01/sep 5 0 0 0 0 7 0 7 0 5 0 0 0 4 0 0 0 5 0 6 0 0 0 9 0 0 4 0 0 7 4 5 6 03 02/sep /sep 04/sep 11 d 0 5 0 5 6 7 d d Inclusief gestorven organismen Exclusief gestorven organismen Totaal aantal nakomelingen Totaal aantal nakomelingen Gemiddeld per organisme 231 Gemiddeld per organisme 26,1 33 261 7 8 9 05/sep 8 d 0 7 0 0 0 0 d d 06/sep 0 d 0 0 0 0 d 0 d d 07/sep 0 d 0 0 12 6 d 0 d d 10 11 12 09 10 08/sep /sep /sep 6 d 0 11 0 0 d 0 d d 13 14 15 11/sep 7 d 10 10 15 8 d 0 d d 12/sep 0 d 14 0 0 0 d 0 d d 13/sep 0 d 0 0 14 13 d 2 d d 16 INCLUSIEF 14/sep STERFTE 12 49 d 7 0 31 13 51 0 45 0 37 d 12 0 18 d 4 d 7 standaard deviatie 18,6395 EXCLUSIEF STERFTE 49 31 51 45 37 18 standaard deviatie 12,5499 VI F1-generatie Reeks 1: blanco Dag 1 Datum 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Inclusief gestorven organismen Totaal aantal nakomelingen 269 Gemiddeld per organisme 26,9 2 3 4 11/sep 12/sep 13/sep 11 0 8 8 0 0 12 0 18 12 0 19 13 0 18 10 0 19 11 20 0 10 15 0 12 0 0 12 0 0 14/sep 0 12 0 0 0 0 0 0 16 13 Exclusief gestorven organismen Gemiddeld aantal nakomelingen / dag 4,75 5 7,5 7,75 7,75 7,25 7,75 6,25 7 6,25 Standaard INCLUSIEF EXCLUSIEF deviatie 5,6199051 19 19 6 20 20 9 30 30 9,394147114 31 31 9,178779875 31 31 9,142392101 29 29 9,673847907 31 31 7,5 25 25 8,246211251 28 28 7,228416147 25 25 standaard standaard deviatie deviatie 4,508017549 4,508017549 IDEM VII Reeks 2: Cd180 Dag 1 Datum 2 11/sep 1 d 2 3 4 5 6 7 8 d 9 10 Inclusief gestorven organismen 12/sep d 0 6 7 0 5 3 0 0 0 0 0 0 14/sep d 4 11 0 0 0 0 d 0 0 4 13/sep d d 6 2 3 1 0 0 1 0 9 d 0 0 8 0 Exclusief gestorven organismen Totaal aantal nakomelingen Totaal aantal nakomelingen 63 Gemiddeld per organisme 6,3 Gemiddeld aantal nakomelingen / dag 0 1,25 4,25 1,75 0,25 1,25 3 0 3,5 0,5 Standaard deviatie 0 1,892969449 5,315072906 3,5 0,5 2,5 4,242640687 0 4,123105626 1 INCLUSIEF EXCLUSIEF 0 5 5 17 17 7 7 1 1 5 5 12 12 0 14 14 2 2 standaard standaard deviatie deviatie 6,1110101 5,817154434 63 Gemiddeld per organisme 7,875 VIII Cd180->Blanco Dag 1 Datum 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Inclusief gestorven organismen Totaal aantal nakomelingen 203 Gemiddeld per organisme 20,3 11/sep 13 13 9 4 4 14 12 10 0 0 2 12/sep 0 0 0 16 0 0 0 10 17 0 3 13/sep 0 0 15 0 0 0 13 0 0 0 4 14/sep 12 12 0 0 0 13 2 0 0 14 Exclusief gestorven organismen Totaal aantal nakomelingen 178 Gemiddeld per organisme 17,8 Gemiddeld aantal nakomelingen / dag 6,25 6,25 6 5 1 6,75 6,75 5 4,25 3,5 Standaard deviatie INCLUSIEF EXCLUSIEF 7,228416147 25 25 7,228416147 25 25 7,348469228 24 24 7,571877794 20 20 2 4 4 7,804912983 27 27 6,701989754 27 27 5,773502692 20 20 8,5 17 17 7 14 14 standaard standaard deviatie deviatie 7,180993432 7,180993432 IX Reeks 3: Cd250 Dag 1 Datum 2 11/sep 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Inclusief gestorven organismen Totaal aantal nakomelingen 31 Gemiddeld per organisme 3,1 d 12/sep d 4 7 d d d d d 3 d d d 4 d d d 0 13/sep d 0 0 14/sep d 8 0 d d d d d d 0 4 0 8 d d d d d d 0 0 Exclusief gestorven organismen Totaal aantal nakomelingen 27 Gemiddeld per organisme 9 Gemiddeld aantal nakomelingen Standaard / dag INCLUSIEF EXCLUSIEF deviatie 0 0 0 3 3,829708431 12 12 3,75 4,34932945 15 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 standaard standaard deviatie deviatie 5,66568619 7,937253933 X Cd250->Blanco Dag 1 Datum 2 11/sep 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Inclusief gestorven organismen Totaal aantal nakomelingen 118 Gemiddeld per organisme 11,8 d 12/sep d 7 10 10 14 8 d d d d 14/sep d 15 11 0 0 0 d d 0 d 4 13/sep d 0 0 18 0 14 0 d 3 0 0 0 11 0 d d 0 d 0 d Exclusief gestorven organismen Totaal aantal nakomelingen 118 Gemiddeld per organisme 19,666667 Gemiddeld aantal nakomelingen Standaard / dag deviatie INCLUSIEF EXCLUSIEF 0 0 0 5,5 7,141428429 22 22 5,25 6,075908711 21 21 7 8,717797887 28 28 6,25 7,320063752 25 25 5,5 6,806859286 22 22 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 standaard standaard deviatie deviatie 12,58570618 9,973297683 XI Reeks 4: Ni Dag 1 Datum 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Inclusief gestorven organismen Totaal aantal nakomelingen 287 Gemiddeld per organisme 28,7 11/sep 12 13 13 11 14 14 10 10 11 13 2 12/sep 4 0 0 0 0 0 2 16 19 0 3 13/sep 17 19 14 0 14 19 16 0 0 14 4 14/sep 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 Exclusief gestorven organismen Totaal aantal nakomelingen 287 Gemiddeld per organisme 28,7 Gemiddeld aantal nakomelingen / dag 8,25 8 6,75 5,75 7 8,25 7 6,5 7,5 6,75 Standaard INCLUSIEF EXCLUSIEF deviatie 7,675719293 33 33 9,556847458 32 32 7,804912983 27 27 6,652067348 23 23 8,082903769 28 28 9,742518497 33 33 7,393691004 28 28 7,895146188 26 26 9,255628918 30 30 7,804912983 27 27 standaard standaard deviatie deviatie 3,267686916 3,267686916 XII Ni->Blanco Dag 1 Datum 1 2 3 4 5 6 d 7 8 9 10 Inclusief gestorven organismen Totaal aantal nakomelingen 240 Gemiddeld per organisme 24 2 11/sep 10 10 13 10 10 12/sep 0 0 0 0 0 d 13 11 10 12 3 13/sep 19 16 12 16 17 d 16 0 17 0 4 14/sep 0 0 0 0 0 d 0 14 1 13 0 0 0 0 Exclusief gestorven organismen Totaal aantal nakomelingen 240 Gemiddeld per organisme 26,666667 Gemiddeld aantal nakomelingen / dag 7,25 6,5 6,25 6,5 6,75 0 7,25 6,25 7 6,25 Standaard deviatie INCLUSIEF EXCLUSIEF 9,142392101 29 29 7,895146188 26 26 7,228416147 25 25 7,895146188 26 26 8,30160627 27 27 0 0 8,460693431 29 29 7,320063752 25 25 8,041558721 28 28 7,228416147 25 25 standaard standaard deviatie deviatie 8,576453554 1,658312395 XIII Bijlage 3: Tabellen met gemeten cadmiumconcentraties Matrix Purity 10% HNO3 (v/v) Normapur Code Sample ID Datum Concentratie in staal (µg/L) 52 Cd 180 P 5.24mg 15/09/2006 4 53 Cd 180 P 5.13mg 15/09/2006 1 54 Cd 180 P 5.09mg 15/09/2006 1 55 Cd 180 P 5.02mg 15/09/2006 4 56 Cd 250 P 2.3mg 15/09/2006 7 57 Cd 250 P 2.1mg 15/09/2006 5 58 Cd 180 F1 5mg 15/09/2006 2 59 Cd 180 F1 3.4mg 15/09/2006 1 60 Cd 180 F1 5mg 15/09/2006 2 61 Cd 250 F1 5.5mg 15/09/2006 3 62 Cd 250 F1 5.1mg 15/09/2006 4 63 Cd 250 F1 5.02mg 15/09/2006 4 64 Cd 13/10/2006 65 66 Cd Cd 13/10/2006 13/10/2006 0,5 0,6 Methode Opmerkingen Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale GF metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting GF Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale GF metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale GF metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale GF metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale GF metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting GF Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale GF metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale GF metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale GF metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale GF metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale GF metaalbelasting GF Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale GF metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale GF metaalbelasting GF Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale XIV 67 Cd 13/10/2006 0,2 GF 68 Cd 13/10/2006 0,3 GF 69 Cd 13/10/2006 0,2 GF 70 Cd 13/10/2006 0,2 GF 71 Cd 13/10/2006 0,2 GF 72 Cd 13/10/2006 0,3 GF 73 Cd 13/10/2006 0,2 GF 74 Cd 13/10/2006 0 GF 75 Cd 13/10/2006 0,3 GF 76 Cd 13/10/2006 0,6 GF 77 Cd 13/10/2006 0,5 GF 78 Cd 13/10/2006 0,5 GF 79 Cd 13/10/2006 0,6 GF 80 Cd 13/10/2006 0,5 GF 81 Cd 13/10/2006 0,5 GF 82 Cd 13/10/2006 0,4 GF 83 Cd 13/10/2006 0 GF 84 85 Cd Cd 13/10/2006 13/10/2006 0,3 GF 0,4 GF metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale XV 86 Cd 13/10/2006 0,4 GF 87 Cd 13/10/2006 0,4 GF 88 Cd 13/10/2006 0,4 GF 89 Cd 13/10/2006 0,4 GF 90 Cd 13/10/2006 0,4 GF 91 Cd 13/10/2006 0,4 GF 92 Cd 13/10/2006 0,4 GF 93 Cd 13/10/2006 0,4 GF 94 Cd 13/10/2006 0,3 GF 95 Cd 13/10/2006 0,4 GF 96 Cd 13/10/2006 0,4 GF 97 Cd 13/10/2006 0,4 GF 98 Cd 13/10/2006 0,4 GF 99 Cd 13/10/2006 0,4 GF 100 Cd 13/10/2006 0,4 GF 101 Cd 13/10/2006 0,4 GF 102 Cd 13/10/2006 0,3 GF 103 Cd 13/10/2006 0,3 GF metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting XVI 104 Cd 27/10 0,3 GF 105 Cd 27/10 0,5 GF 106 Cd 27/10 0,2 GF 107 Cd 27/10 0,5 GF 108 Cd 27/10 1,1 GF 109 Cd 27/10 0,7 GF 110 Cd 27/10 0,5 GF 111 Cd 27/10 1,8 GF 112 Cd 27/10 1,4 GF 113 Cd 27/10 0,9 GF 114 Cd 27/10 0 GF 115 Cd 27/10 0,1 GF 116 Cd 27/10 0,2 GF 117 Cd 27/10 0,3 GF 118 Cd 27/10 0,3 GF 119 Cd 27/10 0,2 GF 120 Cd 27/10 0,2 GF 121 Cd 27/10 1,3 GF 122 Cd 27/10 0,8 GF Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting XVII 123 Cd 27/10 GF 124 Cd 27/10 0,1 GF 125 Cd 27/10 0,1 GF 126 Cd 27/10 0,1 GF 127 Cd 27/10 0,2 GF 128 Cd 27/10 0,3 GF 129 Cd 27/10 0,6 GF 130 Cd 27/10 0 GF 131 Cd 27/10 1,7 GF 132 Cd 27/10 0,1 GF 133 Cd 27/10 0,3 GF 134 135 Cd Cd 17/11 17/11 1,8 GF GF 136 Cd 17/11 0,8 GF 137 Cd 17/11 0,7 GF 138 Cd 17/11 0,8 GF 139 Cd 17/11 0,1 GF 140 Cd 12/01/2006 0,2 GF 141 142 Cd Cd 12/01/2006 12/01/2006 2 GF 2,8 GF Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting referentieplankton Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale XVIII 143 144 Cd Cd 12/01/2006 12/01/2006 1 GF GF 145 Cd 12/01/2006 1 GF 146 Cd 12/01/2006 0,2 GF 147 Cd 12/01/2006 1,4 GF 148 Cd 12/01/2006 1,4 GF 149 Cd 12/01/2006 1,4 GF 150 Cd 09/feb ICP-MS 151 Cd 09/feb ICP-MS 152 Cd 09/feb ICP-MS 153 Cd 09/feb ICP-MS 154 Cd 09/feb ICP-MS 155 Cd 09/feb ICP-MS 156 Cd 09/feb ICP-MS 157 Cd 09/feb ICP-MS 158 159 160 Cd Cd Cd 09/feb 09/feb 09/feb ICP-MS ICP-MS ICP-MS metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting referentieplankton Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting Gedestrueerde D. magna voor bepaling totale metaalbelasting blanco referentieplankton d=dood XIX Bijlage 4: Modellen voor de verdeling van metalen en inductie van MT Cd Zn-ligand Zn MTF/MTI Cd-ligand Zn-MTI MTF MT-expression Zn-MT Cd-MT + Zn-ligand Model voor gekoppelde MT-inductie en niet-specifieke doelliganden (onwenselijke metaalbinding door cadmium). Afkortingen: MT= metallothioneïne, MTF = metalresponsive transcription factor, MTI = metallothionein transcription inhibitor (Korsloot et al., 2004) XX Cu/Cd klein proteïne complex Cd opname Cu/Cd-MT Zn-small protein complex Plasmamembraan receptoren Ca2+ / Calm Zn-MT MAPK cAMP Free Zn Zn-MT opslag PKC 1 Zn-MTI 3 2 MTI/MRTF (s) Zn-MT recyclage 4 Jun/Fos MRTF(s) AP-1 Jun/Fos recycling Gene expression (Mtn/Mto) MRTF(s) recyclage MT (MTN/MTO) Extra metallothioneïne voor andere functies Speculatief model voor de “onafhankelijke” activatie van Drosophila metallothioneïne genen door cadmium. Route 1 = cellulaire koper/zink homeostasis. Route 1 naar 4 is waarschijnlijk door cadmium activeren van transcriptiefactoren. Route 2 leidt tot activatie van MRTFs via PKC. Route 3 = activatie leidt tot activatie van Jun/Fos via PKC. Route 4 = activatie van Jun/Fos via MAPK. Het model voorziet een systeem voor metaalspecifieke genexpressie. Discriminatie tussen de Mtn en Mto genen is afhankelijk van de specificiteit van de betrokken MRTFs. Deze zijn nog niet gekend bij Drosophila. Afkortingen: MT = metallothioneïne, Calm = calmodulin, cAMP = cyclisch adenosine monofosfaat, PKC = proteïne kinase C, MAPK = mitogen-activated protein kinase, MTI = metallothioneïne transcriptie inhibitor, MRTF = metal-responsive transcription factor, AP-1 = activator protein-1, Jun/Fos = componenten van AP-1, Mtn/Mto = genen voor de expressie van de MT’s bij Drosophila: MTN en MTO. (Korsloot et al., 2004). XXI Bijlage 5: Subcellulaire fractionatie Subcellulaire fracties in de cel met bijhorende sedimentatiecoefficiënten in Svedberg. XXII Bijlage 6: Methionine ‘pathway’ De methioninecyclus: groen: gestreepte pijlen stellen de tendens voor waarbij er een toename is in activiteit. rood: een dalende tendens in activiteit van de reactie. [1] MAT: MATIII is geactiveerd en MATI wordt geïnhibeerd door SAM (83,84). Eén vorm is transcriptioneel actief door glucocorticoïden (85). Hydrolyse van ATP zorgt voor de productie van anorganisch fosfaat (Pi) en pyrofosfaat (PPi); [2] guanidinoacetaat methyltransferase; [3] GNMT; [4] de algemene methyltransferase reactie, vetgedrukt [bijvoorbeeld X kan cytosine voorstellen in een CpG-dinucleotide, gemethyleerd door een DNMT]; [5] SAH hydrolase [6] betaïne-homocysteïne methyltransferase (deze reactie gebruikt een zinkcofactor); [7] methioninesynthase (MS); [8] serine hydroxymethyltransferase [samen met glycine en 5,10methylenetetrahydrofolaat (5,10-CH2THF), een molecule water wordt geproduceerd]; [9] MTHFR; [10] CBS; [11] cystathionine -lyase: na cleavage van cystathionine, ketobutyraat en cysteïne kunnen omgezet worden in verschillende stappen, tot respectievelijk succinyl co-enzyme A en pyruvaat. Pyruvaat is direct beschikbaar voor glucosesynthese, terwijl succinyl co-enzyme A eerst moet omgezet worden in oxaloacetaat; [12] L-arginine/glycine amidinotransferase. XXIII
