University of Groningen Quantitative on

University of Groningen
Quantitative on-line monitoring of cellular and cerebral energy metabolism
Leegsma-Vogt, Gepke Henriëtta
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to
cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
2004
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Leegsma-Vogt, G. H. (2004). Quantitative on-line monitoring of cellular and cerebral energy metabolism
s.n.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the
author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately
and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the
number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Download date: 18-07-2017
Samenvatting voor de geïnteresseerde leek
INLEIDING
Energiesubstraten voor de hersenen en hersenanatomie
Energiesubstraten voor de hersenen
De hersenen gebruiken veel energie. De hersenen van een volwassen persoon wegen
ongeveer 2-3% van het totale lichaamsgewicht, maar verbruiken tot 25% van de totale
energievoorraad. Glucose is de belangrijkste energieleverancier voor de hersenen. Glucose
wordt normaliter met behulp van zuurstof omgezet in koolstofdioxide en water, waarbij
energie geproduceerd wordt (aëroob metabolisme). Glucose kan ook zonder zuurstof
omgezet worden in lactaat (anaëroob metabolisme); hierbij ontstaat echter veel minder
energie dan tijdens aëroob metabolisme. Door de lagere “productiviteit” van anaëroob
metabolisme, dacht men van oudsher dat lactaat alleen vanuit glucose gevormd werd tijdens
zuurstofgebrek. Immers, als zuurstof aanwezig is kan veel meer energie geproduceerd
worden via de aërobe omzetting van glucose naar koolstofdioxide en water. Tegenwoordig
weet men echter dat lactaat ook gevormd wordt vanuit glucose tijdens de normale
hersenactiviteit, zonder enige vorm van zuurstoftekort.
Het belangrijkste energiesubstraat voor de hersenen is glucose, maar er zijn ook andere
stoffen die als energiesubstraat kunnen dienen, waaronder lactaat en keton lichamen. Keton
lichamen worden alleen door de hersenen gebruikt in jonge individuen, tijdens vasten, en
als de glucosegehaltes in het bloed te laag zijn (hypoglycemie). Lactaat kan als
energiesubstraat gebruikt worden in zowel normale als hypoglycemische situaties. Lactaat
heeft dus een dubbele rol: het wordt gevormd tijdens zuurstoftekort (anaëroob
metabolisme), maar het kan ook gebruikt worden als energiesubstraat in de aanwezigheid
van zuurstof.
Cellulaire hersenanatomie
De hersenen bestaan uit diverse typen cellen. De zenuwcellen (neuronen) zijn algemeen
bekend; neuronen verzorgen onder andere de centrale aansturing van het lichaam, en
verzorgen de informatie-opslag (geheugen) en –overdracht. Daarnaast zijn er een aantal
celtypen die een meer ondersteunende rol hebben. Eén van deze cel typen is de astrocyt,
genoemd naar zijn stervormige uiterlijk (astro = ster). Astrocyten vormen een cellaag
tussen de neuronen en de bloedvaten, waarbij uitstulpingen van de astrocyt, zogenaamde
eindvoetjes, het bloedvat en de neuron omhullen. Hierdoor hebben zenuwcellen en
bloedvaten vrijwel geen direct contact met elkaar. Omdat de voorraad energie in de
hersenen, in de vorm van glycogeen, erg laag is, is de bloedtoevoer naar de hersenen erg
belangrijk. Vrijwel alle energie voor de hersenen wordt vanuit het bloed gehaald. Door de
merkwaardige anatomische plaatsing van de astrocyten tussen de bloedvaten en de
neuronen wordt gedacht dat zij een rol kunnen spelen in de levering van energie aan de
neuronen. Hierbij wordt glucose vanuit het bloed eerst door de astrocyt opgenomen, die het
SAMENVATTING
-als glucose of als een ander product- doorgeeft aan de neuronen. Omdat huidige
technieken nog niet ver genoeg ontwikkeld zijn om op cellulair niveau in de hersenen te
kijken, worden andere technieken aangewend (zoals in vitro metingen) om te bestuderen
hoe de samenwerking tussen astrocyten en neuronen zou kunnen werken. Door diverse
experimenten bleek al snel dat na opname van glucose door de astrocyten, lactaat weer
vrijgegeven wordt. Dit vormde de basis voor de astrocyt-neuron-lactaat-shuttle theorie,
waarin lactaat, vrijgegeven door de astrocyten, de belangrijkste energiesubstraat van de
neuronen is. Glutamaat (een signaalmolecuul of neurotransmitter) speelt een belangrijke rol
in deze theorie; glutamaat wordt vrijgegeven door neuronen tijdens activiteit, de opname
van dit glutamaat door astrocyten is gekoppeld met de lactaat afgifte. Verscheidende studies
vonden bewijs voor de astrocyt-neuron-lactaat-shuttle theorie, hoewel er ook resultaten
tegenstrijdig met de theorie zijn. Aanhangers van de conventionele theorie denken dat
glucose het belangrijkste energiesubstraat van alle hersencellen is, en dat lactaat wel
verbruikt kan worden, maar alleen als glucose niet voorhanden is. Vandaag de dag wordt er
veel gediscussieerd over verscheidene onderdelen van de twee theorieën, waaronder het
gebruik van lactaat door neuronen in plaats van glucose, en de respons van astrocyten naar
de neuronale vraag om energie.
Hersenschade
Het analyseren van hersenmetabolisme is ook erg belangrijk voor het onderzoeken van
mogelijke therapeutische interventies voor hersenschade. Het analyseren van de
hoeveelheid schade in de hersenen, en de verbetering van voorspellen van het herstel zijn
belangrijke onderzoeksgebieden, waarbij het gebruik van biologische markers wordt
onderzocht. Het monitoren van de hersenen kan belangrijk zijn in elke situatie waar de
conditie van de hersenen in gevaar is, bijvoorbeeld na een herseninfarct, hersentrauma of
vergiftiging.
Hypoxie (zuurstoftekort) of ischemie (zuurstof en voedingtekort) ontstaat wanneer de
hersenen niet voldoende zuurstof en glucose uit het bloed kunnen halen doordat de
bloeddoorstroming is gestopt (door bijvoorbeeld een hartaanval of een bloedprop in de
hersenen). Door het tekort aan zuurstof kan glucose alleen nog maar anaëroob omgezet
worden, waardoor er hoge concentraties lactaat ontstaan. Het tekort aan energie veroorzaakt
uiteindelijk hersenoedeem en celdood. Specifieke markers voor hersenschade, die buiten de
hersenen (in het bloed) gemeten kunnen worden, zouden wellicht kunnen helpen om de
grootte van de hersenschade en het eventuele herstel in kaart te brengen. Omdat de
concentraties van glucose en lactaat veranderen tijdens hersenschade, zijn zij potentiële
kandidaten om als markers voor hersenschade te dienen.
Methoden om metabolisme te meten
In vitro versus in vivo
Metabolisme kan op verschillende manieren gemeten worden. Twee zeer verschillende
meetmethoden zijn de in vitro en in vivo methode. In vitro metingen (bijvoorbeeld aan
celcultures) hebben als voordeel dat de condities tijdens het meten constant gehouden en
gecontroleerd kunnen worden. Een in vitro situatie is echter een model voor de in vivo
realiteit. Monitoren in het lichaam (in vivo) levert een preciezer beeld van de werkelijke
2
samenvatting
SAMENVATTING
situatie, maar is moeilijker te interpreteren omdat metingen in vivo
moeilijk constant gehouden kunnen worden, en er oncontroleerbare invloeden kunnen zijn.
Celcultures worden veel gebruikt om hersenmetabolisme te bestuderen. Een groot deel van
de astrocyt-neuron-lactaat-shuttle theorie is gebaseerd op in vitro bevindingen.
De hersenen worden beschermd door de schedel, wat de benadering van de hersenen voor
in vivo monitoren bemoeilijkt. Verscheidene oplossingen zijn bedacht om toch de hersenen
te kunnen meten: beeldvormende technieken (PET, MRI), intracerebrale (= in de hersenen)
meettechnieken, en het meten van arterio-veneuze verschillen. Bij arterio-veneuze metingen
wordt het energieverbruik van de hersenen berekend door in het ingaande en uitgaande
bloed de concentratieverschillen van glucose en lactaat te meten, en die te
vermenigvuldigen met de snelheid van de cerebrale doorbloeding. In dit proefschrift zijn
arterio-veneuze verschillen gemeten in de aorta en de vena jugularis (halsader).
Batch-wise versus on-line
Een ander onderscheid dat gemaakt kan worden in het meten van metabolisme, is batchwise versus on-line. Batch-wise metingen worden het meest gebruikt. Hierbij wordt een
meting bewaard totdat een groep metingen in één keer geanalyseerd kan worden. Deze
aanpak levert relatief weinig meetpunten. Veel metingen, of een continue meting, kan
verzorgd worden door een on-line meting. Hierbij is de analyse apparatuur direct gekoppeld
aan de experimentele set-up, waardoor metingen direct en frequent geanalyseerd kunnen
worden. De on-line methode is moeilijker uit te voeren dan batch-wise analyse, omdat
gespecialiseerde apparatuur nodig is. On-line monitoren is relatief jong, en wordt daardoor
nog niet veel toegepast.
In dit proefschrift hebben we met een on-line methode gewerkt, waarin Flow Injectie
Analyse (FIA) werd gecombineerd met biosensoren voor glucose en lactaat. Biosensoren
zijn meeteenheden die een biologisch substraat gebruiken om een stof te meten. In ons
onderzoek zijn de enzymen glucose oxidase en lactaat oxidase gebruikt om de concentratie
glucose en lactaat te bepalen. Dit FIA systeem meet semi-continu; op gezette tijden
(bijvoorbeeld elke minuut) wordt een meting geanalyseerd. Het FIA systeem heeft als
voordelen dat het makkelijk aangepast kan worden per experiment, en omdat er kleine
volumina gemeten worden, is de meting snel en secuur. Bovendien zorgen de biosensoren
voor hoge specificiteit. Omdat het lichaam stoffen bevat die het FIA systeem contamineren,
dienen in vivo metingen gefiltreerd te worden. Als toevoeging op het FIA systeem hebben
we daarom in de in vivo experimenten ultrafiltratie gebruikt als prefiltratie methode.
DIT PROEFSCHRIFT
Noch metabolisme in vivo, noch het energieverbruik van cellen in vitro, is eerder met het
on-line FIA systeem gemeten. In dit proefschrift hebben wij glucose en lactaat metabolisme
gemeten, zowel in vitro als in vivo. We hebben onze aanpassingen aan het on-line systeem
onderzocht op toepassing voor in vitro en in vivo bepalingen, en hebben de tegenwoordige
theorieën over cellulair en cerebraal metabolisme bestudeerd. De uitdagingen in dit
onderzoek lagen onder andere in het inzetten van de on-line techniek voor het meten van
glucose en lactaat metabolisme in vitro en in vivo, en in de interpretatie van de data in
relatie tot het huidige debat over energieverbruik van de hersenen. Dit proefschrift is
verdeeld in twee onderdelen. Het eerste deel is gericht op de in vitro metingen van
3
samenvatting
SAMENVATTING
cellulaire glucose en lactaat metabolisme, het tweede deel richt zich op de in vivo metingen
van glucose en lactaat gebruik van de hersenen.
In vitro experimenten
In hoofdstuk 2 staat het aangepaste on-line systeem voor het in vitro monitoren
beschreven, waarmee het metabolisme in diverse cel cultures gemeten is, waaronder
neuronen, astrocyten, en gistcellen. Om cel metabolisme te meten, hebben we een celkamer
ontwikkeld, die in het on-line systeem ingepast kan worden. Glucose consumptie en lactaat
uitscheiding (efflux) zijn in diverse celtypen gemeten. Omdat de zuurstof (essentieel voor
aëroob metabolisme) via de vloeistofstroom bij de cellen terechtkomt, is de aangeboden
zuurstof afhankelijk van de doorstromingssnelheid. De aërobe ratio (een maat voor het
percentage aëroob energieverbruik, waarbij de gemeten vorming van lactaat van glucose
voor anaëroob metabolisme staat), zoals gemeten in onze experimenten, was gemiddeld tot
hoog (60-90%) vergeleken met aërobe ratio´s zoals berekend vanuit de literatuur (50-70%).
Omdat onze experimenten suggereerden dat lactaat (gedeeltelijk) van glycogeen gemaakt
zou kunnen worden in plaats van glucose, zou de werkelijke aërobe ratio hoger kunnen zijn
dan onze berekende aërobe ratio. Een innovatief voordeel van ons on-line systeem is, dat
het energieverbruik per cel per minuut berekend kan worden. Zoals berekend in dit
hoofdstuk, blijken neuronen en astrocyten ongeveer gelijke hoeveelheden glucose te
verbruiken, gist cellen gebruiken daarentegen ongeveer honderd maal minder energie per
cel.
In hoofdstuk 3 zijn organotypische hippocampale slice cultures gemeten in ons on-line
systeem. Organotypische hippocampale slice cultures zijn in vitro gekweekte embryonale
plakjes hippocampusweefsel (de hippocampus is een onderdeel van de hersenen). De
minimale verstoring van de onderlinge verbindingen tussen de cellen, en de stabiliteit van
de plakjes zijn voordelen van de organotypische hippocampale slice cultures. Glucose
metabolisme en lactaat productie waren nog nooit eerder bestudeerd in slice cultures. Voor
dit doel werd een iets andere celkamer ontworpen, waarin de zuurstoftoevoer onafhankelijk
was van de doorstroming. In dit hoofdstuk werd glucose en lactaat metabolisme gemeten
tijdens verscheidene manipulaties van het celmetabolisme. In deze experimenten werd
ongeveer 50% van de opgenomen glucose omgezet in lactaat, en ook lactaat werd door de
plakjes opgenomen (hoewel in mindere mate dan de glucose opname). Ook in deze
experimenten waren er aanwijzingen voor lactaatvorming vanuit glycogeen.
In hoofdstuk 4 hebben we het energieverbruik in astrocyt cultures gemeten. Omdat in de
hersenen de astrocyten zich tussen de bloedvaten en de neuronen bevinden, worden er
gedacht dat astrocyten een rol spelen in de energievoorziening van de neuronen. In het
onderzoek in hoofdstuk 4 zijn het glucose en lactaat metabolisme gemeten terwijl de
astrocyten glucose, lactaat, of een combinatie van beiden aangeboden kregen. De
berekeningen aan het energieverbruik per cel werd uitgebreid in deze metingen, waarin we
zowel glucose verbruik als lactaat verbruik hebben berekend per cel per minuut. De cellen
prefereren glucose boven lactaat, met een glucose verbruik van 1 miljard glucose moleculen
per cel per minuut. We vonden aanwijzingen voor glycogeen afbraak vanuit grote
glycogeen voorraden, wat voornamelijk in lactaat werd omgezet. De grootte van de
glycogeen voorraden en de lactaat efflux bleek af te hangen van de incubatiecondities
tijdens de kweek van de cellen. Het glucose verbruik veranderde niet wanneer lactaat als
extra substraat werd gegeven. Dit gegeven bracht ons tot de theorie dat er een
4
samenvatting
SAMENVATTING
onafhankelijke “pool” van lactaat is, omdat het glucose verbruik lager
zou zijn als lactaat glucose als energiesubstraat zou vervangen. Berekeningen wijzen erop
dat het in vivo energie substraat verbruik en de voorraad per cel veel lager is dan die van de
huidige in vitro preparaten. Deze observatie kan grote implicaties hebben wanneer in vitro
resultaten gebruikt worden om in vivo observaties en theorieën te begrijpen.
In vivo experimenten
Het tweede deel van dit proefschrift richt zich op de in vivo metingen van
hersenmetabolisme, en begint met een overzicht van het gebruik van biosensoren voor in
vivo metingen (hoofdstuk 5). In dit hoofdstuk wordt de werking van de biosensoren die
ontwikkeld zijn in ons laboratorium uitgelegd, en de applicatie van deze biosensoren in
klinisch monitoren en experimenteel onderzoek uiteengezet aan de hand van diverse
resultaten bereikt met deze biosensoren. Dit overzicht illustreert dat biosensoren gebruikt
kunnen worden in diverse gebieden van het experimentele en klinische onderzoek,
waaronder hersentrauma´s, hartinfarcten, en onderzoek aan diabetes. De biosensoren zoals
ontwikkeld in ons laboratorium zijn relatief goedkoop, en zijn een lange periode werkzaam:
zowel de glucose als lactaat biosensor zijn actief voor tenminste 6 weken en 10.000
metingen. Het biosensor-overzicht in hoofdstuk 5 geeft aan dat biosensoren, gecombineerd
met ultrafiltratie of microdialyse, heel bruikbaar zijn in het monitoren van glucose gehaltes
en pathologische gebeurtenissen, zowel onderhuids (subcutaan) als in de bloedbaan
(intraveneus).
In hoofdstuk 6 wordt een overzicht gegeven over het gebruik van ultrafiltratie als een
selectiemethode voor in vivo metingen. Ultrafiltratie-probes worden hierbij subcutaan of
intraveneus geplaatst. Door milde zuiging worden kleine moleculen naar het meetsysteem
gezogen, grote moleculen en cellen kunnen de filtratie-probe niet passeren. Door deze
selectiemethode worden kleine moleculen van grote moleculen gescheiden, wat
contaminatie van het on-line FIA systeem voorkomt. Bovendien wordt door ultrafiltratie
slechts minieme hoeveelheden vloeistof afgenomen. Dit overzicht bespreekt de potentie van
in vivo ultrafiltratie als een continue meettechniek in klinische onderzoeksgebieden, en in
een aantal biomedische applicaties zoals glucose en lactaat metingen en kinetiek studies.
Subcutaan of intraveneuze ultrafiltratie-probes zijn gebruikt voor off-line en on-line
analyses, in diverse diersoorten, waaronder honden, ratten, varkens, en mensen.
Ultrafiltratie lijkt veel op microdialyse, maar er zijn belangrijke verschillen. De voor- en
nadelen van beide technieken zijn besproken in dit hoofdstuk. Dit overzicht laat zien dat
ultrafiltratie een goed alternatief kan zijn voor microdialyse.
De experimentele sectie van deel 2 begint met een onderzoek naar het in vivo glucose en
lactaat verbruik na hersentrauma in geanestheseerde ratten (hoofdstuk 7). In de in vivo
experimenten hebben wij twee ultrafiltratie-probes in één rat aangebracht voor het
tegelijkertijd meten van arteriële en veneuze glucose en lactaat waarden. Dit was nog niet
eerder uitgevoerd. Vóór het hersentrauma werd gegeven, werd er glucose opname en lactaat
efflux gemeten tijdens lage lactaatconcentraties in het bloed. Na de hersentrauma werd er
een verlaging in de glucoseopname en een iets lagere lactaat efflux gevonden, wat
suggereert dat arterio-veneuze metingen gebruikt kunnen worden om hersenschade te
meten. Uit de resultaten bleek dat de lactaatflux in en uit de hersenen niet alleen afhangt
van de lactaatconcentratie in de hersenen, maar ook van de bloedlactaat-waarden. In
tegenstelling tot bevindingen uit de literatuur vinden wij in dit onderzoek dat lactaat
blijkbaar vrij gemakkelijk de bloed-hersen barrière kan passeren.
5
samenvatting
SAMENVATTING
In hoofdstuk 8 hebben we de concentratie-afhankelijkheid van de lactaat-flux beter
bestudeerd door lactaat influx en efflux te meten tijdens en na een lactaat infuus. Ook
hebben we bestudeerd of lactaat, opgenomen vanuit het bloed, door de hersenen gebruikt
kan worden als energiesubstraat, ter vervanging van glucose. De verandering in lactaat en
glucose flux tijdens en na een lactaat infuus werd bestudeerd door het meten van arterioveneuze verschillen over de hersenen. De lactaat flux bleek (net als het vorige hoofdstuk)
concentratie afhankelijk, met een lactaat influx tijdens het lactaat infuus, en een efflux van
lactaat meteen na het infuus. De resultaten suggereren dat het grootste deel van het lactaat
dat de hersenen ingaat tijdens het infuus, na het infuus de hersenen weer verlaat. Dit
betekent dat het grootste deel van de lactaat niet gebruikt wordt als energiesubstraat, en dat
lactaat glucose niet vervangt als energiesubstraat. De theorie werd geopperd dat er een
lactaat “pool” in de hersenen is, die gevuld en geleegd kan worden naar gelang de bloed
lactaat concentratie, maar die niet gebruikt wordt als energiebron.
In het laatste experimentele hoofdstuk (hoofdstuk 9), hebben we de lactaat-infuus data
gebruikt om lactaat kinetiek te beschrijven. Hiervoor hebben we het lactaat metabolisme in
het lichaam theoretische gemodelleerd, en werden zowel de arteriële als veneuze data
gebruikt om de lactaat systemen in het lichaam mathematisch te benaderen. Dankzij de
hoge temporele resolutie tijdens onze metingen, konden arterio-veneuze lactaat kinetiek
gemodelleerd worden in individuele experimenten. Met ons mathematische model konden
we de verlate efflux vanuit het hoofd benaderen, en vonden dat het distributievolume van
lactaat in het hoofd toeneemt met de infuustijd. Berekeningen suggereren dat lactaat
verdeeld kan worden in ongeveer 24% van het hersenvolume.
ALGEMENE DISCUSSIE: METHODE
In dit proefschrift is de bruikbaarheid van het kwantitatief monitoren van zowel cellulair als
cerebraal glucose en lactaat metabolisme aangetoond. Het on-line FIA-systeem zoals
gebruikt in dit proefschrift kenmerkt zich door het gebruik van kleine volumina, met slechts
korte vertraagtijden en een hoge temporele resolutie. Door miniaturisatie van zowel het online systeem als de biosensoren, kan de temporele resolutie en de vertraagtijd verder
geoptimaliseerd worden. Het FIA-meetsysteem kan makkelijk gemodificeerd worden. In dit
proefschrift zijn twee verschillende opstellingen gebruikt; in feite kunnen alle onderdelen
naar wens aangepast worden. De biosensoren kunnen bijvoorbeeld gemakkelijk veranderd
worden voor de meting van andere stoffen, door andere enzymen in de biosensoren te
plaatsen.
Door het innovatieve concept van celkamers waren wij in staat om verscheidene cel typen
en cultures on-line te meten. De relatieve hoge aërobe ratio, zoals berekenend met beide
typen celkamers, suggereert een goede cellulaire conditie, wat essentieel is voor een
accurate meting van energiemetabolisme. Omdat in vitro monitoren van de cellulaire
conditie een relevante en veilige manier is om effecten van stoffen en stimuli te meten, is
het toekomstperspectief van on-line in vitro monitoren zeer gunstig. Metabolisme kan in de
(nabije) toekomst bijvoorbeeld gemeten worden in geïsoleerde celtypen, die normaliter
samenwerken met ander celtypen (vergelijk neuronen en astrocyten), de weerstand tegen
ischemie (zuurstoftekort) kan bestudeerd worden in verscheidene celtypen (bijvoorbeeld
hartcellen) voor de ontwikkeling van medicijnen (voor bijvoorbeeld een hartaanval), en
(menselijk) weefsel kan bestudeerd worden voor onderzoek naar het optimale
6
samenvatting
SAMENVATTING
chemotherapeutisch medicijn bij tumoren. Bovendien kan in vitro
monitoren uiteindelijk het aantal proefdieren in wetenschappelijk onderzoek verminderen.
Een extra voordeel van on-line in vitro monitoren met een hoge temporele resolutie, is de
mogelijkheid om energieverbruik per cel te berekenen, en bovendien is een hoge temporele
resolutie een voordeel bij het analyseren van lactaat kinetiek per individueel experiment.
Een ander nieuw concept in dit proefschrift, naast de mogelijkheid om metabolisme in vitro
te meten, is de introductie van twee monitoreenheden voor het meten van arterio-veneuze
verschillen in vivo. De arterio-veneuze techniek bleek erg geschikt in het meten van de
opname en afgifte van glucose en lactaat door de hersenen na hersentrauma en na lactaat
infuus, hoewel we ook extracerebraal weefsel gemeten hebben tijdens de lactaat-infuus
experimenten. Om lactaat kinetiek te meten, is het belangrijk de infuustijd zo kort mogelijk
te houden. De lactaat efflux dient wellicht in een ander bloedvat gemeten te worden dat
dichter bij de hersenen ligt (bijvoorbeeld de sinus). De arterio-veneuze monitor techniek
kan toegepast worden om opname en afgifte van stoffen te meten in allerlei organen in het
lichaam. Tijdens de in vivo experimenten werd ultrafiltratie geïntroduceerd als prefiltratie
methode. Ultrafiltratie is een geschikte methode in een verscheidenheid aan in vivo
experimenten in plaats van, of complementair aan microdialyse.
In conclusie: de mogelijkheden van biosensortechnologie voor kwantitatieve metabole
studies staat nog in zijn kinderschoenen. Dit proefschrift moge een bijdrage zijn om de
potentie van deze technologie aan te tonen.
ALGEMENE DISCUSSIE: METABOLISME
In dit proefschrift zijn het glucose en lactaat metabolisme bestudeerd in vitro en in vivo,
waarin wij onder andere gevonden hebben dat glucose geprefereerd wordt als
energiesubstraat. De helft van het opgenomen glucose wordt weer afgegeven als lactaat,
zowel in vitro als in vivo, wat onder meer heeft aangegeven dat lactaat gemakkelijk de
bloed-hersen barrière kan passeren. Alhoewel de vorming van lactaat uit glucose in
overeenstemming is met de astrocyt-neuron-lactaat-shuttle theorie, past de lactaatflux over
de bloed-hersen barrière niet in de theorie, omdat de vorming en het verbruik van lactaat
alleen in de hersenen zelf zou plaatsvinden. Wellicht belangrijker dan voorgaande is de
notie dat metingen aan glucose opname zonder inachtneming van lactaat efflux een
behoorlijke overschatting geeft van glucose metabolisme. Dit is bijvoorbeeld van belang in
metingen aan glucose verbruik met behulp van deoxyglucose (DG). De DG methode is
gebaseerd op het feit dat DG wel door cellen opgenomen, maar niet gemetaboliseerd kan
worden. Waar DG opgenomen wordt, wordt het vastgehouden, waardoor aangetoond kan
worden waar en hoeveel glucose opname heeft plaatsgevonden. In de literatuur wordt DG
opname gelijkgesteld aan glucose metabolisme, omdat aangenomen werd dat lactaat de
bloed-hersen barrière niet kon passeren. Daarom wordt er in de DG methode geen rekening
gehouden met lactaat efflux vanuit de hersenen. Echter, in dit proefschrift werd een
behoorlijke bi-directionele lactaat flux over de bloed-hersen barrière gevonden, wat zou
kunnen beteken dat de opname van glucose, zoals gemeten met de DG methode, een
overschatting geeft van het aërobe glucose metabolisme.
In de in vitro experimenten werden aanwijzingen gevonden voor grote glycogeen
voorraden, die afhankelijk zijn van de incubatiecondities en voornamelijk afgebroken en
uitgescheiden worden als lactaat. De invloed van de incubatiecondities op de
glycogeenhoeveelheid, en daarbij de lactaat efflux, en het hogere energieverbruik in vitro
7
samenvatting
SAMENVATTING
vergeleken met in vivo, betekent dat extrapolatie van conclusies over het
energiemetabolisme vanuit in vitro experimenten naar de in vivo situatie niet rechtstreeks
gedaan mag worden. Dit kan behoorlijke gevolgen hebben voor de astrocyt-neuron-lactaatshuttle theorie, omdat een groot deel van de conclusies die aan de basis liggen van de
theorie, gebaseerd zijn op in vitro experimenten.
In dit proefschrift vonden we lactaat consumptie in vitro in neuronen, astrocyten, en
hippocampale slices. Alhoewel neuronaal lactaat metabolisme de astrocyt-neuron-lactaatshuttle theorie ondersteunt, spreekt het lactaatverbruik in astrocyten de theorie tegen. In
tegenstelling met het lactaatverbruik zoals gevonden in vitro, is er geen lactaat metabolisme
gevonden in de in vivo experimenten. Het gebrek aan netto lactaat metabolisme door de
hersenen in vivo, betekent niet dat lactaat helemaal niet door de hersenen gebruikt kan
worden als energiesubstraat. Lactaatmetabolisme door de hersenen in vivo staat in de
literatuur beschreven, en ook de verlaagde lactaat efflux na hersentrauma (dit proefschrift)
kan wellicht wijzen op een (toegenomen) lactaat verbruik. Uit onze arterio-veneuze
experimenten blijkt echter dat een eventueel lactaat metabolisme geen rol speelt in het netto
energie verbruik van de hersenen. De flux van lactaat in en uit een “pool” die niet
gemetaboliseerd wordt (met een poolgrootte van 24% van het hersenvolume), is blijkbaar
(gedeeltelijk) onafhankelijk van de glucose “pool”, en is gebaseerd op een
concentratieverschil over de bloed-hersen barrière, en niet op de actieve opname van lactaat
om gebruikt te worden als metabool substraat.
Samenvattend, wijzend op de ongelijkheid in in vitro en in vivo substraat verbruik en
glycogeen hoeveelheid, moeten de in vitro resultaten voor of tegen de astrocyt-neuronlactaat-shuttle theorie met grote voorzichtigheid geanalyseerd worden. Het is bijvoorbeeld
mogelijk dat de hoge glycogeen concentratie en de lactaat efflux, zoals gevonden in vitro,
artefacten zijn veroorzaakt door de incubatiecondities tijdens het kweken van de cellen.
Omdat de astrocyt-neuron-lactaat-shuttle theorie voornamelijk gebaseerd is op in vitro
resultaten, geeft dit proefschrift aanwijzingen die de basis van de astrocyt-neuron-lactaatshuttle theorie ondermijnen. Dus, hoewel vele resultaten, vanuit dit proefschrift en vanuit
de literatuur, uitgelegd kunnen worden vóór of tegen de astrocyt-neuron-lactaat-shuttle
theorie, zijn veel resultaten geëxtrapoleerd vanuit in vitro resultaten en daarom slechts
indirect bewijs. Maar, met het indirecte bewijs van de in vitro experimenten kan wel
getheoretiseerd worden over hersenmetabolisme. Omdat uit onze experimenten bleek dat
glucose geprefereerd wordt boven lactaat in zowel neuronen als astrocyten, en lactaat
gemetaboliseerd kan worden door beide celtypen (in mindere mate dan glucose), wijst de
data in dit proefschrift niet naar de astrocyt-neuron-lactaat-shuttle theorie, maar in richting
van de conventionele hypothese van hersenmetabolisme. Maar, zoals hierboven vermeld,
moet niet vergeten worden dat in vitro data, bestemd voor in vivo-theorieën, tot misinterpretaties kunnen leiden. Direct bewijs vóór of tegen de theorieën kan alleen gevonden
worden wanneer er technieken voorhanden komen die op cellulaire schaal het in vivo
hersenmetabolisme kunnen meten.
8
samenvatting