Discussion

Samenvatting
Samenvatting
Pseudomonas aeruginosa is een alomtegenwoordige, Gram-negatieve bacterie die
individuen met een verzwakt immuunsysteem infecteert, zoals AIDS-, kanker- en
mucoviscidose-patiënten. Deze staafjes-vormige bacterie produceert virulentie-factoren die
het immuunsysteem van de patiënt manipuleren om eigen overleving en beschikbaarheid
van nutriënten te optimaliseren (Van Delden & Iglewski, 1998; Lyczak et al., 2000).
Overtollig gebruik van antibiotica bij P. aeruginosa-infecties heeft geleid tot multiresistentie zodat de behandeling van infecties met deze facultatieve anaeroob zeer sterk
wordt bemoeilijkt.
De cellen die het immuunsysteem van de gastheer vertegenwoordigen, produceren grote
hoeveelheden schadelijke zuurstofderivaten in een poging om de opportune pathogeen te
vernietigen. Om deze oxiderende omstandigheden te overleven, gebruikt P. aeruginosa
twee transcriptie-factoren, OxyR en SoxR, die voortdurend de concentratie aan H2O2 and
O2-•, respectievelijk, detecteren om vervolgens de nodige verdedigings-mechanismen aan te
schakelen. Uitzonderlijk, SoxR induceert, in P. aeruginosa, geen respons die betrokken is bij
de rechtstreekse detoxificatie van reactieve zuurstof-species (Palma et al., 2005).
Na contact met H2O2 stimuleert de geoxideerde conformatie van OxyR de expressie van het
katB-gen, dat codeert voor een katalase, en van ahpB en ahpCF, die coderen voor
alkylhydroperoxidases (Zheng et al., 1998; Ochsner et al., 2000). Deze anti-oxidant-enzymen
staan in voor de detoxificatie van zowel H 2O2 als van organische peroxides en dragen bij tot
de efficiëntie van de infectie (Brown et al., 1995; Panmanee & Hassett, 2009).
Aerobe omstandigheden leiden echter tot bijkomstige moeilijkheden, zoals ijzer-schaarste.
Dit is het gevolg van het feit dat ijzer reageert met O2 met de vorming van onoplosbare
ijzer-oxides tot gevolg. In de mens wordt vrij ijzer gecomplexeerd in enzymen zoals
transferrine en lactoferrine, zodat de ijzer-limitatie in een gastheer nog meer uitgesproken
is. De meerderheid van aerobe micro-organismen lost dit probleem op door sterke ijzerchelatoren, de zogenaamde sideroforen, te produceren. In P. aeruginosa werden reeds
twee sideroforen geïndentificeerd: het primaire pyoverdine met hoge affiniteit en
pyochelin met een lagere affiniteit. Deze sideroforen worden gesecreteerd naar de ijzerSamenvatting
arme omgeving om Fe3+ te complexeren en vervolgens wordt dit ijzer-siderofoor-complex
gebonden door een buiten-membraan receptor met hoge affiniteit. Hierna wordt de
j
Samenvatting
ferrisiderofoor verder getransporteerd naar de intracellulaire omgeving waar Fe3+ wordt
vrijgemaakt uit de siderofoor en gereduceerd tot Fe2+ (Cornelis & Matthijs, 2002; Ravel &
Cornelis, 2003; Visca et al., 2007; Cornelis et al., 2009).
Deze studie toont aan dat inactivatie van OxyR resulteert in inhibitie van de groei
gedurende ijzer-restricte, ijzer-abundante en oxiderende omstandigheden bij lage celdensiteit. Indien de oxyR-mutant zich met meer dan 106 cellen per ml in deze condities
bevindt of wordt blootgesteld aan het phenazine pyocyanine, worden deze groeidefecten
opgeheven. De concentratie aan H2O2 speelt hierbij een belangrijke rol, aangezien de
groeidefecten eveneens kunnen worden hersteld door de toevoeging van katalase of the
H2O2-scavenger thiourea.
Het belang van het cel-aantal bracht ons tot de analyse van quorum sensing in de oxyRmutant. Hoewel de productie van signaal-moleculen geen significante verschillen vertoont
in vergelijking met het wilde type, produceert de oxyR-mutant meer pyocyanine en minder
rhamnolipiden.
Tot slot kozen we voor een meer holistische benadering, namelijk 2D-proteoom-analyse,
met als doel de fundamentele oorzaak van de fenotypische veranderingen en groeidefecten te ontrafelen. Deze benadering leerde ons dat de inactivatie van OxyR het ijzerbeheer in de cel verstoort, aangezien de ijzer-opname-regulator Fur, nodig voor de controle
van intracellulaire ijzer-concentratie hoofdzakelijk door middel van de repressie van
siderofoor-biosynthese-genen, minder tot expressie komt. Als gevolg is het waarschijnlijk
dat de oxyR-mutant niet voldoende in staat is om siderofoor-gemedieerde ijzer-opname te
onderdrukken resulterende in ijzer-toxiciteit. Dit is in overeenstemming met de
waarneming dat in de oxyR-mutant het proteïne Dps, dat DNA beschermt tegen oxidatieve
schade via de opslag van ijzer in de centrale caviteit, meer tot expressie komt.
Deze studie bevestigt tevens eerdere bevindingen omtrent de geattenueerde virulentie in
de afwezigheid van OxyR, aangezien verscheidene virulentie-factoren, inclusief chitinase
ChiC, het extracellulair protease PasP, rhamnolipiden, het lectine LecA en een putatief
haemolysine minder vertegenwoordigd zijn in de oxyR-mutant. Het proteoom van de oxyRmutant weerspiegelt ook de behoefte aan proteïnen die betrokken zijn bij de vouwing en
Samenvatting
het herstel van beschadigde proteïnen.
k
Samenvatting
Kort samengevat leidt inactivatie van de H2O2-responsieve transcriptionele regulator OxyR
tot een verminderd vermogen om zich te verdedigen tegen tal van zuurstof-derivaten. De
oxyR-mutant ondergaat een aantal aanpassingen om toch met deze stress-situatie om te
gaan via alternatieve strategieën zoals de stimulatie van het redox-actieve pyocyanine, het
ijzer-acculerende en DNA-beschermende Dps en allerlei herstel-mechanismen om oxidatief
beschadigde enzymen te hervouwen. Ongeacht deze aanpassingen, is de oxyR-mutant
Samenvatting
minder virulent en verstoring van ijzer homeostase inhibeert groei bij lage cel-densiteit.
l