Centraal Dogma

Centraal Dogma
Hand-out bij de oefen- en zelftoets-module bij hoofdstuk 7 van 'The Molecular Biology of the Cell',
Alberts et al., 6e druk
Mei 2016
Van DNA naar mRNA
Hier zie je een deel van de sequentie van een menselijke DNA-streng, het 5’-deel van het
menselijke BMP6-gen (bone morphogenetic protein, zorgt voor kraakbeen- en beenvorming).
Dit is de sense-streng (5'  3'), en de transcriptie start bij het basepaar op positie 1 (GCAA...).
Vraag 1. Bindingssites (BMP6)
In dit DNA bevinden zich een aantal sequenties die belangrijk zijn voor de initiatie van transcriptie.
Hieraan binden eiwitten. De samenstelling van de sequenties vind je door te bepalen welke
nucleotiden op die plaatsen het meeste voorkomen.
A. Hoe noemt men dergelijke sequenties?
Vooral in het deel voorafgaande aan de startsite voor transcriptie bevinden zich veel bindingssites
die van belang zijn voor het gen.
B. Wat zijn dit voor eiwitten die aan dergelijke sequenties binden?
In dit 5'-deel van het DNA bevindt zich voor het gen een bindingssite (GATTGG) op positie -1074.
De CCAAT-transcriptiefactor bindt hieraan (vetgedrukt in bovenstaande figuur).
C. Waarom is CCAAT zo afwijkend van GATTGG?
1
De consensus-sequentie voor de bindingssite voor TFIIB is: G/C G/C G/A C G C C
Deze BRE-sequentie is op meerdere plekken te vinden, zoals:
1. GGGCGCC: -617 - -611
2. GGACGCC: -373 - -367
3. CCGCGCC: -171 - -165
4. GCGCGCC: -98 - -92
5. GGGCGCC: +9 - +15
6. CCACGCC: +136 - +142
D. Welke van deze plekken is de meest waarschijnlijke TFIIB-site?
Vraag 2. Start transcriptie (BMP6)
A. Wat verwacht je ongeveer 30 nucleotiden vóór de transcriptiestart?
B. Kun je deze vinden? Zoja, waar?
C. Wat is hiervoor de mogelijke verklaring?
Vraag 3. Eerste deel mRNA (BMP6)
A. Welke kant op beweegt RNA-polymerase vanaf G bij de transcriptie?
5'-TTCGCCACCT CTCTAGCCTG GCAACTGGGG GCGCCCCGGA-3'
B. Geef de eerste 30 nucleotiden van de sequentie van het mRNA voor dit eiwit, zoals het mRNA
in het cytoplasma komt.
2
Vraag 4. Enhancer- en promotorsequenties
Hierboven staat een deel van de sequentie van het gamma-globuline gen. De transcriptie start
waar de nucleotiden zijn aangegeven met hoofdletters. Een aantal plaatsen zijn onderstreept: dit
zijn enhancer- of promotor-sequenties.
A. Zet de namen van de herkenningssequenties op de juiste plaats onder de strepen. Bedenk
dat transcriptiefactoren aan dubbelstrengs DNA binden.
(CAAT, GATA, TATAA, CACCC)
B. Afhankelijk van de 5’-3’ of 3’-5’ sequentie worden deze strepen meestal als pijlen aangegeven.
- een pijl naar rechts als de sequentie in sense-richting is te lezen, en
- naar links als de sequentie in de antisense-streng is te lezen.
Maak van alle strepen een pijl naar links of naar rechts.
Vraag 5. Splicing
Bekijk de sequentie van het gamma-globuline gen. De transcriptie start waar de nucleotiden zijn
aangegeven met hoofdletters.
Rond -70 lees je polypyrimidines, gevolgd door AGG.
Is dit een potentiële splice-site?
Vraag 6. Transcriptie-efficiëntie
In het 5'-deel van de DNA-sequentie voor het gamma-globuline gen (vraag 4) zijn een aantal
stukken onderstreept.
A. Wat wordt hiermee aangegeven?
B. Welke factoren zijn van belang voor een efficiënte transcriptie?
C. Welke van deze factoren zijn aanwezig? En waar? Geef dat aan bij de sequentie bij vraag 4.
3
D. Wordt dit gen sterk getranscribeerd?
Van mRNA naar eiwit
Vraag 7. Efficiëntie translatie
Dit is weer het 5'-deel van de DNA-sequentie voor het gamma-globuline gen.
A. Welke factoren zijn van belang voor een efficiënte translatie?
B. Welke van deze factoren zijn aanwezig? En waar?
C. Zal er waarschijnlijk een efficiënte translatie zijn?
Vraag 8. Start translatie (BMP6)
Bekijk nogmaals de sequentie van de sense-streng van het BMP6-gen bij vraag 1.
Hieronder zijn de eerste zestig nucleotiden gegeven van de sequentie van het mRNA voor dit
BMP6-gen.
7mG-GCAACUGGGGGCGCCCCGGACGACCAUGAGAGAUAAGGACUGAGGGCCAGGAAGGGAAG…
A. Waar begint het ribosoom met de eiwitsynthese?
BMP6 bestaat uit honderden aminozuren. Als het ribosoom bij deze AUG start, treedt er een
probleem op waardoor er geen BMP6 gemaakt kan worden.
B. Geef het codon aan waar het probleem ontstaat.
C. Geef de positie van de nucleotide in het DNA waar de translatie van het BMP6-eiwit zal
starten.
4
D. In dit BMP6-RNA bleek een uAUG en uORF aanwezig, dat de translatie-efficiëntie negatief
beïnvloedt. Noem minstens twee van de drie andere elementen die van invloed zijn op de
efficiëntie van translatie van een bepaald leesraam.
Vraag 9. Start ribosomen
Hier zie je het begin van het mRNA voor het BMP6-eiwit. Ook zie je de 40S- en de 60S-subunit
van een ribosoom dat dit moet gaan aflezen.
7mG-GCAACUGGGGGCGCCCCGGACGACCAUGAGAGAUAAGGACUGAGGGCCAGGAAGGGAAG…
A. Geef in een tekening aan welk deel van het ribosoom het eerst bindt aan het mRNA, en waar.
B. Geef aan door middel van pijlen wat de volgende stap is.
De translatie die begint bij AUG stopt al na 4 codons bij UGA. Toch kan met dit mRNA een
werkend eiwit geproduceerd worden, met als startcodon een AUG op 179.
C. Wat is hiervoor de mogelijke verklaring?
o Startcodon is deel van intron en wordt verwijderd
o UGA resulteert niet altijd in stoppen van translatie
o 40S landt op het tweede startcodon
o 40S-en herkennen eerste AUG niet als startcodon
Vraag 10. Scenario's bij twee startcodons
Hieronder zie je het begin van het BMP6-mRNA, waarin zich twee potentiële startcodons
bevinden, met daartussen een stopcodon. Alleen het tweede startcodon geeft het BMP6-eiwit.
7mG-NNNNNNNNNNNNN-AUG-NNN-NNN-NNN-NNN-NNN-UGANNNNNNNNNNNNNNNN-AUG-NNN-NNN-NNN-NNN-NNN NNNNNNN_
Hoe kan dit eiwit gevormd worden? Er zijn verschillende scenario's bedacht:
1. 40S start bij de cap maar initieert pas bij 2e startcodon
2. 40S start bij de cap, scant tot 1e AUG, translatie start, bij UGA valt 60S + peptide eraf maar
40S scant door naar 2e AUG
3. 40S stopt bij 1e AUG, translatie start, bij UGA valt alleen het gemaakte peptide eraf en
ribosoom gaat door tot 2e AUG
4. Er verdwijnt een deel van de 5’UTR dat het eerste start- en stop-codon bevat, en normale
translatie vindt plaats.
A. Is scenario 1 een mogelijke verklaring?
5
B. Is scenario 2 een mogelijke verklaring?
C. Is scenario 3 een mogelijke verklaring?
D. Is scenario 4 een mogelijke verklaring?
E. Welk scenario is de meest waarschijnlijke verklaring?
Vraag 11. 5’UTR (BMP6)
Bekijk nogmaals de sense-streng van het BMP6-gen uit vraag 1.
A. Hoe lang is de 5'UTR van het gevormde transcript?
B. Meestal is een 5'UTR van humaan mRNA 20 – 80 nucleotiden lang. In welk geval zou de
5’UTR van dit transcript korter kunnen zijn dan de genoemde nucleotiden?
Bij splicing in het precurser-RNA kan de 5'UTR korter worden, en wordt wellicht het AUG-codon
op +25 verwijderd. Hiervoor moeten consensus splice-sequenties aanwezig zijn:
C. Zijn die te vinden rond het AUG-codon op +25?
Vraag 12. Negatieve regulatie (BMP6)
De initiatie van de eiwitsynthese (ook scanning) van het 5'UTR van het mRNA wordt negatief
gereguleerd door:
- een upstream startcodon, waardoor initiatie van het hoofd open leesraam vermindert, of
onmogelijk wordt,
- een veel langere dan gebruikelijke 5’UTR, en
- een hoog GC-gehalte (in ons voorbeeld >75%), waardoor het interne baseparing zal hebben.
Wat zou de fysiologische grondslag hiervoor kunnen zijn?
6
Vraag 13. Functie meerdere startcodons
Bij sommige mRNA's zijn meerdere functionele startcodons aanwezig (...AUG.....AUG...).
Ribosomen die bij een van beiden initiëren, maken in beide gevallen een eiwit, de ene iets langer
aan de N-terminus dan de andere.
Wat kan het voordeel zijn van zo'n extra stukje dat er niet altijd aan zit?
Eigenschappen 5’UTR
Vraag 14. Eigenschappen 5’UTR
De 5’UTR is van belang voor een efficiënte initiatie van de eiwitsynthese.
Welke vijf eigenschappen zijn hierbij van belang?
1.
2.
3.
4.
5.
Dit is de DNA-sequentie van de sense-streng van een humaan gen, van 5' naar 3'.
Het hoofd open leesraam start op de aangegeven ATG (AUG) op positie +54.
Vraag 15. Lengte 5’UTR
Hoe beïnvloedt de lengte van deze 5’UTR de efficiëntie van translatie-initiatie?
7
Vraag 16. GC-gehalte 5’UTR
Beïnvloedt het GC-gehalte van deze 5’UTR de efficiëntie van translatie-initiatie?
Vraag 17. uAUG Kozak
Hoe beïnvloedt de Kozak consensus-sequentie van het upstream AUG (+34) de efficiëntie van
initiatie van translatie van BMP6?
Vraag 18. uAUG
Heeft deze 5’UTR een upstream AUG die de efficiëntie van translatie-initiatie beïnvloedt?
Vraag 19. uORF
Heeft deze 5’UTR een upstream ORF?
Vraag 20. Kozak
Hoe beïnvloedt de Kozak consensus-sequentie van het hoofd open leesraam de efficiëntie van
initiatie van translatie van dit mRNA?
Vraag 21. Eerste drie aminozuren ribosoom
Geef de namen van de eerste drie aminozuren die gekoppeld worden door het ribosoom.
Vraag 22. Eerste drie aminozuren hoofd open leesraam
Wat zijn de eerste drie aminozuren van het hoofd open leesraam?
8