Waswater van sla als medium voor biofilmvorming door

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2015 – 2016
Waswater van sla als medium voor biofilmvorming door
Pediococcus pentosaceus en Pseudomonas aeruginosa
Len Verfaillie
Promotor: Prof. dr. ir. Katleen Raes
Tutor: Ir. Son Nguyen Huu
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van
Master in de industriële wetenschappen: Biochemie
AUTEURSRECHT
De auteur, de promotor en de tutor geven de toelating deze masterproef voor consultatie
beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik
valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met de verplichting
uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.
Meulebeke, januari 2016
De auteur,
Len Verfaillie
De promotor,
De tutor,
Prof. dr. ir. Katleen Raes
Ir. Son Nguyen Huu
I
WOORD VOORAF
Deze masterproef is de afsluiter van mijn masteropleiding Industriële Wetenschappen in de
Biochemie en vormt zo voor mij het einde van vier en een half jaren hoger onderwijs. Deze
werden gestart aan Howest, welke daarna overgegaan is naar Universiteit Gent Campus
Kortrijk. Graag wil ik iedereen bedanken die tijdens mijn opleiding bijgedragen heeft aan
deze zeer inspirerende, leerrijke en vooral zeer aangename jaren.
Een masterproef schrijven is geen individueel proces, daarom wil ik in het bijzonder mijn
promotor Katleen Raes bedanken. Ze gaf mij het vertrouwen dat nodig was om deze
masterproef te kunnen uitwerken in het Laboratorium voor Voedingsmicrobiologie en
Biotechnologie. Daarnaast zorgde haar constructieve feedback voor het bekomen van dit
eindresultaat.
Een groot woord van dank gaat uit naar mijn tutor Son Nguyen Huu. Niet enkel de
aangename samenwerking, de goede begeleiding en tips voor een goede lay-out, maar ook
zijn motiverende woorden hielpen dit tot stand te brengen.
Verder wil ik de rest van het onderwijzend en assisterend personeel bedanken om de
werking van het labo mogelijk te maken. In het bijzonder Elien Van de Vel, Annatachja De
Grande en Christophe Wille voor hun hulp bij het verwezenlijken van mijn masterproef.
Ook wil ik de andere masterstudenten bedanken voor het aangename gezelschap in het labo
tijdens de vele experimenten. A special word of thanks goes out to Ebru for helping me with
some experiments and for her guiding in the beginning of my thesis.
Tot slot bedank ik mijn ouders voor de vele steun en het mogelijk maken om deze studies te
volgen en mijn vriendin Charlotte voor het nalezen en haar motiverende woorden als het
even moeilijker was.
Dan rest mij alleen nog u veel leesplezier te wensen.
II
INHOUDSOPGAVE
Auteursrecht ........................................................................................................................... I
Woord Vooraf ........................................................................................................................ II
Inhoudsopgave ..................................................................................................................... III
Lijst van afkortingen .............................................................................................................. V
Summary .............................................................................................................................. VI
Samenvatting ......................................................................................................................VII
Inleiding ................................................................................................................................. 1
I.
Literatuurstudie ........................................................................................................... 3
1.
Biofilms ................................................................................................................... 3
1.1.
1.1.1.
Polysachariden.......................................................................................... 4
1.1.2.
Nucleïnezuurketens .................................................................................. 4
1.1.3.
Pili ............................................................................................................. 5
1.1.4.
Vetten ....................................................................................................... 5
1.1.5.
Mineralen .................................................................................................. 5
1.1.6.
Proteïnen .................................................................................................. 5
1.1.7.
Humusstoffen ............................................................................................ 5
1.2.
2.
Vorming van een biofilm ................................................................................... 6
1.2.1.
Initiële vasthechting ................................................................................... 6
1.2.2.
Maturatie ................................................................................................... 7
1.2.3.
Dispersie ................................................................................................... 7
Eigenschappen van de gebruikte micro-organismen ............................................... 9
2.1.
Pseudomonas aeruginosa ................................................................................ 9
2.2.
Pediococcus pentosaceus ...............................................................................10
3.
Waswater van sla ...................................................................................................12
4.
Modelsystemen voor biofilmvorming ......................................................................14
4.1.
Batch systemen...............................................................................................14
4.1.1.
Microtiterplaat ..........................................................................................14
4.1.2.
Calgary Biofilm Device .............................................................................14
4.2.
II.
Bouwstoffen van een biofilm............................................................................. 3
Dynamisch systeem ........................................................................................15
4.2.1.
Centers for disease control biofilm reactor ...............................................15
4.2.2.
Modified Robbins Device ..........................................................................17
4.2.3.
Flow cel ....................................................................................................17
Materiaal en methoden ..............................................................................................20
III
1.
Microbiologie ..........................................................................................................20
1.1.
Bereiding inoculum ..........................................................................................20
1.2.
Batch opstelling ...............................................................................................21
1.2.1.
Biofilmvorming in ideale omstandigheden ................................................21
1.2.2.
Biofilmvorming in waswater van sla ..........................................................22
1.3.
Dynamisch systeem ........................................................................................23
1.3.1.
2.
3.
III.
1.
Chemische analyses ..............................................................................................25
2.1.
Koolhydraten ...................................................................................................25
2.2.
Uronzuren .......................................................................................................26
2.3.
Proteïnen ........................................................................................................26
Statistische data-analyses ......................................................................................27
Resultaten ..............................................................................................................28
Batch opstelling ......................................................................................................28
1.1.
3.
IV.
V.
Pseudomonas aeruginosa ...............................................................................28
1.1.1.
Microbiologie ............................................................................................28
1.1.2.
pH verloop................................................................................................31
1.1.3.
Chemische analyse ..................................................................................32
1.2.
2.
Biofilmvorming in verschillende media ......................................................24
Pediococcus pentosaceus ...............................................................................33
1.2.1.
Microbiologie ............................................................................................34
1.2.2.
pH verloop................................................................................................36
1.2.3.
Chemische analyse ..................................................................................37
Dynamisch systeem ...............................................................................................39
2.1.
Microbiologie ...................................................................................................39
2.2.
pH verloop.......................................................................................................40
2.3.
Chemische analyse .........................................................................................41
Invloed van het oppervlak op de detectie van de chemische componenten ............43
3.1.
Pseudomonas aeruginosa ...............................................................................43
3.2.
Pediococcus pentosaceus ...............................................................................44
Discussie ................................................................................................................45
Conclusie ...................................................................................................................50
Referenties ...........................................................................................................................52
Bijlage 1 ................................................................................................................................ 1
Bijlage 2 ................................................................................................................................ 2
Bijlage 3 ................................................................................................................................ 3
IV
LIJST VAN AFKORTINGEN
BCCM
Belgian co-ordinated collections of micro-organisms
BHI
Brain hart infusion broth
BSA
Bovine serum albimine
CDCBR
Centrers for disease control biofilm reactor
CLSM
Confocal laser scanning microscopy
DL
Detectielimiet
DMSO
Dimethyl sulfoxide
EPS
Extracellulaire polymere substantie
KVE
Kolonie vormende eenheden
MHDF
m-hydroxydifenyl
MO
Micro-organisme
MRS
De Man, Rogosa & Sharp broth
NG
Niet getest
OD
Optische densiteit
PAB
Pseudomonas agar base
PCA
Plate count agar
PSM
Pediococcus selectief medium
RPM
Revolutions per minute (toeren per minuut)
SLWW
Standardized lettuce wash water
V
SUMMARY
The existence of biofilms was first reported by Costerton et al. (1977). Since then a lot of
research was performed investigating the possibility of bacteria to form a biofilm. Within the
food industry there has recently been an increased interest for biofilms, because bacteria in
biofilms are more difficult to remove compared to planktonic bacteria. Therefore, more
research is going on studying the efficient removal of biofilms. This is only possible if there is
sufficient understanding on how biofilms are developed and how the environment influences
the development of biofilms (Blaschek et al., 2007, Chmielewski & Frank, 2003, Wong,
1998).
In order to fill this knowledge gap, this thesis is focused on the formation of biofilms in nonideal conditions for the bacteria. More specifically, this research is focused on the formation
of biofilms by Pseudomonas aeruginosa and Pediococcus pentosaceus in lettuce wash water
at a temperature of 8°C. Furthermore, the influence of the initial concentration of bacteria
was studied on the development of the biofilm.
In the initial phase of this research, the biofilm formation was studied in a batch system with
incubations in ideal medium and ideal temperature to have a reference for the non-ideal
conditions. Next, incubations in autoclaved lettuce wash water were done with an inoculation
of 6 and 2 log of the bacteria and incubated at 8°C. In the last phase of the batch experiment,
incubations in non-autoclaved lettuce wash water were performed, which not only contained
the inoculated bacteria but also the bacteria that were naturally present on the butterhead
lettuce (Lactuca sativa).
In the second phase of this research, incubations were performed in a dynamic system with
Ps. aeruginosa in three different conditions. To confirm the formation of biofilm, biofilm
samples were taken for measuring the colony forming units and chemical analyses were
performed to check the presence of carbohydrates, proteins and uronic acids.
Under ideal conditions, we found that both bacteria were able to form a biofilm in the batch
system, in which both were attached to the stainless steel plate. Mainly proteins were found
as a component of the exopolysaccharide layer. Under the same conditions, there was also a
good growth in the dynamic system. Moreover, the protein concentration was higher in the
dynamic system compared to the batch system and most notably was the detection of
carbohydrates, which could not be found previously in the batch system.
In the autoclaved wash water both bacteria showed less growth and biofilm formation
compared to the ideal circumstances. Also lower concentrations of proteins were measured
in the biofilm. The incubation in the dynamic system gave a higher concentration of attached
bacteria compared to the ideal media, but the concentration of chemical components was
lower.
In the non-autoclaved wash water the inoculated bacteria didn’t show a large impact on the
biofilm formation, but in both systems a biofilm was formed which contained all three of the
chemical components.
The lower inoculation strength showed a slower development, both planktonic and in the
biofilm, but P. pentosaceus was well able to start growing and in one case reached the same
concentrations as the higher inoculation strength at the same time point of incubation.
VI
SAMENVATTING
Biofilms werden voor het eerst gerapporteerd door Costerton et al. (1977). Sindsdien is er
veel onderzoek uitgevoerd naar de mogelijkheid van bacteriën om een biofilm te gaan
vormen. Binnen onder andere de voedingsindustrie is recent de aandacht voor biofilms sterk
toegenomen doordat bacteriën in een biofilm veel moeilijker te bestrijden zijn dan gewone,
planktonische bacteriën. Daarom wordt er volop onderzoek gedaan naar hoe een biofilm
efficiënt kan verwijderd worden. Om dit te kunnen moet er eerst gekeken worden naar hoe
een biofilm zich vormt en of de omgeving een invloed heeft op hoe een biofilm zich
ontwikkeld (Blaschek et al., 2007, Chmielewski & Frank, 2003, Wong, 1998).
Met deze masterproef werd dan ook beoogd om meer inzicht te verwerven in hoe een biofilm
zich gaat ontwikkelen in niet-ideale omstandigheden voor de bacteriën. Meer specifiek was
dit onderzoek gericht op de biofilmvorming van Pseudomonas aeruginosa en Pediococcus
pentosaceus in waswater van sla bij een temperatuur van 8°C. Bijkomend werd er ook
gekeken of de initiële concentratie aan bacteriën een invloed heeft op de biofilmvorming.
In het eerste luik van het onderzoek werd de biofilmvorming opgevolgd in een batch
systeem, waarbij er eerst incubaties werden uitgevoerd in ideaal medium geïncubeerd bij de
ideale temperaratuur om een referentie te hebben. Vervolgens werd er geïncubeerd in
geautoclaveerd sla waswater dat geënt werd met zowel log 6 en log 2 van de bacteriën met
incubatie bij 8°C. De laatste test was de incubatie in niet-geautoclaveerd waswater, waarin er
naast de geënte bacteriën ook de bacteriën aanwezig zijn die van nature voorkomen op de
botersla (Lactuca sativa). In het tweede luik van het onderzoek werd een dynamisch systeem
gebouwd, waarin hogere stroomsnelheden waren en waarin er verversing van het medium
plaatsvond. Dit systeem werd getest met Ps. aeruginosa in de drie verschillende media. Om
de biofilmvorming te controleren, werden het aantal KVE bepaald en chemische analyses
uitgevoerd waarin gezocht werd naar koolhydraten, proteïnen en uronzuren.
In ideale omstandigheden waren beide bacteriën in staat om een biofilm te gaan vormen in
het batch systeem. Er werden zowel vastgehechte bacteriën aangetroffen op de inox plaatjes
en vooral proteïnen gedetecteerd. Ook in het dynamische systeem was er een goede
biofilmvorming, waarbij het vooral opviel dat er naast een hogere concentratie aan proteïnen
ook koolhydraten werden gedetecteerd.
In het geautoclaveerde waswater vertoonden beide bacteriën een verminderde
biofilmvorming, wat vooral tot uiting kwam door een veel lagere productie van proteïnen. In
het dynamisch systeem was er echter meer biofilmvorming onder deze omstandigheden. Er
was een hogere concentratie aan vastgehechte bacteriën dan in ideale omstandigheden,
maar wel een iets lagere concentraties aan chemische componenten.
Bij het niet-geautoclaveerde waswater hadden de geënte bacteriën weinig impact op de
biofilmvorming, die wel in beide systemen vrij goed was. Er was bij ieder experiment detectie
van alle drie de chemische componenten.
Bij een lagere entingsconcentratie was er een tragere ontwikkeling van de biofilm, maar
vooral P. pentosaceus was in staat om uit te gaan groeien en een biofilm te ontwikkelen.
VII
INLEIDING
In de voedingsindustrie wordt er de laatste jaren veel aandacht besteed aan de
aanwezigheid van biofilms op de verwerkingsapparatuur en in de productverpakking. Het
probleem bij biofilms is dat deze zich stevig kunnen vasthechten aan een oppervlak en
moeilijk te verwijderen zijn. Hierdoor kunnen ze een constante bron van contaminatie
vormen, waardoor het gevaar voor voedselinfecties en –vergiftiging toeneemt. Ze zijn binnen
een productieomgeving ongewenst, aangezien een bedrijf door een uitbraak van
voedselinfecties of –vergiftiging grote imago en economische schade kunnen oplopen. Een
goede kennis over de vorming, ontwikkeling en bestrijding van een biofilm is daarom
noodzakelijk. Daarnaast is het van belang om te weten of de bacteriën die van nature
aanwezig zijn op een product in staat zijn om een biofilm te ontwikkelen (Chmielewski &
Frank, 2003, Van Houdt & Michiels, 2010).
Momenteel is er al heel wat onderzoek verricht naar biofilmvorming, waardoor er van veel
organismen geweten is of ze al dan niet biofilms kunnen vormen. Deze onderzoeken
gebeuren echter meestal in ideale omstandigheden voor de bacteriën, maar deze
omstandigheden gaan binnen een voedingsbedrijf zo goed als nooit voorkomen. In de
realiteit worden de bacteriën blootgesteld aan verschillende stressfactoren, zoals een te lage
of te hoge temperatuur, gelimiteerde aanvoer van nutriënten, welke dan meestal ook niet de
ideale nutriënten zijn voor dat organisme. Verder worden de meeste experimenten
uitgevoerd met reinculturen, waarbij er gekeken wordt naar de vorming van biofilms
geproduceerd door één of twee gekende organismes, wat in realiteit bijna nooit voorkomt.
Door het bestuderen van reinculturen in verschillende omstandigheden kan biofilmvorming
door dat organisme aangetoond worden.
Om deze reden wordt binnen deze masterproef gekeken naar de ontwikkeling van biofilms in
niet-ideale omstandigheden van de melkzuurbacterie Pediococcus pentosaceus en het
opportunistisch pathogeen Pseudomonas aeruginosa. Meer specifiek worden deze bacteriën
opgekweekt in waswater van sla bij een temperatuur van ongeveer 8°C.
In een eerste fase van het onderzoek wordt een batchsysteem gebruikt om de
biofilmvorming te bestuderen. Hierbij is er geen aan- of afvoer van nutriënten. Dit experiment
wordt eerst uitgevoerd in ideale omstandigheden, om zo met andere omstandigheden te
vergelijken. Voor de niet-ideale omstandigheden wordt het waswater geautoclaveerd, waarbij
enkel de geënte bacteriën gaan groeien. In een later experiment wordt het waswater niet
meer geautoclaveerd, waardoor er een multispecies biofilm gevormd kan worden. Deze
worden met elkaar en met de resultaten van de groei in ideale omstandigheden vergeleken.
Daarnaast wordt er gekeken naar de invloed van twee verschillende inoculumsterktes.
In een tweede fase van het onderzoek wordt de biofilmvorming in een dynamisch systeem
bestudeerd, wat meer overkomt met de realiteit.
Om de aanwezigheid van een biofilm te bevestigen worden naast uitplatingen van de
bacteriën aanwezig in de biofilm ook chemische analyses uitgevoerd. Bij deze analyses
wordt gezocht naar kenmerkende componenten voor een biofilm, namelijk suikers, proteïnen
en uronzuren.
Uiteindelijk zal dit onderzoek een duidelijk inzicht moeten geven of P. pentosaceus en Ps.
aeruginosa al dan niet biofilms kunnen vormen in niet-ideale omstandigheden, zoals in het
waswater van sla bij een temperatuur van 8°C.
2
I.
Literatuurstudie
1.
Biofilms
In de natuur kunnen bacteriën niet enkel voorkomen als losse of planktonische bacteriën,
maar ook onder een sessiele vorm. Bij de eerste vorm bestaan de bacteriën uit
onafhankelijke, alleenstaande cellen terwijl bij de tweede vorm deze bacteriën georganiseerd
zijn in een niet-voortbewegende verzameling. De sessiele vorm vertoont andere
eigenschappen dan de planktonische vorm, wat zich uit in onder andere verschillen in
groeisnelheid, gentranscriptie en tolerantie tegen antibiotica. Tijdens de sessiele vorm
vormen vele bacteriën een biofilm als verdedigingsstrategie tegen ongunstige
omstandigheden. Een biofilm kan gedefinieerd worden als een gestructureerde aggregatie
van micro-organismen die ingesloten zijn in een slijmerige laag van eigen geproduceerde
exopolymeren en vastgehecht zijn aan een inert of levend oppervlak. Bacteriële biofilms
kunnen verschillende problemen met zich meebrengen. In de voedingsindustrie kunnen ze
een continue bron van besmetting vormen, aangezien biofilm-geassocieerde bacteriën
langzaam maar zeker worden vrijgesteld. Tevens kunnen ze aanleiding geven tot
voedselinfecties, voedselbederf en een verkorte levensduur van de apparaten. Ook in de
medische wereld kunnen ze problemen veroorzaken door bijvoorbeeld vast te hechten aan
katheders en implantaten (Chmielewski & Frank, 2003, Van Houdt & Michiels, 2010).
1.1.
Bouwstoffen van een biofilm
In een biofilm worden de bacteriën samengehouden door een extracellulaire matrix die ze
zelf produceren. Deze matrix zorgt voor de vasthechting aan het oppervlak en zorgt ervoor
dat de bacteriën in een biofilm resistenter zijn dan de vrij levende planktonische cellen tegen
bijvoorbeeld verschillende reiniging- en desinfectiebehandelingen en tegen de inwerking van
verschillende omgevingsfactoren, zoals temperatuur, pH, voedingsstoffen en wateractiviteit.
Verder slaat de matrix water op, waardoor de bacteriën voldoende vocht behouden. Ook
gaan er geleidelijk aan verschillende lagen gevormd worden met een ander zuurstofgehalte.
De matrix bestaat uit een mengsel van verschillende polymere stoffen die benoemd wordt als
extracellulaire polymere substantie (EPS) (Vu et al., 2009).
De EPS is opgebouwd uit een complexe mengeling van suikers, proteïnen, nucleïnezuren,
lipiden en humusstoffen. De structuur, samenstelling en gevormde hoeveelheid EPS van de
biofilm matrix is sterk variërend en hangt af van de aanwezige species in de biofilm en hun
fysiologische status, de aanwezige nutriënten en de omgevingsfactoren, alsook van de
ouderdom van de biofilm. Zo bestaat de EPS van Acidithiobacillus ferrooxidans uit neutrale
suikers, vooral rhamnose, fructose en glucose (Vu et al., 2009), terwijl bij Salmonella
Typhimurium en Escherichia coli cellulose een belangrijke component is in de EPS (Branda
et al., 2005). De belangrijkste componenten worden in de volgende paragraven besproken.
De EPS bepaalt voor het grootste deel de structuur die binnenin de biofilm gevormd wordt.
Binnen de structuur ontstaan waterkanalen, welke de volledige biofilm van water,
voedingsstoffen, zuurstof en metaalionen voorzien. De EPS zelf kan ook nutriënten
vasthouden, zodat de bacteriën nog een tijd kunnen overleven als er een tekort is aan
nutriënten van buitenaf (Chmielewski & Frank, 2003).
3
1.1.1.
Polysachariden
Polysachariden zijn bij veel bacteriën een belangrijk onderdeel van de EPS. Deze suikers
kunnen onder twee vormen voorkomen. De eerste vorm omsluit het micro-organisme (MO)
stevig, laat de vorming van verschillende lagen toe en houdt andere partikels buiten. De
stevigheid wordt verkregen door specifieke interacties van de sachariden met Ca2+ of Sr2+,
een eigenschap die ook vaak gebruikt wordt bij de immobilisatie van cellen en enzymen.
Indien deze vorm van insluiting voorkomt, worden de gevormde structuren capsules
genoemd. In het andere geval is er een makkelijkere vervorming mogelijk en is de
aanhechting aan het oppervlak ook minder sterk. Andere deeltjes, zoals voedingsstoffen,
zullen makkelijker opneembaar zijn in deze matrix. Deze vorm van suikers wordt met de term
slijm aangeduid. Deze vorm ontstaat doordat de polysachariden geacetyleerd zijn, waardoor
de interacties tussen de ketens en de kationen geïnhibeerd worden. Welke vorm er wordt
aangemaakt, hangt af van het type bacterie en ook de omgeving waarin de biofilm zich
bevindt. De polysachariden zijn vooral van belang bij het vasthechten van de bacteriën aan
het oppervlak, maar bieden verder ook bescherming voor de bacteriën (Sutherland, 2001,
Van Houdt & Michiels, 2010).
Een deel van de koolhydraten kunnen aanwezig zijn onder de vorm van uronzuren. Dit zijn
suikers waarvan de terminale hydroxylgroep geoxideerd is naar een carboxylgroep. Deze
groep is geladen, waardoor het mogelijk is om interacties aan te gaan met bivalente
kationen, zoals magnesium en kalium. Ze zijn in de eerste plaats afvalproducten van het
metabolisme van de bacteriën, maar door de optredende interacties worden de
polysachariden beter met elkaar verbonden, wat een sterkere samenhang van de biofilm
oplevert. Uronzuren zijn niet volledig specifiek voor biofilms, maar wel specifieker dan
koolhydraten en proteïnen. Ze kunnen dienen als indicator voor de aanwezigheid van een
biofilm (zie II.2) (Flemming & Wingender, 2010, Kokare et al., 2009).
1.1.2.
Nucleïnezuurketens
Het aanwezige extracellulaire DNA (eDNA) is afkomstig van het DNA van bacteriën die
afgestorven zijn en lyse hebben ondergaan. De ketens worden niet aangemaakt en dus ook
niet buiten de cel gebracht door levende bacteriën. Het DNA kan een aanzienlijke
hoeveelheid uitmaken van de opbouw van biofilms, soms tot 10% van de totale organische
stoffen in de EPS. Er wordt dus verondersteld dat ze een belangrijke rol spelen in het
opbouwen en behouden van de structuur van de biofilm (Costerton, 2006). De aanwezigheid
van dit DNA zal ook de horizontale transfer van genen tussen bacteriën bevorderen.
Hierdoor worden eigenschappen veel sneller doorgegeven tussen de bacteriën in de biofilm
dan tussen planktonische bacteriën (Flemming & Wingender, 2010).
4
1.1.3.
Pili
Pili vormen een verbinding tussen de zustercellen na splitsing. Door opeenvolgende
splitsingen ontstaan microkolonies binnen de biofilm. Pili helpen bij het organiseren van de
cellen binnen de microkolonies en vormen een netwerk dat lijkt op de microtubuli en de
microfilamenten van het cytoskelet in een eukaryotische cel. Ze versnellen ook de
horizontale overdracht van genen, een fenomeen dat binnen een biofilm tot 1000 keer meer
voorkomt dan bij planktonische cellen (Costerton, 2006).
1.1.4.
Vetten
Binnen de matrix van de biofilm zijn er bepaalde vetzuren aanwezig. Sommige hebben
waarschijnlijk een boodschappersfunctie. Zo werd cis-2-deceenzuur gelinkt aan het
induceren van dispersie van biofilms gevormd door verschillende MO. Een ander deel van de
vetzuren zijn afkomstig van de afbraak van het celmembraan van afgestorven cellen
(Flemming & Wingender, 2010).
1.1.5.
Mineralen
Onderzoek heeft aangetoond dat in sommige biofilms elementen gecomplexeerd worden tot
amorfe of kristallijne mineralen. Deze elementen worden opgeconcentreerd vanuit zeer
kleine concentraties, zowel door passieve adsorptie of door het metabolisme van de MO.
Doordat de celwanden van de MO en de geproduceerde EPS meestal negatief geladen zijn
kunnen ze kationen, zoals metalen, aantrekken en opnemen in de matrix, waar dan de
vorming van mineralen plaatsvindt. De aangetroffen mineralen zijn afhankelijk van de
omgeving waarin de biofilm zich vormt omdat deze allemaal moeten opgenomen worden uit
de omgeving (Brown et al., 1994).
1.1.6.
Proteïnen
Binnen een biofilm worden verschillende proteïnen aangetroffen, zoals amyloïden en lectine.
Ze hebben verschillende functies, zo helpen ze bij het samenhouden van de biofilm. Hun
grootste belang ligt echter bij het uitvoeren van enzymatische activiteiten. Zo zijn er enzymen
aanwezig die de opgenomen macromoleculen afbreken, en zo voedingsstoffen vormen voor
de MO. Bij oudere biofilms kunnen enzymen aanwezig zijn die EPS afbreken, om zo MO vrij
te zetten en voor verspreiding van de MO te zorgen. Verder zijn er proteïnen aanwezig die
optreden als elektrondonor of –acceptor, om zo redox activiteit in de matrix mogelijk te
maken. Hierdoor kunnen opgenomen stoffen in de EPS gereduceerd worden tot stoffen die
opneembaar zijn voor de bacteriën (Flemming & Wingender, 2010).
1.1.7.
Humusstoffen
Humusstoffen zijn een verzameling van stoffen die gevormd worden door onvolledige
afbraak en transformatie van organische stoffen. Deze stoffen bestaan vooral uit
aromatische ringen met hierop verschillende functionele groepen, hoofdzakelijk komen
carbonzuurfuncties en hydroxylgroepen voor. Meestal hebben humusstoffen een zuur
karakter waardoor ze vaak aangeduid worden als humuszuren. Een mogelijke functie is als
elektrondonor of –acceptor binnen de matrix (Flemming & Wingender, 2010, Vu et al., 2009).
5
1.2.
Vorming van een biofilm
De nu aanvaarde vormgeving voor een biofilm is een soort van champignonachtige structuur
(Figuur 1). Deze vorm ontstaat doordat na deling het nieuw gevormde MO niet loskomt van
de moedercel maar blijft hangen in de EPS matrix. Dit model is er op gebaseerd dat de groei
aan de buitenkant sneller gaat dan aan de binnenkant, omdat er aan de binnenkant minder
zuurstof en nutriënten beschikbaar zijn. In de binnenkant van de biofilm kan er na een tijd
zelfs een anaeroob milieu ontstaan, waardoor ook de groei van anaerobe bacteriën mogelijk
wordt binnenin de biofilm. Hierdoor kunnen er doorheen de biofilm vele verschillende milieus
voorkomen, afhankelijk van de toevoer van nutriënten en zuurstof. In de binnenkant komen
er meerdere bacteriën voor die gaan leven van afvalstoffen geproduceerd door andere
bacteriën. Dankzij deze symbiotische samenwerking tussen de verschillende bacteriën kan
er binnen één biofilm een grote diversiteit zijn in metabolisme en dus ook in bacteriën.
Biofilms die bestaan uit meerdere species zijn over het algemeen dikker en stabieler dan
deze die bestaan uit enkelvoudige species. Het is ook mogelijk dat er in een biofilm bacteriën
opgenomen worden die op zichzelf niet in staat zijn om een biofilm te vormen, waardoor hun
risico kan onderschat worden. Eenmaal in de biofilm zijn de bacteriën namelijk grotendeels
beschermd tegen desinfectantia (Blaschek et al., 2007, Chmielewski & Frank, 2003).
Tijdens de vorming van een biofilm kunnen er vijf grote stappen onderscheiden worden. Als
eerste is er een initiële, zwakke vasthechting, die na verloop van tijd sterker wordt en zo de
bacteriën stevig aan het oppervlak vastmaakt. Vanaf deze stevige basis zal de biofilm zich
verder gaan ontwikkelen. Uiteindelijk gaat een deel van deze bacteriën zich gaan
verspreiden, waardoor deze op andere plaatsen een nieuwe biofilm kunnen vormen
(Marchand et al., 2012). De overgang tussen de verschillende fases wordt geïnduceerd door
quorum sensing. Quorum sensing is een vorm van communicatie tussen bacteriën onderling.
Bacteriële cellen produceren namelijk signaalmoleculen en kunnen deze ook gaan
detecteren. Dit zorgt ervoor dat de volledige bacteriële populatie eenzelfde actie start op het
ogenblik dat de signaalmoleculen een bepaalde kritische concentratie bereiken
(Haesebrouck et al., 2007). In de volgende paragraven worden de verschillende fases van
biofilmvorming verder besproken.
1.2.1.
Initiële vasthechting
De vasthechting van de eerste bacteriën aan een oppervlak wordt getriggerd door
verschillende omgevingsfactoren en fysische triggers (Figuur 1, 1). Een paar gekende
triggers zijn quorum sensing, tekort aan voedingsstoffen en stress door temperatuur, druk en
pH. Tevens kunnen de eigenschappen van het oppervlak een belangrijke rol spelen (Batt &
Tortorello, 2014, Marchand et al., 2012).
De eigenlijke vasthechting kan passief of actief gebeuren (Figuur 1,2). De passieve
vasthechting wordt gedreven door zwaartekracht, diffusie en vloeistofdynamiek. De actieve
vasthechting gebeurt vooral door verschillende cel eigenschappen, zoals flagella, pili,
vasthechtingsproteïnen en oppervlakteladingen.
De eerste vasthechting kan vrij snel gaan, maar kan nog steeds reversibel zijn. Deze vorm
van vasthechting gebeurt vooral door zwakke krachten, zoals van der Waals of
elektrostatische krachten. Hydrofobe interacties spelen hierin mogelijk ook een rol.
6
Eenmaal er een reversibele aanhechting is, kan er overgegaan worden naar een
irreversibele vasthechting. Dit gebeurt door verankering van de bacteriën en/of door de
productie van EPS. Deze stevigere vorm van aanhechting zal meestal verkregen worden een
paar uur na de initiële aanhechting. De verankering gebeurt door een dipool-dipool interactie,
waterstofbindingen, hydrofobe of covalente bindingen tussen de uitsteeksels op de cellen en
het oppervlak. Deze uitsteeksels kunnen pili, flagella of adhesieproteïnen zijn. Dit gaat
meestal gepaard met een beperkte EPS productie (Blaschek et al., 2007, Chmielewski &
Frank, 2003, Gilbert et al., 1991, Hood & Zottola, 1997, Madigan et al., 2010).
1.2.2.
Maturatie
Eenmaal de bacteriën goed vastgehecht zijn aan het oppervlak en de omstandigheden het
toelaten, beginnen de bacteriën zich te vermeerderen en worden er meer EPS
geproduceerd. In de eerste fase zullen er zich meerdere microkolonies gaan vormen (Figuur
1, 3). De kleine kolonies beginnen met de paar bacteriën die zich vastgehecht hebben. Ze
ontstaan doordat de dochtercellen zich niet gaan losmaken van elkaar, maar door de EPS
samenblijven. De EPS kunnen vrij kleverig zijn, waardoor er ook nieuwe bacteriën kunnen
aangetrokken en vastgezet worden in de bestaande kolonies.
Door het groeien van de verschillende kolonies naast elkaar beginnen ze te overlappen en
wordt de structuur van de biofilm gevormd (Figuur 1,4) (Blaschek et al., 2007, Chmielewski &
Frank, 2003, Madigan et al., 2010).
1.2.3.
Dispersie
Eenmaal de biofilm groter wordt, bestaat de mogelijkheid dat stukken ervan gaan loskomen
of losse bacteriën uit de biofilm treden en zich op een andere plaats terug gaan vasthechten
om daar een nieuwe biofilm te vormen (Figuur 1, 5). Dit loskomen ontstaat doordat er vlak bij
het oppervlak lagere stroomsnelheden zijn, waardoor de biofilm niet aan te grote externe
krachten wordt blootgesteld. Als de biofilm aangroeit, gaan de uitstekels verder van het
oppervlak weggaan waardoor er grotere krachten op inwerken en afscheuring mogelijk is.
Indien delen van de biofilm loskomen zijn de MO nog steeds ingebed in EPS, waardoor
nieuwe aanhechting sneller zal optreden en de bacteriën beschermd blijven. Als er niet op
tijd ingegrepen wordt, kan een biofilm sterk gaan uitbreiden en mogelijk voor problemen
zorgen op vlak van de voedselveiligheid (Blaschek et al., 2007, Chmielewski & Frank, 2003,
Madigan et al., 2010). De tijd die nodig is om de maximale populatiedensiteit te bereiken, en
dus een steady state situatie te verkrijgen, is meestal vrij lang. Dit kan tot enkele maanden
duren. Bij het uitplaten zal er na een tiental dagen meestal geen toename meer zichtbaar zijn
in het aantal kolonievormende eenheden (KVE). ATP metingen toonden echter aan dat na
enkele maanden nog steeds geen steady state situatie verkregen werd. Een mogelijke
verklaring hiervoor is dat een groot deel van de bacteriën zich niet meer in een opkweekbare
staat bevinden, waardoor via uitplating geschat wordt dat maar maximum 1% van de
bacteriën in een biofilm terug gevonden wordt (Batt & Tortorello, 2014).
7
Figuur 1: De vorming van een biofilm. 1) Initiële reversibele vasthechting, 2) irreversibele vasthechting, 3)
micro-kolonievorming en productie van EPS, 4) maturatie en 5) dispersie (Marchand et al., 2012)
8
2.
Eigenschappen van de gebruikte micro-organismen
2.1.
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa maakt deel uit van het genus Pseudonomas, welke behoort bij de
familie van Gram-negatieve gamma-proteobacteriën (Tabel 1).
Tabel 1: Taxonomie van Pseudomonas aeruginosa (Life, 2013b)
Pseudomonas aeruginosa is een opportunistisch pathogeen die vaak aangetroffen wordt op
fruit, groenten, vlees, eieren, zeevruchten en melkproducten waar het een bederver is.
Tevens kan het aanwezig zijn in flessen mineraalwater, waarbij dit MO al enkele keren
bevestigd is als de veroorzaker voor uitbraken. Afhankelijk van de plaats van infectie kunnen
er verschillende symptomen optreden, zoals pneumonia bij infectie van de luchtwegen en
meningitis of hersentumoren bij infectie van het centrale zenuwstelsel. Het MO kan in vrij
grote hoeveelheden aanwezig zijn op oppervlakken doordat ze geen organische
groeifactoren nodig hebben. Door deze eigenschap zijn ze vaak in staat om de andere
aanwezige bacteriën weg te concurreren door sneller te groeien. Ze zijn dus in staat om in
de plaats van koolhydraten andere componenten, zoals aminozuren, lipiden, peptiden en
proteïnen te gebruiken als koolstofbron. Om deze te kunnen gebruiken produceren ze
proteases, lipases en pectinases. Deze enzymen zijn in staat om het oppervlak groenten en
fruit af te breken, wat aanleiding geeft tot bederf van het product. Door de afbraak van
eiwitten is ook de productie van ammoniak mogelijk, waardoor de pH van het medium stijgt.
Ps. aeruginosa wordt aangetroffen in omgevingen met een pH range tussen 4,5 en 9,5.
Buiten deze range wordt er dus verondersteld dat er geen groei meer zal optreden. De
normale manier om de houdbaarheid van producten te verlengen is door te koelen, wat voor
Ps. aeruginosa een vrij efficiënte methode is. Ps. aeruginosa vormt namelijk een
uitzondering binnen het Pseudomonas geslacht doordat het amper in staat is om te groeien
bij lage temperaturen. De bacterie maakt vaak ook deel uit van de normale huidflora en komt
vrij veel voor in ziekhuisomgevingen, waar infectie makkelijk plaats kan vinden via wonden.
Ps. aeruginosa maakt deel uit van de groep MO die bekend staan als ziekenhuisbacteriën.
Er zijn verschillende species die resistent zijn tegen veel gebruikte antibiotica, wat bestrijding
al moeilijk maakt. Daarnaast zijn ze ook bekende biofilmvormers, waardoor deze bacteriën
moeilijk te verwijderen zijn, eenmaal aanwezig. Wel zijn ze vrij makkelijk te deactiveren door
te verhitten of door ze in een zure omgeving te brengen (Batt & Tortorello, 2014, Klein et al.,
2009, Lawley et al., 2012, Lessnau, 2014, Madigan et al., 2010).
9
Van Ps. aeruginosa werd er vaak van uitgegaan dat het grootste deel van de koolhydraten
die aanwezig zijn in de biofilm onder de vorm van alginaat voorkomen. Dit werd grotendeels
weerlegd toen er geen duidelijk verschil in biofilmvorming waargenomen werd na het
verwijderen van het gen voor de productie van alginaat. Nieuw onderzoek toonde aan dat er
twee koolhydraat rijke polymeren aangemaakt worden door 2 verschillende genen die een
belangrijk onderdeel vormen in de structuur van de biofilm. Het ene polymeer is opgebouwd
op basis van vooral glucose, de andere voornamelijk uit mannose en galactose. De
hoeveelheden en verhouding die aangemaakt worden verschillen sterk tussen de
verschillende species (Branda et al., 2005, Friedman & Kolter, 2004, Jackson et al., 2004,
Ryder et al., 2007).
De gebruikte streng (LMG 28185, BCCM) voor dit onderzoek, oorspronkelijk afkomstig uit de
baai van Bengal in India, vertoont een optimale groei bij 37°C op Tryptone Soya Agar in
aanwezigheid van zuurstof en is een bevestigde biofilmvormer. Doordat het MO een
opportunistische pathogeen is werd het ingedeeld bij de L2 biohazard groep, waardoor er
extra voorzorgsmaatregelen moeten genomen worden bij het gebruik van dit MO.
Pseudomonas aeruginosa vertoont een strikt aerobe groei, waardoor zijn groei makkelijk
tegen te gaan is door te werken met een gemodificeerde gas samenstelling in de verpakking.
Pseudomonas aeruginosa is wel een uitzondering binnen de Pseudomonas familie,
aangezien deze normaal weinig of geen groei vertoont bij 4°C, terwijl de andere wel in staat
zijn om te groeien bij deze lage temperaturen (Batt & Tortorello, 2014, BCCM, 2015b).
2.2.
Pediococcus pentosaceus
Pediococcus pentosaceus is het meest aangetroffen species binnen Pediococcus, zijn
Grampositief en maken deel uit van de melkzuurbacteriën (Tabel 2).
Tabel 2: Taxonomie van Pediococcus pentosaceus (Life, 2013a)
Ze worden vooral geïsoleerd uit gefermenteerde voeding en dranken, waar ze over het
algemeen gewenst zijn en dus een positieve bijdrage leveren aan de smaakontwikkeling van
het product. Ze maken vaak ook deel uit van de natuurlijke flora die aanwezig is op zowel
groenten als fruit. Bij een fermentatie verlengen ze de houdbaarheid van het product door de
productie van vooral melkzuur en door afscheiding van bacteriocines, een antimicrobieel
component. Het is bekend dat de aanwezigheid van Pediococci de groei van onder andere
Salmonella Typhimurium, Pseudomonas sp, Staphyloccocus aureus en Listeria sp. kan
tegengaan of vertragen. Dit heeft over het algemeen een positief effect op de houdbaarheid
van het product. Deze bacteriocines kunnen na opzuivering gebruikt worden als een
biologisch bewaarmiddel, een toepassing die volop onderzocht wordt.
10
De meeste strengen bevatten één of meerdere plasmiden, waardoor de geproduceerde
stoffen en resistentie onderling sterk kan verschillen (Batt & Tortorello, 2014, Madigan et al.,
2010, Osmanagaoglu et al., 2001).
Deze bacterie werd gekozen voor dit onderzoek omdat het organisme van nature aanwezig
is op vele groenten en fruit, maar door de zuurproductie ook een ongewenste invloed kan
hebben op de smaak van het product. In schril contrast met het uitgebreid bestudeerde
opportunistische pathogeen Ps. aeruginosa, bestaat er tot op heden weinig kennis
aangaande de biofilmvorming door P. pentosaceus (Batt & Tortorello, 2014). Wirtanen &
Mattila-Sandholm (1994) rapporteerden dat P. pentosaceus ELI612 in staat is om een biofilm
te vormen op roestvrij stalen plaatjes op basis van uitplatingen en kleuring van de EPS
matrix met Acridine Orange en analyse met epifluorescentie microscopie. De bacteriën
werden geïncubeerd in Slime Broth bij 25°C in microtiterplaten, waarbij het medium iedere
twee dagen ververst werd.
De gebruikte streng (LMG 11488, BCCM) voor dit onderzoek werd oorspronkelijk geïsoleerd
uit gedroogde Amerikaanse biergist. Ideale groei vindt plaats tussen 28 en 32°C in Man,
Rogosa en Sharpe (MRS) medium bij een pH tussen 6,0 en 6,5. De bacterie is chemoorganotroof en heeft naast een koolstofbron ook verschillende vitamines, aminozuren en
metaalionen, zoals kalium en calcium, nodig om te kunnen groeien (BCCM, 2015a).
P. pentosaceus is in staat om te groeien in een pH range van 4,5 tot 8. Groei van het
organisme werd bewezen tussen 10 en 50°C, maar werd niet getest bij hogere of lagere
temperaturen, het is dus mogelijk dat de groeirange nog breder is. Aangezien er geen enkele
pathogene werking gekend is, werd het ingedeeld bij L1 biohazard groep (Batt & Tortorello,
2014, BCCM, 2015a, Blickstad & Molin, 1981, Portal, 2015).
11
3.
Waswater van sla
De laatste jaren is er een toegenomen vraag naar groenten en fruit wereldwijd. Een gevolg
hiervan is de toename van voedsel gerelateerde ziektes door de consumptie van besmette
groenten of fruit. Reden hiervoor is dat verse producten vaak maar een minimale processing
ondergaan en vaak rauw gegeten worden, waardoor contaminatie met pathogenen een groot
risico vormt. Deze contaminatie kan optreden tijdens alle fasen van de productie van
groenten en fruit. De grootste bron van contaminatie is het irrigatiewater dat gebruikt wordt.
Vaak wordt hiervoor oppervlaktewater gebruikt dat niet of maar minimaal gezuiverd wordt,
waardoor de mogelijk aanwezige contaminanten overgedragen worden aan fruit of groenten.
Indien er weides naast het veld zijn, kunnen deze een oorzaak zijn van contaminatie door de
mest van de dieren die terecht komt in het grond- of irrigatiewater. Verder kunnen ook
uitwerpselen van vogels bacteriën overbrengen op de groenten. De invoer van exotische
groenten en fruit naar het westen kan een bron zijn voor bijkomende voedselinfecties,
aangezien in sommige landen de hygiëne minder aandacht krijgt. Tevens kan er bij het niet
correct bemesten van het land ook contaminatie optreden naar de producten en de
omgeving toe (Batt & Tortorello, 2014, Holvoet, 2014, Holvoet et al., 2012, Jacxsens et al.,
2010, Van Haute, 2015).
Sla is al vaker bevestigd als de oorzaak van verschillende uitbraken van voedselinfecties en
–vergiftigingen door bacteriën. Tussen 1988 en 2008 waren bladgroenten, zoals sla,
verantwoordelijk voor ongeveer 1/3de van de uitbraken in de VS. De uitbraken werden door
verschillende bacteriën veroorzaakt, zoals E. coli O157:H7, Listeria monocytogenes,
Cylospora caytensis, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, Shigella sonnei,
Chronobacter en Salmonella Typhirumrium. Ps. aeruginosa werd aangetroffen op 77 van
120 verschillende stalen van groenten en fruit, waarmee dit MO het meest aangetroffen
werd. De extra gevoeligheid van sla en andere bladgroenten wordt veroorzaakt door het
grotere oppervlak, waardoor er makkelijker contaminatie kan optreden (Batt & Tortorello,
2014, Lawley et al., 2012, Olaimat & Holley, 2012, Srey et al., 2013, Van Haute, 2015, Van
Haute et al., 2013, Van Haute et al., 2015). Een overzicht van de manieren waarop crosscontaminatie kan optreden, wordt weergegeven in Figuur 2.
Figuur 2: Schematisch overzicht van mogelijke cross-contaminatie in de primaire productie, C&D =
cleaning & disinfection (Holvoet, 2014)
12
De processing van verse groenten en fruit is minimaal, meestal enkel wassen en sorteren.
Hierdoor is de wasstap normaal de enige handeling waarbij de microbiologische belading
van het product kan verlaagd worden. De maximale verwijdering is ongeveer 1 à 2 log, maar
daardoor worden niet noodzakelijk alle pathogenen verwijderd. Indien dit waswater zelf ook
gecontamineerd is, dan zal er geen verwijdering zijn van MO en kan er zelfs een verhoging
optreden in de microbiologische belading van het product door cross-contaminatie. Dit kan
leiden tot een sneller bederf van het product, maar kan ook een risico vormen voor de
gezondheid van de consument. Om dit op te lossen is frequent verversen van het water
alleen vaak niet voldoende doordat de bacteriën op het oppervlak van de installatie een
biofilm kunnen vormen. Bij het verwijderen van het water blijft de biofilm achter en zal het
verse water direct weer gecontamineerd worden. Verder kan er ook contaminatie optreden
door transportbanden, menselijke handelingen, via de lucht of door contact met dieren enz.
(Figuur 3). Bijkomend is het belangrijk dat groenten en fruit na het oogsten en verwerken zo
snel mogelijk gekoeld bewaard worden, om zo de uitgroei van de mogelijke pathogenen te
vermijden of minstens te vertragen en bederf van producten tegen te gaan (Holvoet, 2014,
Holvoet et al., 2012, López-Gálvez et al., 2009, Van Haute, 2015).
Figuur 3: Bronnen van contaminatie bij de verwerking van groenten en fruit, C&D = cleaning &
disinfection (Holvoet, 2014)
Over de mogelijkheid van de bacteriën om een biofilm te vormen is al vrij veel gekend, maar
deze testen verliepen vaak in voor de bacteriën ideale omstandigheden. Deze
omstandigheden gaan binnen de verwerking van voedingsproducten zo goed als niet
voorkomen. De kennis over de vorming van biofilms in minder ideale omstandigheden,
bijvoorbeeld in waswater van sla bij lage temperaturen, is heel beperkt. Deze kennis kan
gebruikt worden om betere inzichten te verkrijgen in het tegengaan van de biofilmvorming of
om de aanwezige biofilms beter te kunnen verwijderen onder deze condities.
13
4.
Modelsystemen voor biofilmvorming
Momenteel bestaan er verschillende modelsystemen om de biofilmvorming van microorganismen te bestuderen. Een eerste onderscheid kan gemaakt worden tussen een batch
systeem en een dynamisch systeem. Bij een batch systeem wordt er na het enten niets meer
toegevoegd of verwijderd uit het systeem. Hierdoor zal er na verloop van tijd een tekort aan
nutriënten of een opstapeling van toxische stoffen ontstaan waardoor de groei van de
bacteriën wordt geïnhibeerd. Bij een dynamisch systeem is er een constante verversing van
het medium, waardoor er geen tekort aan nutriënten of opbouw van toxische stoffen zal
ontstaan. Het eerste systeem komt in werkelijkheid overeen met bijvoorbeeld een product
dat verpakt is, waswater dat voor langere tijd blijft stilstaan of in de omgeving die in dode
hoeken voorkomt. Het dynamische systeem representeert meer de omstandigheden die
aanwezig zijn in een wasstank of in leidingen binnen voedingsbedrijven.
4.1.
Batch systemen
4.1.1.
Microtiterplaat
Het kweken van biofilms in microtiterplaten wordt vooral gebruikt om te controleren of het
MO in staat is om een biofilm te vormen en in welke hoeveelheden er EPS aangemaakt
wordt door het organisme. Tevens bestaat er ook een mogelijkheid om een onderscheid te
maken tussen levende en dode MO en de samenstelling van de EPS te onderzoeken. Deze
bepalingen zijn meestal gebaseerd op binding van kleurstoffen aan specifieke componenten
uit de EPS matrix. Verschillende stappen kunnen onderscheiden worden in dit systeem:
enting + adhesie, na 0,5 tot 4h verversen van het medium, de verdere vorming van de biofilm
en als laatste het uitvoeren van de gewenste kleuring en bijhorende detectie (Brackman,
2013, Coenye & Nelis, 2010, Peeters et al., 2008).
Het is ook mogelijk om microtiterplaten met grotere wellen te gebruiken, waarin dan
verschillende oppervlakken kunnen getest worden op biofilmvorming (Brackman, 2013).
De voordelen van deze methode zijn de lage kostprijs door de kleine volumes die maar nodig
zijn en de mogelijkheid om meerdere testen tegelijk uit te voeren. Dit maakt deze methode
uitermate geschikt voor een snelle screening. Door de wellen met verschillende materialen te
coaten kan ook het effect van verschillende coatingen op de vorming en vasthechting van
biofilms onderzocht worden (Coenye & Nelis, 2010).
4.1.2.
Calgary Biofilm Device
Een variant op de gewone microtiterplaat is het Calgary Biofilm Device, ontwikkeld door Ceri
et al. (1999) (Figuur 4). Dit systeem werd ontwikkeld om de werking van antibiotica te testen
op MO in biofilms.
14
Figuur 4: Het Calgary Biofilm Device (Brackman, 2013)
De bedoeling is dat er eerst een biofilm ontwikkeld wordt op de kegels die vastzitten aan het
deksel. Eenmaal de biofilm goed ontwikkeld is, kan het deksel op een andere microtiterplaat
gebracht worden met in de wellen verschillende concentraties aan antibiotica. Na een
bepaalde tijd kunnen de kegels verwijderd worden, en kan na sonicatie een uitplating
gebeuren om te bepalen in hoeverre de MO overleefden in de antibiotica (Brackman, 2013,
Ceri et al., 1999).
4.2.
Dynamisch systeem
4.2.1.
Centers for disease control biofilm reactor
De Centers for disease control biofilm reactor (CDCBR) wordt gebruikt om de ontwikkeling
van een biofilm te gaan opvolgen in verschillende omstandigheden en vooral om de impact
van stroming in het medium op de biofilmvorming te kunnen bepalen. In Figuur 5 staat links
een opstelling van een CDCBR weergeven, welke doorgaans bestaat uit een reactor met
een werkvolume van ongeveer 1L waarin coupons van het gewenste materiaal ingebracht
wordt in houders (rechts in Figuur 5).
Figuur 5: Centers for disease control biofilm reactor (Brackman, 2013)
15
Via een peristaltische pomp wordt er voedingsmedium toegevoegd aan het gewenste debiet.
Een afvoer zorgt voor de verwijdering van het oude medium, zodat het volume van de
reactor constant blijft. Het medium komt normaal tot ongeveer halverwege de hoogte van de
reactor. Meestal wordt er een magnetische roerder toegevoegd om een goede menging te
verkrijgen van het medium, een betere lucht toevoer te hebben en een grotere afschuifkracht
uit te oefenen op de groeiende biofilm. Deze hogere afschuifkrachten zullen in de realiteit
vaak ook aanwezig zijn door stromingen in het water. Indien gewenst kan tevens een andere
gassamenstelling gebruikt worden binnen de reactor. Om de gewenste temperatuur te blijven
behouden kan de reactor in een verwarm- of koelmantel geplaatst worden. Deze reactor
werkt dus eigenlijk volgens hetzelfde principe als een continous-flow stirred tank reactor,
vaak gebruikt voor het uitvoeren van fermentaties of productie van verschillende stoffen
geproduceerd door bacteriën. De bedoeling hierbij is dat de concentratie aan nutriënten
ongeveer constant wordt gehouden. Er wordt met andere woorden een steady state situatie
gecreëerd. Een voordeel bij deze reactor is dat de verschillende couponhouders
onafhankelijk van elkaar kunnen verwijderd worden, waardoor vergelijking van groei op
verschillende momenten mogelijk is. Dit systeem is al enkele jaren in gebruik en blijkt een
betrouwbaar systeem te zijn om op reproduceerbare wijze biofilms te vormen op een
oppervlak. Dit systeem bootst de omstandigheden na die aanwezig zijn in bijvoorbeeld een
wastank voor groenten en fruit (Brackman, 2013, Donlan et al., 2004, Goeres et al., 2005,
Honraet et al., 2005).
Er bestaan nog enkele varianten op dit systeem. Zo is er de rotating disk reactor, waarbij het
medium gemengd wordt door een schijf die zich in het medium bevind. De biofilmvorming
wordt op deze schijf onderzocht. Dit levert een homogene ontwikkeling van de biofilm op
over de volledige oppervlakte van de schijf (Boaventura & Rodrigues, 1997). De constant
depth film fermentor is vooral bedoeld om omstandigheden in de mond na te bootsen en zo
de vorming van tandplak, wat ook een soort van biofilm is, na te bootsen. De nutriënten
worden toegevoegd via een constant ververste dunne vloeistoffilm. De afschuifkracht die
uitgeoefend wordt op de biofilm is dus laag (Morgan & Wilson, 2001). Een andere variant is
de Biofilm annular reactor, welke gelijkaardig opgebouwd is als de CDCBR, maar waarbij de
binnenring die de testplaatjes draagt ronddraait en zo ook de menging van het medium
veroorzaakt. Op die manier is er een sterk contact tussen de vloeistof en de biofilm en een
constante afschuifkracht (Lawrence et al., 2000).
16
4.2.2.
Modified Robbins Device
Het Modified Robbins Device (MRD) werd ontwikkeld om op een herhaalbare manier op
meerdere oppervlakken tegelijk een biofilm te vormen. Het bestaat uit verschillende
verwijderbare cilinders die zich met één uiteinde in een kanaal bevinden (Figuur 6).
Figuur 6: Modified Robbins device (Brackman, 2013)
Om de biofilm te vormen wordt het inoculum in het kanaal geïnjecteerd, waarna het volledige
apparaat ondersteboven geplaatst wordt. Op die manier wordt de aanhechting van de
bacteriën op het uiteinde van de cilinders bevorderd. Na de aanhechting wordt het inoculum
verwijderd en wordt er voedingsmedium door het kanaal gepompt, waardoor de biofilm zich
verder kan ontwikkelen. Op de uiteinden van de cilinders kunnen er verschillende materialen
aangebracht worden, om zo de ontwikkeling van de biofilm op verschillende materialen
tegelijk te kunnen opvolgen. Tevens kunnen er op verschillende tijdstippen een cilinder
verwijderd worden om de ontwikkeling in functie van de tijd op te volgen. Dit toestel wordt
vooral gebruikt om het effect van verschillende coatings, bedoeld om de vorming van biofilms
tegen te gaan, te testen. In dit toestel heerst een andere stroomkarakteristiek dan in de
CDCBR, doordat het medium door een buis stroomt. Hierdoor ontstaat een zogenaamde
plug flow. Dit betekent dat er geen perfect laminaire stroming is, maar een stroming waarbij
er in het midden een constante snelheid is. Deze snelheid neemt af naar de randen toe, om
tegen de randen aan bijna geen stroming meer te hebben. Hierdoor worden er minder
krachten uitgeoefend op de biofilm, maar wordt er wel nog vers medium aangevoerd. Echter
zijn binnen de reactor de omstandigheden niet volledig constant. Hoe verder naar de uitlaat,
hoe meer nutriënten er zullen opgenomen zijn door bacteriën die op eerdere pluggen zitten.
Door de snelheid van toevoer voldoende hoog te maken, zal dit verschil echter miniem zijn
(Brackman, 2013, Coenye & Nelis, 2010).
4.2.3.
Flow cel
Het flow cel systeem is een verdere ontwikkeling van het MRD waarbij de biofilm gevormd
wordt in een buis, liefst met een doorzichtige wand, om zo de vorming van de biofilm via
microscopische analyses te kunnen opvolgen (Figuur 7).
17
Figuur 7: Opstelling voor een flow cel systeem (Nielsen et al., 2011)
De belangrijkste componenten in het systeem zijn de peristaltische pomp, de bubbelvangers
en de flow cel zelf. De flow cel dient als een groeiruimte voor de biofilm, terwijl de nutriënten
en zuurstof toegevoerd worden uit de opslagfles via de peristaltische pomp, waarna het
medium afgevoerd wordt naar een afvalfles. De bubbelvangers zorgen ervoor dat er geen
grote luchtbellen mee kunnen naar de flow cellen, waar ze voor verstopping en verstoring
van de structuur van de biofilm kunnen zorgen. Dit volledige systeem is ontworpen om
ervoor te zorgen dat de omstandigheden waarin de biofilm gevormd worden volledig
controleerbaar zijn. De ontwikkeling van de biofilm wordt al dan niet in real time opgevolgd
via microscopische analyse, meestal via Confocal Laser Scanning Microsopy (CLSM),
waardoor er geen verstoring is van de structuur van de biofilm. Via CLSM is het mogelijk om
de 3D structuur van de biofilm zichtbaar te maken. Via het flow cel systeem is het mogelijk
om de inwerking van bijvoorbeeld disinfectia op de biofilm op te volgen in real time (Coenye
& Nelis, 2010, Nielsen et al., 2011, Sternberg & Tolker-Nielsen, 2005).
In Tabel 3 staan de bovenstaande methodes nog eens samengevat. Beide batch methoden
zijn vooral bedoeld om een snelle screening te kunnen uitvoeren. Deze screening kan voor
verschillende doeleinden toegepast worden, zoals de mogelijkheid van MO om een biofilm te
vormen, de invloed van stoffen op de biofilmvorming, het effect van coatings op de vorming
van biofilms op het oppervlak, enz.. Het is mogelijk om vele testen simultaan uit te voeren en
het is vooral vrij goedkoop. De detectie zal voornamelijk via spectrofotometrische metingen
gebeuren. De looptijd van deze experimenten zal beperkt zijn en er worden geen of weinig
externe krachten uitgeoefend op de biofilm. Door het regelmatig verversen van het medium
kan er wel een langere looptijd bekomen worden, maar dan is het geen echt batch systeem
meer.
De dynamische systemen hebben elk hun eigen bestaansreden. De systemen bieden meer
mogelijkheden om analyses uit te voeren. Ze laten langere looptijden toe doordat het
medium ververst wordt. Hierdoor kan er in principe geen gebrek aan nutriënten of
opstapeling van inhiberende stoffen optreden. Er wordt dus een steady state omgeving
gecreëerd. Het grootste nadeel aan deze methodes is dat ze een stuk duurder zijn en er
minder mogelijkheden zijn om verschillende testen simultaan uit te voeren.
18
Tabel 3: Modelsystemen voor biofilmvorming
19
II.
Materiaal en methoden
Voor het uitvoeren van de experimenten zijn er twee verschillende opstellingen gemaakt, één
voor het batch systeem en één voor het dynamisch systeem. Voor beide systemen werden
de microbiologische en chemische analyses op dezelfde manier uitgevoerd. In Figuur 8
wordt een overzicht gegeven van de uitgevoerde hoofdexperimenten.
Figuur 8: Overzicht uitgevoerde experimenten
1.
Microbiologie
1.1.
Bereiding inoculum
Voor dit onderzoek werden twee verschillende stammen gebruikt, namelijk Pediococcus
pentosaceus (LMG 11488) en Pseudomonas aeruginosa (LMG 28185). Beide stockculturen
werden verkregen uit de collectie van het Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms (BCCM). Een moedercultuur werd aangemaakt door 100 µL van de stockcultuur
over te enten in 10 ml MRS (CM0359, Oxoid) of in Brain-heart infusion (BHI) (CM1135,
Oxoid) voor P. pentosaceus en Ps. aeruginosa respectievelijk. Dit werd dan geïncubeerd
voor 24h bij 30°C voor P. pentosaceus en 37°C voor Ps. aeruginosa onder schudden (150
rpm). Vervolgens werd deze handeling nog eens uitgevoerd om een moedercultuur te
verkrijgen. Om een vers inoculum te verkrijgen, werd 22h voor de enting van de
experimenten 100 µL van de moedercultuur overgebracht in 10 ml vers MRS/BHI medium en
opnieuw geïncubeerd bij 30/37°C onder schudden bij 150 rpm. Hierdoor werd een inoculum
verkregen met een concentratie van ±109 KVE/ml.
20
Dit inoculum werd dan 10x verdund in fysiologisch water (0,85% NaCl) om zo een
concentratie van ±108 KVE/ml te bereiken voor experimenten die een enting op log 6 nodig
hadden. De log 6 werd verkregen door 1,5 ml over te brengen in 150 ml medium. Om een
enting bij log 2 te verkrijgen werd het inoculum verder verdund tot er een concentratie van ±
104 KVE/ml werd verkregen, waarvan dan 1,5 ml over gebracht werd in 150 ml medium om
de gewenste log 2 te bereiken. De concentratie van de inoculums werden telkens bepaald
door de KVE te tellen met behulp van de plaatmethode.
1.2.
Batch opstelling
In de batch opstelling worden er tijdens de uitvoering van het experiment geen
voedingsstoffen of bacteriën meer toegevoegd of verwijderd. Dit simuleert
praktijkomstandigheden waarin bv. het water stilstaat, zoals in een niet-gebruikte
waswatertank, plassen in bedrijven of stilstaand water in leidingen.
1.2.1.
Biofilmvorming in ideale omstandigheden
Als eerste werd de groei en de ontwikkeling van een biofilm opgevolgd in, voor dat
organisme, ideale omstandigheden. Voor P. pentosaceus is dit in MRS medium bij een
temperatuur van 30°C en voor Ps. aeruginosa is dit in BHI medium bij een temperatuur van
37°C.
Roestvrij stalen plaatjes (7,5 cm x 2,5 cm) werden in glazen containers met een maximaal
volume van 200 ml gebracht. Op deze plaatjes werd dan de biofilmvorming bestudeerd in
functie van de incubatietijd. De containers werden gevuld met 150 ml medium, afgedicht met
een stop, gemaakt uit katoenwol, en geautoclaveerd voor 15 minuten bij 121°C. De
inoculatie gebeurde door het overbrengen van 1,5 ml van het inoculum, welke een
concentratie had van ± 108 KVE/ml of ± 104 KVE/ml, om zo een uiteindelijke concentratie aan
MO te bekomen van respectievelijk 6 of 2 log in de glazen container. Deze werden dan 4 uur
geïncubeerd bij optimale temperatuur voor de bacterie onder schudden (150 rpm). Na 4 uur
werd het medium ververst, waarna de containers verder geïncubeerd werden onder ideale
omstandigheden. Het verversen van het medium zorgt voor een selectie van biofilm
geassocieerde cellen op de plaatjes en het verwijderen van planktonische cellen. Bij het
verversen werd eerst het oude medium weg gegoten, terwijl het plaatje tegengehouden werd
met een steriel pincet. Hierna werd er 150 ml vers medium in de container gebracht via een
steriele pipet. Tijdens het vullen werd zoveel mogelijk vermeden om het verse medium over
het plaatje te laten lopen, om de vorming van de biofilm zo min mogelijk te verstoren.
De biofilmvorming werd bestudeerd na 0, 1, 2, 6, 9 en 13 dagen incuberen. De uitplating van
dag 0 gebeurde net na het verversen van het medium. Het experiment werd telkens
uitgevoerd in tweevoud.
Het experiment in ideale omstandigheden voor Pediococcus pentosaceus werd al eerder
uitgevoerd door Ebru Gözetici en gerapporteerd in haar stageverslag ‘Biofilm formation in
vitro: Microbial and chemical characterization of Staphylococcus aureus and Pediococcus
pentosaceus’, waardoor dit experiment niet herhaald wordt in deze thesis voor dit organisme.
De data voor de ideale omstandigheden van dit organisme zullen bijgevolg afkomstig zijn
vanuit dit stageverslag.
21
Op verschillende tijdstippen tijdens de incubatie werden twee inox plaatjes verwijderd uit de
containers met een steriel pincet. Beide kanten van het plaatje werden gespoeld met 2,5 ml
steriel demi water per kant. Na het spoelen werden de plaatjes in een steriele stomacher zak
gebracht met 5 ml steriel demi water. Deze zakken werden gesoniceerd voor 3 x 30
seconden, met telkens 30 seconden tussen de sonicatie sessies. De sonicaties werden
ingesteld op een amplitude van 50% en een cyclus van 0,5 (UP 400s, dr. Hielscher). De
verkregen cel suspensie werd daarna verdund met fysiologisch water en uitgeplaat op het
ideale medium voor dat MO om het aantal KVE/ml te kunnen bepalen, waaruit dan het aantal
KVE/cm² kan berekend worden. De verkregen suspensie werd ook chemisch
gekarakteriseerd volgens het protocol beschreven in paragraaf II.2. Tevens werd de
concentratie aan planktonische cellen bepaald via uitplating op ideaal medium en werd de
pH van het medium geregistreerd (HI 2002 edge pH, Hanna Instruments).
1.2.2.
Biofilmvorming in waswater van sla
Voor het aanmaken van het gestandaardiseerde sla waswater (SLWW) wordt een protocol
gebruikt dat beschreven werd door Van Haute et al. (2013). Er werd 67 g botersla (Lactuca
sativa) afgewogen en overgebracht in een steriele stomacher zak met daarin over het
volledige oppervlak een filter met poriediameter van 0,5 mm. Hierbij werd er 200 ml
leidingwater toegevoegd, waarna dit 2 minuten gehomogeniseerd werd in een stomacher
(Masticator, IUL instruments). De COD werd bepaald via een testkit (LCI 400, Hach Lange)
aan de hand van het meegeleverde protocol waarmee de COD op een spectrofotometrische
manier kan bepaald worden (HI98703, Hanna Instruments). Om binnen de detectierange van
de methode te blijven werd het staal 10x verdund met demi water voor het in de kit werd
ingebracht. Na de COD bepaling werd het mengsel verdund met leidingwater tot een COD
van 800 mg O2/l verkregen werd. Voor de experimenten met een reincultuur (inoculatie met
P. pentosaceus of Ps. aeruginosa) werd voor het autoclaveren de pH van het waswater
gecorrigeerd tot ± 5, dit om na het autoclaveren een pH van ongeveer 6,5 à 7 te verkrijgen.
Indien deze correctie niet gebeurde had het SLWW na het autoclaveren een pH van
ongeveer 8,5 à 9 wat de groei van de bacteriën zou remmen. Daarna werden de glazen
containers, met inox plaatje reeds aanwezig, gevuld met 150 ml van dit SLWW, afgedicht
met een stop van katoenwol en geautoclaveerd voor 15 minuten bij 121°C. Voor het
verversen van het medium werd het SLWW in glazen Duran-Schott flessen gebracht en
geautoclaveerd.
Voor de experimenten met niet-geautoclaveerd SLWW werden de glazen potten, met inox
plaatje aanwezig, afgedicht met watten stop en daarna geautoclaveerd. Na het autoclaveren
werd dan op een steriele wijze 150 ml SLWW toegevoegd in de container.
De enting verliep volgens het protocol beschreven in paragraaf II.1.2.1. Om realistische
omstandigheden na te bootsen moet het SLWW op een temperatuur gehouden worden van
± 8°C, wat overeenkomt met de werkelijke temperaturen van het water tijdens de normale
werking van een wasinstallatie van sla (Van Haute, 2015). Om dit te bereiken werd de
opstelling in een koelkast geplaatst. Daarin werden de glazen containers geschud aan 110
rpm. Hier werd ook na 4 uur het medium ververst.
22
Uitplatingen van het geautoclaveerde SLWW vonden plaats na 0, 1, 2, 6, 9 en 13 dagen,
volgens het protocol beschreven in paragraaf II.1.2.1. Uitplatingen voor niet-geautoclaveerd
SLWW verliepen op dezelfde manier, maar er werden andere media gebruikt. Om alle
aanwezige micro-organismen te bepalen in het SLWW werd er uitgeplaat op plate count agar
(PCA) (CM0325, Oxoid) en geïncubeerd voor 48h bij 30°C. Om de hoeveelheid van de
geënte bacteriën te bepalen, werden selectieve media gebruikt. Voor Ps. aeruginosa werd er
gebruik gemaakt van Pseudomonas Agar Base (CM0559, Oxoid) waarbij CN selective
supplement (SR0102, Oxoid) en10 g/l Agar NO.1 (LP0011, Oxoid) werd toegevoegd. Dit
selectieve medium wordt verder benoemd als PAB. Het selectieve medium voor P.
pentosaceus werd bereid uitgaande van het protocol beschreven door Simpson et al. (2006).
Hierbij werd gestart met MRS broth (CM0359, Oxoid ) met 10 g/l Agar NO.1 (LP0011,
Oxoid), waarbij er na autoclaveren en afkoelen tot 50°C, filtersteriel 0,05% (w/V) cysteïne
hydrochloride (Sigma-Aldrich), 100 µg/l novobiocine (Bio-Rad), 10 mg/l vancomycine (SigmaAldrich), 50000 U/l nystatine (Sigma-Aldrich) en 1 mg/l ampicilline (Affymetrix USB) werd
toegevoegd. Dit medium wordt verder benoemd als Pediococcus selectief medium (PSM).
Uit testen is gebleken dat het medium niet volledig selectief is voor P. pentosaceus. Bij een
test bleek dat ook Leuconostoc mesenteroides kan groeien op dit medium, en bijgevolg
zullen hoogstwaarschijnlijk ook andere melkzuurbacteriën kunnen groeien op deze platen.
Ps. aeruginosa groeide niet, dus het medium is zeker gedeeltelijk selectief. Er zal dus een
overschatting zijn van het aantal KVE bij bepalingen uitgevoerd met dit medium. Per dag
werden de plaatjes uit twee containers geanalyseerd.
Figuur 9: De verschillende condities van het batch experiment
1.3.
Dynamisch systeem
Om de biofilmvorming te kunnen onderzoek in omstandigheden met grotere afschuifkrachten
werd er een dynamisch systeem gebouwd (Figuur 10). Het modelsysteem bestaat uit een
reactorvat waarin inox staafjes met haken in aangebracht zijn om de inox plaatjes aan te
bevestigen (Figuur 11). Op deze inox plaatjes wordt de biofilmvorming opgevolgd. De
staafjes hangen vast aan schroefdoppen die in het deksel van de fermentor zitten. Op deze
manier is het mogelijk om de plaatjes individueel te verwijderen zonder de volledige reactor
open te maken. Er is ook een steriele aan- en afvoer voorzien voor lucht. In de realiteit
kunnen deze omstandigheden aangetroffen worden, bijvoorbeeld in actieve waswatertanks,
in transportwater of in leidingen waar een vloeistof door stroomt.
23
Figuur 10: Opstelling dynamisch systeem
Figuur 11: Reactor van dynamisch systeem 1 = Aanvoer medium; 2 = Aanvoer lucht; 3 = Afvoer lucht; 4 =
Afvoer medium
1.3.1.
Biofilmvorming in verschillende media
In het dynamisch systeem werden er verschillende media getest op hun invloed op de
biofilmvorming door de MO. Het modelsysteem werd eerst geverifieerd op biofilmvorming in
ideale omstandigheden voor het MO. Vervolgens werd de biofilmvorming bestudeerd in
geautoclaveerd en in niet-geautoclaveerd SLWW bij een temperatuur van ± 8°C. De reactor
werd geënt met het gewenste MO zodat een concentratie van 6 log verkregen werd. In het
dynamisch systeem werd enkel getest met Ps. aeruginosa. De toe- en afvoer werd zo
geregeld dat het volledige volume van 1,4 l ongeveer iedere dag ververst werd. Bij ideaal en
geautoclaveerd SLWW werd er enkel vers, steriel medium toegevoegd. Bij het experiment
met niet-geautoclaveerd SLWW bevat de aanvoer de bacteriën die van nature uit aanwezig
zijn op de sla. De inoxplaatjes werden uit de reactor verwijderd op dag 0, 1, 2, 3 en 6.
Vervolgens werden de plaatjes microbiologisch als chemisch geanalyseerd (zie II.2).
Bijkomend werden op deze tijdstippen de pH en de concentratie aan planktonische cellen
bepaald in de reactor. Per dag werd er één plaatje uit de reactor verwijderd.
24
2.
Chemische analyses
Naast MO bevat een biofilm ook EPS, waardoor het nuttig is om naast microbiologische
tellingen ook de componenten van de EPS te bepalen. Hier werd er zowel getest op
koolhydraten, eiwitten en uronzuren om meer zekerheid te verkrijgen rond de aanwezigheid
van een biofilm. Om de concentraties van deze componenten te bepalen, werd er gebruik
gemaakt van spectrofotometrische bepalingen. De bestudeerde componenten hebben na
een kleurreactie namelijk een karakteristieke kleur die gemeten werd via een Labsystems
Multiskan RC. De reacties werden uitgevoerd in microtiterplaten met 96 wellen (REF 353936,
Falcon). Ieder staal of standaard werd in drievoud uitgevoerd. Tevens werden ook de
detectielimieten bepaald. De detectielimiet (DL) is de concentratie waarbij de te detecteren
stof een signaal-ruisverhouding van minimaal drie heeft, en waarbij de aanwezigheid van de
stof vastgesteld kan worden. De resultaten van een analyse zijn te zien op Figuur 12.
In enkele van de geanalyseerde stalen werden er geen of maar lage concentraties aan
chemische componenten gedetecteerd, terwijl er wel een hoge concentratie aan bacteriën
aangetroffen werd. Waarschijnlijk schommelen de concentraties van de chemische
componenten rond de detectielimiet, waardoor deze componenten dus niet kunnen
gedetecteerd worden en het duidelijk is of ze gevormd werden of de concentratie te laag was
om te detecteren. De detectielimieten bedroegen voor eiwitten 1,01 µg/ml, voor koolhydraten
0,019 µmol/ml en voor uronzuren 1,90 µg/ml. Normaal werd er iedere keer één inox plaatje,
met een oppervlak van 37,5 cm², overgebracht in een stomacherzak met daarbij 5 ml steriel
water. Om de concentratie aan chemische componenten te verhogen zijn er een paar
mogelijkheden. Zo kan er minder water toegevoegd worden in het zakje, maar het risico
hierbij is dat door het verminderde contact tussen water en plaatje niet alles van de biofilm
overgaat in het water. Anderzijds kan ook de oppervlakte die ingebracht wordt in 5 ml water
verhoogd worden. Dat is wat hier toegepast werd door vier plaatjes in plaats van één plaatje
in te brengen in de stomacherzak. Hierdoor wordt het oppervlak vergroot tot 150 cm². Het
experiment werd uitgevoerd met Ps. aeruginosa en P. pentosaceus in ideale
omstandigheden.
2.1.
Koolhydraten
Om de hoeveelheid koolhydraten te bepalen werd er gebruik gemaakt van de fenolzwavelzuur methode, waarbij glucose gebruikt werd voor het opstellen van de ijklijn. Deze
standaard werd aangemaakt door een stockoplossing van 10 µmol/ml glucose aan te maken
en deze verder te verdunnen om een range tussen 0,05 en 0,25 µmol/ml glucose te
verkrijgen. In de microtiterplaat werd 50 µl standaard of staal ingebracht, waarbij dan 30µl
5% fenol in water werd toegevoegd, gevolgd door 150 µl puur zwavelzuur. De microtiterplaat
werd vervolgens vijf minuten geïncubeerd in een warmwaterbad bij 90°C, gevolgd door een
incubatie van vijf minuten bij kamertemperatuur. De absorbantie werd daarna bepaald bij een
golflengte van 492 nm (De Grande, 2015, Dubois et al., 1951, Masuko et al., 2005).
25
2.2.
Uronzuren
Om de standaardoplossing te bereiden werd er een stockoplossing aangemaakt van 100
µg/ml van D-galacturonzuur, welke verder verdund werd om een range van 0,5 tot 40 µg/ml
te verkrijgen. De bepaling van uronzuren werd uitgevoerd door bij 40 µl standaard of staal
200 µl natriumtetraboraat decahydraat (Borax) (0,125 mol/L) opgelost in puur zwavelzuur toe
te voegen. De microtiterplaat werd dan voor één uur geïncubeerd in een warmwaterbad van
80°C. Na afkoelen tot kamertemperatuur werd de absorbantie gemeten bij 540 nm. Deze
meting werd als blanco gebruikt en de absorbantie van blanco werd afgetrokken van de
verkregen absorbanties na het toevoegen van het kleurreagens. Voor de bereiding van het
kleurreagens werd eerst een oplossing aangemaakt van 100 mg/ml 3-m-hydroxydifenol
(MHDF) in dimethyl sulfoxide (DMSO). Van deze oplossing werd net voor gebruik 100 µL
toegevoegd bij 4,9 ml puur zwavelzuur om de kleuroplossing volledig te maken. Van deze
kleuroplossing werd 40 µl toegevoegd aan iedere well, gevolgd door drie uur incubatie in het
donker bij kamertemperatuur. Na de incubatie werd de absorbantie opnieuw gemeten bij 540
nm (De Grande, 2015, van den Hoogen et al., 1998, Yapo, 2012).
2.3.
Proteïnen
De bepaling van eiwitten gebeurde via de Bradford methode. De standaardreeks werd
aangemaakt door een stockoplossing van 100 µg/ml bovine serum albumine (BSA) aan te
maken en deze te verdunnen om een range te verkrijgen tussen 1 en 10 µg/ml BSA. Bij 100
µl staal werd 100 µl Bradford reagens (Sigma-Aldrich) toegevoegd, gevolgd door vijf minuten
incubatie bij kamertemperatuur. De absorbantie werd bepaald bij 595 nm (Bradford, 1976).
Figuur 12: Overzicht van de standaardreeksen van de chemische analyses: A = uronzuren, B =
koolhydraten, C = proteïnen (Gözetici, 2015)
26
3.
Statistische data-analyses
De statistische analyses werden uitgevoerd met IBM SPSS Statistics Version 21. De
normaliteit van de data werden eerst gecontroleerd via de Kolmogorov-Smirnov test (α =
0,05). Indien de data normaal verdeeld was, werd een One-way Anova test uitgevoerd.
Indien de gemiddelden niet gelijk waren, werd Tukey post-hoc analyse uitgevoerd om te
bepalen welke waarde verschillend zijn van elkaar. Indien de data niet normaal verdeeld
was, werd een niet-parametrische test uitgevoerd, namelijk de Independent-Samples
Kruskal-Wallis test. Indien de gemiddelden niet gelijk waren, werd een pairwaise comparison
uitgevoerd om te bepalen welke waarde verschillen van elkaar.
27
III.
Resultaten
1.
Batch opstelling
1.1.
Pseudomonas aeruginosa
In het onderstaand gedeelte wordt het batch experiment met Pseudomonas aeruginosa
besproken. Er werden drie verschillende media gebruikt namelijk ideaal medium (BHI) bij
ideale temperatuur (37°C), geautoclaveerd SLWW bij 8°C en niet-geautoclaveerd SLWW bij
8°C. Verder werd er bij de niet-ideale media twee inoculum sterktes getest, namelijk log 2 en
log 6. De ontwikkeling van de biofilm werd normaal opgevolgd tot dag 13, maar in de ideale
omstandigheden was dit tot dag 22 en werd er niet getest op dag 9. In bijlage 3 zijn enkele
afbeeldingen van de biofilms opgenomen.
De initiële inoculum concentratie in het ideale medium was 6,94 ± 0,07 log KVE/ml. Voor het
geautoclaveerde SLWW was dit bij de 6 log enting 6,52 ± 0,05 log KVE/ml en bij de 2 log
enting 2,52 ± 0,05 log KVE/ml. Bij het niet-geautoclaveerde SLWW werd er geënt met 6,38 ±
0,10 log KVE/ml voor de 6 log en 2,38 ± 0,10 log KVE/ml voor de 2 log.
1.1.1.
Microbiologie
Onder ideale groeiomstandigheden vertoonde Ps. aeruginosa een snelle groei in de eerste
24h tot een maximum concentratie aan planktonische cellen van ongeveer 10 log KVE/ml,
welke aangehouden werd tot dag 6 (Figuur 13). Daarna begon een langzame afsterving tot
ongeveer 5,5 log KVE/ml op dag 22. In de biofilm was een sterke initiële vasthechting waar
te nemen waardoor na 4 uur (dag 0) al een concentratie van 5,59 KVE/cm² bereikt werd
(Figuur 14). De concentratie aan cellen steeg dan verder om een maximum te bereiken op
dag 1 van 7,50 log KVE/cm². Op dag 2 vertoonde de concentratie aan bacteriën een afname,
waarna op dag 6 weer het niveau van dag 1 bereikt werd. Daarna namen de hoeveelheden
cellen langzaam af.
In het geautoclaveerde SLWW was er bij de log 6 inoculum planktonisch weinig groei waar te
nemen in de eerste 9 dagen, maar op dag 13 was er een lichte toename (Figuur 13). De
initiële concentratie in de biofilm bij log 6 enting was iets lager dan deze in het ideale
medium, namelijk ongeveer 4 log KVE/cm² (Figuur 14). Deze concentratie bleef behouden
tot en met dag 9. Pas op dag 13 steeg de concentratie tot 5 log KVE/cm².
Bij een inoculum sterkte van log 2 in geautoclaveerd SLWW was er op de eerste dagen geen
detectie van planktonische bacteriën (Figuur 15). Op dag 6 werd een opvallend hoge waarde
teruggevonden, welke hoogstwaarschijnlijk te wijten is aan een fout bij de inoculatie. Er zal
waarschijnlijk geënt geweest zijn met 6 log in plaats dan 2 log, waardoor de detectie op dag
6 verder niet in rekening wordt gebracht. Op dag 13 werd er wel in één van de twee
containers een lage concentratie aan bacteriën teruggevonden, wat erop kan wijzen dat na
verloop van tijd de bacterie toch in staat zou kunnen zijn om terug uit te groeien en dus de
omgeving te contamineren. In de biofilm was er de eerste dagen geen detectie, tot er op dag
6 weer een hoge piek waargenomen werd (Figuur 16). Zoals eerder gezegd zal deze
waarschijnlijk te wijten zijn aan een fout bij de enting.
28
Pas op dag 13 was er in één container een betrouwbare detectie van aangehechte cellen
wat erop wijst dat een biofilm zich begint te ontwikkelen.
In het niet-geautoclaveerde SLWW met log 6 inoculatie was een licht dalende trend te zien in
de concentratie aan planktonische cellen van Ps. aeruginosa in de loop van de tijd (Figuur
13). Er zal dus geen groei van Ps. aeruginosa in dit medium plaats gevonden hebben. Het
totale kiemgetal nam wel licht toe tot dag 2 om daarna min of meer stabiel te blijven rond 7
log KVE/ml. In de biofilm bleef de concentratie van Ps. aeruginosa min of meer constant
(ongeveer 4 log KVE/cm²), het totale kiemgetal steeg tot dag 6 en bleef daarna min of meer
stabiel rond 7 log KVE/cm² (Figuur 14).
Bij de log 2 enting was er eerst een lichte toename in de concentratie aan planktonische
bacteriën, maar vanaf dag 9 werden er geen meer aangetroffen, wat waarschijnlijk ook te
wijten was aan de concurrentie met de andere bacteriën (Figuur 15). Op dag 0 werd er in de
biofilm nog geen Ps. aeruginosa aangetroffen, maar na dag 1 bleven ze met een ongeveer
constante concentratie van 2 log KVE/cm² aanwezig (Figuur 16). Het planktonisch totaal
kiemgetal steeg van 7 tot 8,5 log KVE/ml op dag 2, waarna het langzaam daalde tot opnieuw
7 log KVE/ml bereikte op dag 13. In de biofilm was er eerst een stijging van 5,5 log KVE/cm²
tot iets meer dan 8 log KVE/cm² op dag 6, waarna er een lichte daling was tot iets meer dan
7 log KVE/cm² op dag 13.
KVE (Log/ml)
Tijdens het experiment werden ook blanco’s onder dezelfde omstandigheden geïncubeerd.
Deze blanco’s bevatten enkel SLWW, dus alleen de bacteriën die van nature aanwezig
waren op de sla. De microbiologische data zijn opgenomen in Figuur 26 en Figuur 27 in
bijlage 1.
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Ideaal medium
Geatoclaveerd SLWW
Niet-geautoclaveerd SLWW
Selectief
NG
NG
0
1
2
6
9
13
Niet-geautoclaveerd SLWW
Totaal kiemegetal
22
Incubatietijd (dagen)
Figuur 13: Aantal planktonische cellen van Ps. aeruginosa in functie van de incubatietijd na inoculatie
met log 6, n = 2, NG = niet getest, DL = 2 log KVE/ml
29
9
8
KVE (Log/cm²)
7
Ideaal medium
6
5
Geautoclaveerd SLWW
4
3
Niet-geautoclaveerd SLWW
Selectief
2
Niet-gautoclaveerd SLWW
Totaal kiemgetal
1
NG
0
0
1
2
NG
6
9
13
22
Incubatietijd (dagen)
KVE (Log/ml)
Figuur 14: Aantal cellen van Ps. aeruginosa in de biofilm in functie van de incubatietijd na inoculatie met
log 6, n = 2, NG = niet getest, DL = 1,12 log KVE/cm²
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Geautoclaveerd SLWW
Niet-geautoclaveerd SLWW
Selectief
Niet-geautoclaveerd SLWW
Totaal kiemgetal
0
1
2
6
9
13
Incubatietijd (dagen)
Figuur 15: Aantal planktonische cellen van Ps. aeruginosa in functie van de incubatietijd na inoculatie
met log 2, n = 2, DL = 2 log KVE/ml
30
9
8
KVE (Log/cm²)
7
6
Geatoclaveerd SLWW
5
4
Niet-geautoclaveerd SLWW
Selectief
3
Niet-geautoclaveerd SLWW
Totaal kiemgetal
2
1
0
0
1
2
6
9
13
Incubatietijd (dagen)
Figuur 16: Aantal cellen van Ps. aeruginosa in de biofilm in functie van de incubatietijd na inoculatie met
log 2, n = 2, DL = 1,12 log KVE/cm²
1.1.2.
pH verloop
De pH bij het ideale medium steeg langzaam van 7 tot 9 op dag 13 (Figuur 17). Het is wel
opmerkelijk dat tussen dag 0 en 2 de pH niet echt steeg, terwijl de bacteriën wel sterk
toenamen in aantal.
Bij het geautoclaveerde SLWW was er maar weinig variatie in de pH waar te nemen. Voor
beide inoculumsterktes schommelde de pH rond 6,5. Pas tussen dag 9 en 13 was er bij
beide een lichte stijging waar te nemen.
Bij het niet-geautoclaveerde SLWW verliepen beide inoculumsterktes ongeveer gelijk, en
liepen ze ook samen met de blanco. Ze stegen langzaam van een pH 7 op dag 0 naar
ongeveer 8,5 op dag 13.
10
Ideaal medium log 6
9
8
Geautoclaveerd SLWW log 6
7
pH
6
Niet-geautoclaveerd SLWW
log 6
5
4
Geautoclaveerd SLWW log 2
3
2
Niet-geautoclaveerd SLWW
log 2
1
0
0
1
2
6
9
Incubatietijd (dagen)
13
22
Niet-geatoclaveerd SLWW
Blanco
Figuur 17: pH verloop van Ps. aeruginosa in functie van de incubatietijd
31
1.1.3.
Chemische analyse
De detectielimiet bij de analyses was 0,003 µmol/cm² voor koolhydraten, 0,13 µg/cm² voor
proteïnen en 0,25 µg/cm² voor uronzuren.
Van de drie chemische componenten die geanalyseerd werden maakt Ps. aeruginosa onder
ideale omstandigheden vooral proteïnen aan (Tabel 4). De afname in cellen in de biofilm die
waargenomen werd bij de uitplating (Figuur 14) van het ideale medium werd hier zichtbaar
als een sterke terugval in de concentratie aan proteïnen. De hoogste concentratie aan
proteïnen werd waargenomen op dag 6, waarna de concentratie vrij snel weer daalt. Op dag
13 werd er een lage concentratie aan uronzuren gedetecteerd.
Tabel 4: Chemische analyse van de biofilm gevormd door Ps. aeruginosa geïncubeerd onder ideale
omstandigheden. De statistische analyse werd uitgevoerd met een One-way Anova (n ≥9, α = 0,05) en de
indeling via een Post Hoc Tukey analyse (α = 0,05)
Dag 0
Dag 1
Dag 2
Dag 6
Dag 13
Dag 22
Koolhydraten
(µmol/cm²)
Proteïnen
(µg/cm²)
Uronzuren
(µg/cm²)
<DLa
<DLa
<DLa
<DLa
<DLa
<DLa
<DLa
3,02 ± 0,14b
0,47 ± 0,16c
10,47 ± 0,17d
1,50 ± 0,17e
0,34 ± 0,09c
<DLa
<DLa
<DLa
<DLa
0,28 ± 0,17b
<DLa
In het geautoclaveerde SLWW was er geen al te sterke ontwikkeling van de biofilm waar te
nemen. Er werden geen chemische componenten gedetecteerd, behalve proteïnen op dag 9
(0,14 ± 0,04 µg/cm²) en 13 (0,15 ± 0,06 µg/cm²) bij een log 6 enting, wat eerder lage
concentraties zijn. Dit is in overeenstemming met de microbiologische data, waarbij op alle
analysetijdstippen een constant aantal MO waargenomen werd. De detectie op dag 6 bij de
log 2 enting (0,23 ± 0,14 µg/cm²) zal waarschijnlijk, zoals eerder gezegd, te wijten zijn aan
een verkeerde enting. Bij de log 2 enting was er dus op geen enkele dag chemische
componenten boven de DL detecteerbaar.
Bij het niet-geautoclaveerde SLWW werden er vrij grote concentraties van alle drie de
chemische componenten aangetroffen (Tabel 5). Deze hoge concentraties waren
waarschijnlijk vooral te wijten aan de andere bacteriën die aanwezig waren naast Ps.
aeruginosa, want onder de gelijkaardige omstandigheden in het geautoclaveerde SLWW
was er enkel op het einde een kleine productie van proteïnen. Onder ideale omstandigheden
(Tabel 4) was er geen productie van koolhydraten en uronzuren, dus het is onwaarschijnlijk
dat Ps. aeruginosa deze hier wel zal produceren. De chemische analyses van de blanco’s
leverde gelijkaardige resultaten op als bij de geënte SLWW incubaties.
32
Tabel 5: Chemische analyse van de biofilm gevormd door Ps. aeruginosa geïncubeerd bij 8°C in nietgeautoclaveerd SLWW. De blanco’s zijn niet geënt, enkel de bacteriën die van nature voorkomen op
sla zijn erin aanwezig. Bij de koolhydraten zijn niet alle dagen normaal verdeeld, dus werd KruskalWallis 1-way Anova toegepast (α = 0,05) met een Pairwise Comparisons. Bij de proteïnen en uronzuren
werd een One-way Anova gebruikt met een Tukey Post Hoc analyse (α = 0,05)
Dag 0
Dag 1
Dag 2
Dag 6
Dag 9
Dag 13
1.2.
Inoculumsterkte
(KVE/ml)
Koolhydraten
(µmol/cm²)
Proteïnen
(µg/cm²)
Uronzuren
(µg/cm²)
Blanco
Log 2
Log 6
Blanco
Log 2
Log 6
Blanco
Log 2
Log 6
Blanco
Log 2
Log 6
Blanco
Log 2
Log 6
Blanco
Log 2
Log 6
<DL
<DLa
<DLa
0,013 ± 0,003
<DLa
<DLa
0,042 ± 0,014
0,029 ± 0,009ac
0,004 ± 0,001ab
0,086 ± 0,009
0,073 ± 0,011ad
0,104 ± 0,031bd
0,107 ± 0,016
0,103 ± 0,010bcd
0,107 ± 0,020bcd
0,101 ± 0,031
0,114 ± 0,019bcd
0,105 ± 0,007bcd
0,39 ± 0,01
0,27 ± 0,02a
0,36 ± 0,08a
2,32 ± 0,08
2,11 ± 0,05b
1,50 ± 0,17ab
8,30 ± 0,21
8,09 ± 0,41c
7,51 ± 0,95c
8,95 ± 0,66
9,45 ± 1,48d
10,63 ± 0,71d
7,37 ± 0,48
7,20 ± 0,42c
8,34 ± 0,55c
7,18 ± 0,79
7,54 ± 0,35c
8,34 ± 0,57c
<DL
<DLa
<DLa
1,66 ± 0,27
<DLa
<DLa
1,62 ± 0,28
0,31 ± 0,08ab
<DLa
8,54 ± 0,30
0,58 ± 0,05b
1,54 ± 0,58c
3,75 ± 0,13
0,49 ± 0,10b
0,42 ± 0,16b
3,08 ± 0,08
0,64 ± 0,05b
0,60 ± 0,12b
Pediococcus pentosaceus
In de onderstaande punten wordt het batch experiment met Pediococcus pentosaceus
besproken. Er werden drie verschillende media getest namelijk ideaal medium (MRS) bij
ideale temperatuur (30°C), geautoclaveerd SLWW bij 8°C en niet-geautoclaveerd SLWW bij
8°C. Verder werd er bij de niet-ideale media twee inoculumsterktes getest, namelijk log 2 en
log 6. In bijlage 3 werden enkele afbeeldingen opgenomen van de bekomen biofilms.
De data van het ideale medium is in dit gedeelte afkomstig uit Gözetici (2015). Hierbij werd
dag 9 niet getest, maar liep het experiment tot dag 22.
Bij het ideale medium werd er geënt met 6,35 ± 0,09 log KVE/ml. Bij het geautoclaveerde
SLWW was de inoculumsterkte 6,46 ± 0,14 log KVE/ml voor de log 6 en voor de log 2
bedroeg deze 2,46 ± 0.14 log KVE/ml. Bij het experiment met niet-geautoclaveerde SLWW
was dit 6,39 ± 0,02 log KVE/ml voor log 6 en 2,39 ± 0,02 log KVE/ml voor de log 2 enting.
33
1.2.1.
Microbiologie
Onder ideale groeiomstandigheden werd er planktonisch een goede ontwikkeling van P.
pentosaceus waargenomen, waarbij al na dag 1 de maximale concentratie van iets meer dan
9 log KVE/ml bereikt werd (Figuur 18). Deze bleef min of meer behouden tot dag 6, waarna
de bacteriën begonnen af te sterven. Hierdoor bleef er op dag 22 ongeveer 2,5 log KVE/ml
over. In de biofilm was er een snelle vasthechting te zien, met een maximale concentratie na
dag 2 van iets meer dan 7 log KVE/cm² (Figuur 19). Daarna begonnen de bacteriën in de
biofilm snel af te sterven, waardoor op dag 13 in nog maar één container bacteriën
aangetroffen werden in de biofilm. Op dag 22 was er geen detectie meer van bacteriën.
In het geautoclaveerde SLWW met 6 log enting was er planktonisch maar weinig groei waar
te nemen, enkel tussen dag 2 en 6 nam de concentratie met ongeveer 1 log toe om daarna
weer te stabiliseren op ongeveer 6 log KVE/ml tot 13 dagen incubatie (Figuur 18). De
concentratie van bacteriën in de biofilm steeg over de volledige periode, van 3 log KVE/cm²
tot een maximum op dag 13 van bijna 6 log KVE/cm² (Figuur 19).
Bij de log 2 enting in het geautoclaveerde SLWW (Figuur 20) gedroegen de bacteriën zich
anders dan bij de log 6 enting (Figuur 18). Bij de log 6 werd er gestart met een hoge
concentratie aan planktonische bacteriën die min of meer behouden bleef. Bij de log 2 enting
werd er gestart van een veel lagere concentratie (niet detecteerbaar), maar deze groeiden
langzaam uit, tot er op dag 13 ongeveer dezelfde concentratie bereikt werd als bij de log 6
enting. De bacteriën in de biofilm waren in het begin te laag om te detecteren, maar vanaf
dag 9 werden er constant bacteriën aangetroffen (Figuur 21). Op dag 1 werd er ook in één
container aanhechting van bacteriën vastgesteld, maar aangezien dat in de twee dagen erna
geen detectie was, zal dit waarschijnlijk te wijten zijn aan contaminatie. Op dag 13 werd zelfs
dezelfde concentratie aan bacteriën in de biofilm gedetecteerd als bij de log 6 enting.
In het niet-geautoclaveerde SLWW met log 6 enting was er tussen dag 1 en 2 even groei van
de planktonische cellen van P. pentosaceus, tot iets meer dan 5 log KVE/ml (Figuur 18).
Deze concentratie bleef behouden tot dag 9, op dag 13 was er een lichte afname tot 4 log
KVE/ml. Het totale kiemgetal nam toe tot dag 2, waarna het ook begon af te nemen. In de
biofilm groeide P. pentosaceus niet al te sterk tot dag 1, waarna er een sterke toename was
op dag 2 tot iets meer dan 5 log KVE/cm² (Figuur 19). Deze concentratie bleef min of meer
behouden tot dag 9, om dan op dag 13 te dalen tot 4 log KVE/cm². Het totale kiemgetal in de
biofilm nam snel toe tussen dag 0 en 1, en bereikte op dag 2 een maximum van iets meer
dan 7 log KVE/cm². Deze concentratie bleef behouden tot dag 13.
Bij log 2 enting in niet-geautoclaveerd SLWW vertoonde het planktonisch totale kiemgetal
ongeveer hetzelfde verloop als bij de log 6 enting (Figuur 20). Tussen dag 2 en dag 6
groeide P. pentosaceus snel uit tot ongeveer dezelfde concentratie als bij de log 6 op dag 6.
Dus ook hier groeide het MO opnieuw uit van een veel kleinere concentratie naar dezelfde
concentratie als deze verkregen bij een hogere enting concentratie. Hetzelfde patroon was te
vinden bij de biofilm (Figuur 21), waar op dag 0 en 1 P. pentosaceus niet gevonden werd,
maar op dag 2 dezelfde concentratie gedetecteerd werd als bij de log 6 enting. Het totale
kiemgetal in de biofilm had ongeveer hetzelfde verloop als deze in de log 6 enting.
34
KVE (Log/ml)
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Ideaal medium
Geautoclaveerd SLWW
Niet-geautoclaveerd SLWW
Selectief
NG
0
1
2
NG
6
9
13
Niet-geautoclaveerd SLWW
Totaal kiemgetal
22
Incubatietijd (dagen)
Figuur 18: Aantal planktonische cellen van P. pentosaceus in functie van de incubatietijd na inoculatie
met log 6, n = 2, NG = niet getest, DL = 2 log KVE/ml
9
8
KVE (Log/cm²)
7
Ideaal medium
6
5
Geatoclaveerd SLWW
4
3
Niet-geautoclaveerd SLWW
Selectief
2
1
NG
NG
0
0
1
2
6
9
13
Niet-geautoclaveerd SLWW
Totaal kiemgetal
22
Incubatietijd (dagen)
Figuur 19: Aantal cellen van P. pentosaceus in de biofilm in functie van de incubatietijd na inoculatie met
log 6, n = 2, NG = niet getest, DL = 1,12 log KVE/cm²
35
KVE (Log/ml)
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Geautoclaveerd SLWW
Niet-geautoclaveerd SLWW
Selectief
Niet-geautoclaveerd SLWW
Totaal kiemgetal
0
1
2
6
9
13
Incubatietijd (dagen)
Figuur 20: Aantal planktonische cellen van P. pentosaceus in functie van de incubatietijd na inoculatie
met log 2, n = 2, DL = 2 log KVE/ml
9
8
KVE (Log/cm²)
7
6
Geautoclaveerd SLWW
5
4
Niet-geautoclaveerd SLWW
Selectief
3
Niet-geautoclaveerd SLWW
Totaal kiemgetal
2
1
0
0
1
2
6
9
13
Incubatietijd (dagen)
Figuur 21: Aantal cellen van P. pentosaceus in de biofilm in functie van de incubatietijd na inoculatie met
log 2, n = 2, DL = 1,12 log KVE/cm²
1.2.2.
pH verloop
In het ideale medium daalde de pH al na één dag van 6 tot ongeveer 4. Vanaf dag 2 bleef de
pH ongeveer constant rond vier.
Bij het geautoclaveerde SLWW liep de pH van log 2 en log 6 tot dag 6 vrij gelijk, maar na
dag 6 daalde de pH bij log 6 enting vrij sterk. Op dag 13 was de pH 6,21 ± 1,05 doordat één
container een veel hogere pH had dan de andere. Waarschijnlijk ging de daling die gestart
was na dag 9 zich doorzetten. Deze daling komt ietwat overeen met de langzame groei die
zichtbaar is van de planktonische bacteriën naar het einde toe. Bij de log 2 zette een
langzame daling zich in, wat ook te zien is door de toename aan planktonische bacteriën.
36
Bij het niet-geautoclaveerde SLWW was er een constante stijging te zien bij beide inoculum
sterktes die gelijk loopt met de geteste blanco’s. De pH steeg tijdens de incubatie van iets
meer dan 7 tot iets boven 8.
9
Ideaal medium log 6
8
7
Geautoclaveerd SLWW log 6
pH
6
5
4
Niet-geautoclaveerd SLWW
log 6
3
Geautoclaveerd SLWW log 2
2
Niet-geautoclaveerd SLWW
log 2
1
0
0
1
2
6
9
13
22
Incubatietijd (dagen)
Niet-geautoclaveerd SLWW
Blanco
Figuur 22: pH verloop P. pentosaceus in functie van de incubatietijd
1.2.3.
Chemische analyse
De detectielimiet bij de analyses is 0,003 µmol/cm² voor koolhydraten, 0,13 µg/cm² voor
proteïnen en 0,25 µg/cm² voor uronzuren.
Bij chemische analyse van de biofilm gevormd onder ideale omstandigheden (Tabel 6)
werden er vooral proteïnen gevonden, maar in vrij kleine concentraties. Na dag 2 blijft de
concentratie van de proteïnen ongeveer constant. Enkel op dag 0 werden koolhydraten
gevonden, terwijl uronzuren geen enkele keer gedetecteerd werden.
Tabel 6: Chemische analyse van de biofilm gevormd door P. pentosaceus geïncubeerd onder ideale
omstandigheden. De statistische analyse werd uitgevoerd met een One-way Anova (n ≥9, α = 0,05) en de
indeling via een Post Hoc Tukey analyse (α = 0,05)
Dag 0
Dag 1
Dag 2
Dag 6
Dag 13
Dag 22
Koolhydraten
(µmol/cm²)
Proteïnen
(µg/cm²)
Uronzuren
(µg/cm²)
0,006 ± 0,004a
<DLb
<DLb
<DLb
<DLb
<DLb
<DLa
0,18 ± 0,02b
0,33 ± 0,10c
0,43 ± 0,13c
0,37 ± 0,12c
0,27 ± 0,05b
<DLa
<DLa
<DLa
<DLa
<DLa
<DLa
In geautoclaveerd SLWW bevat de biofilm, gevormd door P. pentosaceus, zeer weinig
detecteerbare chemische componenten. Bij beide entingen werd er enkel maar op dag 13
een lage concentratie aan proteïnen aangetroffen, namelijk 0,14 ± 0,08 µg/cm² voor de log 2
inoculumsterkte en 0,51 ± 0,41 µg/cm² voor de log 6 inoculumsterkte.
37
Deze concentraties zijn niet significant verschillend van elkaar. De twee andere
componenten, koolhydraten en uronzuren, werden geen enkele keer boven de DL
waargenomen.
In het niet-geautoclaveerde SLWW werden er naast vrij hoge concentraties aan proteïnen
ook vaak koolhydraten gedetecteerd en af en toe uronzuren. Er was al vanaf dag 0 detectie
van proteïnen, de concentratie daarvan steeg tot dag 2, waarna de concentratie constant
bleef tot dag 6. Na dag 6 daalt de concentratie langzaam. Koolhydraten werden bij de log 6
enting waargenomen vanaf dag 1, bij de log 2 maar vanaf dag 2. Na dag 2 bleef de
concentratie bij beide vrij constant. Uronzuren werden op sommige dagen gedetecteerd bij
de log 6 enting. De chemische analyse van de blanco leverde zowat hetzelfde verloop op als
de geënte containers. Alleen lijken de concentraties, vooral van de proteïnen, een stuk lager
te zijn dan bij de geënte containers.
Tabel 7: Chemische analyse van de biofilm gevormd door P. pentosaceus geïncubeerd bij 8°C in nietgeautoclaveerd SLWW. De blanco’s zijn niet geënt, enkel de bacteriën die van nature voorkomen op
sla zijn erin aanwezig. de statistische analyse werd uitgevoerd met een One-way Anova (n ≥9, α = 0,05)
en de indeling via een Post Hoc Tukey analyse (α = 0,05)
Dag 0
Dag 1
Dag 2
Dag 6
Dag 9
Dag 13
Inoculumsterkte
(KVE/ml)
Koolhydraten
(µmol/cm²)
Proteïnen
(µg/cm²)
Uronzuren
(µg/cm²)
Blanco
Log 2
Log 6
Blanco
Log 2
Log 6
Blanco
Log 2
Log 6
Blanco
Log 2
Log 6
Blanco
Log 2
Log 6
Blanco
Log 2
Log 6
NG
<DLa
<DLa
NG
<DLa
0,005 ± 0,002a
0,005 ± 0,001
0,007 ± 0,001b
0,008 ± 0,003b
NG
0,011 ± 0,004bc
0,015 ± 0,005c
0,007 ± 0,000
0,013 ± 0,003bc
0,014 ± 0,001c
0,006 ± 0,003
0,0013 ± 0,004bc
0,010 ± 0,002bc
NG
0,31 ± 0,06a
0,27 ± 0,03a
NG
2,74 ± 0,75b
3,86 ± 0,26b
2,87 ± 0,08
6,79 ± 0,81d
5,69 ± 1,67cd
NG
4,32 ± 0,97bc
5,96 ± 1,78cd
2,50 ± 0,13
3,63 ± 0,49b
4,22 ± 0,28bc
2,10 ± 0,42
2,91 ± 0,78b
3,36 ± 0,28b
NG
<DLa
<DLa
NG
<DLa
<DLa
<DL
<DLa
0,54 ± 0,11b
NG
<DLa
<DLa
0,98 ± 0,03
<DLa
0,67 ± 0,23b
<DL
<DLa
<DLa
38
2.
Dynamisch systeem
Het dynamisch systeem werd enkel getest met Pseudomonas aeruginosa. Er werd gekozen
om het systeem te testen met dit organisme omdat het zeker is dat deze in staat is om een
biofilm te gaan vormen. Dit bleek uit de experimenten in het batch systeem en werd al
uitgebreid beschreven in de literatuur. Alle drie de eerder gebruikte media werden gebruikt in
het systeem. In de bijlage werden enkele afbeeldingen opgenomen van de verkregen
biofilms.
2.1.
Microbiologie
De inoculum sterkte bij het ideale medium bedroeg 6,68 ± 0,07 log KVE/ml, bij het
geautoclaveerde SLWW was dit 6,46 ± 0,15 log KVE/ml en voor het niet-geautoclaveerde
SLWW was de inoculum sterkte 6,79 ± 0,08 log KVE/ml.
Per dag werd er één plaatje verwijderd uit de reactor en geanalyseerd.
In Figuur 23 worden de data weergegeven van de planktonische bacteriën in het dynamisch
systeem in verschillende media. In ideale omstandigheden was er een snelle groei na dag 1,
maar hierna begon er een langzame afname. Deze werd waarschijnlijk veroorzaakt door
contaminatie in een fles met vers medium, waardoor de nutriënten waarschijnlijk al
grotendeels verbruikt waren voordat ze in de reactor kwamen. Dit zal waarschijnlijk ook de
verklaring zijn voor de daling in de concentratie aan bacteriën in de biofilm van het ideale
medium in Figuur 24.
Bij het geautoclaveerd SLWW duurde het tot dag 6 om een duidelijke toename te zien in het
aantal planktonische bacteriën. Waarschijnlijk hadden de bacteriën die tijd nodig om zich aan
te passen aan de niet-ideale omstandigheden, wat een langere lag-fase reflecteert. De
aantallen in de biofilm namen toe tot dag 2 en bleven daarna constant tot dag 6 rond 8 log
KVE/cm².
In het niet-geautoclaveerde SLWW was er bij de selectieve uitplatingen een ongeveer
constante concentratie aan Ps. aeruginosa te zien van ongeveer 6 log KVE/ml aan
planktonische cellen. Het totale kiemgetal steeg echter met bijna 2 log in de loop van de
incubatie tot iets meer dan 8 KVE log/ml. In de biofilm steeg de concentratie aan Ps.
aeruginosa constant van 3 log KVE/cm² tot 6 log KVE/cm². Gelijktijdig nam het totale
kiemgetal van 3,5 log KVE/cm² toe tot 7,6 log KVE/cm². De biofilm groeide dus aan tijdens
de volledige duur van de incubatie.
39
KVE (Log/ml)
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Ideaal medium
Geautoclaveerd SLWW
Niet-geautoclaveerd SLWW
selectief
Niet-geautoclaveerd SLWW
totaal kiemgetal
0
1
2
3
6
Incubatietijd (dagen)
Figuur 23: Aantal planktonische cellen in het dynamisch systeem van Ps. aeruginosa in functie van de
incubatietijd na inoculatie met log 6, n = 1, DL = 2 log KVE/ml
9
8
KVE (Log/cm²)
7
Ideaal medium
6
5
Geautoclaveerd SLWW
4
3
Niet-geautoclaveerd SLWW
Selectief
2
Niet-geatoclaveerd SLWW Totaal
kiemgetal
1
0
0
1
2
3
6
Incubatietijd (dagen)
Figuur 24: Aantal cellen in het dynamisch systeem van Ps. aeruginosa in de biofilm in functie van de
incubatietijd na inoculatie met log 6, n = 1, DL = 1,38 log KVE/cm²
2.2.
pH verloop
De pH metingen bevestigen grotendeels de planktonische bacterie tellingen. Alleen voor het
ideaal medium is de initiële daling wat moeilijker te verklaren. Mogelijk is deze veroorzaakt
door de contaminatie in de voedingsfles, want bij de groei van Ps. aeruginosa wordt er
ammonium geproduceerd waardoor een stijging in de pH wordt verwacht. De verwachte
stijging wordt dan wel licht waargenomen in de volgende dagen, maar het is vrij normaal dat
deze niet al te sterk is door de verversing van het medium.
In het geautoclaveerd SLWW wordt er maar op de 6de dag een stijging in de pH
waargenomen, wat gelijk valt met de toename in bacterie concentratie op dag 6.
40
In het niet-geautoclaveerde SLWW is er eerst een kleine daling door zuurproductie,
waarschijnlijk door melkzuurbacteriën die van nature aanwezig zijn op de sla. Daarna is er
een kleine stijging waar te nemen, waarschijnlijk door de productie van ammonium door Ps.
aeruginosa. Vanaf dag 3 neemt de planktonische concentratie namelijk niet meer af,
waardoor er dus groei moet geweest zijn. Indien er geen groei zou zijn, dan zal de
concentratie van de bacteriën dalen door het verversen van het medium.
Voor alle drie de media verschilt de pH tussen het begin en eind van de incubatie niet sterk,
wat normaal is door de verversing van het medium.
9
8
7
pH
6
5
Ideaal medium
4
Geutoclaveerd SLWW
3
Niet-geautoclaveerd SLWW
2
1
0
0
1
2
3
6
Incubatietijd (dagen)
Figuur 25: pH verloop dynamisch systeem in functie van de incubatietijd
2.3.
Chemische analyse
De detectielimiet bij de analyses is 0,005 µmol/cm² voor koolhydraten; 0,24 µg/cm² voor
proteïnen en 0,45 µg/ cm² voor uronzuren. Deze detectielimieten zijn anders dan die voor het
batch systeem, dit komt doordat de initiële concentratie bepaling gebeurt per ml en daarna
wordt deze omgerekend naar cm². Doordat de plaatjes in het dynamisch systeem een
andere oppervlak hebben, is de DL hier anders, maar per ml is de DL hetzelfde als bij de
voorgaande analyses.
Bij de chemische analyses wordt er geen dag 0 weergeven. De absorbantie die van dit staal
verkregen werd, is gebruikt als blanco. Dit houdt in dat de absorbanties van de volgende
dagen verminderd werden met de absorbantie van het staal van dag 0, en de concentraties
van de stoffen berekend werden op basis van dit verschil. Het staal voor dag 0 werd
genomen kort na de inoculatie, waardoor er nog geen biofilmvorming mogelijk was geweest.
De chemische analyse van de biofilms gevormd in ideale omstandigheden vertoont vooral
een hoge concentratie aan proteïnen, met een afname in concentratie op dag 2 en 3. Op dag
6 wordt de hoogste concentratie aan proteïnen waargenomen, bijna 50 µg/cm². Met
uitzondering van dag 2 is er ook iedere dag detectie van koolhydraten. Op dag 6 worden ook
uronzuren waargenomen. Wel was er tijdens het uitvoeren van dit experiment contaminatie
opgetreden, wat een invloed kan hebben op de samenstelling van de biofilm.
41
Bij het geautoclaveerde SLWW duurt het iets langer voor er detectie is van de chemische
componenten, maar de concentraties aan koolhydraten en proteïnen die gevonden worden
op dag 2 zijn direct vrij hoog. Op dag 6 wordt de hoogste concentratie aan koolhydraten
waargenomen, namelijk 0,124 µg/ml. Dit alles wijst op een zeer goed ontwikkelde biofilm.
In de biofilm gevormd in het niet-geautoclaveerde SLWW is er vanaf dag 1 detectie van
proteïnen. De concentratie aan proteïnen blijft stijgen tijdens de loop van de incubatie, maar
in vergelijking met de twee andere media getest in het dynamisch systeem blijft de
concentratie vrij laag. Koolhydraten worden pas gedetecteerd vanaf dag 3 en uronzuren
worden niet gedetecteerd.
Tabel 8: Chemische analyse van de biofilm gevormd in het dynamisch systeem door Ps. Aeruginosa
geïncubeerd onder verschillende omstandigheden, n = 1
Dag 1
Dag 2
Dag 3
Dag 6
Ideaal medium
Geautoclaveerd SLWW
Niet-geautoclaveerd SLWW
Ideaal medium
Geautoclaveerd SLWW
Niet-geautoclaveerd SLWW
Ideaal medium
Geautoclaveerd SLWW
Niet-geautoclaveerd SLWW
Ideaal medium
Geautoclaveerd SLWW
Niet-geautoclaveerd SLWW
Koolhydraten
(µmol/cm²)
Proteïnen
(µg/cm²)
Uronzuren
(µg/cm²)
0,022
<DL
<DL
<DL
0,024
<DL
0,007
0,011
0,009
0,058
0,124
0,036
7,71
<DL
0,24
0,38
5,09
1,49
0,97
5,84
0,81
49,29
40,20
12,44
<DL
<DL
<DL
<DL
<DL
<DL
<DL
<DL
<DL
1,20
1,90
<DL
42
3.
Invloed van het oppervlak op de detectie van de chemische
componenten
3.1.
Pseudomonas aeruginosa
Bij de testen werden iedere dag vijf containers geanalyseerd. Er werden twee
stomacherzakken gemaakt met één plaatje in en één met vier plaatjes. De concentratie aan
planktonische bacteriën werd ook bepaald door vanuit twee van de containers een staal te
nemen en dit te verdunnen en uit te platen op BHI (Figuur 28 in bijlage 2). Ook de
concentratie aan bacteriën in de biofilm werd bepaald, de data hiervan staat in Figuur 29 in
bijlage 2.
Het inoculum had een sterkte van 6,79 ± 0,11 log KVE/ml. Bij dit experiment werd er niet
ververst na 4 uur. Het staal van dag 0 werd direct na inoculatie genomen.
De microbiologische data is vrij gelijklopend in vergelijking met het vorige experiment (Figuur
13 en Figuur 14). De concentratie aan planktonische cellen neemt hier wel al af na dag 2,
terwijl in het ander experiment dit maar na dag 6 gebeurde. De concentraties in de biofilm
zijn vrij gelijk, alleen de afname op dag 2 is hier niet te zien.
Uit de resultaten in Tabel 9 blijkt dat bij gebruik van een groter oppervlak de chemische
componenten beter kunnen gedetecteerd worden. Na het omrekenen naar een concentratie
per oppervlakte eenheid blijkt er hier wel maar weinig verschil in te zitten. Wel is het zo dat
het vergroten van de te analyseren oppervlakte het makkelijker maakt om betrouwbare
detectie te krijgen van de componenten. Het vergroten van het oppervlak is echter niet altijd
evident in de realiteit. Opvallend in deze data is dat hier bij de testen met één plaatje er
koolhydraten in concentraties boven de DL gevonden worden, terwijl dit in Tabel 4 niet het
geval is. Verder is nog te zien dat vanaf dag 2 de concentraties per cm² voor één plaatje een
stuk hoger liggen dan deze van vier plaatjes. Als er verder vergeleken wordt met de data uit
Tabel 4 is duidelijk te zien dat de verkregen concentraties voor één plaatje op dag 1 en 2
hoger zijn dan de vorige keer, en op dag 6 dan weer een heel stuk lager. Ook de afname op
dag 2, zoals die te zien is in het vorige batch experiment en dynamisch systeem, is hier niet
aanwezig.
Tabel 9: Chemische analyse van verschillende oppervlaktes van inoxplaatjes op de biofilm gevormd door
Ps. aeruginosa geïncubeerd onder ideale omstandigheden, n = 1
Oppervlakte
Dag 0
Dag 1
Dag 2
Dag 6
Koolhydraten
µmol/ml
µmol/cm²
Proteïnen
Uronzuren
µg/ml
µg/cm²
µg/ml
µg/cm²
37,5 cm²
< DL
< DL
< DL
< DL
< DL
< DL
150 cm²
< DL
< DL
< DL
< DL
< DL
< DL
37,5 cm²
0,101
0,014
54,58
7,28
< DL
< DL
150 cm²
0,330
0,011
199,22
6,64
< DL
< DL
37,5 cm²
0,334
0,045
116,81
15,57
< DL
< DL
150 cm²
0,596
0,020
242,23
8,07
6,11
0,20
37,5 cm²
0,035
0,005
14,67
1,96
< DL
< DL
150 cm²
0,402
0,013
47,97
1,60
< DL
< DL
43
3.2.
Pediococcus pentosaceus
Voor P. pentosaceus werd er enkel een analyse uitgevoerd op dag 6 in ideale
omstandigheden. De incubatie vond dus plaats in MRS medium bij 30°C. Bij de analyse
werden er geen koolhydraten aangetroffen bij een oppervlak van 150 cm². Wel werd er bij
het oppervlak van 150 cm² uronzuren aangetroffen met een concentratie van 0,22 ± 0,08
µg/cm², wat maar net boven de DL ligt. Er zal dus een groot oppervlak moeten bemonsterd
worden om detecteerbare concentraties te verkrijgen voor deze component. Voor proteïnen
werd er enkel bij vier plaatjes een detecteerbare concentratie aangetroffen, namelijk 0,12 ±
0,02 µg/cm².
44
IV.
Discussie
Pseudomonas aeruginosa werd bij deze experimenten vooral gebruikt als een referentieorganisme omdat het gekend staat als een goede biofilmvormer (Batt & Tortorello, 2014,
Lawley et al., 2012). Daarnaast komt dit MO ook courant voor op groenten, en dan vooral op
groene bladgroenten, wat het MO voor de uitgevoerde experimenten erg geschikt maakt
(Holvoet, 2014, Van Haute et al., 2015). Het organisme vertoonde onder ideale
groeiomstandigheden een goede groei, zowel planktonisch als in de biofilm (Figuur 13 en
Figuur 14). De vaststelling dat er vastgehechte bacteriën op het plaatje aanwezig waren in
combinatie met de detectie van proteïnen in Tabel 4, bevestigd dat Ps. aeruginosa in staat is
om een biofilm te vormen. In het experiment met een groter oppervlak (Tabel 9) werden er
naast proteïnen ook koolhydraten gedetecteerd. Hierdoor kunnen deze, naast proteïnen, een
bruikbare chemische indicator zijn voor een biofilm van Ps. aeruginosa. Bij dit experiment
waren de proteïnen wel het makkelijkst te detecteren doordat ze in grotere hoeveelheden en
bij iedere test aangemaakt werden in het batch systeem. Proteïnen en koolhydraten komen
niet enkel voor in biofilms, maar kunnen ook vanuit de omgeving aanwezig zijn. Daarom zijn
ze geen perfecte indicatoren, maar in combinatie met vastgehechte bacteriën geven ze wel
een goede indicatie voor de aanwezigheid van een biofilm.
Pediococcus pentosaceus werd voor de experimenten geselecteerd omdat het een vrij vaak
voorkomend bederf- organisme is voor groenten en fruit (Batt & Tortorello, 2014, Madigan et
al., 2010). Verder werd door Wirtanen & Mattila-Sandholm (1994) gerapporteerd dat het MO
in staat is om een biofilm te vormen. Over de biofilmvormende capaciteit van P. pentosaceus
is verder nog niet zeer veel gekend. Onder ideale omstandigheden in het batch systeem
vertoonde de bacterie een goede groei, zowel planktonisch als in de biofilm (Figuur 18 en
Figuur 19). De chemische analyse van de EPS in Tabel 6 geeft aan dat vooral proteïnen een
bruikbare indicator kunnen zijn voor een biofilm gevormd door P. pentosaceus. Bij het
experiment met een groter oppervlak in het batch systeem (paragraaf III.3.2) worden er ook
uronzuren gedetecteerd. Dit is een iets betere indicator dan proteïnen, omdat uronzuren iets
specifieker zijn voor een biofilm, ook al kunnen ze nog altijd uit de omgeving komen. Wel is
er een groter oppervlak nodig om een betrouwbare detectie te hebben van uronzuren.
Hierdoor zullen proteïnen de meest praktische indicator zijn voor een biofilm van P.
pentosaceus in combinatie met vastgehechte bacteriën.
In vergelijking met Ps. aeruginosa is P. pentosaceus een slechtere biofilmvormer. De
hoeveelheden EPS die aangemaakt werden lagen namelijk een stuk lager. Dit zal ervoor
zorgen dat de biofilm minder stevig is waardoor de bacteriën minder goed beschermd zijn
tegen de factoren uit de omgeving.
Vanuit alle verkregen data is het duidelijk dat zowel P. aeruginosa, P. pentosaceus en de
bacteriën die van nature aanwezig zijn op sla nog in staat zijn om een biofilm te vormen bij
lagere temperaturen, hier ongeveer 8°C. Bij een lagere temperatuur gaan werken is bijgevolg
geen geschikte methode om biofilmvorming tegen te gaan. Het echte effect van de lagere
temperatuur is vanuit de verkregen data niet te achterhalen. De verschillen met de ideale
omstandigheden kunnen zowel veroorzaakt zijn door de lagere temperatuur als de nietideale nutriënten toevoer, of een combinatie van beide. Voor Ps. aeruginosa is de lage
temperatuur sowieso al een knelpunt, aangezien het bekend is dat het MO een sterk
gereduceerde groei vertoont bij lage temperaturen (Batt & Tortorello, 2014).
45
Voor P. pentosaceus is er voor de gebruikte temperatuur geen data gevonden. Wel is er
groei gekend bij 10°C, dus zal de bacterie bij 8°C wellicht nog in staat zijn om te groeien
(Blickstad & Molin, 1981).
Er zijn reeds een aantal studies beschikbaar rond de ontwikkeling van biofilms bij lage
temperaturen. Zo rapporteerden Liu et al. (2015) dat Pseudomonas lundensis bij 10°C en
4°C meer EPS vormde dan bij 30°C, maar dat de concentratie aan bacteriën in de biofilm wel
lager was. Het duurde ook langer vooraleer de biofilm zich ontwikkelde. Wel waren de
maximale hoeveelheden EPS die gevormd werden hoger dan bij 30°C, ondanks het feit dat
Ps. lundensis volgens de literatuur niet kan groeien bij deze lagere temperaturen. De
bepaling van de hoeveelheden EPS gebeurde spectrofotometrisch na kleuring met
Kristalviolet. Er werd niet gecontroleerd of er een verschil in samenstelling was.
Belessi et al. (2011) en Di Bonaventura et al. (2008) hebben de invloed van lagere
temperaturen getest op de vorming van biofilms door Listeria monocytogenes. Beiden
rapporteerden dat L. monocytogenes in staat is om biofilms te vormen bij lage temperaturen
(5°C en 4°C respectievelijk). Belessi et al. (2011) rapporteerden dat de concentratie aan
vastgehechte cellen hoger was bij 20°C (na 12 dagen incubatie) dan bij 5°C (na 19 dagen
incubatie). Hun verklaring hiervoor is dat er bij 20°C meer flagella gevormd worden,
waardoor de vasthechting aan een oppervlak beter verloopt. De biofilm gevormd bij 20°C
was daarnaast minder vatbaar voor de inwerking van desinfectantia. Di Bonaventura et al.
(2008) rapporteerden dat bij lage temperaturen de biofilmvorming op glas veel beter verloopt
dan op roestvrij staal en polystyreen. Er werden verschillende serotypes getest, waarbij er
onderling vrij grote verschillen werd gedetecteerd in biofilmproductie, vooral bij hogere
temperaturen. De lage temperaturen verminderen dus de waargenomen verschillen in
biofilmvorming tussen de verschillende serotypes.
Bij de bovenstaande MO is het effect van de temperatuur dus verschillend. P. lundensis
vormt bij lagere temperatuur meer biofilm, terwijl L. monocytogenes meer biofilm vormt bij
kamertemperatuur. Het effect van temperatuur zal dus verschillen van organisme tot
organisme. Ook het serotype en de voorgeschiedenis van de streng zullen een invloed
hebben.
Bijkomend werd nagegaan of de initiële concentratie aan bacteriën een invloed heeft op de
ontwikkeling van de biofilm. Over het algemeen werd er waargenomen dat bij een log 2
inoculumsterkte de ontwikkeling trager verliep of er zelfs bijna geen ontwikkeling was. Vooral
bij Ps. aeruginosa werd er bij de lage inoculumsterkte weinig ontwikkeling waargenomen in
niet-ideale omstandigheden. In tegenstelling tot Ps. aeruginosa lijkt P. pentosaceus zich
sneller te kunnen ontwikkelen bij een lagere enting concentratie. De planktonische uitgroei in
het geautoclaveerde SLWW begon vanaf dag 6 en op dag 13 bereikte deze dezelfde
concentratie als de log 6 enting op dag 13 (Figuur 18 en Figuur 20). Ook de biofilm
ontwikkelde zich, tussen dag 9 en 13 groeide deze aan tot hetzelfde niveau als de log 6
enting (Figuur 19 en Figuur 21). Ook in het niet-geautoclaveerde SLWW was dezelfde trend
te zien. Er was in het begin namelijk geen detectie op de selectieve platen van de biofilm bij
de log 2 waar te nemen, waarna een opbouw begon tot hetzelfde niveau bereikt werd als bij
de log 6 enting. De chemische analyses in het geautoclaveerde SLWW (III.1.2.3) en nietgeautoclaveerde SLWW (Tabel 7) bevestigen dat er geen significante verschillen zijn tussen
beide inoculumsterktes.
46
Dit houdt in dat voor P. pentosaceus de initiële concentratie weinig uitmaakt voor het effect
over langere tijd. Uit alle data blijkt namelijk dat het organisme in staat is om op een vrij korte
periode uit te groeien vanuit niet detecteerbare concentraties naar een vrij hoge concentratie,
zowel planktonisch als in de biofilm.
In het geautoclaveerde waswater werd er onderzocht hoe goed de bacterie zich kan
aanpassen aan deze nieuwe omstandigheden, zonder dat er concurrentie is van andere
bacteriën. Hiervoor wordt de log 6 enting vergeleken met de ideale omstandigheden, welke
ook geënt werd met log 6.
Voor Ps. aeruginosa werd er een snelle ontwikkeling waargenomen onder ideale
omstandigheden, zowel planktonisch als in de biofilm (Figuur 13 en Figuur 14). Op de latere
dagen was er al afsterving, waarschijnlijk door een gebrek aan nutriënten of een te hoge pH.
Het gebrek aan nutriënten is de meest waarschijnlijk oorzaak, aangezien de pH steeg tot
ongeveer 9 (Figuur 17) en de bovengrens voor groei van Ps. aeruginosa gerapporteerd
wordt op 9,5 (Klein et al., 2009). Deze grens is wel afhankelijk van de voorgeschiedenis van
de streng. De pH stijging wordt veroorzaakt door de productie van ammonium als
afvalproduct van het metabolisme (Baligh et al., 1996). Aangezien het metabolisme vooral
actief is tijdens de groei vormt een pH stijging een indicatie voor de groei van Ps.
aeruginosa. In het geautoclaveerd SLWW was er maar weinig groei zichtbaar, enkel tussen
dag 9 en 13 was er een duidelijke groei waar te nemen (Figuur 13 en Figuur 14) welke ook
gepaard ging met een pH stijging (Figuur 17). De hier gecreëerde omstandigheden waren
dus niet zeer geschikt voor de groei van Ps. aeruginosa. De groei op het einde toont wel aan
dat de bacteriën zich na verloop van tijd konden aanpassen aan de omstandigheden. Dit
ondanks het feit dat het MO normaal een sterk geïnhibeerde groei vertoont bij lage
temperaturen.
P. pentosaceus vertoonde onder ideale omstandigheden een snelle ontwikkeling, zowel
planktonisch als in de biofilm (Figuur 18 en Figuur 19). Na dag 6 daalde de concentratie aan
bacteriën, zowel planktonisch als in de biofilm. In de biofilm was er op dag 22 zelfs geen
detectie meer van MO. De pH daalde al na één dag tot het minimum van 4 en bleef daarna
stabiel. Normaal kan P. pentosaceus groeien als de pH hoger is dan 4,5 en lager dan 8
(Portal, 2015), dus hier zal de afname van groei te wijten zijn aan een te lage pH. Dat ook de
bacteriën in de biofilm afsterven, en zelfs sneller dan de planktonische, zal te wijten zijn aan
de lage EPS productie. In de chemische analyse (Tabel 6) werden er enkel lage
concentraties aan proteïnen gevonden, wat erop wijst dat er maar een dunne EPS laag
gevormd werd, welke niet goed in staat is om de bacteriën af te schermen van de omgeving.
In het geautoclaveerde waswater was het MO in staat om te groeien, maar de groei verliep
een stuk trager dan bij de ideale omstandigheden (Figuur 18). In de biofilm is er een
constante toename aan bacteriën waar te nemen doorheen de volledige incubatieperiode
(Figuur 19), maar deze ging niet gepaard met een grote productie van chemische
componenten (III.1.2.3). Dit wijst erop dat de bacteriën blijven hangen in de eerste fases van
de ontwikkeling van een biofilm (Figuur 1), waarbij er wel vasthechting is maar geen grote
productie van EPS. Daardoor zijn de concentraties te laag om te kunnen detecteren met de
gebruikte chemische analyses.
47
Bij de log 2 enting was er groei waar te nemen, maar was er weinig daling van de pH (Figuur
22). Het is mogelijk dat het SLWW een zekere buffercapaciteit bezit, waardoor de
zuurproductie weinig invloed heeft op de pH. Dit werd echter niet gecontroleerd.
Een ander medium dat gebruikt werd is niet-geautoclaveerd SLWW, waar er naast de geënte
bacteriën ook bacteriën aanwezig zijn die van nature voorkomen op de sla. Met dit SLWW
werd de invloed van andere bacteriën getest op de vorming en de samenstelling van de
EPS.
In het niet-geautoclaveerde SLWW kon Ps. aeruginosa zich planktonisch niet aanpassen en
werd het door de andere bacteriën weggeconcurreerd (Figuur 13). In de biofilm was er een
licht toename aan vastgehechte bacteriën (Figuur 14). Het is mogelijk dat deze toename niet
veroorzaakt is door groei, maar wel door overgaan van planktonische bacteriën naar de
biofilm. Het is namelijk mogelijk dat er vanuit de omgeving extra bacteriën opgenomen
worden in de biofilm (Blaschek et al., 2007, Chmielewski & Frank, 2003, Madigan et al.,
2010). De afwezigheid van groei van Ps. aeruginosa is ook te zien in het pH verloop, welke
volledig samenvalt met de blanco. Indien er een redelijke aangroei van Ps. aeruginosa zou
geweest zijn, zou dit een hogere pH opgeleverd hebben. De bacteriën die afkomstig waren
van de sla groeiden wel goed, wat extra competitie voor nutriënten oplevert. Deze competitie
kan een extra stressfactor opleveren, waardoor de uitgroei van Ps. aeruginosa nog meer
bemoeilijkt wordt. In de biofilm werden alle drie de geteste componenten aangetroffen.
Aangezien de concentraties niet al te verschillend lijken van die van de blanco zullen deze
componenten vooral aangemaakt zijn door de bacteriën die van nature aanwezig zijn en niet
door de geënte bacteriën.
P. pentosaceus kon in het niet-geautoclaveerde SLWW vrij goed groeien (Figuur 18) en er
was een vrij grote concentratie ervan aanwezig in de biofilm (Figuur 19). In vergelijking met
Ps. aeruginosa was P. pentosaceus veel beter in staat om zich aan te passen aan het nietgeautoclaveerde waswater en de competitie door de andere bacteriën. In de chemische
analyse (Tabel 7) is ook te zien dat de concentraties voor de log 6 enting lijken te verschillen
van de blanco, wat erop duidt dat de geënte bacteriën een invloed gehad hebben op de
vorming van de biofilm in dat medium.
In het dynamisch systeem hadden de gevormde biofilms (Tabel 8) een samenstelling die vrij
sterk verschilde in vergelijking met het batch systeem. Vaak werden er hogere concentraties
aan proteïnen gevormd. Wat vooral opviel is dat er koolhydraten aanwezig waren in de
biofilm, terwijl deze amper gedetecteerd werden in het batch systeem. Dit wijst erop dat de
andere omstandigheden in het dynamisch systeem een grote invloed hebben op de opbouw
van de biofilm. De belangrijkste factor die dit kan veroorzaken zijn wellicht de hogere
afschuifkrachten die uitgeoefend werden op de biofilm door de stroming in het medium. Deze
afschuifkrachten proberen de biofilm los te rukken van het oppervlak, waardoor een
stevigere vasthechting aan het oppervlak noodzakelijk is om de biofilm te laten ontwikkelen.
Deze betere vasthechting wordt waarschijnlijk verkregen door de hogere concentratie aan
koolhydraten. In de literatuur werd door Sutherland (2001) en Van Houdt & Michiels (2010)
vermeld dat koolhydraten vooral van belang zijn voor een stevige vasthechting aan een
oppervlak en ook extra bescherming bieden.
48
Deze extra bescherming komt doordat koolhydraten in staat zijn om een sterk vertakt
netwerk te gaan vormen voor een stevigere biofilm. Ze geven ook een betere vasthechting
aan het oppervlak. Ook uronzuren werden vaker aangetroffen, wat logisch is omdat deze ook
een vorm van koolhydraten zijn. Ze zullen waarschijnlijk ook bijdragen aan de extra
stevigheid.
In het geautoclaveerde SLWW pasten de bacteriën in het dynamisch systeem zich sneller
aan aan de omstandigheden. In het batch systeem duurde het tot dag 13 vooraleer er groei
werd waargenomen, terwijl bij het dynamisch systeem de groei al duidelijk op dag 2
aanwezig was voor de planktonische bacteriën (Figuur 23). In de biofilm begon de groei nog
sneller, daar was er al een sterke toename tussen dag 0 en 1 (Figuur 24). De snellere
toename in de biofilm kan getriggerd worden door de extra stress die de bacteriën
ondervinden door de hogere stromingssnelheid. De planktonische groei kan het gevolg zijn
van de constante toevoer van nutriënten en de betere zuurstofoverdracht.
Uit de data weergegeven op Figuur 24 kan afgeleid worden dat er op dag 0 in de biofilm in
alle media in het dynamisch systeem direct aangehechte bacteriën werden aangetroffen,
terwijl het plaatje amper vijf minuten na inoculatie werd verwijderd uit het systeem. Het lijkt
vrij onwaarschijnlijk dat er zich in vijf minuten al dergelijke concentraties aan bacteriën
vasthechten aan het oppervlak. Een deel van deze bacteriën zullen wellicht planktonische
bacteriën zijn die tijdens het spoelen niet goed verwijderd werden. Het spoelproces is dus
niet volledig effectief in het volledig verwijderen van niet aangehechte bacteriën, waardoor de
hoeveelheden vastgehechte bacteriën hoogstwaarschijnlijk overschat worden.
49
V.
Conclusie
Uit alle uitgevoerde experimenten bleek dat zowel Pseudomonas aeruginosa en
Pediococcus pentosaceus in staat zijn om zich vast te hechten aan een oppervlak en EPS te
produceren. Dit houdt in dat ze in staat zijn om een biofilm te vormen. De concentratie aan
aangehechte bacteriën, de hoeveelheid en samenstelling van de EPS hangen sterk af van
de omstandigheden waarin geïncubeerd wordt.
Zo gaf het dynamisch systeem, waarbij er hogere afschuifkrachten uitgeoefend werden op
de biofilm, veel hogere concentraties aan EPS dan in het batch systeem met vooral
opvallend meer koolhydraten. Deze zorgen blijkbaar voor een stevigere aanhechting aan het
roestvrij stalen plaatje.
Voor beide bacteriën zijn proteïnen, naast aangehechte bacteriën, de meest voorkomende
indicator voor de aanwezigheid van een biofilm. Proteïnen komen echter vrij veel voor in een
voedingsomgeving, waardoor ze dus niet noodzakelijk afkomstig zijn van een biofilm. De
chemische resultaten gekoppeld met vastgehechte bacteriën is zeker noodzakelijk om een
besluit te vormen of er sprake is van een biofilm.
De handelingen die nodig waren voor het verwijderen van de biofilm van het oppervlak
zorgen voor een verdunning van de chemische componenten. Hierdoor kwam het vaak voor
dat er al aangehechte bacteriën aangetroffen werden, maar dat er geen betrouwbare
detectie was van de chemische componenten. Dit terwijl er waarschijnlijk al EPS productie
was, alleen was deze niet zeer groot. Hierdoor lagen de concentraties van de chemische
componenten onder de DL. Het vergroten van het bemonsteringsoppervlak bood hiervoor
een oplossing, al is dit in de praktijk niet altijd evident.
De initiële concentratie waarin de bacteriën aanwezig zijn, heeft een invloed op de
biofilmvorming. Bij een lagere initiële concentratie duurt het langer voor de bacteriën
beginnen te groeien en een biofilm gaan vormen. Er is dus een langere lag fase. P.
pentosaceus was in staat om vanuit een lage inoculatiesterkte bij incubatie in geautoclaveerd
SLWW binnen de 13 dagen uit te groeien tot hetzelfde niveau als de hoge inoculatiesterkte.
Ps. aeruginosa had meer tijd nodig, want bij de log 2 enting waren er bijna nooit
detecteerbare aantallen van het MO.
Verder onderzoek is nodig naar het exacte effect van de niet-ideale media. Verder kan de
invloed van temperatuur op de biofilmvorming in kaart gebracht worden. Dit kan onderzocht
worden door beide bacteriën in ideaal medium te incuberen bij 8°C en te incuberen in zowel
geautoclaveerd als niet-geautoclaveerd SLWW bij de ideale temperatuur voor het MO.
Bijkomend kan een log 2 enting in ideale omstandigheden nuttige data opleveren om te
vergelijken met de log 2 entingen in SLWW.
In het dynamisch systeem kunnen bijkomende testen uitgevoerd worden om meer
herhalingen te verkrijgen en zo een meer gevalideerd, reproduceerbaar systeem voor
biofilmvorming te bekomen. Op die manier kan de vergelijking tussen het batch en
dynamisch systeem beter gemaakt worden.
50
Om efficiënte methodes te ontwikkelen voor de verwijdering van biofilms, zal er meer
onderzoek nodig zijn naar de manier waarop bacteriën zich vasthechten aan het oppervlak
en hoe de samenstelling van de biofilm deze vasthechting beïnvloed. Kennis van de
samenstelling van de EPS matrix kan namelijk een indicatie geven over welke bacteriële
processen interessante potentiële doelwitten zijn voor biofilm-inhibitoren. Verder kan er ook
gezocht worden naar andere, betere indicatoren voor een biofilm dan diegene die in dit
onderzoek getest werden. Een ideale indicator voor een biofilm zou namelijk enkel
voorkomen binnenin de biofilm en al bij lage concentraties detecteerbaar zijn. Tevens
kunnen er genexpressie studies uitgevoerd worden om een beter beeld te krijgen in de
moleculaire processen die specifiek bijdragen tot de biofilmvorming. Hierbij kan de expressie
opgevolgd worden van genen die (on)rechtstreeks betrokken zijn in de biofilmvorming met
behulp van qRT-PCR.
Zoals eerder vermeld is het mogelijk dat de gebruikte wasstap niet in staat was om alle
planktonische bacteriën te verwijderen van het plaatje. Een optimalisatie van deze stap kan
dus nuttig zijn.
De karakterisatie van de bacteriën die van nature aanwezig zijn in het SLWW kan tevens
nuttige informatie opleveren en eventueel helpen bij het verklaren van de verkregen data uit
dit onderzoek. De karakterisatie van de gevormde multi-species biofilm kan meer informatie
geven omtrent welke bacteriën kunnen aangetroffen worden in een dergelijke biofilm.
51
REFERENTIES
BALIGH, M., CONWAY, K. E. & DELGADO, M. A. 1996. Production of ammonia by
Pseudomonas cepacia and Pseudomonas aeruginosa: Quantification and effect on
host and pathogen. Recent Research Development in Plant Pathology, 1, 7-19.
BATT, C. A. & TORTORELLO, M.-L. 2014. Encylopedia of Food Microbiology, London,
Academic Press.
BCCM. 2015a. LMG 11488 [Online]. Beschikbaar: http://bccm.belspo.be/catalogues/lmgstrain-details?NUM=11488&COLTYPE=&LIST1=STRNUM&TEXT1=11488&LIST2=
ALL%20FIELDS&TEXT2=&LIST3=STRNUM&TEXT3=&LIST4=STRNUM&TEXT4=&
LIST5=STRNUM&TEXT5=&CONJ=OR&RANGE=20 [Geraadpleegd op: 03/10/2015].
BCCM. 2015b. LMG 28185 [Online]. Beschikbaar: http://bccm.belspo.be/catalogues/lmgstrain-details?NUM=28185&COLTYPE=&LIST1=STRNUM&TEXT1=28185&LIST2=
ALL%20FIELDS&TEXT2=&LIST3=STRNUM&TEXT3=&LIST4=STRNUM&TEXT4=&
LIST5=STRNUM&TEXT5=&CONJ=OR&RANGE=20 [Geraadpleegd op: 03/10/2015].
BELESSI, C.-E. A., GOUNADAKI, A. S., PSOMAS, A. N. & SKANDAMIS, P. N. 2011.
Efficiency of different sanitation methods on Listeria monocytogenes biofilms formed
under various environmental conditions. International Journal of Food Microbiology,
145, 46-52.
BLASCHEK, H. P., WANG, H. H. & AGLE, M. E. 2007. Biofilms in the Food Environment,
Oxford, Blackwell Publishing.
BLICKSTAD, E. & MOLIN, G. 1981. Growth and lactic acid production of Pediococcus
pentosaceus at different gas environments, temperatures, pH values and nitrite
concentrations. European Journal of Applied Microbiology and biotechnolgy, 13, 170174.
BOAVENTURA, R. A. R. & RODRIGUES, A. E. 1997. Denitrifaction kinetics in a rotating disk
biofilm reactor. Chemical Engineering Journal, 65, 227-235.
BRACKMAN, G. 2013. Biofilm model systems and quantification tools. Lab of
Pharmaceutical Microbiology, Ghent University, Faculty of Pharmaceutical Sciences,
58.
BRADFORD, M. M. 1976. A rapid and Sensitive Method for the Quantification of Microgram
Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Analytical
biochemistry, 72, 248-254.
BRANDA, S. S., VIK, A., FREIDMAN, L. & KOLTER, R. 2005. Biofilms: the matrix revisited.
Trends in Microbiology, 13, 20-26.
BROWN, D. A., KAMINENI, D. C., SAWICKI, J. A. & BEVERIDGE, T. J. 1994. Minerals
Associated with Biofilms Occuring on Exposed Rock in a Granatic Underground
Research Laboratory. Applied and Environmental Microbiology, 60, 3182-3191.
CERI, H., OLSON, M. E., STREMICK, C., READ, R. R., MORCK, D. & BURET, A. 1999. The
Calgary Biofilm Device: New Technology for Rapid Determination of Antibiotic
Susceptibilities of Bacterial Biofilms. Journal of Clinical Microbiology, 37, 1771-1776.
CHMIELEWSKI, R. A. N. & FRANK, J. F. 2003. Biofilm Formation and Control in Food
Processing Facilities. COMPREHENSIVE REVIEWS IN FOOD SCIENCE AND
FOOD SAFETY, 2, 22-32.
COENYE, T. & NELIS, H. J. 2010. In vitro and in vivo model systems to study microbial
biofilm formation. Journal of Microbiological Methods, 83, 89-105.
COSTERTON, J. W., GEESEY, G. G. & CHENG, K.-J. 1977. How Bacteria Stick. Scientific
American, 238, 86-95.
COSTERTON, W. J. 2006. The Biofilm Primer, Springer.
DE GRANDE, A. 2015. Biofilms in de voedingsindustrie: chemische karakterisatie en
biofilmvorming door melkzuurbacteriën. Universiteit Gent, Faculteit Bioingenieurswetenschappen, campus Kortrijk.
DI BONAVENTURA, G., PICCOLOMINI, R., PALUDI, D., D'ORIO, V., VERGARA, A.,
CONTER, M. & IANIERI, A. 2008. Influence of temperature on biofilm formation by
52
Listeria monocytogenes on various food-contact surfaces: relationship with motility
and cell surface hydrophobicity. Journal of Applied Microbiology, 104, 1552-1561.
DONLAN, R. M., PIEDE, J. A., HEYES, C. D., SANII, L., MURGA, R., EDMONDS, P., ELSAYED, I. & EL-SAYED, M. A. 2004. Model System for Growing and Quantifiying
Streptococcus pneumoniae Biofilms In Situ and in Real Time. Applied and
Environmental Microbiology, 70, 4980-4988.
DUBOIS, M., GILLES, K., HAMILTON, J. K., REBERS, P. A. & SMITH, F. 1951. A
colorimetric method for the determination of sugars. Nature, 28, 167.
FLEMMING, H.-C. & WINGENDER, J. 2010. The biofilm matrix. Nature revieuws, 8, 623633.
FRIEDMAN, L. & KOLTER, R. 2004. Two Genetic Loci Produce Distinct Carbohydrate-Rich
Structural Components of the Pseudomonas aeruginosa Biofilm Matrix. Journal of
Bacteriology, 186, 4457-4465.
GILBERT, P., EVANS, D. J., EVANS, E., DUGULD, I. G. & BROWN, M. R. W. 1991. Surface
characteristics and adhesion of Escherichia coli and Staphylococcus epidermidis.
Journal of Applied Bacteriology, 71, 72-77.
GOERES, D. M., LOETTERLE, L. R., HAMILTON, M. A., MURGA, R., KIRBY, D. W. &
DONLAN, R. M. 2005. Statistical assessment of a laboratory method for growing
biofilms. Microbiology, 151, 757-762.
GÖZETICI, E. 2015. Biofilm formation in vitro: Microbial and chemical characterization of
Staphylococcus aureus and Pediococcus pentosaceus. Universiteit Gent.
HAESEBROUCK, F., VAN IMMERSEEL, F., HERMANS, K., MARTEL, A., DUCATELLE, R.
& PASMANS, F. 2007. Biofilms: Betekenis voor de behandeling en bestrijding van
bacteriële infecties bij huisdieren. Vlaams Dierengeneeskundig Tijdschrijft, 76, 331 336.
HOLVOET, K. 2014. Bacteriological safety of lettuce in primary production and fresh-cut
processing industry. PhD thesis, Ghent University, Belgium.
HOLVOET, K., JACXSENS, L., SAMPERS, I. & UYTTENDAELE, M. 2012. Insight into the
prevalence and distribution of microbial contamination to evalutat water managment
in the fresh produce processing industry. Journal of Food Protection, 75, 671-681.
HONRAET, K., GOETGHEBEUR, E. & NELIS, H. J. 2005. Comparison of three assays for
the quantification of Candida biomass in suspension and CDC reactor grown biofilms.
Journal of Microbiological Methods, 63, 287-295.
HOOD, S. K. & ZOTTOLA, E. A. 1997. Adherence to stainless steel by foodborne
microorganisms during growth in model food systems. International Journal of Food
Microbiology, 37, 145-153.
JACKSON, K. D., STARKEY, M., KREMER, S., PARSEK, M. R. & WOZNIAK, D. J. 2004.
Identification of psl, a Locus Encoding a Potential Exopolysaccharide That is
Essential for Pseudomonas aeruginosa PAO1 Biofilm Formation. Journal of
Bacteriology, 186, 4466-4475.
JACXSENS, L., LUNING, P. A., VAN DER VORST, J. G. A. J., DEVLIEGHERE, F.,
LEEMANS, R. & UYTTENDAELE, M. 2010. Simulation modelling and risk
assessment as tools to identify the impact of climate change on microbiological food
safety - The case study of fresh produce supply chain. Food Research International,
43, 1925-1935.
KLEIN, S., LORENZO, C., HOFFMANN, S., WALTHER, J. M., STORBECK, S., PIEKARSKI,
T., TINDALL, B. J., WRAY, V., NIMTZ, M. & MOSER, J. 2009. Adaptation of
Pseudomonas aeruginosa to various conditions includes tRNA-dependent formation
of alanyl-phosphatidylglycerol. Molecular Microbiology, 71, 551-565.
KOKARE, C. R., CHAKRABORTY, S., KHOPADE, A. N. & MAHADIK, K. R. 2009. Biofilm:
Importance and applications. Indian Journal of Biotechnology, 8, 159-168.
LAWLEY, R., CURTIS, L. & DAVIS, J. 2012. The Food Safety Hazard Guidebook,
Cambridge, RSC Publishing.
LAWRENCE, J. R., SWERHONE, G. D. W. & NEU, T. R. 2000. A simple rotating annular
reactor for replicated biofilm studies. Journal of Microbiological Methods, 42, 215-224.
53
LESSNAU, K.-D. 2014. Pseudonomas aeruginosa Infections [Online]. Medscape.
Beschikbaar: http://emedicine.medscape.com/article/226748-overview [Geraadpleegd
op: 17/10/2015].
LIFE,
E.
O.
2013a.
Pediococcus
Pentosaceus
[Online].
Beschikbaar:
http://eol.org/pages/976108/names [Geraadpleegd op: 17/10/2015].
LIFE,
E.
O.
2013b.
Pseudomonas
aeruginosa
[Online].
Beschikbaar:
http://eol.org/pages/973051/names [Geraadpleegd op: 17/10/2015].
LIU, Y.-J., XIE, J., ZHAO, L.-J., QIAN, Y.-F., ZHAO, Y. & LIU, X. 2015. Formation
Characteristics of Pseudomonas lundensis Isolated from Meat. Journal of Food
Science, 80, 2904 - 2910.
LÓPEZ-GÁLVEZ, F., ALLENDE, A., SELMA, M. V. & GIL, M. I. 2009. Prevention of
Escherichia coli cross-contamination by different commercial sanitizers during
washing of fresh-cut lettuce. International Journal of Food Microbiology, 133, 167171.
MADIGAN, M., MARTINKO, J., STAHL, D. & CLARK, D. 2010. Brock Biology of
Microorganisms, Pearson.
MARCHAND, S., BLOCK, J. D., JONGHE, V. D., COOREVITS, A., HEYNDRICKX, M. &
HERMAN, L. 2012. Biofilm Formation in Milk Production and Processing
Environments; Influence on Milk Quality and Safety. COMPREHENSIVE REVIEWS
IN FOOD SCIENCE AND FOOD SAFETY, 11, 133-147.
MASUKO, T., MINAMI, A., IWASAKI, N., MAJIMA, T., NISHIMURA, S.-I. & LEE, Y. C. 2005.
Carbohydrate analysis by a phenol–sulfuric acid method in microplate format.
Analytical biochemistry, 339, 69-72.
MORGAN, T. D. & WILSON, M. 2001. The effects of surface roughness and type of denture
acrylic on biofilm formation by Streptococcus oralis in a constant depth film fermentor.
Journal of Applied Microbiology, 91, 47-53.
NIELSEN, M. W., STERNBERG, C., MOLIN, S. & REGENBERG, B. 2011. Pseudomonas
aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells. Journal of
Visualized Experiments.
OLAIMAT, A. N. & HOLLEY, R. A. 2012. Factors influencing the microbial safety of fresh
produce: A review. Food Microbiology, 32, 1-19.
OSMANAGAOGLU, Ö., BEYATLI, Y. & GÜNDÜZ, U. 2001. Isolation and characterization of
Pediocin Producing Pediococcus pentosaceus Pep1 from Vacuum-Packed
Sausages. Turkish Journal of Biology, 25, 133-143.
PEETERS, E., NELIS, H. J. & COENYE, T. 2008. Comparison of multiple methods for
quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of
Microbiological Methods, 72, 157-165.
PORTAL,
G.
2015.
Pediococcus
pentosaceus
[Online].
Beschikbaar:
http://genome.jgi.doe.gov/pedpe/pedpe.home.html [Geraadpleegd op: 21/11/2015].
RYDER, C., BYRD, M. & WOZNIAK, D. J. 2007. Role of polysaccharides in Pseudomonas
aeruginosa biofilm development. Current Opinion in Microbiology, 10, 644-648.
SIMPSON, P. J., FITZGERALD, G. F., STANTON, C. & ROSS, R. P. 2006. Enumeration and
identification of pediococci in powder-based products using selective media and rapid
PFGE. Journal of Microbiological Methods, 64, 120-125.
SREY, S., JAHID, I. K. & HA, S.-D. 2013. Biofilm formation in food industries: A food safety
concern. Food Control, 31, 572-585.
STERNBERG, C. & TOLKER-NIELSEN, T. 2005. Growing and Analyzing Biofilms in Flow
Cells. Current Protocols in Microbiology, 1B.2.1-1B.2.15.
SUTHERLAND, I. W. 2001. Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky framework.
Microbiology, 147, 3-9.
VAN DEN HOOGEN, B. M., VAN WEERTEN, P. R., LOPES-CARDOZO, M., VAN GOLDE,
L. M. G., BARNEVELD, A. & VAN DE LEST, C. H. A. 1998. A Microtiter Plate Assay
for the Determination of Uronic Acids. Analytical biochemistry, 257, 107-111.
VAN HAUTE, S. 2015. Water use and water disinfection in food operations. Universiteit
Gent, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Campus Kortrijk, 118.
54
VAN
HAUTE, S., SAMPERS, I., HOLVOET, K. & UYTTENDAELE, M. 2013.
Physicochemical Quality and Chemical Safety of Chlorine as a Reconditioning Agent
and Wash Water Disenfectant for Fresh-Cut Lettuce Washin. Applied and
Environmental Microbiology, 79, 2850-2861.
VAN HAUTE, S., TRYLAND, I., VEYS, A. & SAMPERS, I. 2015. Wash water disinfection of a
full-scale leafy vegetables washing proces with hydrogen peroxide and the use of a
commercial metal ion mixture to improve disinfection efficiency. Food Control, 50,
173-183.
VAN HOUDT, R. & MICHIELS, C. W. 2010. Biofilm formation and the food industry - a focus
on the bacterial outer surface. Journal of Applied Microbiology, 109, 1117-1131.
VU, B., CHEN, M., CRAWFORD, R. J. & IVANOVA, E. P. 2009. Bacterial Extracellular
Polysaccharides Involved in Biofilm Formation. Molecules, 14, 2535-2554.
WIRTANEN, G. & MATTILA-SANDHOLM, T. 1994. Measurement of biofilm of Pediococcus
pentosaceus and Pseudomonas fragi on stainless steel surfaces. Colloids and
Surfaces B. Biointerfaces, 2, 33-39.
WONG, A. C. L. 1998. Biofilms in Food Processing Environments. Journal of Dairy Science,
81, 2765-2770.
YAPO, B. M. 2012. On the colorimetric-sulfuric acid analysis of uronic acids in food
materials: potential sources of discrepancies in data and how to circumvent them.
Food Analytical Methods, 5, 195-215.
55
BIJLAGE 1
Microbiologische analyses van niet-geënt SLWW. Er zijn geen foutbalken weergegeven
doordat er iedere keer maar 1 container geanalyseerd werd.
9
8
KVE (log/ml)
7
6
5
Ps. aeruginosa Totaal kiemgetal
4
Ps. aeruginosa Selectief
3
P. pentosaceus Totaal kiemgetal
2
P. pentosaceus Selectief
1
0
NG
0
NG
NG
1
2
6
9
13
Incubatietijd (dagen)
Figuur 26: Aantal planktonische cellen in de blanco in functie van de incubatietijd, n = 1, NG = niet getest,
DL = 2 log KVE/ml
9
8
KVE (Log/cm²)
7
6
5
Ps. aeruginosa Totaal kiemgetal
4
Ps. aeruginosa Selectief
3
P. pentosaceus Totaal Kiemgetal
2
P. pentosaceus Selectief
1
0
NG
NG
0
1
NG
2
6
9
13
Incubatietijd (dagen)
Figuur 27: Aantal cellen in de biofilm in functie van de incubatietijd, n = 1, NG = niet getest, DL = 1,12 log
KVE/cm²
1
BIJLAGE 2
KVE (Log/ml)
Microbiologische analyse van het experiment waarbij de invloed van een groter oppervlak
werd getest met Ps. aeruginosa.
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
1
2
6
Incubatietijd (dagen)
KVE (Log/cm²)
Figuur 28: Aantal planktonische cellen van Ps. aeruginosa in functie van de incubatietijd na inoculatie
met log 6, n = 2, DL = 2 log KVE/ml
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
37,5 cm²
150 cm²
0
1
2
6
Incubatietijd (dagen)
Figuur 29: Aantal cellen van Ps. aeruginosa in de biofilm in functie van de incubatietijd na inoculatie met
log 6, n = 1, DL = 1,12 log KVE/cm² bij 37,5 cm² en 0,52 log KVE/cm² bij 150 cm²
2
BIJLAGE 3
In deze bijlage zijn enkele afbeeldingen opgenomen van de gevormde biofilms tijdens de
experimenten. Alle foto’s zijn genomen na het spoelen en zijn afkomstig van een log 6
inoculatie. Vanuit het batch systeem zijn er geen afbeeldingen van de ideale
omstandigheden en van het geautoclaveerde SLWW omdat er zo goed als geen zichtbare
biofilmvorming was.
Figuur 30: Biofilmvorming op de inox plaatjes van het batch systeem. A = P. pentosaceus na één dag
incubatie in niet-geautoclaveerd SLWW; B = P. pentosaceus na 13 dagen incubatie in niet-geautoclaveerd
SLWW; C = Ps. aeruginosa na twee dagen incubatie in niet-geautoclaveerd SLWW en D = Ps. aeruginosa
na 13 dagen incubatie in niet-geautoclaveerd SLWW
Figuur 31: Biofilmvorming op de inox plaatjes van het dynamisch systeem met Ps. aeruginosa. A = ideaal
medium na zes dagen; B = geautoclaveerd SLWW na twee dagen; C = geautoclaveerd SLWW na zes
dagen en D = niet-geautoclaveerd SLWW na zes dagen
3