Certificate of

Application Note 4
Gebruik van gecertificeerde
referentiematerialen voor de kwantificering
van GGO's in levensmiddelen en
diervoeders
In deze nota worden richtlijnen verstrekt voor het correcte gebruik van IRMMreferentiematerialen met een gecertificeerde massafractie van een specifiek GGO.
De hierna vermelde bijzonderheden gelden met name voor het gebruik van de
CRM's ERM-BF410, ERM-BF411, ERM-BF412, ERM-BF413, ERM-BF414, ERMBF415, ERM-BF416, ERM-BF417, ERM-BF418 en ERM-BF423.
INLEIDING
Krachtens Verordening (EG) nr. 1830/2003 is
specifieke etikettering vereist voor levensmiddelen en
diervoeders die bestaan uit genetisch gemodificeerde
organismen (GGO’s), of die meer dan 0,9 % van
dergelijke organismen bevatten. (Het gaat daarbij om
GGO’s die conform het Gemeenschapsrecht in Europa
in de handel zijn gebracht.) Bijgevolg is een
betrouwbare kwantificering van de hoeveelheid GGO’s
in dergelijke producten noodzakelijk. Geschikte
gecertificeerde referentiematerialen (CRM’s) zijn in dit
verband van onmisbaarbelang voor de garantie van de
kwaliteit.
KENMERKEN VAN GGO-CRM’S
De gecertificeerde waarden van bovengenoemde
CRM’s zijn gebaseerd op de massa’s droog poeder van
genetisch gemodificeerde (GG) en ongemodificeerde
zaden welke bij de gravimetrische bereiding zijn
gebruikt. Deze massa’s worden gecorrigeerd op basis
van het watergehalte en van een schatting van de
zuiverheid. De GG massafractie wordt als volgt
berekend:
gecorr. massa GGO - poeder
gecorr. massa GGO - poeder + gecorr. massa niet - GGO - poeder
Elk GGO-CRM is gecertificeerd voor een massafractie
van een specifieke genetische modificatie (zoals
vermeld op het certificaat). Bijgevolg kan een dergelijk
CRM alleen worden gebruikt ter kwantificering van de
op het certificaat vermelde modificatie en kan het
overeenkomstige blancomateriaal alleen worden
gebruikt om de afwezigheid van die modificatie onder
de drempelwaarde, weergegeven op het certificaat, aan
te tonen.
ERM®- BF418c
DRIED MAIZE POWDER
Mass Fraction
1507 maize
Certified value 1)
[g / kg]
Uncertainty 2)
[g / kg]
9.9
-0.6 ; +0.8
1) The certified value is based on the mass fraction of dried non-genetically modified powder and dried
genetically modified powder mixed and corrected for the water content. The certified value is traceable
to the SI.
2) The certified uncertainty is the expanded uncertainty estimated in accordance with the Guide to the
Expression of Uncertainty in Measurement (GUM) with a coverage factor k = 2, corresponding to a
level of confidence of about 95 %.
Figuur 1: Gedeelte van het certificaat van GGO-CRM ERM-BF418c.
Recentelijk door het IRMM in omloop gebrachte GGOCRM’s zijn gecertificeerd met een asymmetrisch
onzekerheidsbereik. Wanneer een dergelijk CRM wordt
gebruikt om te controleren of er sprake is van een 'bias'
(systematische afwijking; zie Application Note 1), dient
September 2006
Auteur: Stefanie Trapmann
Europese Commissie - Gemeenschappelijk
Centrum voor Onderzoek
Instituut voor Referentiematerialen en Metingen
(IRMM)
Retieseweg 111, 2440 Geel, België
Email: [email protected]
www.erm-crm.org
de ‘plus-onzekerheid’ te worden gebruikt als
gemiddelde meetresultaat
hoger
is
dan
gecertificeerde waarde, en de ‘minus-onzekerheid’
het gemiddelde meetresultaat lager is dan
gecertificeerde waarde.
het
de
als
de
GEBRUIK VAN REAL-TIME PCR
De real-time polymerasekettingreactie (rt-PCR) wordt
courant gebruikt om de GG fractie in levensmiddelenen diervoedermonsters te kwantificeren. Deze
kwantificeringstechniek berust op de bepaling van de
verhouding van de hoeveelheden transgeen (d.w.z.
genetisch gemodificeerd) en endogeen (d.w.z. voor de
betrokken biologische soort specifiek) deoxyribonucleïnezuur (DNA).
Wegens de verschillende genetische samenstelling van
de verschillende delen van de zaden van
eenzaadlobbige planten (bijv. endosperm, zaadhuid en
embryo) kan de waarde van de DNA-verhouding in het
referentiemateriaal
verschillen
van
de
massafractiewaarde voor het gecertificeerde poeder.
De verhouding ‘geëxtraheerd transgeen DNA /
geëxtraheerd endogeen DNA’ is daardoor niet
noodzakelijk gelijk aan de verhouding ‘massa GG maïs
/ totale massa maïs’ – zelfs niet als beide DNA-types
een vergelijkbare extractieopbrengst hebben.
Bij de bereiding van de GGO-CRM’s is er zorg voor
gedragen dat het GG poeder en het ongemodificeerde
maïspoeder vergelijkbaar zijn qua spreiding van de
partikelgroottes. Dit is van groot belang met het oog op
de hoeveelheid extraheerbaar DNA in beide poeders.
Een verschillende DNA-extractie-efficiëntie voor GG
poeder en ongemodificeerd poeder zou de concentratie
van genetisch gemodificeerd DNA bepaald via rt-PCR
beïnvloeden.
Daarom
is
het
nodig
alleen
extractiemethoden te gebruiken die ten aanzien van dit
criterium zijn gevalideerd.
Bij de certificatie wordt de GG massafractie van het
CRM
geverifieerd
met
behulp
van
een
modificatiespecifieke rt-PCR-methode. Men moet
echter voorzichtig zijn met het trekken van kwantitatieve
conclusies op basis van metingen op onbekende
monsters, aangezien de onderzochte variëteit van
invloed kan zijn op de GGO-kwantificering via het DNA.
Indien informatie over het effect van verschillende
variëteiten op de rt-PCR-resultaten nergens anders
beschikbaar is, verdient het aanbeveling dit aspect te
onderzoeken middels een interne laboratoriumvalidatie
[1].
rt-PCR-detectiemethoden
die
uit
hoofde
van
Verordening (EG) nr. 1829/2003 zijn aangemeld en
gevalideerd, zijn publiek beschikbaar op de homepage
© Europese Gemeenschappen, 2006. Reproductie met bronvermelding toegestaan.
De Europese Commissie noch enige andere persoon die namens de Commissie optreedt, is verantwoordelijk voor het gebruik dat van
onderstaande informatie kan worden gemaakt.
Page 1 of 2
van het Communautaire Referentielaboratorium voor
GG levensmiddelen en diervoeders
(http://gmo-crl.jrc.it/detectionmethods.htm).
UITDRUKKING VAN RESULTATEN ALS RELATIEVE
AANTALLEN DNA-MOLECULEN
In Europa is rt-PCR de vaakst toegepaste GGOkwantificeringsmethodiek. In een recente aanbeveling
van de Commissie (2004/787/EG) wordt daarom
voorgesteld,om de resultaten van metingen op GG
monsters uit te drukken in termen van aantallen DNAmoleculen. Indien voor de kalibratie van de metingen
GGO-CRM’s worden gebruikt met een gecertificeerde
GG massafractie en indien het eindresultaat wordt
uitgedrukt in relatieve aantallen moleculen, dient men
er rekening mee te houden dat de maïs-CRM’s zijn
verkregen uit GG maïs die heterozygoot is voor het
transgen. Informatie over de zygositeit van het zaadmateriaal dat voor de productie van de CRM’s is
gebruikt, kan worden bekomen uit het desbetreffende
certificatierapport. Voorts moet rekening worden
gehouden met het feit dat de proportie GG DNA-
moleculen bij maïs wordt beïnvloed door de manier
waarop het GG hybride ras werd verkregen, alsook
door de endoreduplicatietoestand van de zaden,
waardoor het effect van de genomische verhoudingen
in het endospermweefsel wordt versterkt. In de meest
extreme gevallen kan de proportie GG DNA-moleculen
ofwel 33 % (transgen afkomstig van de vaderplant van
het heterozygote zaad), ofwel 66 % (transgen afkomstig
van de moederplant van het heterozygote zaad)
bedragen, ingeval de endoreduplicatie zo intens is dat
het meetresultaat voor bijna 100 % door het endosperm
wordt bepaald. In alle andere gevallen (geringer effect
van endoreduplicatie en een grotere bijdrage van het
embryoweefsel) ligt de waarde tussen 33 en 66 %, mits
ervan mag worden uitgegaan dat in vergelijking met
deze effecten de invloed van de zaadhuid verwaarloosbaar is.
Hieronder volgt een uitgewerkt voorbeeld van de
omrekening van een meetresultaat en de bijbehorende
onzekerheid van g/kg naar relatieve aantallen DNAmoleculen.
VOORBEELD
Door gebruik te maken van CRM's met een gecertificeerde GG massafractie voor de kalibratie, werd voor een bepaald
maïsmonster een gehalte aan maïstransformant 1507 van 65 ± 20 g/kg gemeten. Een uitgebreide meetonzekerheid van 20 g/kg
werd berekend op basis van een omvattingsfactor 2 en een meetonzekerheid van de kwantificeringsmethode van 15 %, zoals
geraamd bij interne laboratoriumvalidatie. Voor de omrekening van massafractie naar relatieve aantallen DNA-moleculen moet
het in g/kg uitgedrukte resultaat eerst in een percentage worden omgezet (deling door 10). Omdat de CRM's voor GG maïs die
voor de kalibratie worden gebruikt uit heterozygote maïszaden zijn verkregen, moet het resultaat voorts nog door 2 worden
gedeeld:
x
65
=
= 3,3
10 × 2 20
waarin x = gemiddeld gehalte aan GG materiaal, uitgedrukt in g/kg
Opgelet: indien is vastgesteld dat de GG en de ongemodificeerde uitgangsmaterialen die voor de productie van de CRM's zijn
gebruikt, verschillen qua DNA-extraheerbaarheid, moet een correctiefactor worden toegepast. Informatie over de DNAextraheerbaarheid kan worden bekomen uit het certificatierapport. Met de CTAB methode is een DNAextraheerbaarheidsverhouding van 0,7 ± 0,3 waargenomen voor het GG-poeder ten opzichte van het poeder van de
ongemodificeerde maïs. Het ware GG-gehalte van het geanalyseerde monster, uitgedrukt in termen van relatieve aantallen DNAmoleculen, wordt bijgevolg overschat en moet worden gecorrigeerd:
waarin f = correctiefactor te wijten aan de verschillende DNA-extraheerbaarheid van de poeders
3,3 * f = 3,3 * 0,7 = 2,3
van GG en ongemodificeerde maïs die als CRM worden gebruikt
Het effect van endoreduplicatie en de manier waarop de heterozygote GG maïs is geteeld, moeten bij de berekening van de
onzekerheid van de meetresultaten in acht worden genomen. De onzekerheid heeft een bereik van 33 % (66 % min 33 %); de
gemeten waarde kan dus een afwijking van 16,5 % vertonen. Voor de raming van het relatieve aantal GG moleculen moet het
DNA geëxtraheerd uit het onderzochte maïsmonster worden gekwantificeerd en moet het aantal maïsgenomen worden geschat.
Voor die schatting wordt de totale DNA-hoeveelheid gedeeld door de genoomgrootte van maïs. Bijgevolg moeten bij de
berekening van de totale onzekerheid zowel de onzekerheid m.b.t. de DNA-kwantificering als de onzekerheid m.b.t. de schatting
van de genoomgrootte worden meegenomen. Volgens de literatuur vertoont de grootte van het maïsgenoom tot 36 % variatie [2].
Bij de interne laboratoriumvalidatie is gebleken dat de reproduceerbaarheid van de kwantificeringsmethode 22 % bedraagt. De
uitgebreide gecombineerde onzekerheid van het resultaat uitgedrukt als DNA-aantalsverhouding (Ucc) is bijgevolg:
2
Ucc = k um2 + ugs
+u Dq2 +u 2e
2
2
⎛ 16.5 ⎞
⎛ 18 ⎞
U cc = 2 152 + ⎜
⎟ % = 60 %
⎟ + 222 + ⎜
⎝ 3 ⎠
⎝ 3⎠
waarin k omvattingsfactor
um = onzekerheidsbijdrage te wijten aan de kwantificering van
het aantal DNA-moleculen
ugs = onzekerheidsbijdrage te wijten aan de schatting van de
genoomgrootte
= onzekerheidsbijdrage te wijten aan de
uDq
DNA-kwantificering
ue = onzekerheidsbijdrage te wijten aan teelwijze en
endoreduplicatie
Het maïsmonster bevat 2,3 ± 1,4 transgene sequenties met modificatie 1507 per honderd endogene sequenties wanneer uitgedrukt in
aantallen moleculen. In vergelijking met het resultaat van 65 ± 20 g/kg uitgedrukt in 1507-massafractie is de relatieve uitgebreide
onzekerheid toegenomen van 30 % tot 60 %.
-----------------------------------------[1] IUPAC Technical Report (2002): Harmonized Guidelines for Single-Laboratory Validation of Methods of Analysis.
[2] Poggio et al., Annals of Botany 85 (1998),107-115.
Page 2 of 2