Samenvatting les 8

Les 8
Deel 1
Risicoberekeningen
Enkele begrippen uit de kansberekening
1) De additieve wet (law of addition):
Wanneer ofwel gebeurtenis 1 ofwel gebeurtenis 2 kan voorkomen (maar nooit
samen) en wanneer de kans op gebeurtenis 1 gelijk is aan P1 en de kans op
gebeurtenis 2 gelijk is aan P2, dan is de kans dat ofwel gebeurtenis 1 ofwel
gebeurtenis 2 optreedt: P = P1 + P2.
Voorbeeld: de kans op een meisje is ½ en de kans op een jongen is ½.
De kans dat het ofwel een jongen ofwel een meisje is bij de geboorte is dus ½ + ½ = 1.
2) De multiplicatieve wet (law of multiplication):
Wanneer gebeurtenis 1 en gebeurtenis 2 onafhankelijk van elkaar kunnen optreden
en wanneer de kans op gebeurtenis 1 gelijk is aan P1 en de kans op gebeurtenis 2
gelijk is aan P2 dan is de kans dat zowel gebeurtenis 1 als gebeurtenis 2 optreden :
P = P1 P2.
Voorbeeld: de kans op een meisje is ½ en de kans op een jongen is ½. De kans op
telkens een jongen bij 2 zwangerschappen is ½  ½ = ¼ .
3) Bayes’ theorema:
Bij de berekening van de uiteindelijk kans wordt rekening gehouden met anterieure
en posterieure informatie:
 Prior probabilitiet: initiële probabiliteit (anterieure informatie)
 Conditionele probabiliteit: probabiliteit op de posterieure informatie gegeven
een bepaalde voorwaarde.
 Joint probabiliteit: product van de prior en de conditionele probabiliteit.
 Posterieure probabiliteit: finale probabiliteit = joint probabiliteit/som van de
joint probabiliteiten
1
Voorbeeld 1: X-gebonden recessieve overerving:
I
1
2
3
II
1
2
3
III
1
probabiliteit
Prior
Conditionele
Joint
posterieure
2
3
II-2 is drager
½
(1/2)3
1/16
1/9
II-2 is geen drager
½
13
8/16
8/9
Wat is de kans dat II-2 draagster is?




Prior probabiliteit: de kans dat II-2 draagster is zonder rekening te houden dat
ze 3 gezonde zonen heeft, is gezien de X-gebonden recessieve overerving ½. De
kans dat ze geen draagster is , is eveneens ½.  a priori kans is ½ maar het feit
dat II-2 drie gezonde zonen heeft, verlaagt het finale risico.
Conditionele probabiliteit: de kans dat II-2 3 gezonde zonen heeft als ze
draagster is, is (1/2)3 of 1/8. De kans dat ze 3 gezonde zonen heeft als ze geen
draagster is, is 13 of 1.
Joint probabiliteit: product van prior en conditionele probabiliteit.
Posterieure probabiliteit: joint probabiliteit/som van de joint probabiliteiten:
de kans dat ze draagster is, is 1/9, kans dat ze geen draagster is, is 8/9.
Het finale risico werd dus gereduceerd van ½ naar 1/9!
2
Voorbeeld 2: Autosomaal dominante neurologische aandoening die ontstaat op
oudere leeftijd.
60% van de individuen met een afwijkend gen vertonen een
afwijkende scan van de hersenen op de leeftijd van 50 jaar.
I
II
1
2
III
1
Wat is de kans dat III-1 het afwijkend gen heeft geërfd wanneer II-2 een normale
hersenscan heeft op de leeftijd van 50 jaar?


Eerst moeten we berekenen wat de kans is op dragerschap van het afwijkend
gen voor II-2
De posterieure informatie: II-2 heeft normale hersenscan op 50 jaar.
Probabiliteit
Prior
Conditionele
Joint
Posterior

II-2 is drager
½
4/10
4/20
4/20 : (4/20+10/20) = 2/7
II-2 is geen drager
½
1
10/20
5/7
De kans dat III-1 drager is van het afwijkend gen is dus 2/7  ½ = 1/7.
3
risicoberekening
Risicoberekening
Voor numerieke chromosoomafwijkingen
Risicoberekening voor numerieke chromosoomafwijkingen
Vb. Trisomie 21 tgv nondisjunctie tijdens meiose
46, XY
46, XX
Nondisjunctie: als tijdens meiose1 of
meiose2 of mitose, de
chromosomenparen niet worden
opgesplitst, of als de chromatiden niet
worden opgesplitst
?
47, XY, +21
1) Trisomie 21 ten gevolge van een non-disjunctie tijdens de meiose: wanneer
het karyotype van beide ouders normaal is, is de kans dat bij een volgende
zwangerschap opnieuw trisomie 21 optreedt maximaal 1% (empirisch risico).
Trisomie 21 bij 2 opeenvolgende zwangerschappen bij eenzelfde individu kan
mogelijk verklaard worden door:
o Gonadaal mosaïcisme (in de gonaden bevindt zich een groep cellen die
trisomisch zijn)
risicoberekening
o Genetisch predispositie tot non-disjunctie bij de vorming van gameten
(hypothese, nog onvoldoende bewezen)
Voor structurele chromosoomafwijkingen
o Toeval
Vb. Downvoor
syndroom
tgv een Robertsoniaanse
translokatie
Risicoberekening
structurele
chromosoomafwijkingen
45, XY, der(14;21)(q10;q10)
46, XX
?
46, XY, der(14;21)(q10;q10), +21
2) Trisomie 21 ten gevolge van een Robertsoniaanse translocatie bij één van
beide ouders: ongeveer 1/1000 personen is drager van een dergelijke
translocatie.
4
Voorbeeld:
o Kind: trisomie 21 (syndroom van Down): 46,XY der(14;21)(q10;q10)+21.
o Vader:45,XY,der(14;21)(q10;q10).
Het herhalingsrisico voor elke volgende zwangerschap voor syndroom
van Down bedraagt 1-3%.
Monosomie 21, monosomie 14 en trisomie 14 leiden steeds tot een
miskraam.
o Moeder: 45,XX,der(14;21)(q10;q10).
Wanneer de moeder draagster is van een Robertsoniaanse translocatie, is
het risico op Down syndroom voor elke volgende zwangerschap ongeveer
10%. De reden voor dit groter risico (vergeleken met vader) is niet
bekend.
Wanneer de moeder de robertsoniaanse translocatie draagt, is het risico veel groter
dat er een kind geboren zal worden met trisomie 21.
Risicoberekening voor monogenische aandoeningen
1) Autosomaal dominant:
o het risico voor de kinderen van een aangetast individu is in de regel 50%.
o Cave non-penetrantie: vb. penetrantie is 80%: het risico wordt ½  8/10 =
0.4 (ipv 0.5).
o Belangrijk is steeds rekening te houden met gonadaal mosaïcisme bij een
nieuwe mutatie: het herhalingsrisico voor volgende zwangerschappen bij
een nieuwe mutatie is bijgevolg moeilijk te bepalen en wordt op 1-3%
geraamd (in tegenstelling tot vb. 1/100000, zijnde de mutatierate in de
populatie).
- Gonadaal= de abnormale cellen bevinden zich in de geslachtsklieren
- Mosaïcisme = de mutatie is slechts aanwezig in een deel van de cellen
2) Autosomaal recessief:
o In de regel zijn beide ouders van een aangetast kind drager, en is het
herhalingsrisico voor broers/zussen 25%.
o Cave uniparentale disomie: kan een mogelijke verklaring zijn wanneer we
bij één van beide ouders het dragerschap niet kunnen vaststellen.
(indien mogelijk bevestig dragerschap bij beide ouders!)
5
risicoberekening
o Cave non-paterniteit: steeds aan denken wanneer je het dragerschap bij
één van beide ouders niet kan vaststellen.
o Besluit: indien mogelijk steeds het dragerschap bij beide ouders
bevestigen!
Voor monogenische aandoeningen
X-GEBONDEN
RECESSIEF
 X-gebonden recessief:
3 mogelijkheden:
?
1) De moeder is draagster en het risico op een aangetaste zoon bij een volgende
zwangerschap (indien het een jongen is) is ½.
2) De moeder is geen draagster: het betreft een nieuwe mutatie tijdens de
maternele meiose met verwaarloosbaar klein herhalingsrisico.
3) De moeder vertoont gonadaal mosaïcisme: klein herhalingsrisico.
In de praktijk kan men moeilijk onderscheid maken tussen deze 3 mogelijkheden
tenzij een dragerschapstest voorhanden is.
Voorbeeld: dragerschapsonderzoek: ziekte van Duchenne (spierdystrofie):
Dragershapstest bij vrouwen: CK-bepaling in het bloed:
 2/3 van de obligate draagsters vertonen een verhoogd CK (creatine kinase:
spierenzym dat in bloed kan bepaald
worden).
I
i
II
1
2
III
6
Wat is de kans dat II-2 draagster is?
De a priori kans is ½ maar mevrouw heeft 3 gezonde zonen en het CK is normaal.
probabiliteit
Prior
Conditionele:
3 gezonde zonen
normaal CK
II-2 is drager
½
II-2 is geen drager
½
(1/2)3
1/3
13
1
Joint
Posterieure
1/48
1/25
24/48
24/25
Berekeningen zie pp
Conditionele probabiliteit:
kans op 3 gezonde zonen, al dan niet drager.
kans op normaal CK, al dan niet drager.
Het finale risico werd dus gereduceerd van ½ naar 1/25!
Risicoberekening voor multifactoriële aandoeningen:
o
o
o
o
Meestal gebaseerd op observaties uit familiestudies
Geen theoretische berekeningen
Men spreekt van empirische risico’s
Kenmerken:
· Het risico voor 1ste graadsverwanten is ongeveer de vierkantswortel van het
populatierisico (meestal 3-5%)
· Het risico voor 2de en verdere graadsverwanten neemt exponentieel af
· Het risico voor 1ste graadsverwanten wordt groter wanneer verschillende
individuen binnen een familie aangetast zijn en naarmate de aandoening
ernstiger is.
· Wanneer de aandoening meer frekwent is bij het ene dan bij het andere
geslacht, is het risico groter voor de 1ste graadsverwanten van een aangetast
individu van het geslacht waar de aandoening het minst frekwent bij
voorkomt
· Consanguiniteit (= bloedverwantschap) bij de ouders verhoogt het risico
voor de kinderen.
7
Les 8
Deel 2
Mutatie detectie
Inleiding
De recente vooruitgang in identificatie en karakterisatie van ziektegenen betrokken
bij monogenetische aandoeningen maken moleculaire diagnostiek van veel
genetische aandoeningen mogelijk.
De technieken die aangewend worden voor moleculaire diagnostiek hebben een
revolutionaire ontwikkeling gekend in de laatste decennia, in hoofdzaak door twee
factoren.
Ten eerste heeft de identificatie van ziektegenen het mogelijk gemaakt genetische
testen uit te voeren op sequentieniveau, eerder dan de overerving van mutante
chromosomen na te gaan in families.
Een tweede factor is de ontwikkeling van de polymerase kettingreactie (PCR),
waardoor DNA sequenties exponentieel kunnen geamplificeerd worden tot een PCR
product, wat het uitgangspunt is van verschillende moleculaire toepassingen (zie
verder).
Chromosoom analyse met polymorfe merkers (koppelingsonderzoek) is soms nog
noodzakelijk wanneer de causale mutatie niet gekend is.
Dit wordt uitgevoerd met behulp van hoog polymorfe (en dus zeer informatieve)
microsatellietmerkers, die kunnen geanalyseerd worden na PCR en electroforese.
-
Moleculaire diagnostiek : medische genetica, microbiologie, virologie,
hematologie, pathologie.
Medische genetica : mutatiedetectie, genetische testing van Mendeliaanse
factoren.
Klinische context
-
perceptie: genetische aandoeningen zijn zeldzaam
echter: ~ 3-7% van de populatie zal een genetische aandoening ontwikkelen
50% kindersterfte = een erfelijke aandoening
frequente aandoeningen:
 Alzheimer dementie
 Diabetes
 Hypertensie
 Kanker
8
Klinische relevantie
o Diagnose
- Ziektegen identificatie
- Herhalingsrisico voor de ouders van een aangedaan kind
- Prenatale en pre-implantatie diagnose
- Presymptomatisch onderzoek in niet-aangedane verwanten
o Prognose
- Ziekteverloop
- Te verwachten symptomen
o Therapie
- Momenteel: zeer beperkt (gentherapie,..)
- Inzichten in pathogene mechanismen: identificatie van targets voor
therapeutische interventie
(! Spermadonoren worden enkel gescreend voor mucoviscidose, niet voor andere
aandoeningen want dit is duur en tijdrovend!
Wél extra onderzoek indien er bij de wensmoeder erfelijke aandoeningen gekend
zijn !)
Vraagstelling
Is patiënt drager van een mutatie in elk van de ziektegenen betrokken bij de
specifieke ziekte?
 Vroeger niet mogelijk  wel sinds de komst van NGS
 Voorbeeld: erfelijke doofheid, retinitis pigmentosa (RP), cardiomyopathie
Is patiënt drager van een mutatie in specifiek ziektegen verantwoordelijk voor
specifieke ziekte?
 Mutatiescanning: screening van het volledige gen
 Voorbeeld: neurofibromatose type 1 (NF1)
Is patiënt drager van (een) specifieke mutatie(s) in bepaald ziektegen?
 Directe mutatiedetectie: gericht mutatieonderzoek
 Voorbeeld: CF, HFE: beperkt aantal mutaties vertegenwoordigen groot % van
het mutatie spectrum; nazicht mutatie gedetecteerd bij verwant
9
Materiaal voor genetisch onderzoek
DNA-onderzoek
Moleculair genetische testen kunnen uitgevoerd worden op genetisch materiaal van
verschillende bronnen mét een kern (genomisch DNA/gDNA) zoals:








bloedstalen (EDTA = volbloed)  meest frequent!
gedroogd bloed (bijv. Guthriekaart)  neonatale screening PKU
buccale cellen (wang brush)  niet invasief, populatiescreening
chorion villi (CVS)  beste bron van foetaal DNA, afname tss. 11-12 weken
amniocyten  bron van foetaal DNA, amniocentese tussen 15-15 weken
1 cel uit 8-cellig embryo  na IVF, voor preimplantatie diagnostiek (PGD)
haar, sperma  vooral bij forensische toepassingen
pathologische specimens (paraffine)  typering individuen, analyse tumoren, gefragmenteerd
(enkel analyse van korte fragmenten mogelijk (< 250 bp)
 voorbeeld van een Guthriekaart
Elke cel met kern kan gebruikt worden voor DNA onderzoek (dus niet de rode
bloedcellen).
!! In tegenstelling tot bij het onderzoek van de chromosomen moeten de cellen niet in
cultuur gebracht worden. Doorgaans maakt men gebruik van niet-gestold bloed !!
Genetische testen worden meestal uitgevoerd op genetisch materiaal dat
geamplificeerd (vermenigvuldigd) wordt door PCR.
Ter info:
“De polymerasekettingreactie,[1] (PCR, van Polymerase Chain Reaction), is een manier
om uit zeer kleine hoeveelheden DNA (enkele basen) specifiek een of meer gedeeltes
te multipliceren (amplificeren) tot er genoeg van is om het te analyseren.”
10
Zowel genomisch DNA (zie hierboven) als mRNA kunnen als uitgangsmateriaal
gebruikt worden.
 Genomisch DNA kan bekomen worden uit ongeveer elke bron (bloed, CVS,
speeksel).
Het bevat - naast informatie van de exonen - potentieel interessante informatie in
sequenties zoals promoters, splice sites, die niet aanwezig zijn in mRNA.
Het nadeel van genomisch DNA is dat vele genen groot zijn met een complexe
organisatie van intronen en exonen.
Wanneer de genstructuur gekend is, kunnen alle exonen geamplificeerd worden met
behulp van specifieke primers.
cDNA afkomstig van mRNA, is een veel eenvoudiger doelwit om te analyseren, omdat
de intronen hieruit verwijderd zijn door RNA processing.
Voordelen RNA-onderzoek:
 RT-PCR: interessant voor mutatiescanning
=> Minder fragmenten te onderzoeken dan op gDNA niveau
 Aantonen effecten op ‘splicing’
=> confirmatie effect sequentieverandering gDNA op RNA niveau
=> identificatie ‘splicing’ defect wanneer genomische verandering gemist
wordt. Bv. bij activatie van cryptische ‘splice site’ diep in intron
Nadelen RNA-onderzoek
 Snelle degradatie (verse stalen), RNAse vrij werken
 Expressie gen van interesse nodig in toegankelijke weefsels (bloed,
fibroblasten)
 Mutant mRNA: onstabiel, degradatie door NMD
=> additie van stabilisatoren nodig
RNA degradeert echter sneller dan gDNA en het doelwit gen moet tot expressie
komen in het beschikbare weefsel.
Om de aanwezigheid van specifieke mutaties te karakteriseren wordt meestal
genomisch DNA gebruikt.
11
Moleculair genetisch onderzoek
In sommige gevallen is de aard van een mutatie in een bepaald gen gekend.
Ten eerste is dit het geval wanneer slechts een klein aantal verschillende mutaties in
een populatie verantwoordelijk zijn voor een ziekte.
Dit is meestal het gevolg van een founder mutatie.
Ten tweede komt dit voor wanneer de ziekte steeds het gevolg is van een bepaald
type mutatie, bijvoorbeeld bij de ziekte van Duchenne (DMD), waar deleties
verantwoordelijk zijn voor ~60% van de gevallen.
In andere gevallen is dergelijke informatie niet gekend.
Dit is onvermijdelijk wanneer een ziektegen pas geïdentificeerd is, en wanneer het
genotype nog aan het fenotype gecorreleerd moet worden.
Er zijn ook vele genen waar een groot spectrum van verschillende mutaties gekend
zijn. Soms zijn deze mutaties uniek voor een bepaalde familie of individu, dit zijn de
zogenaamde private mutaties (bijvoorbeeld fibrilline 1 of FBN1 mutaties in het
syndroom van Marfan; NF1 mutaties in neurofibromatose type 1).
 Het uitvoeren van mutatie-analyse in dergelijke genen is technisch zeer
omslachtig.
Vaak zijn deze genen groot en is de causale mutatie een verandering van slechts één
enkele base.
Er zijn verschillende strategieën die gevolgd worden voor moleculair genetisch
onderzoek.
De volgende strategieën komen aan bod in de lessen:



Het ziektegen is gekend, er zijn veel mogelijke mutaties.
Dit impliceert testen waarbij het verschil kan gedetecteerd worden tussen
normale en mutante genen zonder noodzakelijkerwijs de aard van de mutatie
te bepalen. Er wordt geopteerd voor sequenering !
De ziekte is veroorzaakt door triplet repeat expansie - de strategie voor
detectie van dergelijke expansies is gericht op bepaling van de lengte van de
repeats met PCR-gebaseerde technieken.
De mutatie kan niet gekarakteriseerd worden, wanneer het causale ziektegen
bijvoorbeeld niet gekend is, maar wél de genlocus.
In dit geval kan het chromosoom waarin de mutatie zich bevindt, opgespoord
worden in een familie door middel van koppelingsonderzoek met DNAmerkers.
12
Dit was de uitgangssituatie een decennium geleden, en is nu de minst
aangewende strategie.
De technologie wordt nu echter toegepast in het kader van exclusie testen (zie
verder).
Polymerase ketenreactie
PCR is een alternatieve techniek voor clonering waarbij onbeperkte hoeveelheden
van een welbepaalde DNA sequentie kunnen aangemaakt worden.
Polymerase kettingreactie = polymerase chain reaction.
Componenten PCR:
- 2 primers/oligonucleotiden (15-20 bp)
=> 1 ‘forward’ en 1 ‘reverse’ primer
=> corresponderen met DNA sequenties die doelwitsequentie flankeren
- DNA polymerase
=> thermisch stabiel
=> nodig voor primer extensie
- Vrije DNA nucleotiden (dNTP’s)
- gDNA of RNA (RT-PCR)
=> kleine hoeveelheden PCR, centrale tool
http://www.allesoverdna.nl/woordenboek/pcr.html
13
PCR, centrale tool
DNA fragment dat moet geamplificeerd worden
denaturatie bij 95°C: ds ® ss
toevoegen van primers; binding (annealing) van primers
bij 50 à 55 °C
ketenverlenging bij 72°C: DNA polymerase verlengt de primers
aan hun 3’ uiteinde
1 cyclus
na tweede cyclus 4 fragmenten
derde cyclus:
8 fragmenten
PCR is een enzymatische amplificatie (= vermenigvuldiging) van een DNA fragment
(=’target’) dat gelokaliseerd is tussen 2 oligonucleotide ‘primers’ (ongeveer 20nt).
 De ene primer is complementair aan de ene streng van de DNA molecule gelegen
aan het ene uiteinde (flankerende regio) van de ‘target’ sequentie.
 De andere primer is complementair aan de andere streng van de DNA molecule
gelegen aan de tegenovergestelde zijde (flankerende regio) van de targetsequentie.
Het 3’ uiteinde van de flankerende oligonucleotide primers wijst naar de
targetsequentie die bijgevolg dmv een termostabiel DNA-polymerase zal
geamplificeerd worden.
De primers zijn dus zo georiënteerd dat er 2 nieuwe strengen gevormd worden die
op hun beurt complementair zijn aan elkaar en een kopij van de originele target
sequentie vormen.
Herhaalde cycli van denaturatie (enkelstrengig DNA) door middel van verhitting,
hybridisatie van de primers en enzymatische DNA synthese resulteren uiteindelijk in
een exponentiële amplificatie van de target sequentie.
Deze PCR wordt uitgevoerd in een PCR toestel waar een 20 tot 30 cycli van
temperatuurveranderingen worden doorlopen.
Na een 2 tot 3 uur krijgt men een 105-voudige toename van het DNA.
14
De polymerase chain reaction of polymerase kettingreactie
(PCR) laat de vermeerdering toe van een specifieke DNAsequentie uit een zeer kleine hoeveelheid DNA. Een PCR bestaat
uit drie stappen die elk bij een welbepaalde temperatuur en
gedurende een welbepaalde tijd worden uitgevoerd. Als eerste
stap (95°C) vindt men de denaturatie of het “smelten” van het
DNA tot twee enkelstrengen. De tweede stap (50-65°C) bestaat
uit het doen “annealen” of binden van de twee primers of
startsequenties aan de DNA-sequentie die men wil kopiëren.
Deze primers worden in de elongatiestap verlengd door de
inbouw van de DNA-bouwstenen met behulp van DNApolymerase
Onderzoek van het PCR-product:
De lengte van het PCR product kan men vervolgens verifiëren door middel van gel
electroforese.
Hierbij worden de DNA fragmenten gescheiden op basis van de grootte.
Het kleinste DNA fragment migreert het snelst (onderaan de gel), het grootste DNA
fragment het traagst (bovenaan de gel).
Deze DNA fragmenten worden vervolgens gekleurd d.m.v. ethidium bromide en
gevisualiseerd met UV licht.
Op deze wijze weet men of de PCR reactie geslaagd is.
Deze DNA fragmenten kunnen nu verder geanalyseerd worden (bijv. door
sequenering).
15
DNA sequenering/sequencing
Deze sectie belicht mutatiedetectie technieken voor analyse van genen waarin vele
verschillende en ongekende mutaties voorkomen.
Doel: detectie van het spectrum van mutaties (gekende en niet-gekende) in
doelwitgen.
Voor mutatie-analyse van dergelijke genen worden specifieke testen uitgewerkt.
Een voorbeeld zijn de BRCA1 en BRCA2 genen (betrokken bij erfelijke borstkanker),
waarin een groot aantal verschillende mutaties voorkomen.
 wanneer grote allelische heterogeniteit
Het majeure probleem van dit type analyses is het evalueren van de gedetecteerde
veranderingen of varianten, namelijk het catalogeren als een polymorfisme (niet
pathogeen) of als een pathogene mutatie, waarbij de verandering schadelijke
gevolgen heeft voor genfunctie.
identificatie van nieuwe sequentievariaties: evalueren pathogeniciteit
Directe sequenering (gouden standaard)
= is het bepalen van de basenvolgorde van een DNA sequentie.
Door directe sequenering van een PCR product verkrijgt men informatie over de aard
en de precieze localisatie van een mutatie.
Sequenering wordt door toenemende robotisering steeds minder arbeidsintensief,
maar blijft vrij duur.
16
DNA sequenering - Sanger
dideoxy terminatie methode volgens Sanger (1977)
De methode van Sanger is de meest gebruikte methode om te sequeneren.
=> de ‘dideocy terminatie methode’ van Sanger
De methode is gebaseerd op enzymatische aanmaak van één van de DNA-ketens
waarvan de basenvolgorde bepaald moet worden.
De methode maakt gebruik van:
- een kort gelabelde primer
- DNA-polymerase
- vier verschillende nucleotidebouwstenen (dATP, dTTP, dCTP en dGTP)
- vier dideoxynucleotiden (ddATP, ddTTP, ddCTP en ddGTP).
De primer hecht zich aan het 3’ uiteinde en wordt verlengd.
De bouwstenen worden door het DNA-polymerase in de keten ingebouwd volgens
complementariteit aan de onbekende streng.
Wordt er een dideoxynucleotide ingebouwd, dan wordt de aanmaak van de streng
gestopt.  Op deze manier ontstaan gelabelde fragmenten met een verschillende
lengte.
Manueel worden de reactieproducten naast elkaar in een gel op lengte gescheiden en
zichtbaar gemaakt.
De basenvolgorde van de complementaire streng kan afgelezen worden.
De kleinste fragmenten lopen het verst op de gel en vormen het 5’-uiteinde van de
complementaire streng en het 3’-uiteinde van het onbekende DNA-fragment.
17
Figuur: Principe van directe sequenering.
Tijdens een lineaire PCR reactie worden in een DNA fragment gemerkte nucleotiden
ingebouwd. Deze nucleotiden zijn chemisch gewijzigd (‘BigDye Terminator cycle
sequencing’) en leiden tot een terminatie van DNA synthese.
De fragmenten worden volgens grootte gescheiden, detectie van het fluorochroom
leidt dan tot identificatie van de nucleotidesequentie.
18
DNA sequenering
DNA sequenering
fluorescente automatische sequenering
- capillaire elektroforese (ABI3730XL)
elektropherogram: sequentieprofiel
- goede leeslengte tot ~ 500-1000 bp
normale sequentie
c.657C>T (p.Arg219*)
ruwe data
heterozygote sequentievariatie, vb. substitutie
sequentieprofiel
Voordelen DNA-sequencing:
 Accuraat
 Leeslengte: 500-1000bp
 “gouden standaard” => sensitiviteit ~ 100%!
 Geeft informatie over de aard van de mutatie
 Geeft informatie over de locatie van de mutatie
Nadelen DNA-sequencing:
 Duur
 Arbeidsintensief
 Beperkte doorvoer (100.000 bp/h)
PCR gebaseerde techniek voor bepaling lengte trinucleotide repeat
Ziekte van
Huntington (HD)
Ziekte van
Steinert (MD)
Fragiele X
CAG: 5’ exon 1
(polyQ) HTT gen
CTG 3’UTR
CGG 5’UTR
DMPK gen
FMR1 gen
normaal allel
10-26
5-37 CTG
< 45 CGG
intermediair allel
27-35
zz
45-58
38-49
59-200 (normale
methylatie)
36-121
> 50 CTG
> 200
(36-39: onvolledig
penetrant)
3 gradaties
(+ abnormale
methylatie)
repeat
premutatie allel
full mutatie
(mild, klassiek,
congenitaal)
19
Testing voor triplet repeat expansies (TRE): niet met sequencing maar met PCR!
Alhoewel elke triplet repeat expansie een onafhankelijk gebeuren is, komt elke
mutatie op dezelfde locatie voor en kan bijvoorbeeld gedetecteerd worden door een
PCR reactie gebaseerd op primers die aanhechten aan elke zijde van de plaats van
expansie.
De grootte van het PCR product toont aan of een expansie heeft plaatsgehad of niet.
De grootte van de expansie is belangrijk voor de prognose of de age of onset en ernst
van de aandoening.
Oefening: Ziekte van Huntington
-
progressieve neuromotore, psychiatrische en cognitieve aantasting
AD overerving, anticipatie
Diagnostiek: PCR, gel electroforese
Oefening: Ziekte van Huntington
De data hieronder tonen de resultaten van de electroforese van PCR fragmenten
voor de CAG repeat expansie in het HTT gen geassocieerd met de ziekte van
Huntington. De vader kreeg de ziekte van Huntington toen hij 40 jaar oud was. Bij 6
van zijn kinderen werd eveneens de aandoening vastgesteld (3,5,7,8,10,11) – de
leeftijd waarop de eerste symptomen ontstonden, worden weergegeven op
onderstaande figuur bij de band van het respectievelijke PCR fragment.
Wat is de prognose voor kind 4, 6 en 9?
Lengte CAG repeat
Leeftijd bij diagnose
20
Koppelingsonderzoek = indirecte analyse
Historisch: het is de eerste methode voor indirecte mutatiedetectie.
Koppelingsonderzoek is gebaseerd op variaties in de DNA sequentie tussen elk
individu = DNA polymorfismen.
Vergelijking tussen de overerving van polymorfe merkers (=polymorfismen) in of
rond een gen met de overerving van een ziekte.
Er gebeurt geen mutatie onderzoek voor het gen verantwoordelijk voor het
ziektebeeld.
DNA polymorfismen zijn variaties in DNA sequentie die geen klinisch belang hebben.
Voorwaarden:
- de ziektelocus is gekend : we gebruiken merkers die gekoppeld zijn aan de
ziektelocus
- stambomen + beschikbaarheid voldoende stalen voor het bepalen van de fase
- zekerheid over de klinische diagnose
Koppelingsanalyse (linkage analyse)
Mogelijk voor:
drie stappen
- autosomaal dominant
- autosomaal
recessief in relevante ouder(s)
(1) genotyperen
2 chromosomen
- -gebruik
X-gebonden
van informatieve polymorfe merkers (i.e. waarvoor heterozygositeit)
die dicht tegen ziektelocus gelegen zijn (= gekoppeld)
3 stappen:
AR
AD
23
43
aangetast
drager
gezond
1. Genotyperen 2 chromosomen in relevante ouder(s)
=> gebruik van informatieve polymorfe merkers (i.e. waarvoor
heterozygositeit) die dicht tegen ziektelocus gelegen zijn (=gekoppeld)
21
2. Het bepalen van de fase
=> opstellen haplotypes (= combinatie van allelen op 1 chromosoom)
=> welk haplotype draagt het ziekte-allel?
3. Bepalen welk chromosoom transmissie naar indexpatient
We onderscheiden:
· Variaties in de sequentie van één enkele nucleotide of SNPs (single nucleotide
polymorfisms) genoemd.
Dergelijke SNPs treffen we aan om de 200 à 500 bp.
SNPs zijn veel frequenter dan de VNTRs en de microsatellieten en zijn uniform
doorheen het genoom verspreid.
Het zijn excellente merkers voor het opstellen van genetische kaarten.
· Variaties in lengte van repetitieve sequenties: microsatellieten en VNTRs.
o De microsatellieten zijn di- of tri- of tetranucleotide repeats (vb.
TGTG…TG; CAACAA…CAA; AAATAAAT…AAAT).
De totale lengte van de microsatellieten is kleiner dan 1 kb.
Het aantal nucleotiderepeats binnen een microsatelliet kan verschillen
tussen de homologe chromosomen van eenzelfde individu en tussen de
individuen onderling.
Microsatellieten zijn derhalve een polymorfe locus.
Microsatellieten zijn erg nuttig voor linkage-analyse omdat:
- een microsatelliet doorgaans vele allelen (repeat lenghts) heeft in een
populatie zodat de probabiliteit dat een individu heterozygoot is meestal
groter is dan 70%
- in tegenstelling tot analyse van de VNTR is er geen Southern blotting
nodig maar kan men gebruik maken van PCR technieken
- tienduizenden microsatellieten polymorfe loci werden reeds
geïdentificeerd doorheen het humaan genoom zodat we voor nagenoeg
elke regio van het genoom linkage studies kunnen uitvoeren met deze
microsatelliet-markers.
o Variable number of tandem repeat (VNTR) polymorfismen ontstaan door
insertie van multiple kopieën, in tandem, van een DNA sequentie met een
lengte van 10-100 bp (=minisatellite), tussen 2 restrictie sites. VNTRs
hebben een langer repeat motief en een totale lengte van 1-3 kb. VNTRs
omvatten meerdere allelen vermits de grootte van het restrictiefragment
welke de minisatelliet bevat afhankelijk is van het aantal kopijen van de
minisatelliet. De minisatelliet repeat sequenties die voorkomen in
22
verschillende VNTR-type polymorfismen zijn vaak voldoende gelijkend
zodat men met één minisatelliet-probe in een enkele Southern blot
hybridisatie veel verschillende loci gelijktijdig kan detecteren. Deze
simultane detectie van een aantal VNTR polymorfismen noemt men DNA
fingerprinting. Enkel ééneiïge tweelingen vertonen een identiek patroon.
Deze VNTR markers worden vaak gebruikt voor identificatie van personen
(stoffelijke resten bij rampen, paterniteit…).
Mutatie-analyse via sequenering
Koppelingsonderzoek

Opsporen van een causale mutatie ; Analyse van 
het causale gen
Analyse van polymorfe merkers in of rond het
causale gen

De DNA sequentie van het gen moet bekend zijn 
Enkel de genlocus moet bekend zijn

Enkel onderzoek van het aangetaste individu

Onderzoek van zowel aangetaste als niet
aangetaste individuen in een bepaalde familie

De techniek laat niet altijd toe om de mutatie te
vinden

Pas op bij locus heterogeniteit (verschillende
genen kunnen verantwoordelijk zijn voor de
ziekte)
Figuur: Linkage in ADPKD.
Autosomaal dominant nierpolycystose (autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD) wordt veroorzaakt door
mutaties in PKD1 (85%) en PKD2 (15%). Beide genen zijn enorm groot waardoor mutatie-analyse niet in routine-diagnostiek
kan aangeboden worden. Koppelingsonderzoek biedt hier een uitweg. Hier wordt koppeling weergegeven voor PKD1 en PKD2
door 2 merkers die beide genen flankeren. We nemen aan dat voor de verschillende merkers telkens verschillende allelen
bestaan die weergegeven worden door een cijfer. De 4 merkers vertonen koppeling: tussen de merkers treed in geen enkel
geval recombinatie op (i.e. de haplotypes bij de ouders en hun nakomelingen is identiek). De PKD1 allelen vertonen geen
segregatie met het fenotype: beide paternele allelen komen zowel voor bij aangetaste als niet aangetaste kinderen. Het allel
dat gekenmerkt wordt door merkers 2 en 3 van het PKD2 allel vertoont wel segregatie met het fenotype: deze merkers zijn
gelegen in het haplotype dat de pathogene mutatie bevat. In deze familie wordt ADPKD dus veroorzaakt door een mutatie in
het PKD2 gen. Predictief onderzoek kan hierdoor aangeboden worden met koppelingsonderzoek.
23
Exclusie test
= een prenatale test voor de risicodrager van een late onset neurodegeneratieve
aandoening die zijn eigen status niet wil kennen.
Doel:
Voor het toekomstig kindje het risico op late onset neurodegeneratieve aandoening
uitsluiten.
Deze test wordt meer en meer gevraagd door koppels waarbij één van beide
partners 50% risico heeft op een autosomaal dominante late-onset
neurodegeneratieve aandoening.
Via PD (vlokkentest) of PGD
Deze test wordt niet in ieder genetisch centrum aangeboden en is in sommige
landen zelfs bij wet verboden.
Naast de mogelijkheid om via mutatie onderzoek na te gaan of een foetus al dan niet
drager is van de ziekte-veroorzakende mutatie, is er voor de risicodrager die zijn
status niet wil kennen een andere manier van prenataal testen mogelijk.
Het gaat in dat geval om de zogenaamde exclusietest of uitsluitingstest.
Het doel van deze exclusietest is om aan toekomstige ouders met 50 % risico op de
ziekte de kans te geven het risico voor hun kinderen uit te sluiten zonder hun eigen
risico te kennen.
Voorwaarden:
 Test dient op punt gezet voor de zwangerschap
 DNA-materiaal ouders risicodrager dient voorhanden te zijn
Het voorbeeld dat tijdens de les aangehaald wordt, gaat over de ziekte van
Huntington.
Stel dat de grootmoeder de ziekte van Huntington heeft en de grootvader gezond is.
Aangezien HD (Huntington Disease) een autosomaal dominante aandoening is, zal
de grootmoeder in dat geval één chromosoom 4 mét de mutatie en één nietafwijkend chromosoom 4 hebben.
Eén van die beide chromosomen zal worden doorgegeven aan haar zoon.
Als die zoon een kind verwekt, wordt bij deze foetus nagegaan of hij een
chromosoom 4 van de grootmoeder of van de grootvader heeft gekregen.
24
Indien hij chromosoom 4 van de grootmoeder kreeg, is er 50 % kans dat dit het
afwijkende chromosoom is.
In dat geval zal men meestal tot een zwangerschapsafbreking overgaan, hoewel er
50 % kans is dat de foetus nooit de ziekte van Huntington zal ontwikkelen, namelijk
als hij het chromosoom 4 van de grootmoeder heeft overgeërfd met het nietafwijkende gen.
!! Enerzijds heeft het uitvoeren van een exclusietest als voordeel dat 'het recht op
niet weten' van de risico-ouder gerespecteerd wordt.
!! Anderzijds moeten de ouders zich realiseren dat men toch in de helft van de
gevallen een zwangerschapsafbreking van een gezonde foetus uitvoert.
Interpretatie resultaten exclusie test
Interpretatie resultaten exlusie test:
25
Les 8
Deel 3
Medische genoom analyse
Het humane genoom project
In 1987 werd één der belangrijkste onderzoeksprojecten van vorige eeuw opgestart,
het "Humaan Genoom Project" (HGP).
DOEL: een gedetailleerde genetische en fysische kaart van het volledige menselijke
genoom op te stellen.
De snelheid waarmee dit werd gerealiseerd overtrof alle verwachtingen.
Op 14 april 2003 werd officieel aangekondigd dat de doelstelling van het HGP, nl. de
volledige sequenering van het menselijke genoom, gerealiseerd was
(http://www.genoom.gov/11006929).
Toen: 13 jaar, 3 miljard dollar, tientallen labs  1 genoom
Nu: 1 week, 5000 dollar, 1 laborant  1 genoom
Deze datum valt op enkele dagen na samen met de 50ste verjaardag van de publicatie
door Watson en Crick in het tijdschrift “Nature” over de opheldering van de DNA
structuur.
Alle gegevens uit het HGP zijn publiek beschreven in algemeen toegankelijke
databanken (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), zodat deze onmiddellijk kunnen
geraadpleegd worden door alle wetenschappers die zich met de studie van
genetische en erfelijke aandoeningen bezig houden.
Het HGP heeft uiteraard de identificatie van ziektegenen betrokken bij erfelijke
aandoeningen aanzienlijk versneld.
Voor nagenoeg een 2000-tal monogenetische aandoeningen zijn nu één of meer
causale genen geïdentificeerd.
Het 1000-genomen project
DOEL: een gedetailleerd overzicht te maken van de variatie die kan waargenomen
worden in de humane genoom sequentie.
Deze cataloog kan gebruikt worden om de relatie te onderzoeken tussen genotype en
fenotype (bijvoorbeeld: komen bepaalde varianten enkel voor in mensen met een
specifieke aandoening en niet bij gezonde mensen) en zal helpen de rol van de
genetische variatie doorheen de menselijke geschiedenis en evolutie beter te
begrijpen.
26
Whole exome sequencing (WES)
Exoom = alle coderende sequenties of exons van een genoom (~1%; 30Mb)
WES = aanrijking van het exoom, sequeneren van alle exonen in 1 experiment >
180.000 exonen.
Bart De Wever & Elio Di Rupo => 99,8% gelijkenis!
27
Veel mogelijkheden voor monogenische aandoeningen, maar (nog) niet voor
multifactoriële.
Genetische diagnostiek vandaag: Long-QT syndroom:
Medische genetica in een historisch perspectief:
Medische genetica in een historisch perspectief
Tijo & Levan
Wetten van Mendel
1865
46 chromosomen
PCR
1983
1956
1953
DNA structuur
Identificatie
1ste humane
ziektegen
1989
1000 genomen project
2008-
1990-2003
Humaan genoom project
?
personal genome
Watson & Crick
Alhoewel het begrip erfelijkheid al eeuwen geleden gekend was, is de geschiedenis van
de medische genetica vrij recent.
Het is 150 jaar geleden dat Mendel de fundamenten van de wetten van erfelijkheid legde,
slechts 60 jaar geleden dat Watson en Crick de structuur van DNA blootlegden, gevolgd
door de ontdekking van het exacte aantal chromosomen enkele jaren later.
In 2003 werd het Humaan Genoom Project afgerond, gevolgd door het post-genoom
tijdperk, wat geleid heeft tot revolutionaire inzichten in de basis van gezondheid en
ziekte, en de interesse voor genetica een breed draagvlak gegeven heeft. Een nieuw
baanbrekend project is het 1000genomes project.
28