indicatoren: eiwitten aantonen 1.xanthoproteïnetest

INDICATOREN: EIWITTEN AANTONEN
1.XANTHOPROTEÏNETEST
Materiaal
• Reageerbuisrekje
• 2 reageerbuizen
• Melk
• Druppelflesje met geconcentreerde HNO3-oplossing / salpeterzuur
• Labjas en handschoenen (HNO3-oplossing veroorzaakt o.a. brandwonden)
Methode
Breng ongeveer 3 ml melk in een proefbuisje en voeg vervolgens enkele druppels
geconcentreerd salpeterzuur toe.
Indicatorreactie
De eiwitten die aanwezig zijn in de melk worden aangetast door het salpeterzuur, net als
door andere zuren. Hierdoor ontstaat een gelige kleur.
Let op:
De huid kleurt geel o.i.v. salpeterzuur. Aangezien huidcellen voor een groot deel bestaan
uit eiwitten treedt de xanthoproteïnereactie op enkleurt de huid geel. Gebruik dus
handschoenen.
2.BIUREETTEST
Materiaal
• Reageerbuisrekje
• 2 reageerbuizen
• Melk
• NaOH-oplossing 3 mol/l
• CuSO4-oplossing 0,1 mol/l
• Labjas en handschoenen
Methode
Doe in een reageerbuis 2 ml melk. Voeg hieraan 1 ml NaOH-oplossing en daarna 1 ml
CuSO4-oplossing toe.
Indicatorreactie
De melk krijgt een violette (paars-blauwe) kleur na het toevoegen van CuSO4–oplossing
en NaOH-oplossing.
De reactie is gebaseerd op de reactie tussen koper(II)ionen en in eiwitten voorkomende
peptidebindingen in een basische oplossing. Bij deze reactie wordt de oplossing paars
gekleurd. De kleur van de oplossing geeft een indicatie van de concentratie
peptidebindingen, een lichte roze kleuring betekent dat er weinig peptidebindingen
aanwezig zijn, een donker paarse kleur dat er veel aanwezig zijn.
Verbindingen die op zijn minst twee groepen -CO-NH- (peptidebindingen) bevatten,
geven met kopersulfaat (CuSO4) in alkalische (=basische) oplossing blauwe, violette of
rode complexe zouten. In sterk alkalisch milieu geven eiwitten, die vele peptidebindingen
bevatten, met koper-ionen een paars-rode kleur, waarvan de intensiteit een maat is voor
de eiwitconcentratie, zodat de reactie colorometrisch voor kwantitatieve bepalingen
(dus op kleurintensiteit) kan worden gebruikt (zie experiment 4).
Biologiepagina.nl
3.BIUREETTEST MET VOEDINGSMIDDELEN
Materiaal
• Weegschaal
• Voedingsmiddel (bijv. aardappel, melk, kaas, brood, kippenvlees, ui, appel)
• Schuurzand
• Mortier
• Filter
• Demiwater
• Reageerbuis
• NaOH-oplossing 3 mol/l
• CuSO4-oplossing 0,1 mol/l
Methode
• Maak van een vast voedingsmiddel ongeveer 1 gram fijn in een mortier met 10 ml
demiwater. Voeg eventueel schuurzand toe. Giet door een filter en vang ongeveer
2 ml op.
• Van vloeibare voedingsmiddelen kun je gewoon 2 ml gebruiken.
• Voeg aan elke buis 1 ml NaOH 10% toe
• Voeg aan elke buis 1 ml verdund kopersulfaat toe.
• Schud de buizen en laat ze daarna een minuut staan.
4.BIUREETTEST EN COLORIMETRIE
Doel: Bepaling van de eiwitconcentratie van een onbekende oplossing
Met deze proef gebruiken we de colorimeter om de extinctiewaarden (van vijf eiwitoplossingen met een bekende concentratie (standaardoplossingen) te bepalen.
Hiermee kunnen we een grafiek maken van de extinctie (absorbance) tegen de
concentratie. Dit verband wordt de wet van Lambert-Beer genoemd.
Met behulp van deze grafiek kunnen we aan de hand van de extinctie (absorbance) de
concentratie bepalen van een onbekende oplossing.
Wanneer een lichtbundel met een zekere intensiteit (I0) door een absorberend materiaal
valt, zal de bundel bij het verlaten van het materiaal een lagere intensiteit (I1) hebben.
Een deel van de bundel wordt namelijk geabsorbeerd. De extinctie (ook: absorbantie)
hangt af van de absorberende stof in het materiaal maar ook van de concentratie (C) van
die absorberende stof.
Transmissie
De transmissie (T) is gedefinieerd als de fractie van het oorspronkelijke licht die
doorgelaten wordt door het monster:
Waarbij I0 de oorspronkelijke hoeveelheid licht is en I de hoeveelheid licht die
doorgelaten is door het monster.
T is altijd een getal tussen 0 en 1.
Biologiepagina.nl
Extinctie
De extinctie (ook wel absorbantie/absorbance genoemd) is niet hetzelfde als de
absorptie. De absorbantie wordt gedefinieerd in de volgende relatie als:
In Nederlandse teksten wordt vaak in plaats van de "A" voor "Absorbantie" de "E" voor
"Extinctie" gebruikt.
Materiaal:
• Colorimeter of spectrometer
• Twee pipette van 10 mL
• Twee maatbekers van 100 mL
• Een cuvet
• Demiwater
• Vijf 20 x 150 mm test tubes
• Test tube rekje
• 30 mL 1% eiwit stock oplossing*
• 5 mL van de onbekende eiwitoplossing*
*De stock oplossing wordt gemaakt door 1 gram
eiwit aan te vullen met gedestilleerd water tot 100
mL. Aan elke 30 mL eiwitoplossing moet 2 mL Biureetreagens worden toegevoegd.
Methode:
• Doe 30 mL van de 1% eiwit stockoplossing in een bekerglas van 100 mL. Doe in
een ander bekerglas van 100 mL 30 mL gedestilleerd water.
• Nummer de schone en droge testtubes 1 – 5. Pipetteer 2, 4, 6 en 8 mL van de
stock oplossing in de test tubes 1 – 4.
• Met een schone pipet pipetteer je vervolgens 8, 6, 4 en 2 mL gedestilleerd water
in de buisjes 1 – 4. Mix de oplossingen vervolgens goed.
• De 5e oplossing in de standaard stockoplossing, voeg hiervan 10 mL toe aan test
tube 5. De test tubes 1 – 5 hebben nu concentraties van 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 en
1.0% eiwitoplossing.
• Sluit de colorimeter/spectrometer aan (open eventueel op de computer het
experiment bestand voor absorptive vs. concentratie). Op de x-as moet de
concentratie komen.
• Maak een blanco door een lege cuvet voor 3/4e met gedestilleerd water te vullen.
Plaats de cuvette in de cuvette-slot van de colorimeter en sluit hem af. Kies er nu
voor om te calibreren.
• Verzamel nu telkens de piek-extinctiedata voor de vijf standaardoplossingen.
Begin met de 1.0 % eiwitoplossing en neem steeds een lagere concentratie. Maak
de cuvette elke keer goed schoon.
• Afhankelijk van de colorimeter of spectrometer laat je de computer automatisch
een grafiek maken of je maakt zelf een grafiek van concentratie tegen de extinctie
(absorbance).
• Verzamel nu de piek-extinctiedata voor je onbekende eiwitoplossing. Met behulp
van je grafiek kun je nu de onbekende concentratie uitrekenen.
Biologiepagina.nl
Bronnen:
http://www2.vernier.com/sample_labs/VSPEC-01-COMP-beers_law.pdf
http://www.vernier.com/caliper/spring03/beers.html
http://www.bioplek.org/techniekkaartenbovenbouw/techniek%7F101colorimeter.html
Biologiepagina.nl