pectolytische enzymen

logo’s
Enzymen
2de, herziene uitgave
auteur:
HPM 0657
82.284.238.100
INLEIDING ........................................................................................................................................................ 3
Enzymen en katalyse....................................................................................................................................... 3
Enzymen en temperatuur. ............................................................................................................................... 4
Enzymen en pH. .............................................................................................................................................. 5
Enzymen en andere eigenschappen. ............................................................................................................... 6
TOEPASSING VAN ENZYMEN IN DE LEVENSMIDDELENTECHNOLOGIE. .................................................................. 6
FENOLASE ........................................................................................................................................................ 8
KATALASE ....................................................................................................................................................... 9
PEROXYDASE .................................................................................................................................................. 9
LIPOXYGENASE .............................................................................................................................................10
PROTEOLYTISCHE ENZYMEN ....................................................................................................................10
Kaas...............................................................................................................................................................10
Bier. ...............................................................................................................................................................11
Brood. ............................................................................................................................................................12
Vlees. .............................................................................................................................................................12
AMYLOLYTISCHE ENZYMEN .....................................................................................................................12
α-amylase ......................................................................................................................................................13
β-amylase ......................................................................................................................................................13
Glucoamylase ................................................................................................................................................13
Brood .............................................................................................................................................................13
Bier. ...............................................................................................................................................................14
Zetmeelhydrolyse. ..........................................................................................................................................14
CELLULASES ..................................................................................................................................................15
HEMICELLULASES ........................................................................................................................................15
PECTOLYTISCHE ENZYMEN .......................................................................................................................16
Pectine-esterase ............................................................................................................................................16
INVERTASE .....................................................................................................................................................17
LACTASE .........................................................................................................................................................18
GLUCOSE ISOMERASE .................................................................................................................................19
LIPASE..............................................................................................................................................................19
CHLOROFYLLASE .........................................................................................................................................20
BRONNEN ...........................................................................................................................................................21
2
INLEIDING
Enzymen en katalyse.
Enzymen zijn eiwitachtige stoffen die de snelheid van een chemische reaktie verhogen. Een enzym
doet dat door zich te binden met het substraat (de om te zetten stof) tot een enzym-substraat-complex,
waarna het substraat uiteenvalt in de produkten. De produkten laten los van het enzym en dan is het
enzymmolecuul beschikbaar om opnieuw een substraatmolecuul te binden.
Een enzym maakt een chemische reaktie niet mogelijk, alleen gemakkelijker. Een reaktie die zonder
een enzym niet kan verlopen, doet dat met een enzym ook niet. Het enige dat een enzym kan doen is
een reaktie vergemakkelijken.
Wanneer kan een chemische reaktie verlopen? Dat kan alleen maar als het energieniveau van de
stoffen vóór de reaktie hoger is dan het energieniveau van de stoffen na de reaktie. We nemen als
voorbeeld de afbraak van saccharose tot glucose en fructose.
In een saccharosemolecuul zit meer energie opgeslagen dan in een glucose + fructose-molecuul. Dat
komt omdat in een saccharosemolecuul meer onderlinge chemische bindingen zitten dan in twee losse
monosaccharidemoleculen. Saccharose heeft een hoger energieniveau dan glucose + fructose.
In de natuur streeft alles naar een zo laag mogelijk energieniveau: water stroomt naar beneden, warmte
stroomt van een hete naar een koude plaats, de appel valt van de boom, etc. Dat is de zgn. Tweede
Hoofdwet van de Thermodynamica.
Toch valt de appel niet vanzelf van de boom: dat gebeurt pas als de kracht waarmee het steeltje vast zit
aan de tak de appel niet meer vast kan houden. Normaal gebeurt dat als de appel rijp is: de
bindingskracht van het steeltje wordt kleiner en de appel valt vanzelf. Onrijpe appels vallen niet van de
boom, maar als je stevig aan de boom schudt, wil het steeltje wel breken.
Om de bindingkracht tussen atomen te verbreken moet je dus hard schudden: als je de temperatuur
voldoende verhoogt, botsen de moleculen zo hevig tegen elkaar dat de bindingen wel degelijk breken.
Dat is de aktiveringsenergie die je de moleculen moet geven om de reaktie te laten verlopen. Hoe
hoger de temperatuur (hoe harder je schudt), des te gemakkelijker wordt de verbinding verbroken. Hoe
hoger de temperatuur, des te meer bindingen worden er verbroken: hoe hoger de temperatuur, des te
groter de reaktiesnelheid. (Hoe harder je schudt, des te meer appels komen er per seconde naar
beneden.)
3
.
Wat doet een katalysator, zoals enzym, met een molecuul? Het zorgt ervoor dat de chemische binding
tussen twee atomen alvast een beetje uit elkaar wordt getrokken: de aktiveringsenergie wordt verlaagd.
Het steeltje van de appel wordt zwakker. Je hoeft nu niet meer zo hard te schudden om de appels van
de boom te krijgen. De reaktie verloopt al bij een lagere temperatuur.
Voor een katalysator, zoals een enzym, geldt dus:
 de katalysator vergemakkelijkt de chemische reaktie
 hoe hoger de temperatuur, hoe sneller de reaktie verloopt
Enzymen en temperatuur.
Bij enzymen moeten we ook rekening houden met een andere eigenschap. Een enzym is een
katalysator, maar ook een eiwit, en eiwitten zijn nogal gevoelig voor hoge temperaturen. Bij
temperaturen van 60 ºC en hoger beginnen eiwitmoleculen hun normale vorm te verliezen.
4
Dat betekent dat enzymmoleculen minder goed functioneren en voor de meeste geldt dat bij
ca 80 ºC de struktuur zo ernstig verstoord is dat ze voor altijd onbruikbaar zijn geworden. Het
eiwit is dan gedenatureerd.
Bij lage temperatuur is de reaktiesnelheid laag. Loopt de temperatuur op, dan wordt de
reaktiesnelheid steeds hoger (2-3 maal zo snel bij 10 ºC temperatuurverhoging). Maar bij
verdere verhoging begint het enzymmolecuul schade te ondervinden en uiteindelijk wordt het
gedenatureerd. Dat leidt dus tot bovenstaande optimum-curve. Voor elk enzym is deze
optimum-temperatuur anders. Gebruikelijke waarden: 30-65 ºC.
Enzymen en pH.
Er is nog een andere eigenschap van eiwitten waar we rekening mee moeten houden bij
enzymen. De ruimtelijke struktuur wordt ook beïnvloed door de pH. En die ruimtelijke
struktuur is van belang, want die bepaalt de vorm van de aktieve plaats: de plaats waar het
substraat vóór de reaktie aan het enzym wordt gebonden.
Als het substraat niet past in de aktieve plaats, wordt het enzym-substraat-complex moeilijk of niet
gevormd en dan is het enzym slecht of helemaal niet werkzaam. De pH beïnvloedt de ruimtelijke
struktuur van een eiwit en dus ook van een enzym. Ook voor de pH is er dus een optimum en ook die
is voor elk enzym anders. Gebruikelijke waarden: pH 4-6.
5
Enzymen en andere eigenschappen.
Veel enzymen bestaan niet uitsluitend uit eiwit (het apo-enzym) maar ook nog een niet-eiwit deel (coenzym). De haem-groep in hemoglobine en myoglobine en sommige B-vitaminen zijn daar
voorbeelden van. Veel enzymen zijn ook in het bezit van een metaal-atoom (Mg, Zn, Fe). Zo’n enzym
kan dan alleen werken als het juiste metaal aanwezig is. Vaak worden dit co-faktoren genoemd.
Wanneer de verkeerde metaal-atomen aanwezig zijn , kunnen die soms op de plaats van het vereiste
metaal gaan zitten. Dat leidt er gewoonlijk toe dat het enzym slecht of niet meer werkzaam is (Cu, Pb,
Cd). Dat noemt men enzym-vergiftiging.
Er is nog een andere vorm van enzym-vergiftiging: soms past ook een andere molecuul dan het
bedoelde substraatmolecuul op de aktieve plaats en dit wordt niet omgezet. Zo worden dus
enzymmoleculen bezet gehouden en die zijn niet meer beschikbaar voor de bedoelde omzetting. Dat
doet zich bv. voor bij koolmonoxide: dat bindt net als zuurstof aan hemoglobine, maar gaat er niet
meer af. Hemoglobine kan dan geen zuurstof meer vervoeren.
Hierboven is alleen gesproken over afbrekende enzymen bv. saccharose + water --> glucose +
fructose. Maar het zal duidelijk zijn dat in planten en dieren ook opbouwende enzymen moeten
bestaan. Hoe kan de suikerbiet anders saccharose vormen?
Toch geldt voor deze enzymen hetzelfde als voor alle andere: een reaktie verloopt alleen maar als de
substraten een hoger energieniveau hebben dan het eindprodukt. In levende cellen is dit geen
probleem: aan glucose en aan fructose wordt een fosfaat-groep gebonden met behulp van ATP.
Daardoor krijgt glucose-fosfaat en fructose-fosfaat een hoger energieniveau dan saccharose en dus kan
saccharose hieruit met een geschikt enzym gevormd worden.
Het is dan ook duidelijk zijn waarom in de industrie alleen afbrekende enzymen worden toegepast.
Voor opbouwende enzymen is ATP nodig en dat wordt alleen in levende cellen gevormd. Voor het
opbouwen van stoffen kun je dus beter complete levende organismen gebruiken, die zijn daar beter
voor toegerust.
Toepassing van enzymen in de levensmiddelentechnologie.
In de levensmiddelentechnologie hebben we te maken met plantaardige en dierlijke materialen. Daarin
vinden voortdurend chemische veranderingen plaats die gedeeltelijk door enzymen worden
veroorzaakt. Met het oog op de kwaliteit van levensmiddelen moeten we dus bij de bewaring en
verwerking van levensmiddelen rekening houden met de werkzaamheid van producteigen en door
micro-organismen gevormde enzymen. Men zal proberen hun activiteit te onderdrukken (b.v. door
steriliseren, drogen, vriezen of koelen van voedingsmiddelen) of in goede banen te leiden (b.v. geconditioneerde rijping van bananen tijdens transport, bereiding van kaas en fermentatie van o.a. koffie,
6
thee, cacao en tabak.).
Het toepassen van enzymen in de levensmiddelentechnologie is niet nieuw: de bereiding van kaas en
bier is alleen maar mogelijk door gebruik te maken van enzymen uit resp. de kalvermaag en de
graankorrel. Ze werden al toegepast voordat men het begrip enzym kende.
In de moderne levensmiddelentechnologie maakt men doelbewust steeds meer gebruik van
toegevoegde enzymen om bepaalde gewenste omzettingen tot stand te brengen (b.v. klaring van
appelsap, inversie van sacharose, hydrolyse van lactose).
In deze module worden een aantal voor de levensmiddelentechnoloog belangrijke enzymen behandeld.
Daarbij wordt de nadruk gelegd op
 de reactie die het enzym katalyseert, waar het enzym voorkomt, en
 waar het technologisch belangrijk is,
 wat de gewenste en eventueel ongewenste gevolgen zijn van de werking van het enzym, en
 welke maatregelen men neemt om de activiteit van het enzym in gewenste banen te leiden of
te verhinderen.
De hier besproken enzymen vertegenwoordigen verschillende hoofdgroepen van de enzymen:
1. Oxydoreductasen: deze groep enzymen oxideert het ene molecuul en reduceert het andere.
Dit gebeurt door de overdracht van zuurstof (oxidatie) of van waterstof (reductie).
fenolase, katalase, peroxydase, lipoxygenase, glucose oxydase
2. Hydrolasen: ontleden een molecuul onder opname van water (hydrolyse).
proteolytische enzymen, amylolytische enzymen, cellulases, hemicellulases, pectine-esterase,
polygalacturonase, invertase, lactase, naringinase, lipase, chlorophyllase.
3. Lyasen: ook deze enzymen ontleden een molecuul, maar zonder opname van water.
pectaat lyase, pectine lyase.
4. Isomerasen: deze enzymen zetten een molecuul om in een isomeer van hetzelfde molecuul.
glucose isomerase
De meeste toegepaste enzymen zijn hydrolytische enzymen. Die zijn ook het gemakkelijkst, o.a.
omdat geen dure co-factoren vereist zijn.
7
FENOLASE
Fenolase wordt ook wel aangeduid met polyphenol oxydase (PPO) of tyrosinase. Fenolase komt voor
in allerlei plantaardig materiaal zoals thee- en tabaksbladeren, appels en peren, aardappels,
paddestoelen en schimmels, maar niet b.v. in citrusvruchten. In plantaardig materiaal komen ook vaak
polyfenolen voor. De looistoffen (tanninen) en de anthocyanen zijn daar voorbeelden van. De
looistoffen worden gekenmerkt doordat ze zich binden aan eiwitten (ze “looien” eiwitten). Dat zorgt
voor hun adstringerende werking: het samentrekkende gevoel dat je krijgt in je mond bij bv. sterke
thee. De functie in de plant is gewoonlijk om hem minder smakelijk te maken. De anthocyanen
(letterlijk”bloemenblauw”) hebben gewoonlijk een blauwe (bij hoge pH) tot rode kleur (bij lage pH).
Ze komen vooral voor in bloemen (bv. korenbloem, hyacint) en besvruchten (braam, bosbes, vlier,
druif).
Fenolase of polyfenoloxidase oxideert polyfenolen tot chinonen (quinonen). Daarvoor is zuurstof
nodig.
De ontstane chinonverbindingen hebben de neiging te polymeriseren tot bruine pigmenten (de z.g.
enzymatische bruinkleuring). Vaak worden ze daardoor onoplosbaar en dragen dus niet meer bij aan
de smaak. Bij wijn verlopen deze reacties zelfs zonder enzym tijdens de rijping.
De enzymatische reacties verlopen bij de fermentatie van thee, bij de rijping van dadels en bij het
drogen van verse cacaobonen, waar ze een belangrijke stap zijn in de ontwikkeling van de kleur en de
smaak. Ook zijn deze reacties buitengewoon belangrijk bij de bereiding van appelsap en appelmoes,
maar hier is het ontstaan van de bruine kleur ongewenst. Chlorogeenzuur is het belangrijke substraat
8
voor de enzymatische bruinkleuring van appels, tyrosine voor de zwartkleuring van aardappels en
bananen.
Bij de bereiding van (zwarte) thee is de activiteit van het enzym dus gewenst, bij appelmoes
ongewenst. Bij thee bevordert men de werking van het enzym door warme lucht te blazen door de
gekneusde theeblaadjes.
De bruinkleuring bij verwerking van appels e.d. kan men proberen te verhinderen door hitteinactivering van het enzym (koken van appels bij appelmoesbereiding), het uitsluiten van lucht
(invriezen van bessen met suiker) en snelle scheiding van pulp en sap (het enzym zit aan de
pulpdeeltjes vast; centrifugeren van appelsap). Ook kan men de bruine pigmenten en de tannineachtige
tussenproducten uit het sap verwijderen door coagulatie met gelatine (klaren van appelsap).
De bruinkleuring kan vaak gedeeltelijk worden teruggedraaid door een reductiemiddel. Zwaveligzuur
(sulfiet) of ascorbinezuur (vitamine C) kunnen hiervoor gebruikt worden. Met ascorbinezuur loopt
men overigens het risico op een andere vorm van bruinkleuring: na oxidatie kan het gevormde
dehydroascorbinezuur met suikers reageren tot bruingekleurde producten (niet-enzymatische
bruinkleuring).
Men kan ook fenolase-werking in principe verhinderen door gebruik te maken van andere enzymen.
Een voorbeeld daarvan is het toepassen van enzymen die het substraat omzetten in voor fenolase
ongeschikte vorm. Deze enzymen, die men "anti-fenolasen" zou kunnen noemen werken jammer
genoeg in zwak basisch milieu en kunnen eigenlijk alleen als oppervlaktebehandeling b.v. bij
loogschillen worden toegepast. (Loogschillen is het verwijderen van de aardappelschil door er een
warme, verdunde natronloog-oplossing overheen te sproeien).
Tenslotte ligt een oplossing van het probleem van de bruinkleuring van appelsap in het opzettelijk
beluchten van appelpulp. Daardoor wordt voornamelijk het chlorogeenzuur, dat niet belangrijk is voor
de karakteristieke smaak van appelsap, in onoplosbare bruine pigmenten wordt omgezet zodat het
daarna uitgeperste sap licht gekleurd is en niet behoeft te worden nabehandeld met gelatine. Ook bij de
bereiding van witte wijn blijkt deze methode van opzettelijk beluchten tot goede resultaten te
leiden.
KATALASE
Dit enzym breekt waterstofperoxide af tot water en zuurstof. Het katalyseert de reactie:
waarbij het ene waterstofperoxyde-molecuul waterstofdonor, en het andere waterstof acceptor is. Het
enzym komt voor in vrijwel alle dierlijke en plantaardige weefsels en in micro-organismen. Het zorgt
daar voor het onschadelijk maken van waterstofperoxide dat bij de aërobe dissimilatie wordt gevormd.
De activiteit van het enzym is tussen pH 3 en 9 maximaal en pH onafhankelijk.
Belangrijk is het gebruik voor de ontleding van overmaat waterstofperoxyde dat als conserveermiddel
wordt gebruikt, bijvoorbeeld in kaasmelk.
PEROXYDASE
Peroxydase katalyseert de volgende reactie:
waarbij AH2 de waterstofdonor is, b.v. guaiacol, pyrogallol, flavonoïden of tyrosine. Er ontstaat geen
moleculaire zuurstof bij deze reactie.
Er bestaan diverse types peroxydases, zij zijn aanwezig groenten, vlees, gisten en melk.
9
Peroxydase is nog actief in gedroogde voedingsmiddelen, en speelt vermoedelijk een rol bij
oxydatieve bederf van gedroogde groenten. Het enzym is zeer hittestabiel. Daarom wordt het wel
gebruikt als indicatorenzym in het blancheringsproces. Eventuele restactiviteit van dit enzym is
gemakkelijk aan te tonen met waterstofperoxyde en guaiacol. Gereduceerd guaiacol heeft een
paarsbruine kleur (practicum).
LIPOXYGENASE
Ook bekend als lipoxydase. Het enzym katalyseert de oxidatie van lipiden met een cis, cis-1,4pentadieen systeem. Dat zijn o.a. de meervoudig onverzadigde vetzuren linolzuur, linoleenzuur en
arachidonzuur. In aanwezigheid van zuurstof worden die omgezet in hydroperoxyden, die verder
uiteenvallen. Daarbij ontstaan aldehyden en ketonen, die een ranzige geur met zich meebrengen. Het
enzym leidt dus tot oxidatieve ranzigheid van vetten.
Lipoxygenase komt o.a. voor in tarwekiemen, sojabonen en ook in appels. In tarwebloem is het van
belang omdat het ook carotenen kan afbreken. De geel gekleurde carotenen, die in kleine
hoeveelheden voorkomen in tarwebloem, worden daardoor kleurloos. Het zorgt dus voor de zgn.
natuurlijke bleking van van pas gemalen tarwebloem. In oliehoudende zaden, zoals sojabonen, veroorzaakt het oxydatieve ranzigheid. In appels speelt het een rol bij de vorming van hexanal uit
linoleenzuur. Hexanal is een kenmerkende component van het aroma van rijpe appels en andere
vruchten.
PROTEOLYTISCHE ENZYMEN
Proteolytische enzymen (andere namen: proteasen, peptidasen) breken eiwitten af door hydrolyse. Ze
worden onderscheiden in twee groepen, op grond van de plaats waar ze aangrijpen in het
eiwitmolecuul:
 Endo-peptidasen: splitsen eiwitmoleculen in kleinere peptideketens
 Exo-peptidasen: werken vanaf het uiteinde van een peptideketen en splitsen daar een
aminozuur af.
Proteasen tamelijk specifiek. Het percentage peptide bindingen dat één bepaald enzym van een eiwit
kan splitsen is niet groot. De endo- en exo-peptidasen werken vaak effectief samen bij de hydrolyse
van een eiwit.
Verschillende bekende proteolytische enzymen, zoals de spijsverteringsenzymen pepsine, trypsine,
chymotrypsine en rennine en de plantaardige enzymen papaine, ficine en bromeline en de microbiële
proteasen zijn allemaal endo-peptidasen met hun eigen specificiteit. Ook de exo-peptidasen hebben
hun specificiteit.
Er zijn vele toepassingen van proteolytische enzymen in de levensmiddelentechnologie bekend: bij de
kaasbereiding, in de biertechnologie, bij de broodbereiding, bij het mals maken van vlees en potentieel
ook bij de bereiding van maatjesharing.
Kaas.
Aan melk wordt rennine (lebferment of stremsel) toegevoegd om de zgn. stremming te bewerken,
waarbij het melkeiwit coaguleert tot de zgn. wrongel. Het gebruikte enzym wordt gewonnen uit
kalvermagen. Omdat aan de grote vraag naar dit enzym op deze wijze niet meer kan worden voldaan
gebruikt men naast lebferment steeds meer proteolytische enzymen van schimmels (o.a. Mucor). Er is
ook lebferment op de markt dat wordt verkregen uit genetisch gemodificeerde gist. De
Landbouwkwaliteitswet verbiedt echter het gebruik ervan.
Melk is een emulsie van melkvet in melkserum, de waterige fase. De caseïne-moleculen op de
vetbolletjes fungeren als emulgator. Deze caseïne in melk is hoofdzakelijk aanwezig in de vorm van
10
micellen van 40 - 280 mμ doorsnede. Die micellen bestaat uit drie moleculen α-caseïne en één
molecuul κ-caseïne. Vooral dit κ-caseïne beschermt de vetbolletjes tegen samenklontering.
figuur (Model van melkvet)
Algemeen wordt aangenomen dat rennine bepaalde peptide bindingen van caseïne splitst en meer in
het bijzonder van κ-caseïne. Wanneer het κ-caseïne wordt gesplitst door rennine kan het α-caseïne
reageren met Ca++ uit de melk. De Ca++-ionen kunnen nu fungeren als bruggen tussen naburige
vetbolletjes, waardoor een gel ontstaat. Door het optreden van synerese wordt daarna een deel van het
vocht uitgeperst. Dit wordt nog bevorderd door te snijden en te verwarmen. Op deze manier komt de
scheiding tussen wrongel en wei tot stand. Overigens is het mechanisme van de melkstremming
ingewikkelder dan hier beschreven en niet geheel opgehelderd.
De rol van het stremsel is niet uitgespeeld op het moment dat de stremming heeft plaatsgevonden.
Gedurende de kaasrijping zorgen stremselenzymen, samen met melkproteasen en proteasen
uitgescheiden door streptococcen (uit het zuursel) voor de verdere omzetting van het eiwit, waaraan
uiteindelijk de consistentie en vooral de pittige smaak van de kaas zijn te danken.
Andere proteolytische enzymen, bijv. pepsine, chymotrypsine, trypsine, papaine e.d. kunnen ook
gebruikt worden om melk te laten stremmen. Die veroorzaken echter meer eiwitafbraak dan nodig is.
wat leidt tot grotere verliezen door opgeloste peptides die in de wei terechtkomen en in een slappere
wrongel. Ook wordt de kaas later bitter.
Bier.
In mout komen proteasen voor die tijdens de zgn. eiwitrust in de brouwfase de kans krijgen om
eiwitten af te breken. De gevormde aminozuren zijn van belang als voeding voor de gist. Overigens
wordt uit deze aminozuren ook een deel van de foezeloliën gevormd die verantwoordelijk worden
gesteld voor kater na bierconsumptie. De mate van eiwitafbraak heeft ook invloed op het
schuimvormend vermogen van bier.
Een andere toepassing van proteolytische enzymen in de bierbereiding is het voorkómen van nietbiologische troebeling. Tijdens opslag kan in bier een troebeling ontstaan doordat in het bier
aanwezige gecondenseerde polyfenolen complexen vormen met peptides. Proteolytische enzymen
worden met succes gebruikt ter verhindering van dit soort troebeling. Verschillende preparaten zijn
11
bruikbaar, vooral papaine in combinatie met andere enzymen om bier zgn. "chillproof" te maken. Men
spreekt in dit verband van "chill haze" omdat de troebeling het eerst ontstaat bij afkoeling, hoewel hij
na verloop van tijd ook bij opwarmen niet meer verdwijnt.
Brood.
Het gebruik van α-amylase (zie aldaar) bij de broodbereiding is normale praktijk in Europa, terwijl de
toepassing van schimmelprotease gebruikelijk is in Noord Amerika waar graan wordt gewonnen dat
zeer rijk is aan gluten en een zgn. sterke bloem levert. Met behulp van o.a. proteolytische enzymen
regelt men de rheologische eigenschappen van het deeg, waardoor het beter kneedbaar wordt en de
kneedtijd wordt bekort. In Europa is het niet nodig om proteolytische enzymen te gebruiken omdat
men liever geïmporteerde sterke bloem mengt met inlandse bloem van mindere kwaliteit.
Vlees.
Het mals maken van vlees door enzymen is niet alleen een commerciële toepassing maar ook wordt de
verteerbaarheid van het vlees er door bevorderd. Tijdens het mals maken worden bepaalde
spierweefselcomponenten gehydrolyseerd en wel speciaal het sarcolemma dat de spiervezels bijeen
houdt. Bruikbaar zijn trypsine, papaine, bromeline, ficine en schimmel-protease, maar ficine en
papaine zijn het meest geschikt.
Mals makende enzymen worden toegepast door dompelen van vlees in een enzymbad, door het
bestrooien van vlees met enzympoeder of door injectie van een enzymoplossing in het vlees (post
mortem). Ante mortem injectie van proteolytische enzymen in de bloedbaan van het slachtdier heeft
nog de beste resultaten opgeleverd, maar ethische bezwaren maken deze toepassing nogal
contoversieel.
AMYLOLYTISCHE ENZYMEN
Zetmeel, het substraat van de amylolytische enzymen, bestaat uit twee fracties: het onvertakte amylose
en het vertakte amylopectine.
In het vertoonde model van Whelan voor amylopectine zijn de moleculen in de keten onderling
verbonden met 1α-4 bindingen en de zijketens met 1α-6 bindingen.
figuur (Model van Whelan)
12
De meeste amylolytische enzymen hydrolyseren alleen 1α-4-bindingen (α-amylase en β-amylase),
glucoamylase verbreekt ook (maar wel veel langzamer) 1α-6-bindingen en sommige hydrolyseren
alleen de 1α-6-bindingen (onttakkingsenzymen).
figuur grens dextrine
α-amylase
is een endo enzym dat 1α-4-bindingen in de keten van amylose en amylopectine splitst tot uiteindelijk
een mengsel van onvertakte en vertakte oligosacchariden: brokstukken bestaande uit 2 tot 6 glucose
eenheden.
β-amylase
is een exo enzym dat vanaf het uiteinde steeds maltose in β-vorm (vandaar β-amylase) afsplitst, totdat
een 1α-6-binding dit verder verhindert. Zo ontstaat uit amylopectine door inwerking van β-amylase
maltose en een zgn. grensdextrine.
Glucoamylase
splitst vanaf het ketenuiteinde glucose af, alweer in β-vorm. Ook 1α-6-bindingen worden
gehydrolyseerd, zij het langzamer. Dit enzym kan een bijna volledige (tot 98%) hydrolyse van zetmeel
tot glucose katalyseren.
Brood
Amylolytische enzymen spelen in de broodbereiding een rol tijdens het kneden en rijzen van het deeg.
Daarbij worden niet de intacte zetmeelkorrels, maar alleen die welke bij het malen zijn beschadigd,
enzymatisch aangetast. Door de aanwezigheid van amylase neemt de hoeveelheid vergistbare suiker in
het deeg toe. Gist kan daardoor meer koolstofdioxide produceren, waardoor het broodvolume wordt
vergroot.
Bloem bevat altijd wel voldoende β-amylase. In het verleden, toen het graan na het maaien nog op het
veld werd gedroogd, trad er meestal wat schot op (beginnende ontkieming) en daardoor was er ook
voldoende α-amylase in aanwezig, zodat voldoende maltose kan worden geproduceerd voor de gisting
en het rijzen van het brood. Door het maaidorsen en vervolgens kunstmatig drogen van graan, blijft de
vorming van α-amylase achterwege. Men is dan ook genoodzaakt aan het bloem van zulk graan αamylase toe te voegen. Ter beschikking staan schimmel amylase, bacteriële amylase en amylase in de
13
vorm van mout, maar men gebruikt bij voorkeur de schimmel amylase vanwege zijn geringere
thermostabiliteit. Tijdens het bakproces verstijfselen namelijk de zetmeelkorrels en daarmee komt
nieuw substraat ter beschikking voor de α-amylase. Als gedurende het bakken de α-amylase niet op
tijd zou worden geïnactiveerd, dan zou een te sterke vervloeiing van het zetmeel resulteren in een slap
brood met een kleffe kruim. De kans dat dit zal gebeuren is minimaal met de α-amylase van
schimmels. Door het gebruik van schimmelamylase wordt een brood verkregen met een zachte kruim,
een diepbruine korstkleur en een groot broodvolume.
Bier.
Bij het brouwen verlopen belangrijke enzymatische processen waarbij vooral α- en β-amylase en
protease uit mout betrokken zijn. Zoals hierboven vermeld leidt α-amylase tot de vorming
oligosacchariden, korte brokstukken van enkele glucose eenheden. Vooral de wat grotere brokstukken
zijn slecht vergistbaar, maar hebben wel een zoete smaak. β-Amylase leidt tot de vorming van
maltose, een goed vergistbare suiker, en grensdextrine dat niet vergistbaar is.
Bij de klassieke infusiemethode wordt het brouwsel langzaam opgewarmd tot uiteindelijk zo’n 80 ˚C.
De enzymen met de laagste optimumtemperatuur worden dus het eerst aktief. Voor de mout-enzymen
is dat eerst protease (eiwitrust), dan β-amylase (maltoserust) en tenslotte α-amylase (dextrinerust).
Met het oog op de hoeveelheid vergistbare suikers is dat jammer: β-amylase is de belangrijkste
producent van vergistbare suikers, maar het enzym kan niet over de vertakkingspunten heen springen.
De grensdextrines die overblijven worden vervolgens door α-amylase nog wel verder afgebroken tot
oligosacchariden, maar die zijn slecht vergistbaar. De infusiemethode leidt dus tot relatief weinig
vergistbare suiker (en dus weinig alcohol) en veel onvergistbare suikers (en dus zoet en zwaar bier).
Dit klassieke brouwersprobleem zou kunnen worden opgelost door de volgorde van werkzaamheid
van β-amylase en α-amylase om te keren: als eerst α-amylase aktief is kan dat enzym de grote
zetmeelmoleculen in kleinere brokstukken knippen en daarna kan β-amylase van de nu verkregen vrije
uiteinden steeds maltose afsplitsen. Dat leidt dan tot veel vergistbare suiker (maltose) en weinig
oligosacchariden. Helaas ligt de optimumtemperatuur van de enzymen vast, maar men kan aan de
behoefte aan een grotere hoeveelheid vergistbare suikers tegemoet komen door de gebruik te maken
van de decoctie-methode. Daarbij wordt een deel van het brouwsel al meteen na de eiwitrust
verwarmd tot de optimumtemperatuur van α-amylase. Daardoor mist men weliswaar de aktiviteit van
β-amylase, maar in dit deel van het brouwsel wordt nu wel het zetmeel in kortere ketens geknipt. Deze
portie wordt vervolgens weer samengevoegd met het deel dat nog niet hoog verhit is geweest en
waarin β-amylase dus nog aanwezig is. Van de verkorte zetmeelketens kan het β-amylase nu maltose
afsplitsen. Een bijkomend voordeel is dat in de hoogverhitte portie het zetmeel verstijfelt, waardoor
het veel beter toegankelijk wordt voor de enzymen. In de praktische toepassing van de
decoctiemethode wordt vaak deze stap nog een- of tweemaal herhaald.
Mout, een dure grondstof, bevat een surplus aan enzymen waardoor het mogelijk is om zonder meer
20-25% mais-, rijst- of gerstemeel toe te voegen. Er zijn tegenwoordig zelfs speciale brouwerijenzymen waardoor men het aandeel van de mout nog veel verder heeft kunnen verminderen, namelijk
tot 15-25%. De bedoelde brouwerij-enzymen bevatten o.a. amylasen en proteasen. Niet alleen is een
omzetting van zetmeel in een maximale hoeveelheid vergistbare suikers noodzakelijk, maar ook
moeten eiwitten afgebroken worden tot peptides en vooral tot vrije aminozuren waardoor de gisting
sterk wordt gestimuleerd. Brouwerij-enzymen moeten voor een goede werking ook bepaalde andere
glucanases hebben voor de enzymatische afbraak van de zgn. "barley gum", een zeer visceus
polysaccharide dat enorme filtratieproblemen kan opleveren
Zetmeelhydrolyse.
De klassieke bereiding van zetmeelstroop en glucose bestaat uit een zure hydrolyse van zetmeel onder
druk en bij hoge temperatuur. Deze hydrolyse verloopt niet volledig: maximaal 90 DE (dextrose
equivalent). Bovendien ontstaan bittere en gekleurde bijproducten door caramelisatie. Ook werkt men
met lage concentraties, zodat men met hoge indampingskosten zit.
Bij de bereiding van glucose uit zetmeel zijn enzymen dus een uitkomst. In een eerste stap wordt door
bacteriële α- en β-amylase maiszetmeel afgebroken tot 20 DE. In een tweede stap wordt de hydrolyse
voltooid met behulp van glucoamylase, waarbij men na 72 uur bij 60°C een DE bereikt van 98. Zo'n
14
preparaat kan, indien gewenst na ontkleuring door actieve kool worden gekristalliseerd door
sproeidrogen. Als meer zoetkracht gewenst wordt kan de glucose ook worden geïsomeriseerd tot
fructose (zie onder glucose isomerase). Ook bij de bereiding van zetmeelstropen met lage DE waarden
(bijv. barley syrup voor de brouwerij) liggen interessante mogelijkheden voor enzymen, omdat men bij
de zure hydrolyse niet veel mogelijkheden heeft om de samenstelling van het eindproduct te regelen.
De productie van zoetmiddelen uit zetmeel heeft door de toepassing van enzymen een hoge vlucht
genomen. Zetmeel is een goedkope grondstof, goedkoper dan rietsuiker en veel goedkoper dan
bietsuiker. Tot enkele tientallen jaren geleden werd vooral rietsuiker gebruikt als zoetmiddel voor
frisdranken. Nu is dat vooral ‘isomerose’: een mengsel van glucose en fructose, verkregen uit zetmeel
dat eerst enzymatisch wordt gehydrolyseerd tot glucose, wat daarna door isomerase gedeeltelijk wordt
omgezet in fructose.
CELLULASES
In de natuur het meest overvloedig aanwezige polysaccharide is cellulose. Het is een β-1,4 glucaan
met polymerisatiegraden van bijv. 10.000 (in katoenvezel) en 600 - 100 (in hout). Met de
verzamelnaam cellulase of cellulase complex duidt men in de regel alle enzymen aan die werkzaam
zijn op cellulose. Ze worden vrijwel uitsluitend gevomd door schimmels.
Er is enorme technologische belangstelling voor cellulases, waarmee men in principe de ontzaglijke
hoeveelheden cellulose in de natuur zou kunnen versuikeren en voorts eiwitten in vezelige plantedelen
zou kunnen ontsluiten. Er bestaan echter nog geen voldoende werkzame preparaten en het is nog niet
gelukt economisch verantwoorde toepassingen te vinden.
HEMICELLULASES
Met hemicellulose duidt men een groep polysacchariden aan, die naast pectine en cellulose voorkomen
in de celwanden van hogere planten. De groep omvat pentosanen (xylaan en arabaan) en hexosanen
(mannaan en galactaan). Vaak zijn het echter geen homopolysacchariden maar heteropolysacchariden
(arabinoxylaan, galactomannaan), van deels onopgehelderde structuur.
Vele micro-organismen, waaronder plantenziekten veroorzakende schimmels en bacteriën produceren
extracellulaire hemicellulases (xylanase, galactanase, arabanase, mannanase, etc), vaak samen met
vele ander enzymen zoals pectinases, proteases en cellulases. Over het effect van deze enzymen op
plantenweefsels is weinig bekend omdat men ze tot nu toe niet vaak als goed gezuiverd enzym heeft
bestudeerd. Wel is bekend, o.a. uit de fytopathologische literatuur dat hemicellulases bepaalde
plantenweefsels kunnen macereren.
Met arabinoxylanase blijkt men rijst enzymatisch te kunnen pellen en de zaadhuid van sojabonen te
kunnen verwijderen. Met hemicellulases kan men in principe ook de voedingswaarde van menselijk en
dierlijk voedsel aanzienlijk verhogen (sojabonen bevatten bijna 20% hemicellulose). Bij de
fermentatie van sojabonen tot tempé door de specifieke schimmel Rhizopus oligosporus, zal
enzymatische afbraak van hemicellulose beslist bijdragen aan de verteerbaarheid en voedingswaarde
van het gefermenteerde produkt. Hemicellulases schijnen wel toegepast te worden in vloeibaar
koffieconcentraat om de gomachtige stoffen (o.a. arabinogalactaan) af te breken die anders gelering
zouden veroorzaken. Pentosanases van Aspergillus worden wei toegepast in banketbakkerijen om
onoplosbare pentosanen in meel af te breken, en daardoor een groter broodvolume en een fijnere
kruim te verkrijgen.
15
PECTOLYTISCHE ENZYMEN
Pectine is hoofdzakelijk α-D-galacturonaan waarvan de carboxylzuurgroepen voor een hoger of lager
percentage zijn veresterd met methanol (zie Hydrocolloïden). Pectine afbrekende enzymen moeten
allereerst worden onderverdeeld in pectine-esterases en pectine-depolymerases.
Pectine-esterase
Ook wel pectase genoemd. Pectine-esterase ontdoet de veresterde galacturonzuurgroepen van de
methanol-groep, waarbij methanol en lager veresterde pectine ontstaat. (zie onderstaande figuur). Dit
enzym is verantwoordelijk voor het ontstaan van methanol in producten als (rode) wijn,
vruchtenwijnen en destillaten daarvan zoals bv. pruimenbrandewijn. Plantaardige pectine-esterases
(citrus, tomaat) hebben een pH optimum van 7 of hoger; pectine-esterases uit schimmels hebben een
pH optimum van 4,5.
Pectine-depolymerases
Er bestaan diverse enzymen die het ketenvormige pectinemolecuul verbreken. Het zijn hydrolasen of
lyasen, maar ze allemaal ongeveer hetzelfde resultaat: door het verbreken van de pectineketen
verminderen ze de bindkracht die pectine heeft.. Sommige worden door schimmels geprodeceerd,
andere in hogere planten.
Aangrijppunten van pectine afbrekende enzymen op hun substraat.
Het zacht worden van vele vruchten tijdens de rijping wordt aan deze pectinesplitsende enzymen
toegeschreven maar men kent het mechanisme bijzonder slecht. Pectine-splitsende enzymen spelen
een grote rol in de technologie van groenten en vooral fruit. In het navolgende worden daarvan
voorbeelden gegeven.
Bij de verwerking van de tomaat tot tomatenpuree breken de vruchteigen pectinesplitsende enzymenm
direct na het malen van de vruchten het oorspronkelijk hoogpolymere pectine af. Het resultaat is een
dun-vloeibaar zg. "cold-break" sap dat goed te concentreren is, zoals dat nodig is voor tomatensaus en
tomatenpuree.
Alleen wanneer men de enzymen onmiddellijk door hitte inactiveert b.v. door stoom in de molen te
leiden, kan men tomatensap krijgen met de bekende smeuïge consistentie, zoals die gewenst wordt bij
het gebruik als drank. Men spreekt dan van "hot-break" sap.
In de appelsaptechnologie gaat het om de bereiding van helder sap. Men gebruikt voor de klaring
preparaten van pectolytische enzymen geproduceerd met behulp van schimmels. Bij de enzymatische
klaring van appelsap gaat het om het afbreken van het hoogpolymere pectine van het perssap om het
sap gemakkelijk filtreerbaar te maken.
16
Pectolytische enzymen worden nu ook meer en meer gebruikt als "maische-enzym", d.w.z. ze worden
toegevoegd aan gemalen appels en bessen om een goede opbrengst aan sap en evt. kleurstof in het sap
te verkrijgen (druiven). Anthocyanen zijn namelijk samen met pectinestoffen complex aan
metaalionen gebonden. Een betere persbaarheid en een hogere sapopbrengst zou men kunnen
verklaren uit het verloren gaan van het waterbindend vermogen van de gedepolymeriseerde
pectinestoffen. Bij bessen wordt deze werkwijze al langer toegepast. Bij appels is dit ook van belang,
omdat tegenwoordig vaak overtollige oude consumptieappels lang na de oogst nog tot sap moeten
worden verwerkt. Rode wijn, die vanwege de kleur nu nog wordt vervaardigd door vergisting van het
sap op de schillen, kan met de eenvoudigere technologie voor witte wijn worden bereid, wanneer men
met behulp van enzymen druivensap met voldoende rode kleurstof kan winnen.
Met een combinatie van pectolytische en cellulolytische enzymen kan men vruchten, bessen en ook
groenten vloeibaar maken, waarbij de celwanden geheel of gedeeltelijk zijn opgelost. Op deze wijze
kan men nagenoeg 100% van de grondstof verwerken tot een halffabrikaat waarvoor interessante
mogelijkheden lijken te bestaan (concentreren, drogen, verwerken tot troebele dranken rijk aan ruwe
vezels). Ook gebruikt men pectolytische enzymen om uit citrusschillen, natuurlijke
troebelingsmiddelen ("cloudifying agents") te vervaardigen om toe te voegen aan bepaalde soorten
frisdranken.
INVERTASE
Uit bakkersgist (Saccharomyces cerevisiae), andere gisten en schimmels kan invertase worden
gewonnen. Het breekt het fructose-deel af van saccharose of van andere suikers waarin fructose
voorkomt (inuline).
fructocidase
De reactie die door dit enzym wordt gekatalyseerd kan als volgt worden opgeschreven (waarbij de
getallen onder de suikers de specifieke draaiing weergeven),
Saccharose  H 2O  glu cos e  fructose
66,5
 52,2
 93
Volgt men de reactie met een polarimeter, dan verandert de draaiing van positief naar negatief, en
hieraan danken het hydrolyse mengsel (invertsuiker) en het enzym hun naam.
17
Gist invertase vindt veel toepassing in de suikerwerkenindustrie, en wel bij de bereiding van
suikerwerken, bonbons e.d. met vloeibare vulling. Er wordt daarbij een tamelijk vaste fondantmassa
bestaande uit een stroop met saccharose kristallen gebruikt als betrekkelijk vaste kern, die wordt
gecoat met chocolade. Onder invloed van de bijgemengde invertase zal de fondantmassa
langzaam inverteren, waarbij de suikerkristallen in oplossing gaan en uiteindelijk een geheel vloeibare
invertsuikerstroop met hoge Brix (82°) ontstaat. Door deze hoge concentratie zijn de suikerwerken
tevens beschermd tegen de ontwikkeling van osmofiele gisten.
In principe kan men invertase ook gebruiken voor de productie van de begeerde zoete fructose uit
inuline, de reservestof van de aardpeer (topinamboer).
LACTASE
Lactose kan door middel van lactase (dat commercieel gewonnen wordt uit Saccharomyces fragilis )
worden omgezet in galactose en glucose.
figuur D-glucose
Daarmee staat een middel ter beschikking om de betrekkelijk weinig oplosbare en weinig zoete
melksuiker om te zetten in een veel beter oplosbaar mengsel van monosacchariden met grotere
zoetkracht.
Het enzym wordt toegepast bij de bereiding van melkpoeder voor consumptie-ijs. Een andere
toepassing is die bij de bereiding van gecondenseerde melk, waarbij dan niet meer het zanderige
(kristallijne) depot van melksuiker ontstaat en een zelf-conserverend systeem ontstaat. Bij Afrikanen
en Aziaten treft men vaak lactose intolerantie aan, die voortvloeit uit het gemis aan lactase en dus de
onmogelijkheid om lactose te verteren. De technologische toepassing van lactase ligt hier voor de
hand.
18
GLUCOSE ISOMERASE
Het bacteriële enzym glucose isomerase isomeriseert glucose gedeeltelijk tot fructose (of fructose tot
glucose). Hiermee beschikt men over een mogelijkheid om producten van zetmeelhydrolyse
(glucosestroop met hoge DE) om te zetten in glucose/fructose mengsels (isomerose genoemd) die
méér zoetkracht hebben . (De zoetkracht van glucose:fructose:saccharose = 75:140:100.)
Weliswaar verloopt de omzetting maar voor ongeveer de helft (evenwicht), zodat men met de
zoetkracht niet hoger komt dan bij invertsuiker, maar de prijs ligt veel lager omdat men van goedkoop
zetmeel kan uitgaan.. Het enzym kan uit bacteriële cellen worden geïsoleerd, maar het blijkt ook
mogelijk, om het enzym in de cellen van b.v. Streptomyces te "fixeren" door een hittebehandeling en
vervolgens de cellen direct als enzymdrager te gebruiken (immobiliseren van het enzym).
LIPASE
.
De vetten in onze voeding worden voornamelijk door pancreas lipase hydrolytisch gesplitst in
glycerol en vetzuren. Pancreas lipase is verreweg het meest bestudeerd, maar lipases treft men ook
elders aan: in het bloedplasma, in speeksel, in melk, in oliehoudende zaden, in granen en in
schimmels, gisten en bacteriën. Pancreas lipase werkt alleen aan een oliewater grenslaag, en men
veronderstelt dat de aanhechting van het enzym mogelijk gemaakt wordt door een hydrofoob gedeelte
van de lipase. De interactie van het enzym met de grenslaag zou er tevens voor zorgen dat de juiste
oriëntatie wordt verkregen voor het actieve centrum van het enzym. Het actieve centrum zou dicht bij
het hydrofobe gedeelte van het enzym liggen, maar daar ruimtelijk wel van gescheiden zijn, zodat
watermoleculen, nodig voor de hydrolyse, de mogelijkheid hebben om de acylester plaats te bereiken.
19
Lipase uit varkenspancreas splitst triglycerides het snelst, het gevormde diglyceride langzamer en het
resterende monoglyceride heel erg langzaam. Het is dan ook gebleken dat het enzym de vetzuren in de
l en 3 positie gemakkelijk afsplitst en die in de 2 positie veel moeilijker.
Vele lipases zijn tamelijk (maar niet absoluut) specifiek voor glycerolesters. Tributyrine-esters
(4C-vetzuur) worden het snelst gesplitst, en naarmate het aantal C-atomen van de vetzuurrest
toeneemt, neemt de reactiesnelheid af. Voorts is de activiteit van lipase op vetten met verzadigde
vetzuren met 10 of meer C-atomen extra laag, bij temperaturen waarbij het vaste stoffen zijn. Het
homogeniseren van b.v. melk, waardoor de vetbolletjes worden verkleind en hun specifiek oppervlak
wordt vergroot, stimuleert de lipase-activiteit. Dit geldt ook voor emulgatoren, zoals b.v. galzouten in
het darmkanaal.
Lipases veroorzaken hydrolytische ranzigheid, b.v. in melk, eiwit-, vis- en vleesprodukten.
Daarentegen zijn lipases ook nodig voor de ontwikkeling van het specifieke aroma van bepaalde
schimmelkazen (Roquefort, Camembert). De kiem van diverse graansoorten is betrekkelijk rijker aan
lipase dan het graan endo-sperm. Gedurende opslag van graan, vooral wanneer het vochtgehalte en de
temperatuur niet zeer laag gehouden worden, ontstaat al gauw bederf door vethydrolyse en ophoping
van vrije vetzuren (hydrolytische ranzigheid)..
CHLOROFYLLASE
Chlorofyllase, een enzym dat gewoonlijk wel aanwezig is in alle planteweef-sels, katalyseert de reactie
waarbij chlorofyl (bladgroen) wordt wordt omgezet in chlorofyllide. Het enzym heeft een hoge
optimumtemperatuur (77°C). Het wordt gebruikt om beter de kleur van groene groenten te behouden.
Chlorofyl wordt namelijk door geringe hoeveelheden zuur gemakkelijk omgezet in een grauw-bruine
kleurstof, terwijl chlorofyllide veel beter bestand is tegen deze bruine verkleuring.
20
Bronnen
Whitaker, J.R. Principleaof enzymology for the food sciences.
Marcel Dekker, Inc., New York, 1972.
Reed, G.
Enzymes in food processing, second edition. Academie Press, New York, 1975.
Eskin, N.A.M., Henderson, H.M. & Townsend, R.J. Biochemistry of foods.
Academie Press, London, 1971.
Terui, G.(editor)Fermentation technology to-day, Proceedings IVth Int. Ferm.
Symp., Kyoto (Japan), 1972.
Whitaker, J.R. (editor). Food related enzymes. Adv. Chem. Ser. 136.
American Chemical Society, Washington, D.C., 1974.
Dechema Monographien, Band 70. Verlag Chemie GmbH., Weinheim, 1972.
Olson, A.C. & Cooney, C.L. Immobilized enzymes in food and microbial processes.
Plenum Press, New York, 1974.
21