Optimalisatie van de extractieprocedure voor
advertisement
Optimalisatie van de extractieprocedure voor PLFA fingerprinting van microbiële biomassa uit bodems Studiegebied Industriële Wetenschappen en Technologie Opleiding Milieukunde Academiejaar 2005-2006 Gudrun Vandenbussche Optimalisatie van de extractieprocedure voor PLFA fingerprinting van microbiële biomassa uit bodems Studiegebied Industriële Wetenschappen en Technologie Opleiding Milieukunde Academiejaar 2005-2006 Gudrun Vandenbussche Woord vooraf Tijdens mijn studie voor industrieel ingenieur milieukunde werd ik geconfronteerd met de veelzijdigheid van het milieugebeuren. Als afsluiter van mijn studie wordt een eindwerk verwacht. Ik koos voor een origineel en vernieuwend onderwerp. Ik had zo het genoegen om mee te werken aan het doctoraatsonderzoek van ir. Ben Leroy. Dit eindwerk is het gevolg van een boeiende samenwerking die in de lijn ligt van mijn interesses. Ik wil iedereen bedanken die op één of andere manier heeft bijgedragen tot de realisatie van dit eindwerk. Graag had ik iedereen van de Vakgroep Bodembeheer en Bodemhygiëne en de Vakgroep Dierlijke Productie van de Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen (FBW) van de Universiteit Gent bedankt voor de vele raadplegingen en de aangename samenwerking tijdens die maanden. Dr. ir. Veerle Fievez voor het ter beschikking stellen van de labo’s en het materiaal en Prof. Dr. ir. Stefaan De Neve voor het nalezen van mijn eindwerk. In het bijzonder wil ik mijn mentor ir. Ben Leroy bedanken voor alle bezorgde informatie, het tijdig bijsturen en meermaals herlezen van mijn eindwerk. Ik hoop dat deze eindwerk een steentje heeft kunnen bijdragen tot zijn doctoraat en ik wens hem van harte nog veel succes toe. Ook wil ik mijn promotor Dr. ir Margriet Drouillon van harte bedanken voor haar betrokkenheid en voor de zovele keren dat ze me met raad en daad bijstond. J.Bursen en B. Bruneel voor het nalezen en verbeteren van mijn eindwerk. Tenslotte maar zeker niet het minst wil ik mijn ouders bedanken, die mij de mogelijkheid boden om verder te studeren en mijn vriend Joachim voor zijn steun en begrip tijdens de vele dagen dat ik aan dit eindwerk gewerkt heb. I Inhoudstafel Woord vooraf ________________________________________________ I Inhoudstafel ________________________________________________II Lijst van figuren ______________________________________________ V Lijst van tabellen ____________________________________________VII Lijst van gebruikte afkortingen ________________________________ VIII 1. Inleiding ______________________________________________ 1 2. Literatuurstudie _________________________________________ 3 2.1 Fosfolipidevetzuren analyse _____________________________ 3 2.1.1 Inleiding ___________________________________________________ 3 2.1.2 Fosfolipiden ________________________________________________ 3 2.1.3 Bacteriën en schimmels (Madigan, Martinko en Parker; 2006) ________ 5 2.1.4 Nomenclatuur PLFA (Zelles, 1998) ______________________________ 7 2.1.5 PLFA als biomerkers__________________________________________ 9 2.1.6 Moeilijkheden ______________________________________________ 11 2.2 Methodieken________________________________________ 12 2.2.1 Microbiële identificatie _______________________________________ 12 2.2.2 PLFA-analyse ______________________________________________ 13 a Eenvoudige methode _______________________________________ 14 b De uitgebreide methode _____________________________________ 15 2.2.3 Vergelijking tussen de verschillende methodes____________________ 17 2.2.4 Invloeden op PLFA-profielen tijdens de analyse ___________________ 18 a Temperatuur ______________________________________________ 18 b Zeven ___________________________________________________ 18 2.3 PLFA-analyse in de literatuur ___________________________ 19 2.3.1 Zware metalen _____________________________________________ 19 2.3.2 Bemesting ________________________________________________ 21 a Voorbeelden ______________________________________________ 21 II 3 Materiaal en methoden __________________________________ 23 3.1 Beschrijving van het studiegebied _______________________ 23 3.1.1 Geschiedenis ______________________________________________ 24 3.1.2 Bodemtype ________________________________________________ 24 3.2 Phospolipid fatty acid analyse __________________________ 25 3.2.1 Staalname ________________________________________________ 25 3.2.2 Analyses __________________________________________________ 25 a Reagentia ________________________________________________ 29 3.2.3 Solid phase extraction (SPE) (Simpson, 2000) ____________________ 30 a Principe en uitvoering _______________________________________ 30 b Het gebruik _______________________________________________ 30 3.2.4 Gaschromatograaf __________________________________________ 31 a Principe __________________________________________________ 31 b Injectiepoort ______________________________________________ 32 c Kolom ___________________________________________________ 33 d Detector _________________________________________________ 34 e Autosampler ______________________________________________ 37 f Recorder _________________________________________________ 38 3.2.5 Aangepaste methode ________________________________________ 39 a Reagentia ________________________________________________ 43 4 Resultaten en bespreking ________________________________ 44 4.1 Inleiding ___________________________________________ 44 4.2 Optimalisatie van de PLFA-methode ______________________ 45 4.2.1 Experiment ‘de volledige methode’ _____________________________ 45 a Aanpassingen in de methode _________________________________ 45 b Chromatogrammen _________________________________________ 46 c Bespreking________________________________________________ 48 4.2.2 Experiment ‘Vetzuren extraheren uit de bodem’___________________ 48 a Aanpassingen in de methode (2e aanpassing) ____________________ 48 b Chromatogrammen _________________________________________ 50 c Berekening vetgehalte ______________________________________ 51 d Bespreking _______________________________________________ 51 III 4.2.3 Experiment ‘Overbrengen naar andere buisjes’ ___________________ 52 a Aanpassingen in de methode (3e aanpassing) ____________________ 52 b Chromatogrammen _________________________________________ 53 c Berekening vetgehalte ______________________________________ 54 d Bespreking _______________________________________________ 54 4.2.4 Experiment ‘scheiden van de lipiden’ ___________________________ 55 a Aanpassingen in de methode _________________________________ 55 b Chromatogrammen _________________________________________ 56 c Berekening vetgehalte ______________________________________ 58 d Bespreking _______________________________________________ 60 4.2.5 Experiment ‘vetzuren omvormen naar methylesters’ _______________ 61 a Aanpassingen in de methode (4e aanpassing) ____________________ 61 b Chromatogrammen _________________________________________ 62 c Berekening vetgehalte ______________________________________ 63 d Bespreking _______________________________________________ 63 4.2.6 De analyse door de GC-FID ___________________________________ 64 a Bespreking________________________________________________ 64 5 Besluit _______________________________________________ 65 6 Literatuurlijst__________________________________________ 67 Bijlagen ____________________________________________________ 1 IV Lijst van figuren Figuur 2-I: Structuur van een fosfolipide, blauw: fosfaatgroep, roze: choline (Madigan en Martinko, 2006) ______________________________________________ 4 Figuur 2-II: Fosfolipide-bilayer-structuur (Madigan, Martinko en Parker, 2006) ______ 4 Figuur 2-III: Onderscheid tussen grampositieve en gramnegatieve bacteriën (Madigan en Martinko, 2006) ______________________________________________ 5 Figuur 2-IV: Voorstelling van verzadigde iso- en anteiso-methyl vertakte vetzuren (Viklund, 2006) _________________________________________________________ 7 Figuur 2-V: Overzicht van de classificatie van PLFA (Zelles, 1999)_________________ 8 Figuur 2-VI: Esterverbinding (a), etherverbinding (b) en structuur van een isopreenmolecule (c) (Madigan en Martinko, 2006) ___________________________ 12 Figuur 2-VII: Scheidingstechniek bij de eenvoudige PLFA-analyse (Zelles, 1999) ____ 14 Figuur 2-VIII: De scheidingstechniek bij de uitgebreide PLFA-analyse (Zelles, 1999) _ 16 Figuur 3-I: Grondplan van het proefveld in Melle _____________________________ 23 Figuur 3-II: SPE-vacuümtank met cartridges_________________________________ 30 Figuur 3-III:Voorstelling gaschromatograaf (Dumoulin, 2005) ___________________ 31 Figuur 3-IV: Voorstelling split-splitless injector (Dumoulin, 2005) ________________ 32 Figuur 3-V: Kolom: CPSil 88 (Varian, 2006)__________________________________ 33 Figuur 3-VI: Voorstelling FID _____________________________________________ 35 Figuur 3-VII: 4 g bodem afgewogen in extractiebuizen ________________________ 39 Figuur 3-VIII: P-buffer, CHCl3 en MeOH toevoegen in extractiebuizen_____________ 39 Figuur 3-IX: De scheiding van de waterlaag en chloroformlaag __________________ 40 Figuur 3-X: De chloroformlaag met een spuit in proefbuisjes overbrengen _________ 40 Figuur 3-XI: N2-bad ____________________________________________________ 40 Figuur 3-XII: De lipiden overbrengen naar de SPE-cartridges ___________________ 41 Figuur 3-XIII: Opvangen van fosfolipidenfracties in proefbuisjes _________________ 42 Figuur 3-XIV: De hexaanlaag in tipbuisjes brengen ___________________________ 43 Figuur 4-I: Chromatogrammen van de drie herhalingen van het experiment ‘de volledige methode’ _____________________________________________________ 46 Figuur 4-II: Chromatogrammen van de twee herhalingen van het experiment ‘vetzuren extraheren uit de bodem’ ________________________________________ 50 Figuur 4-III: Chromatogrammen van de drie herhalingen van het experiment ‘overbrengen naar andere buisjes’ _________________________________________ 53 Figuur 4-IV: Chromatogrammen van de drie herhalingen van de fosfolipidenfractie__ 56 V Figuur 4-V: Chromatogrammen van de drie herhalingen van de glycolipidenfractie __ 57 Figuur 4-VI: Chromatogrammen van de drie herhalingen van de neutrale lipidenfractie __________________________________________________________ 57 Figuur 4-VII:Chromatogrammen van de drie herhalingen van het experiment ‘ vetzuren omvormen naar methylesters’_____________________________________ 62 VI Lijst van tabellen Tabel 2-I: Merkervetzuren van geselecteerde microbiële groepen in bodem (Kozdroj en van Elsas, 2001) ____________________________________________________ 10 Tabel 2-II: Lijst van PLFA’s gevonden in bodem behandeld met mest en in bodem behandeld met mest en stalmest (Toyota en Kuninage, 2005) __________________ 22 Tabel 3-I: Resultaten vooronderzoek van het proefveldje ______________________ 24 Tabel 3-II: De methode uit de literatuur om fosfolipiden uit bodem te extraheren (Balser, 2005) _________________________________________________________ 26 Tabel 3-III: De FAME’s die via GC-FID kunnen bepaald worden (Incublong, Fievez) _ 38 Tabel 3-IV: De aangepaste methode _______________________________________ 39 Tabel 4-I: Welke aanpassingen bij welke experimenten uitgevoerd? ______________ 45 Tabel 4-II:Berekening vetgehaltes van het experiment ‘de volledige methode’______ 47 Tabel 4-III: Vetzuren extraheren uit de bodem ______________________________ 49 Tabel 4-IV: Berekening vetgehaltes van het experiment ‘vetzuren extraheren uit de bodem’ ______________________________________________________________ 51 Tabel 4-V: Berekening vetgehaltes van het experiment ‘overbrengen naar andere buisjes’ ______________________________________________________________ 54 Tabel 4-VI: Berekening vetgehaltes van de fosfolipidenfractie ___________________ 58 Tabel 4-VII: Berekening vetgehaltes van de glycolipidenfractie __________________ 58 Tabel 4-VIII: Berekening vetgehaltes van de neutrale lipidenfractie ______________ 59 Tabel 4-IX: De som van de vetgehaltes van de fosfo-, glyco- en neutrale lipidenfracties _________________________________________________________ 59 Tabel 4-X: Vetzuren omvormen naar methylesters ____________________________ 61 Tabel 4-XI: Berekening vetgehaltes van het experiment ‘vetzuren omvormen naar methylesters’__________________________________________________________ 63 VII Lijst van gebruikte afkortingen EL-FAME’s ester linked fatty acid methyl esters (via een ester verbonden methylesters van vetzuren) EL-PLFA’s ester linked phospholipid fatty acids (via een ester verbonden fosfolipidenvetzuren) FAME’s fatty acid methyl esters (methylesters van vetzuren) FID flame-ionization detector (vlamionisatie detector) GC(-MS) gaschromatograaf (-massaspectrometer) LPS lipopolysacchariden MeOH methanol MIDI microbiële identificatie MM molecuulmassa MUFA’s monounsaturated fatty acids (mono-onverzadigde vetzuren) NEL-PLFA’s non ester linked phospholipid fatty acids (niet via een ester verbonden fosfolipidenvetzuren) OM organisch materiaal PLFA’s phospholipid fatty acids (fosfolipidenvetzuren) PUFA’s polyunsaturated fatty acids (poly-onverzadigde vetzuren) SATFA’s saturated fatty acids (verzadigde vetzuren) SPE solid phase extraction (vaste fase extractie) VIII 1. Inleiding Het toedienen van organisch materiaal (OM) aan de bodem is cruciaal voor het in stand houden van het organische stofgehalte van de bodem en de bodemstructuur, het behoud van de biodiversiteit, het algemeen functioneren van het bodemvoedselweb en de bescherming tegen erosie. Het is al lang bekend uit de praktijk dat de kwaliteit van het exogeen (toegediend) OM een belangrijke invloed heeft op verschillende bodemfuncties (nutriënten leverend vermogen, ziekteonderdrukking, bodemfysische eigenschappen…) en dat niet alle soorten OM in dat opzicht evenwaardig zijn. Toch is er bijzonder weinig fundamentele kennis voor handen over de precieze effecten van verschillende soorten (i.e. kwaliteiten) OM op de verscheidenheid aan bodemfuncties. De bedoeling van het doctoraatsonderzoek waarvan dit eindwerk een onderdeel is, is te achterhalen hoe veranderingen in de bodemfysische eigenschappen en in de structuur van het bodemvoedselweb, te wijten aan het toedienen van verschillende kwaliteiten OM, in wisselwerking staan met de C- en N-mineralisatie van bodem OM. Kwaliteit verwijst hierbij naar de samenstelling van het toegediende OM. Deze kennis moet toelaten om later bodemgebonden processen zoals stikstofbeschikbaarheid, C-sequestratie, ziekteonderdrukking,… te sturen. In het kader van het doctoraatsonderzoek werd een veldproef aangelegd op de Proefhoeve van de Universiteit Gent in Melle. Verschillende organische bemestingen (stalmest, drijfmest, GFT-compost en twee soorten bedrijfscompost) en één puur chemische bemesting werden toegediend op experimentele veldjes van 6m x 8m (n=4). Deel 1: Inleiding 1 In het doctoraatsonderzoek worden volgende zaken onderzocht: • Hoe de samenstelling van bodemfauna en -flora wijzigt door de verschillende behandelingen: de populaties van bacteriën en schimmels en hun onderlinge verhouding, en de populaties van nematoden en regenwormen. • Hoe organische C en N verdeeld zijn over verschillende bodemfracties: opgeloste en oplosbare organische C en N, microbiële C en N en C en N in fractie bekomen via fysische fractionatie. Deze fractionaties moeten inzicht verschaffen over de beschikbaarheid van de toegediende organische koolstof (als drijvende kracht achter de N-transformaties) voor de bodemorganismen en de beschikbaarheid van de toegediende N. • Hoe de C en N mineralisatie verlopen onder gecontroleerde omstandigheden. Hiervoor worden mesocosmos experimenten uitgevoerd met minimaal verstoorde bodemmonsters van de experimentele veldjes. • Hoe de bodemstructuur en de bodemfysische eigenschappen evolueren in de tijd. Dit eindwerk behandelt enkel het luik van de microbiële populaties in de bodem, dus de bacteriën en de schimmels. Deze populaties kunnen bepaald worden door fosfolipidenvetzuren of phospholipid fatty acids (PLFA), afkomstig uit microbiële celmembranen, te extraheren uit bodemstalen. Deel 1: Inleiding 2 2. Literatuurstudie 2.1 Fosfolipidevetzuren analyse 2.1.1 Inleiding Een directe bepaling van microbiële groei in de bodem is niet mogelijk, doordat micro-organismen moeilijk uit de bodem te isoleren zijn. Er bestaan twee manier om microbiële groei te bepalen nl. (1) de activiteit van de microbiële biomassa kan bv. via respiratie, fumigatie bepaald worden en (2) de soorten micro-organismen kunnen bepaald worden door het uitplaten of via DNA/RNA-analyse of de phospholipid fatty acid-analyse (PLFA-analyse) (White, 1983). Fosfolipiden zijn essentiële membraancomponenten van levende cellen en maken deel uit van de biomassa van organismen. Hun vetzuren geven inzicht in de structuur van microbiële gemeenschappen (Zelles, 1999). Bacteriën en schimmels vormen de microbiële biomassa in de bodem, die verantwoordelijk is voor de afbraak van het aanwezige en toegediende OM. Om de samenstelling van deze microbiële gemeenschappen in de bodem goed in te schatten worden chemische componenten, in dit geval de vetzuren, die specifiek zijn voor deze twee groepen gemeten en waarbij rekening gehouden wordt met het feit dat bacteriën en schimmels verschillen in de samenstelling van hun fosfolipiden (Baath en Anderson, 2003). 2.1.2 Fosfolipiden Fosfolipiden zijn vetten (triglyceriden). Vetten bestaan uit een glycerolmolecule waar drie vetzuren aan vastzitten. Fosfolipiden hebben aan de glycerolmolecule slechts twee vetzuren, terwijl het derde vetzuur vervangen is door een fosfaatgroep. In sommige gevallen kan aan deze fosfaatgroep een stikstofverbinding gebonden zijn, bv. een choline (figuur 2-I). Deel 2: Literatuurstudie 3 Figuur 2-I: Structuur van een fosfolipide, blauw: fosfaatgroep, roze: choline (Madigan en Martinko, 2006) De vetzuren in een fosfolipide zijn hydrofoob en keren zich van het water af. De fosfaatgroep in een fosfolipide is daarentegen hydrofiel. Wanneer fosfolipiden in een waterige omgeving komen, zullen de apolaire ketens (vetzuren) vanwege hun hydrofobe karakter elkaar aantrekken. De fosfaatgroepen zullen zich keren naar het water toe. Op die manier ontstaat de typische fosfolipide-bilayer-structuur (figuur 2II). De membranen van plantaardige en dierlijke cellen bestaan uit fosfolipiden, deze spelen een belangrijke rol in het celmembraan. Het celmembraan scheidt de inhoud van de cel van de omgeving daarbuiten en het heeft een belangrijke rol in het functioneren van de cel. Door het membraan moeten alle voedingsstoffen binnen komen, terwijl afvalstoffen moeten kunnen verwijderd worden (selectieve permeabiliteit). Het membraan kan naast fosfolipiden ook bestaan uit proteïnen. Deze proteïnen regelen het transport van ionen en polaire moleculen door de celwand (Madigan, Martinko en Parker, 2006). Figuur 2-II: Fosfolipide-bilayer-structuur (Madigan, Martinko en Parker, 2006) Deel 2: Literatuurstudie 4 2.1.3 Bacteriën en schimmels (Madigan, Martinko en Parker; 2006) Bacteriën en schimmels zijn micro-organismen die respectievelijk behoren tot de prokaryoten en eukaryoten. Bacteriën zijn ééncellige organismen waarvan het genetisch materiaal niet in een nucleair membraan is ingesloten. Ze worden in twee groepen verdeeld nl. in Archaebacteriën en Eubacteriën. Ze kunnen ook ingedeeld worden naargelang de structuur van hun celwand: grampositieve en gramnegatieve bacteriën. Bij grampositieve bacteriën is de celwand opgebouwd uit een dikke peptidoglycaanlaag en een celmembraan. Bij gramnegatieve bacteriën is de celwand opgebouwd uit een dunne peptidoglycanlaag, celmembraan en een buitenste membraan. Het buitenste membraan is voor het grootste gedeelte opgebouwd uit lipopolysaccahariden (LPS) (figuur 2-III). Figuur 2-III: Onderscheid tussen grampositieve en gramnegatieve bacteriën (Madigan en Martinko, 2006) Bacteriën kunnen verschillende eisen (temperatuur, pH, osmotische druk, zuurstofbehoefte) stellen aan de omgeving om er te kunnen groeien. Voldoet de omgeving hier niet aan dan zullen bepaalde bacteriën niet groeien. Omgekeerd kunnen gunstige omgevingsfactoren de groei stimuleren. Deel 2: Literatuurstudie 5 Naar gevoeligheid voor temperatuur zijn er drie groepen bacteriën te onderscheiden: • Psychrofiele bacteriën met een temperatuurrange van 5° tot 30°C. • Mesofiele bacteriën groeien optimaal tussen 15° en 50°C. De meeste bacteriën behoren tot deze groep. • Thermofiele bacteriën groeien optimaal bij een temperatuur tussen 50°C en 60°C. Tot de eukaryoten behoren naast schimmels, ook de planten en dieren. Eukaryotische cellen zijn meestal groter dan prokaryotische (volumeverhouding ongeveer 2000:1). Het belangrijkste verschil met de prokaryoten is het bezit van een celkern. Schimmels doen niet aan fotosynthese. De sporen1 van fungi zijn in tegenstelling tot bij de bacteriën voortplantingscellen. 1: Sporen zijn een andere verschijningsvorm van het organisme. Ze komen voor wanneer het organisme zich in minder voordelige omstandigheden bevindt. Het kan op die manier overleven. Van zodra de schimmel zich terug in goede omstandigheden bevindt, kan deze terug ontwikkelen en vermenigvuldigen. Deel 2: Literatuurstudie 6 2.1.4 Nomenclatuur PLFA (Zelles, 1998) Vetzuren worden aangeduid door het totale aantal koolstofatomen. De graad van dubbele bindingen is aangeduid door een nummer gescheiden van het nummer van de ketenlengte door een dubbelpunt bv. 20:4, dit vetzuur heeft 20 koolstofatomen met 4 dubbele bindingen. De graad van de verzadiging wordt aangeduid door ∆x of ωx, waarbij x de positie van de dubbele binding het dichtst bij het carboxyleinde aangeeft, ∆, of in een aantal gevallen het dichtst bij het alifatische einde, ω. De voorvoegsels a, i, cy en d verwijzen respectievelijk naar anteiso, iso (figuur 2IV), cyclopropyl vertakkingen en dicarboxylic vetzuren. Br duidt aan dat de plaats van de vertakking onbekend is, terwijl een nummer gevolgd door ME duidt op de positie van een methylgroep (MeFA’s =vetzuren die methylgroepen bevatten). Voorbeelden: a15:0, i16:0, cy19:0, 10 Me16:0. Figuur 2-IV: Voorstelling van verzadigde iso- en anteiso-methyl vertakte vetzuren (Viklund, 2006) De voorvoegsels α en β duiden aan dat een OH-groep van een OH-vetzuur (OH-FA) respectievelijk op positie twee en drie is gelokaliseerd. Nummers voorafgegaan door ω duiden de positie aan van een OH-groep van een vetzuur. De achtervoegsels c en t staan respectievelijk voor cis- en transconfiguraties. Deel 2: Literatuurstudie 7 Figuur 2-V: Overzicht van de classificatie van PLFA (Zelles, 1999) Deel 2: Literatuurstudie 8 2.1.5 PLFA als biomerkers De analyse van PLFA’s afkomstig uit membranen van micro-organismen kan info geven omtrent grote groepen micro-organismen aanwezig in een systeem en hoe zij reageren op milieufactoren zoals op vervuiling, bemesting,… (zie 2.3). De veranderingen in de structuur van gemeenschappen kunnen bepaald worden door bepaalde PLFA’s van verschillende specifieke groepen van micro-organismen te vergelijken. Sommige PLFA’s zijn merkers voor het detecteren van specifieke microbiële groepen (tabel 2-I) (Kozdroj en van Elsas, 2001). Deel 2: Literatuurstudie 9 Tabel 2-I: Merkervetzuren van geselecteerde microbiële groepen in bodem (Kozdroj en van Elsas, 2001) Microbiële groep Subgroep Vetzuren Gramnegatieve OH FA’s (gewoonlijk 3OH) bacteriën Mono-onverzadigde FA’s (bv. 16:1ω7t, 16:1ωSc, 18:1ω7) cy17:0, cy 19:0 Grampositieve Iso- en anteiso FA’s (bv. i15:0, bacteriën a15:0, i16:0, i17:0, a17:0) Actinomycetales 10 Me FA’s (bv. 10 Me 16:0, 10 Me17:0, 10 Me18:0) Cytophaga- 16:1ω5c Flavobacterium- FA’s met oneven aantal C-atomen Bacteriodes Pseudomonas 16:0 en 16:1ω7c (gelijke hoeveelheden) 18:1ω7c/ω9t/ω12t FA’s met even aantal C-atomen Arthrobacter a15:0 en a17:0 (hoge hoeveelheden) Schimmels 16:1ωSc, 18:2ω6,9c, 18:1ω9c, 20:4, 23:0, 25:0, 21:0 Algen en protozoa Polyonverzadigde 16:1ω4, 16:3, FA’s (bv. 18:4ω3, 20:4, 20:5, 22:6) Opmerking: Voor de notatie van de vetzuren, zie 2.1.4 Nomenclatuur PLFA. Deze classificatie van vetzuren kan eenvoudig en snel inzicht geven in de diversiteit van de samenstelling van vetzuren in verschillende bodems, maar toch is er nog een geringe kennis over de relatie tussen de profielen van vetzuren en microorganismen (Zelles et al., 1992). Deel 2: Literatuurstudie 10 2.1.6 Moeilijkheden Hoewel PLFA-analyse een geschikte manier is om microbiële gemeenschappen in bodem te vergelijken en interpreteren, heeft deze techniek toch belangrijke beperkingen. Met PLFA-analyses kan enkel een beeld bekomen worden van veranderingen in samenstelling van microbiële populaties en dus niet van individuele organismen. Dit komt doordat verschillende vetzuren gemeenschappelijk zijn voor bepaalde organismen binnen een populatie (Zelles et al., 1992). De meeste extractie- en scheidingstechnieken van vetzuren bepalen niet alle informatie die nodig is om de micro-organismen te identificeren. De meest eenvoudige manier om dit probleem te omzeilen is de specifieke vetzuren van de belangrijkste organismen identificeren (Zelles, 1999). Het is nog steeds niet duidelijk of de vetzuren die nu aanzien worden als merkervetzuur voor een bepaalde groep van micro-organismen niet voorkomen in de membranen van andere microbiële organismen. Er werd bijvoorbeeld verondersteld dat ß-hydroxy (OH)-vetzuur kan gebruikt worden als merker voor gramnegatieve bacteriën. ß-OH-vetzuren zijn bestanddelen van LPS, waar gramnegatieve bacteriën voor een groot deel uit bestaan (zie 2.1.3). Zelles ontdekte deze vetzuren ook in grampositieve bacteriën en in planten. Sommige bacteriën bv. Eikanella corrodens bevatten geen hydroxyvetzuren in hun LPS-laag (Zelles, 1997). De lipiden in Eubacteriën en Eukaryoten zijn via een esterbinding gebonden aan de glycerolmolecule (figuur 2-VIa), terwijl de lipiden van Archaebacteriën een etherbinding hebben tussen de glycerolmolecule en de hydrofiele keten (figuur 2VIb). De lipiden van Archaebacteriën hebben geen vetzuren. De vetzuren zijn bij deze bacteriën vervangen door isopreen-polymeren (Madigan en Martinko, 2006) (figuur 2-VIc). Hierdoor zal de PLFA-analyse enkel op Eubacteriën en Eukaryoten kunnen toegepast worden en kan dus de structuur van Archaebacteriën niet bepaald worden (Zelles, 1998). Deel 2: Literatuurstudie 11 Figuur 2-VI: Esterverbinding (a), etherverbinding (b) en structuur van een isopreenmolecule (c) (Madigan en Martinko, 2006) 2.2 Methodieken Verschillende methodes zijn ontwikkeld om PLFA’s te bepalen in bodem. De belangrijkste fractioneringmethodes worden hieronder besproken. In dit eindwerk werd gebruik gemaakt van de eenvoudige PLFA-extractie. Om compleet te zijn, worden de methode van ‘Microbiële identificatie’ (MIDI) en de uitgebreide PLFAanalyse ook besproken. 2.2.1 Microbiële identificatie MIDI bepaalt vetzuurprofielen van het volledige bodemstaal, dus zowel vetzuren in de cel als buiten de cel. De extractie van de vetzuren is gebaseerd op een procedure in vier stappen. • Een zeepoplossing wordt aan de bodem toegevoegd om vetzuren van de cellulaire lipiden te isoleren (NaOH in waterig methanol (MeOH)) nadat de stalen verwarmd werden tot 100°C in een waterbad • Methylatie van de vetzuren op 80°C door toevoegen van HCl in waterig MeOH • Extractie van fatty acid methyl esters (FAME) in methyl-ter-butyl etherhexaan • Organisch extract wassen met water De FAME’s worden verder geanalyseerd via gaschromatografie. Deel 2: Literatuurstudie 12 2.2.2 PLFA-analyse De PLFA-analyse is gebaseerd op solid phase extraction (SPE) (zie Materiaal en methoden). SPE is een populaire procedure geworden voor de scheiding van lipiden. Deze techniek heeft kleine volumes van solventen nodig en vertoont een goede selectiviteit voor lipiden (Kaluzny et al.,1985; Kim en Salem, 1990). De SPE-techniek is eenvoudig, vlug en betrouwbaar. De lipiden worden met deze techniek gesplitst in verschillende fracties: neutrale lipiden, glycolipiden en fosfolipiden. Neutrale en glycolipiden worden verder niet gebruikt in de analyse van microbiële gemeenschappen. Deze lipiden kunnen wel gebruikt worden voor andere doeleinden, bv. om de voedingstoestanden van bacteriën te beschrijven (White et al, 1998). Dit is echter niet van toepassing in dit eindwerk. De fosfolipiden worden gemethyleerd tot FAME’s. Daarna kunnen de FAME’s geanalyseerd worden door een gaschromatograaf (GC) met een flame-ionization detector (FID) of door een GC gekoppeld aan een massa-spectrometer (GC-MS) (Zelles, 1999). De interpretatie van de resultaten kan gebeuren via multivariate statistische methoden, bvb. door principale componenten analyse (Zelles, 1999). Er bestaan verschillende methoden, die gebaseerd zijn op de graad van scheiding van de verschillende vetzuurfracties. Deel 2: Literatuurstudie 13 a Eenvoudige methode Bij deze analyse worden alleen ester linked PLFA’s (EL-PLFA’s) bepaald uit de bodemstalen (Zelles,1999). Er wordt gebruik gemaakt van kiezelzuur- of siliciumkolommen bij de SPE om de lipiden te scheiden in neutrale, glyco- en fosfolipiden (figuur 2-VII). Hierbij wordt chloroform gebruikt om de neutrale lipiden van de kolom te verwijderen, aceton voor de glycolipiden en methanol voor de fosfolipiden (Frostergård, 1995). Daarna wordt een zachte alkalische methylatie uitgevoerd op de fosfolipiden, waardoor de ester-linked fatty acid methyl ester (EL-FAME’s) gevormd worden, opgelost in of hexaan. Ze kunnen verder kwantitatief bepaald worden via GC-MS (Zelles, 1999). Figuur 2-VII: Scheidingstechniek bij de eenvoudige PLFA-analyse (Zelles, 1999) Deel 2: Literatuurstudie 14 b De uitgebreide methode Om gedetailleerdere informatie over de bindingen van de vetzuren in een lipidemolecule te weten werd een meer complexe extractie-methode ontwikkeld. (Zelles et al., 1992; Zelles en Bai, 1993; Zelles 1996) Bij de uitgebreide methode (figuur 2-VIII) worden de stappen zoals bij de eenvoudige methode overgenomen tot aan de zachte alkalische methylatie. Hierna worden de fosfolipiden gescheiden met een aminopropylgebonden SPE-kolom in ongesubstitueerde FAME’s, OH-gesubstitueerde FAME’s en onverzeepbare lipiden. De onverzeepbare lipiden worden daarna gescheiden in vetzuren met niet-ester bindingen, met een zure hydrolyse. Deze FAME’s worden verder verdeeld in ongesubstitueerde en OH-gesubstitueerde vetzuren, die NEL-PLFA’s (non-ester linked PLFA’s) worden genoemd. De ongesubstitueerde FAME’s van EL-PLFA’s worden via een benzeensulfonzuurgebonden SPE-kolom gescheiden in verschillende fracties van: saturated fatty acids (SATFA’s), monounsaturated fatty acids (MUFA’s) en polyunsaturated fatty acids met EL-fracties (PUFA’s). Deel 2: Literatuurstudie 15 Figuur 2-VIII: De scheidingstechniek bij de uitgebreide PLFA-analyse (Zelles, 1999) Deel 2: Literatuurstudie 16 2.2.3 Vergelijking tussen de verschillende methodes Via MIDI worden FAME’s bepaald die kunnen voorkomen als vrije vetzuren en in membranen van de micro-organismen. De vrije vetzuren zijn oorspronkelijk afkomstig van planten of micro-organismen én kunnen blijven bestaan als vetzuren in de bodem. De analyse van vetzuren wordt hierdoor bemoeilijkt, aangezien niet gekend is welke vetzuren juist bepaald worden. Vetzuren afkomstig uit de membranen van micro-organismen zullen de toestand nu weergeven, terwijl de vrije vetzuren een beeld geven over de geschiedenis van de fosfolipiden (Zelles, 1999). Bij de PLFA-analyse worden enkel vetzuren bepaald afkomstig van de celmembraan van micro-organismen, deze methode kan beter gebruikt worden om veranderingen van de structuren van microbiële gemeenschappen in bodem te bepalen (Zelles, 1998). Een ander voordeel van PLFA-analyse t.o.v. MIDI is dat PLFA in subfracties kunnen verdeeld worden en gebruikt worden als merkers voor specifieke microorganismen (Tunlid en White, 1992). De eenvoudige PLFA-methode bepaalt enkel de EL-PLFA’s. Terwijl de uitgebreide PLFA-methode het voordeel heeft dat de vetzuren in meer verschillende subfracties verdeeld worden (zie figuur 2-VIII). Hierdoor wordt een gedetailleerde info over de lipidestructuur verkregen, die kan gebruikt worden om structuren van microbiële gemeenschappen gedetailleerd te bepalen. (Zelles, 1998). Deel 2: Literatuurstudie 17 2.2.4 Invloeden op PLFA-profielen tijdens de analyse Sommige factoren beïnvloeden de analyse van de biomassa en de structuur van microbiële gemeenschappen en hun metabolische activiteiten. Deze factoren zijn: verstoringen afkomstig van staalname, homogenisatie van de bodem, aanpassing van de waterhoeveelheid, opslag en incubatie. De effecten van deze verstoringen zijn belangrijk aangezien bodemstalen vaak gedurende langere tijd worden bewaard vooraleer de PLFA-analyses uit te voeren (Petersen en Klug, 1994). a Temperatuur De temperatuur bij bewaring van de bodemstalen beïnvloedt de samenstelling van PLFA door zijn impact op de functie van het membraan. De vloeibaarheid van de lipidenlaag zal stijgen bij een stijgende temperatuur. Dit zal resulteren in een vorming van fasen buiten de lipidenlagen. Deze fasen zullen de membraanpermeabiliteit beïnvloeden. Een stijging van de vloeibaarheid van de lipidenlaag zal ook vele transportsystemen beïnvloeden. Er bestaat een duidelijk verband tussen een verhoogde (van 4.5°C naar 25°C) temperatuur en de veranderingen in het profiel van PLFA. Deze veranderingen kunnen verklaard worden door een reactie op stresstoestanden. Volgende veranderingen werden aangetroffen: een daling in de graad van onverzadiging, een dalende productie van cyclopropyl vetzuren en een stijgende verhouding van vertakte vetzuren (i15:0 en i17:0 t.o.v. a15:0 en a17:0). Zo troffen Petersen en Klug (1994) een daling in de graad van onverzadiging in de totale hoeveelheid van PLFA’s. b Zeven Via het zeven wordt het bodemstaal gehomogeniseerd. Craswell en Waring (1972) vonden dat veranderingen in de PLFA-samenstelling weinig verschilden ten gevolge van fysische verstoringen. Een mogelijke uitzondering hierop is het vetzuur 18:2ω6c (markervetzuur voor schimmels). De schimmels worden gemakkelijker beschadigd door het zeven dan eencellige organismen (bacteriën). Het zeven wordt in dit eindwerk niet uitgevoerd. Deel 2: Literatuurstudie 18 2.3 PLFA-analyse in de literatuur In dit hoofdstuk worden enkele voorbeelden gegeven waarbij PLFA-analyses werden gebruikt om veranderingen in de microbiële gemeenschappen in bodem te bepalen. 2.3.1 Zware metalen Pennanen et al. (1996) bestudeerden de effecten van langdurige blootstelling van zware metalen op bosbodems van twee verschillende plaatsen (nl. in Finland en in Zweden). In Finland werd hoofdzakelijk koper (Cu) aan de bosbodem toegevoegd, terwijl in Zweden een mengsel van metalen (Cu, zink (Zn), cadmium (Cd) en nikkel (Ni)) werd toegevoegd. Het grootste deel van de vetzuren die de veranderingen in de structuur van microbiële gemeenschappen in relatie van de zware metaalvervuiling tonen, reageerden op dezelfde manier in beide gebieden. Er werd een stijging van volgende PLFA’s teruggevonden tengevolge van de zware metaalvervuiling: br18:0, br17:0, i16:0 en i16:1. De PLFA’s 18:2w6 en 20:4 daalden in beide gebieden. Aangezien de blootstelling gebeurde op twee verschillende manieren (verschillend in samenstelling van de zware metalen) kan dit gezien worden als een goede indicatie voor het effect van zware metaalvervuiling. Schimmels zijn toleranter voor zware metalen dan bacteriën en actinomycetes (Hiroki, 1992). Frostegård et al. (1993) toonden via een laboratoriumstudie dat hoeveelheden van het vetzuur 18:2ω6 afkomstig van schimmels stijgen in metaalvervuilde bodems. Deel 2: Literatuurstudie 19 Vertakte vetzuren zoals br17:0 en br18:0 of iso-en anteisovertakte PLFA’s, zoals i15:0, i16:0, i16:1 en i17:0 vermeerderden in hoog metaalvervuilde bodems. Deze vetzuren worden gewoonlijk in grampositieve bacteriën gevonden (O’ Leary en Wilkinson, 1988). Nochtans overheersen gramnegatieve bacteriën in metaalgecontamineerde bodem vergeleken met grampositieve bacteriën (Duxbury en Bicknell, 1983) en is dominantie van grampositieve bacteriën zeldzaam in metaalgecontamineerde bodem (Timoney et al., 1978). Deze tegenstrijdigheid kan verklaard worden doordat in de bodem de gramnegatieve bacteriën veelvuldig voorkomen in de omgeving van wortels. Wanneer wortels in de bodems in mindere mate voorkomen, zal de hoeveelheid gramnegatieve bacteriën dalen (Pennanen et al., 1996). De veranderingen in PLFA’s van de studie op het veld verschillen van de veranderingen die werden bekomen uit laboratoriumstudies die werden uitgevoerd door Frostegård et al. (1993). Dit kan verklaard worden doordat in de bodem in het laboratorium geen planten aanwezig waren en dus ook geen wortels. Toch werden vetzuren gevonden die gelijkaardig reageren in beide studies op de zware metalen, bv. 20:4, br17:0, i16:0 en i16:1. Deze PLFA’s kunnen duiden op organismen die goede markers kunnen zijn voor metaalvervuiling in bodem. Bijvoorbeeld was het PLFA 20:4 in beide studies het meest gevoelig voor de zware metalen. Dit vetzuur komt voor in eukaryoten en werd ook gevonden in schimmels (Pennanen et al., 1996). Microbiële gemeenschappen worden meer verdraagzaam tegenover zware metalen. Er zijn drie redenen mogelijk: (1) de verkregen resistentie door aanpassing aan zware metalen, (2) een genetisch gewijzigde verdraagzaamheid of (3) een verandering in samenstelling van organismen waardoor de tolerantie meer competitief wordt. De laatste en meest logische reden kan de verklaring geven voor de hoge tolerantie van schimmels in metaalgecontamineerde bodems. De verdraagzaamheid van zware metalen van microbiële gemeenschappen kan bepaald worden door een verandering in de PLFA-profielen (Pennanen et al., 1996). Deel 2: Literatuurstudie 20 2.3.2 Bemesting Het toevoegen van organisch materiaal in bodem, zoals mest, compost en plantenresten, heeft positieve invloeden op de microbiële biomassa, maar de specifieke effecten van het organische materiaal in bodem zijn nog altijd niet helemaal gekend (Roberson et al., 1995; Wander et al., 1994). a Toyota Voorbeelden en Kuninaga (2005) vergeleken de structuur van microbiële gemeenschappen tussen een bodem waarbij alleen chemische mest werd toegevoegd en een bodem waarbij mest en stalmest werd toegevoegd gedurende tien jaar. Verschillen in microbiële gemeenschappen werden vastgesteld tussen de twee bodems met verschillende behandeling. Het totale aantal bacteriën was niet verschillend tussen de bodem met mest en de bodem met mest en stalmest. De PLFA’s die overheersten in beide bodems waren: 16:0, i15:0 en 18:1w9c. Deze PLFA’s waren 5-20% van de totale PLFA’s aanwezig (tabel 2-II). PLFA’s ai15:0, 10Me17:0, 16:1w7c, 18:1w7, i16:0, i17:0, ai17:0, 18:0, 14:0 en 18:2 waren steeds aanwezig in de twee bodems met aandelen van 2-9% (tabel 2-II). Deel 2: Literatuurstudie 21 Tabel 2-II: Lijst van PLFA’s gevonden in bodem behandeld met mest en in bodem behandeld met mest en stalmest (Toyota en Kuninage, 2005) mest-bodem (%) juli 1997 PLFA's april 1997 13:0 0 0.7 i14:0 0.7 1 14:0 1.9 2.3 i15:0 8.1 11.4 ai15:0 5.7 4.5 15:0 1.6 2.3 i16:0 4.8 6.3 16:1wp 0 0.5 16:1w7c 3.7 3.6 16:1w7t 1.8 2.4 16:2w5 1 1.6 16:0 20 19.9 5.2 10Me17:0 4.4 ai17:1 0.7 0.8 i17:0 4.9 5 ai17:0 3.2 3 17:1w8 1.1 1.7 cy17:0 2.1 1.3 17:0 1.3 1.6 1.3 10Me18:0 1.1 18:2 3.2 2.3 18:1w9c 10.9 4.5 18:1w7 3.5 2 18:0 7.2 7.7 2.3 10Me19:0 2.2 cy19:0 2.4 2.3 20:0 2.3 2.5 mest + stalmest bodem (%) april 1997 juli 1997 0.5 0.2 1.4 1.1 2 2.2 11 10.8 8.5 6.2 1.6 1.6 5.3 6.3 1 0.6 6.9 4 2.3 2 2.4 2.1 13.8 16 6 5.1 0.6 1.7 3.8 4.7 3.6 3.7 0.8 0.6 3.3 3.1 0.8 1.4 1.2 1.2 2.3 2.5 5.5 5.9 5.9 3.3 3.7 5.8 2.2 2.3 2.3 3.1 1.3 2.4 Arao et al. (1998) vonden dat het percentage van vertakte vetzuren (biomarker voor grampositieve bacteriën) hoger is bij een bodem die werd behandeld met compost dan bij een onbehandelde bodem. Wander et al. (1995) vonden daarentegen dat geen veelbetekenende veranderingen in de structuur van microbiële gemeenschappen werden gevonden in een bodem behandeld met organisch materiaal t.o.v. een bodem die niet werd behandeld met organische mest. Deel 2: Literatuurstudie 22 3 Materiaal en methoden 3.1 Beschrijving van het studiegebied De bodemstalen voor het onderzoek werden genomen op een proefveld van de proefhoeve van de Universiteit Gent in Melle. Het proefveld is ontworpen als een randomised complete block design met 4 herhalingen. Dit betekent dat binnen elk van de 4 blokken elke behandeling volledig gerandomiseerd binnen het blok voorkomt. Het proefveld werd aangelegd in het voorjaar van 2005. De plotjes worden bemest met uiteenlopende organische meststoffen (nl. stalmest, drijfmest, GFT-compost en twee soorten bedrijfs- of CMCcompost) en één zuiver chemische meststof. Enkele veldjes worden niet bemest (figuur 3-I). 48 m I1 I2 II 1 II 2 III 1 III 2 IV 1 IV 2 MIN N DRM GB- CMC 1 CMC 2 GB+ CMC 1 GB- I3 I4 II 3 II 4 III 3 III 4 IV 3 IV 4 GB+ CMC 1 GFT MIN N STM GB- DRM MIN N 35m RIJ PAD 3m I5 I6 II 5 II 6 III 5 III 6 IV 5 IV 6 STM GB- CMC 2 GB+ GFT DRM GFT STM I7 I8 II 7 II 8 III 7 III 8 IV 7 IV 8 CMC 2 GFT DRM STM MIN N CMC 1 GB+ CMC 2 Bemestingen: 1. 2. 3. 4. STM = Stalmest + min N GFT = GFT-compost + min N CMC 1 = CMC-compost schimmel + min N CMC 2 = CMC-compost bacterie + min N 5. 6. 7. 8. 6m DRM = Drijfmest + oogstresten MIN N = Minerale N GB+ = Geen bemesting, wel gewas GB- = Geen bemesting, geen gewas Figuur 3-I: Grondplan van het proefveld in Melle Deel 3: Materiaal en methoden 23 8m 3.1.1 Geschiedenis In de periode voor de aanleg van het proefveld (2000-2004) stond op het perceel maïs. De jaren daarvoor heeft er afwisselend één jaar bonen gestaan en twee jaren maïs. Het proefveldje werd gedurende al die jaren enkel mineraal bemest (dus enkel kunstmeststoffen en geen stalmest, drijfmest,…). 3.1.2 Bodemtype Volgens de Belgische bodemclassificatie gaat het over een zandleembodem (L) met als samenstelling 36.3% zand, 52% leem en 11.7% klei. De pH van de bodem van het proefveldje is 5.9. Een vooronderzoek werd uitgevoerd van het proefveld, de resultaten werden beoordeeld op basis van de gegevens van de ‘Bodemkundige Dienst van België’. Bij de berekening van de resultaten werd rekening gehouden met een schijnbare dichtheid van 1.5 g/cm3. Er werden telkens 10 steken op het volledige proefveld genomen van 30 cm diep (tabel 3-I). Tabel 3-I: Resultaten vooronderzoek van het proefveldje parameter C totale N minerale N: NO3minerale N: NH4P Na K Ca Mg Deel 3: Materiaal en methoden eenheid % % kg N/ha kg N/ha mg P/100g mg Na/100g mg K/100g mg Ca/100g mg Mg/100g 0-30cm 1,013 0,086 56,100 2,505 20,750 1,600 19,670 122,400 32,680 beoordeling tamelijk laag tamelijk hoog laag normaal normaal zeer hoog 24 3.2 Phospolipid fatty acid analyse 3.2.1 Staalname Er werden per veldje (figuur 3-I) 15 stalen genomen tot op een diepte van 10 cm. De 15 stalen worden in één zak samengebracht, waardoor een mengmonster wordt bekomen. De monsters werden daarna gevriesdroogd en gemalen zodat de bodem goed gehomogeniseerd wordt. De bodemstalen worden bewaard in de diepvries voor verdere analyses. 3.2.2 Analyses In tabel 3-II staat de methode weergegeven om fosfolipiden uit bodemstalen te extraheren om ze te kunnen analyseren met de GC-FID of GC-MS. Deze extractieprocedure is opgesteld door Teri C. Balser (Balser, 2005). Deel 3: Materiaal en methoden 25 Tabel 3-II: De methode uit de literatuur om fosfolipiden uit bodem te extraheren (Balser, 2005) 1. Voorbereiden van bodem en glaswerk Het glaswerk (proefbuizen, extractiebuizen, bekers,..) spoelen met hexaan Bodem invriezen na staalname Bodem zo vlug mogelijk vriesdrogen Bodem met mortier en stamper homogeniseren + mixen 2. Vetzuren extraheren uit de bodem 4 g bodem afwegen in extractiebuizen 3.6 ml P-buffer (pH 7) toevoegen in extractiebuizen 4 ml chloroform (CHCl3) 8 ml methanol (MeOH) 1 uur schudden (horizontaal, in het donker) Centrifugeren: 30 min, 2000 toeren/min De vloeistof decanteren in nieuwe extractiebuizen 3.6 ml P-buffer en 4 ml CHCl3 toevoegen 1 min schudden en ‘s nachts laten staan in het donker Scheiding van twee lagen is goed te zien na één nacht De bovenste laag afzuigen met een waterstraalpomp De onderste laag (CHCl3) wordt bewaard De CHCl3 droogdampen met N2-gas Na deze stap kunnen de proefbuisjes bewaard worden in het donker en in de diepvries 3. Overbrengen naar andere buisjes Met een pasteurpipet 0.5 ml CHCl3 in proefbuisje brengen Vortexen Met een andere pasteurpipet deze 0.5 ml CHCl3 overbrengen in een nieuw proefbuisje Deze stappen nog 3 keer herhalen zodat alle lipiden worden overgebracht naar de nieuwe proefbuisjes De CHCl3 droogdampen met N2-gas Na deze stap kunnen de proefbuisjes bewaard worden in het donker en in de diepvries Deel 3: Materiaal en methoden 26 4. Scheiden van de lipiden (SPE) De silica SPE-cartridges plaatsen op de vacuümtank Conditioneren van de cartridges door 3 ml CHCl3 toe te voegen Overbrengen van de lipiden naar de cartridges: 250µl CHCl3 in de proefbuisjes brengen, vortexen en overbrengen naar cartridges met pasteurpipet. Deze stappen nog 3 keer herhalen Daarna 5 ml CHCl3 in cartridges brengen; de neutrale lipiden worden op deze manier geïsoleerd Tien ml aceton brengen in de cartridges om zo de glycolipiden te isoleren De naalden van de cartridges schoonmaken met MeOH Proefbuisjes worden in de vacuümtank gebracht om zo de fosfolipiden op te vangen voor verdere analyse Vijf ml MeOH wordt in de cartridges gebracht De proefbuisjes met de fosfolipiden worden met N2-gas drooggedampt De proefbuisjes kunnen eventueel bewaard worden voor verdere analyse in het donker en in de diepvries 5. Vetzuren omvormen naar methylesters De drooggedampte lipiden worden in 1 ml 1:1 MeOH:tolueen en 1 ml 0.2M methanolic KOH opgelost Vortexen De proefbuisjes incuberen op 35°C gedurende 15 min De stalen op kamertemperatuur brengen 2 ml 4:1 hexaan:CHCl3 toevoegen, vortexen De stalen neutraliseren met 1ml 1M zwavelzuur (pH controleren!) 2 ml milliQ ultrapuur water toevoegen, vortexen Centrifugeren op 2000 tpm gedurende 5 min om de fasen te scheiden De bovenste (hexaan) laag in 4 ml amber GC-vials met schroefdop brengen Deel 3: Materiaal en methoden 27 Twee ml 4:1 hexaan:CHCl3 toevoegen, vortexen Centrifugeren op 2000 tpm gedurende 5 min De hexaanlaag in de 4 ml GC-vials brengen De hexaan droogdampen met N2-gas Eventueel kunnen de stalen in het donker en in de diepvries bewaard worden 6. Overbrengen naar GC-vials met inserts 100 µl interne standaard in hexaan in de vials met drooggedampte lipiden brengen Voorzichtig vortexen De 100µl overbrengen in nieuwe GC-vials (2ml) Deze stappen nogmaals herhalen N2-gas in de inserts van GC-vials brengen en afsluiten De GC-vials kunnen bewaard worden in de diepvries voor verdere analyse in de GC-MS of GC-FID (GC 6890 Agilent Technologies) Deel 3: Materiaal en methoden 28 a Reagentia Hieronder worden de bereiding van de verschillende reagentia besproken die werden gebruikt in de ‘oorspronkelijke PLFA-methode’. P-buffer Fosfaatbuffer (P-buffer) : 0.1 M (pH 7) 39 ml 1M K2HPO4 stokoplossing en 61 ml 1M KH2PO4 stokoplossing worden in een maatkolf van 1 liter gebracht en aangevuld met gedemineraliseerd water. De pH wordt gecorrigeerd met NaOH tot 7. 1:1 MeOH:tolueen Gelijke volumes van MeOH en tolueen worden in een bewaarfles (vooraf gereinigd met hexaan) gebracht. 4:1 hexaan:CHCl3 In een bewaarfles (vooraf gereinigd met hexaan) wordt 4 keer meer hexaan dan chloroform gebracht. 0.2M methanolic KOH Deze oplossing moet iedere dag vers aangemaakt worden. Eerst wordt KOH afgewogen en daarna wordt met onderstaande formule berekend hoeveel MeOH bijgevoegd moet worden. (X g KOH / 0.2 MM (KOH)) * 1000 = x ml Deel 3: Materiaal en methoden toe te voegen MeOH 29 3.2.3 Solid phase extraction (SPE) (Simpson, 2000) Deze extractieprocedure is gebaseerd op verdeling, adsorptie, affiniteit of ionenuitwisseling en wordt steeds meer ingezet omwille van de snelheid van uitvoering in vergelijking met de klassieke technieken (vloeistof-vloeistof extractie). Grote monstervolumes kunnen behandeld worden met een kleine hoeveelheid vaste fase, waardoor er kleine solventvolumes vereist zijn om de vaste fase te strippen. Dit elimineert additionele verdampingsstappen en reduceert bijgevolg de kans op contaminatie. a In zijn Principe en uitvoering eenvoudigste vorm, maakt SPE gebruik van kleine kunststoffen wegwerpkolommen of cartridges. Vaak is dit een huls van een injectiespuit, die gepakt is met een kleine hoeveelheid sorbens. In figuur 3-II wordt een SPEvacuümtank weergegeven waarop cartridges zijn geplaatst. Door te werken met een vacuümtank, stroomt het solvent gecontroleerd door het pakkingmateriaal. Figuur 3-II: SPE-vacuümtank met cartridges b Het gebruik Om een analytisch monster voor te behandelen kan SPE op twee manieren gebruikt worden. Volgens de eerste benadering worden de componenten van interesse weerhouden op het pakkingmateriaal. Na het wegwassen van de onzuiverheden worden de weerhouden componenten geëlueerd met een klein volume geschikt solvent. Dit monster is rechtstreeks bruikbaar voor GC, HPLC of andere typische analysetechnieken. Deel 3: Materiaal en methoden 30 De tweede benadering is enkel een zuivering van het monster. De onzuiverheden worden weerhouden op het pakkingmateriaal. In de PLFA-methode wordt gebruikt gemaakt van silica SPE-cartridges (chromabond, 6 ml, 500 mg SiOH art. nr. 760 070 van Machterey Nagel) en de lipiden werden in de verschillende fracties gescheiden via de eerste benadering. 3.2.4 Gaschromatograaf Gaschromatografie is een vorm van chromatografie waarbij de te scheiden chemische stoffen (componenten) zich in de gasfase bevinden. Deze vorm wordt gebruikt voor het bepalen van samenstellingen van mengsels (Scott, 1998). In dit eindwerk werd gebruik gemaakt van een GC 6890 Agilent Technologies. a Principe Het principe van gaschromatografie berust op de verdeling van de componenten tussen de stationaire fase en mobiele fase. De mobiele fase bestaat uit een draaggas (bv. He, N2,…) dat over de stationaire fase stroomt. Een gaschromatograaf is opgebouwd uit een injectiepoort, kolom, detector, autosampler (optioneel) en recorder (figuur 3-III) (Scott, 1998). Figuur 3-III:Voorstelling gaschromatograaf (Dumoulin, 2005) Deel 3: Materiaal en methoden 31 b Injectiepoort Het injecteren gebeurt met een speciale injectienaald met een zeer klein volume. Met de injectienaald wordt het monster door het septum geïnjecteerd in de mobiele fase waarbij het door verhitting in de injectiepoort snel verdampt en als monsterwolk met de mobiele fase mee stroomt. De monsterwolk dient als een dunne band mee te worden gevoerd in de mobiele fase. Daarom is het van belang dat het monster zo snel mogelijk verdampt. De temperatuur van de injector moet hiervoor in regel hoger zijn dan het kookpunt van de hoogst kokende component in het monster. Maar een te hoge temperatuur kan tot een explosieve verdamping leiden waardoor er terugslag van de draaggasstroom ontstaat (Scott, 1998). De gebruikte injector bij de analyses voor de fosfolipiden is de split-splitless injector (figuur 3-IV). Het totale draaggasdebiet wordt in drie fracties opgesplitst. Een gedeelte stroomt langs het septum, om vervolgens uit het systeem te worden verwijdert. Op deze manier voorkomt men dat contaminaties door bv. bloeden van het septum op de kolom terechtkomen (bij hoge temperaturen kunnen stoffen afkomstig van septum vrijkomen). De grootste fractie van het draaggas verlaat de injector via ‘split outlet’. De rest van het draaggas met het monster komt op de kolom. Door de ‘split outlet’ af te sluiten, werkt men in de splitless modus (Dumoulin, 2005). Figuur 3-IV: Voorstelling split-splitless injector (Dumoulin, 2005) Deel 3: Materiaal en methoden 32 c Kolom Na de injectiepoort stroomt het draaggas met de geïnjecteerde monsterwolk door naar een in een oven geplaatste kolom. In dit eindwerk wordt gebruik gemaakt van een capillaire kolom. Bij capillaire kolommen zit de stationaire fase uitsluitend op de wand van de kolom. Wanneer een monsterwolk door de kolom stroomt, zullen de componenten in het monster zich gaan verdelen tussen de stationaire fase en mobiele fase. Als men een apolaire kolom neemt zullen apolaire componenten meer in de stationaire fase gaan zitten dan in de mobiele fase waardoor ze moeilijker met de mobiele fase mee stromen. Polaire componenten lossen veel moeilijker op in de apolaire stationaire fase en stromen gemakkelijk verder met het draaggas. Men kan de kolom op constante temperatuur houden. Maar bij analyses waarbij de componenten met grote tijdsverschillen van de kolom komen, past men ook wel temperatuurprogrammering toe. Hierbij is de kolom geplaatst in een oven die een temperatuurprogramma kan doorlopen om bijvoorbeeld eerst de laagkokende componenten van de kolom af te halen bij een lage temperatuur. Wanneer de temperatuur stijgt komen de hoger kokende componenten van de kolom. Hierdoor daalt de benodigde analysetijd in sterke mate (Scott, 1998). De gebruikte kolom is een CP-SIL 88-kolom (100m x 25mm x 2µm) en kan gebruikt worden om FAME’s te analyseren. De CP-SIL 88-kolom (figuur 3-V) bevat een gesubstitueerde cyanopropylfase die werd gestabiliseerd. De hoge polariteit van de kolom biedt een maximum resolutie in de scheiding van de componenten waarvan het kookpunt en de polariteit dicht bij elkaar liggen. De kolom is een niet-chemisch gebonden gestabiliseerde kolom (Varian, 2006). Figuur 3-V: Kolom: CPSil 88 (Varian, 2006) Deel 3: Materiaal en methoden 33 d Detector Na de kolom stromen de gescheiden componenten door naar de detector waar de componenten in een elektrisch signaal omgezet worden. Dit elektrische signaal wordt vervolgens door een computer omgezet in een piekje met een bepaalde oppervlakte die recht evenredig is met de concentratie. De grafiek van het detectorsignaal tegen de tijd, noemt men het chromatogram (Scott, 1998). De optimalisatie van de PLFA-extractieprocedure werd uitgevoerd met een GC-FID. De verdere analyses van de fosfolipiden zullen later uitgevoerd worden met een GCMS. Hieronder worden de verschillende detectoren besproken. Flame ionisation detector De flame ionisation detector (FID) is een specifieke, massastroomgevoelige detector. De werking berust op de verandering van de elektrische geleiding van de gasmassa in een waterstofvlam wanneer organische componenten in de vlam worden geleid. Het hart van de detector wordt gevormd door een kleine brander die met waterstof wordt gevoed. Rond de brander wordt lucht toegevoerd. De elektrische geleiding van de gasmassa in de vlam wordt gemeten via twee elektroden waarbij de brander de negatieve elektrode en een metalen cilinder de positieve elektrode vormt (figuur 3-VI). Deel 3: Materiaal en methoden 34 Figuur 3-VI: Voorstelling FID In de waterstofvlam, waar zuiver draaggas uit de kolom wordt geleid, zijn slechts weinig ionen aanwezig zodat de ionenstroom zeer klein is. Wanneer in de vlam een koolstofverbinding wordt verbrand, zal een klein gedeelte hiervan ionen leveren. De geproduceerde ionen en elektronen worden door de aangelegde spanning over de elektroden afgevoerd. Het verkregen signaal kan worden geregistreerd. De FID is specifiek voor verbindingen die de combinatie koolstof en waterstof bevatten. De gevoeligheid voor verschillende verbindingen die alleen deze beide elementen bevatten, varieert zeer weinig, de aanwezigheid van hetero-atomen (CO, OH en NH2) verlaagt echter wel de gevoeligheid. Een FID is niet gevoelig voor verbindingen zoals water, H2S, CO2, N2, SO2, CCl4 en NH3 (Scott, 1998). Deel 3: Materiaal en methoden 35 Massaspectrometrie De massaspectrometer is een krachtige analytische techniek die gebruikt wordt om onbekende mengsels te identificeren, om bekende mengsels te kwantificeren en om de structuur en chemische eigenschappen van moleculen toe te lichten. De detectie van mengsels kan met minieme hoeveelheden bereikt worden. In een massaspectrometer worden de moleculen geïoniseerd. De meest gebruikte methode is elektronimpact: een hoge-energie (70eV) elektronbundel afkomstig van een filament verwijdert een elektron van de molecule en produceert zo een positief ion. M + e- → M+ + 2 e- met M: de bestudeerde molecule M+: het moleculair ion De elektronenbundel produceert M+ in een variëteit aan energietoestanden. Sommige krijgen een grote hoeveelheid interne energie (rotatie, vibratie en elektronische energie). Omdat de ionisatie plaatsvindt in een hoog vacuüm, kan de molecule het overschot aan energie niet afstaan via botsingen. De energie wordt dan ook gebruikt voor het verbreken van bindingen in de molecule zelf, wat resulteert in fragmentatie: Waarbij M1+, M2+,… ionen met een lagere massa zijn. De molecule valt uiteen op een karakteristieke manier die samenhangt met de moleculaire structuur. Andere moleculen hebben onvoldoende energie om te fragmenteren en worden gedetecteerd op de oorspronkelijke moleculaire massa. De ionogene fragmenten worden versneld in een elektrisch veld (m/e-scheiding) en verlaten de ionenbron met een kinetische energie gelijk aan: mv2/2 = V.e Deel 3: Materiaal en methoden 36 Vervolgens komen ze in een magnetisch veld terecht, waarvan de veldlijnen loodrecht staan op de transportrichting. Een bewegende elektrische lading ondervindt in een magnetisch veld een centripetale kracht = H.e.v, met H de veldsterkte. Deze kracht wordt gebalanceerd door een centrifugale kracht mv2/r. Als gevolg hiervan wordt een cirkelvormige baan met straal r beschreven. mv2/r = H.e.v of v= H.e.r/m Rekening houdend met mv2/2 = V.e, kan men afleiden dat: m/e= H2.r2/2V De afbuiging is functie van de molecuulmassa (MM): hoe hoger de MM, hoe minder de afbuiging. Zo ontstaat een waaier aan fragmenten die door het magneetveld bewegen. Op het eind bevindt zich een spleet met daarachter een detector. Doordat er met een vaste straal gewerkt wordt, wordt het massaspectrum verkregen door het veld van de elektrische versneller of door het magneetveld te veranderen zodat de fragmenten één voor één op volgorde van massa geregistreerd worden. Het resultaat is een uniek massaspectrum dat kan worden opgeslagen. De verbinding kan vervolgens geïdentificeerd worden door het massaspectrum te vergelijken met spectra uit de literatuur of met eerder opgeslagen referentiespectra (Dumoulin, 2005). e Een Autosampler autosampler is een soort robot die de monsters injecteert in de gaschromatograaf. Een autosampler heeft als voordeel dat deze veel nauwkeuriger is dan een handmatige injectie, met een veel betere herhaalbaarheid (Scott, 1998). Deel 3: Materiaal en methoden 37 f Recorder De elektrische signalen afkomstig van de detector (FID of MS) worden naar een computer gestuurd die de signalen omzet in piekjes (chromatogram) of in een massaspectrum. Via een programma kunnen chromatogrammen en massaspectra geïdentificeerd worden. Om de chromatogrammen te identificeren werd gebruik gemaakt van het programma ‘HP ChemStation’. Er werd een bepaalde methode toegepast die specifieke FAME’s analyseren (tabel 3-III). De FAME’s die zijn weergegeven in de tabel worden bepaald in melk die via de GC worden bepaald. Onbekende vetzuren worden ook geïdentificeerd maar worden als onbekend weergegeven. Tabel 3-III: De FAME’s die via GC-FID kunnen bepaald worden (Incublong, Fievez) C10 iso C10ante C10:0 C11:0 C12iso C12ante C12:0 C13iso C13ante C13:0 C14iso C14ante C14:0 C15iso C15ante C14:1 C15:0 C16iso C15.1 C16ante PrA Deel 3: Materiaal en methoden FAME's C16:0 C16:1t C17iso C16:1c C17ante PhA PhA2 C17:0 C18iso C17:1 C18ante C18:0 C18:1t6-8 C18:1t9 C18:1t12-14 C18:1t10+11 C18:1c9 C18:1c11 C18:1c12 C18:1c13 C18:1c14+t16 C18:1c15 C19:0 C18:2t9c12 C18:2t11c15 C18:2n-6 C20:0 C18:3n-6 C18:3n-3 CLAc9t11 CLAct11,13 CLAt10c12 ccCLA ttCLA C18:3c9t11c15 C20:2n-6 C20:3n-6 C20:4n-6 C20:5n-3 C22:4n-6 C22:5n-3 C22:6n-3 38 3.2.5 Aangepaste methode De methode van Teri C. Balser werd grotendeels overgenomen (zie tabel 3-II), maar enkele stappen werden anders uitgevoerd. Dit wordt weergegeven in tabel 3IV. De veranderingen worden in vetgedrukt weergegeven. Tabel 3-IV: De aangepaste methode 1. Voorbereiden van bodem en glaswerk Het glaswerk (proefbuizen, extractiebuizen, bekers,..) spoelen met hexaan Bodem invriezen na staalname Bodem zo vlug mogelijk vriesdrogen 1e aanpassing 2. Bodem wordt gehomogeniseerd door te malen Vetzuren extraheren uit de bodem 4 g bodem afwegen in extractiebuizen Figuur 3-VII: 4 g bodem afgewogen in extractiebuizen 3.6 ml P-buffer (pH 7) toevoegen in extractiebuizen 4 ml chloroform (CHCl3) 8 ml methanol (MeOH) Figuur 3-VIII: P-buffer, CHCl3 en MeOH toevoegen in extractiebuizen 1 uur schudden (horizontaal, in het donker) Centrifugeren: 30 min, 2000 toeren/min De vloeistof decanteren in nieuwe extractiebuizen Deel 3: Materiaal en methoden 39 3.6 ml P-buffer en 4 ml CHCl3 toevoegen 1 min schudden en 1 ‘s nachts laten staan in het donker Scheiding van twee lagen is goed te zien na één nacht Figuur 3-IX: De scheiding van de waterlaag en chloroformlaag 2e aanpassing De onderste laag (CHCl3) met een spuit opzuigen en in proefbuisjes overbrengen Figuur 3-X: De chloroformlaag met een spuit in proefbuisjes overbrengen 3 ml CHCl3 toevoegen aan de extractiebuizen Centrifugeren: 30 min, 2000 toeren/min Onderste laag met spuit in proefbuisjes brengen De CHCl3 droogdampen met N2-gas Figuur 3-XI: N2-bad Na deze stap kunnen de proefbuisjes bewaard worden in het donker en in de diepvries Deel 3: Materiaal en methoden 40 3e aanpassing 3. Overbrengen naar andere buisjes deze stap werd niet uitgevoerd 4. Scheiden van de lipiden (SPE) De silica SPE-cartridges plaatsen op de vacuümtank Conditioneren van de cartridges door 3 ml CHCl3 toe te voegen Overbrengen van de lipiden naar de cartridges: 250µl CHCl3 in de proefbuisjes brengen, vortexen en overbrengen naar cartridges met pasteurpipet. Deze stappen nog 3 keer herhalen Figuur 3-XII: De lipiden overbrengen naar de SPE-cartridges Daarna 5 ml CHCl3 in cartridges brengen ;de neutrale lipiden worden op deze manier geïsoleerd Tien ml aceton brengen in de cartridges om zo de glycolipiden te isoleren De naalden van de cartridges schoonmaken met MeOH Deel 3: Materiaal en methoden 41 Proefbuisjes worden in de vacuümtank gebracht om zo de fosfolipiden op te vangen voor verdere analyse Vijf ml MeOH wordt in de cartridges gebracht Figuur 3-XIII: Opvangen van fosfolipidenfracties in proefbuisjes De proefbuisjes met de fosfolipiden worden met N2-gas drooggedampt De proefbuisjes kunnen eventueel bewaard worden voor verdere analyse in het donker en in de diepvries 4e aanpassing 5. Vetzuren omvormen naar methylesters De drooggedampte lipiden worden in 1 ml 1:1 MeOH:tolueen en 1 ml methanolic KOH opgelost Vortexen De proefbuisjes incuberen op 35°C gedurende 15 min in oven De stalen op kamertemperatuur brengen 2 ml 4:1 hexaan:CHCl3 toevoegen, vortexen De stalen neutraliseren met 1ml 1M zwavelzuur (pH controleren!) 2ml milliQ ultrapuur water toevoegen, vortexen Centrifugeren op 2000 tpm gedurende 5 min om de fasen te scheiden De bovenste (hexaan) laag in tipbuisjes brengen met pasteurpipet Deel 3: Materiaal en methoden 42 Figuur 3-XIV: De hexaanlaag in tipbuisjes brengen Twee ml 4:1 hexaan:CHCl3 toevoegen, vortexen Centrifugeren op 2000 tpm gedurende 5 min De hexaanlaag in de tipbuisjes brengen Deze drie laatste stappen nogmaals herhalen De hexaan droogdampen met N2-gas Eventueel kunnen de stalen in het donker en in de diepvries bewaard worden 5e aanpassing 6. Overbrengen naar GC-vials met inserts 0.3 ml hexaan met methylester C19:0 (als interne standaard) in tipbuisjes met drooggedampte lipiden brengen Vortexen (zodat alle vetzuren opgelost worden in de standaard) De 0.3 ml overbrengen in de inserts van de GC-vials De GC-vials kunnen bewaard worden in de diepvries voor verdere analyse in de GC-MS of GC-FID (GC 6890 Agilent Technologies) a Reagentia De reagentia gebruikt in de ‘aangepaste methode’ zijn dezelfde als gebruikt in de oorspronkelijke methode. Zie 3.2.2 a voor de bereiding van de reagentia. Deel 3: Materiaal en methoden 43 4 Resultaten en bespreking 4.1 Inleiding In dit hoofdstuk wordt besproken hoe de PLFA-methode op punt werd gesteld. Hetzelfde bodemstaal werd telkens opnieuw geanalyseerd, waarbij stappen anders uitgevoerd of zelfs weggelaten werden. Het bodemstaal werd in juni 2005 genomen. Via de chromatogrammen en berekening van vetgehaltes werd nagegaan of de aangepaste methode dezelfde resultaten oplevert. In tabel 3-IV wordt weergegeven welke aanpassingen zijn aangebracht aan de ‘oorspronkelijke methode’ (tabel 3-II). De methode werd geoptimaliseerd naargelang bepaalde aanpassingen werden uitgevoerd. Gedurende de optimalisatie van de methode werd telkens uitgegaan van de ‘oorspronkelijke methode’ (tabel 3II). In tabel 4-I wordt weergegeven welke aanpassingen werden uitgevoerd bij welke experimenten: • Experiment ‘volledige methode’: enkel 1e en 5e aanpassingen werden uitgevoerd, de stap ‘scheiden van de lipiden’ zoals beschreven in tabel 3-IV werd niet uitgevoerd. • Experiment ‘vetzuren extraheren uit de bodem’: 1e, 2e en 5e aanpassingen werden uitgevoerd. De stap ‘scheiden van de lipiden’ zoals beschreven in tabel 3-IV werd niet uitgevoerd. • Experiment: ‘overbrengen naar andere buisjes’: 1e, 3e en 5e aanpassingen werden uitgevoerd. De stap ‘scheiden van de lipiden’ zoals beschreven in tabel 3-IV werd niet uigevoerd. • Experiment: ‘scheiden van de lipiden’: 1e en 5e aanpassingen werden uitgevoerd en bij dit experiment werd de stap ‘scheiden van de lipiden’ wel uitgevoerd om te controleren of de scheiding goed verloopt. • Experiment: ‘vetzuren omvormen naar methylesters’:1e, 4e en 5e aanpassingen werden uitgevoerd en ook hier werd de stap ‘scheiden van de lipiden’ niet uitgevoerd. Deel 4: Resultaten en bespreking 44 Tabel 4-I: Overzicht van welke aanpassingen bij welke experimenten werden uitgevoerd experiment Aanp.* Aanp Aanp. Aanp. Aanp. 1 .2 3 4 5 Volledige methode X Vetzuren extraheren uit de bodem X Overbrengen naar andere buisjes X Scheiden van de lipiden X Vetzuren omvormen naar X X X X X X X X X methylesters * Aanp.: aanpassing 4.2 Optimalisatie van de PLFA-methode 4.2.1 Experiment ‘de volledige methode’ a Aanpassingen in de methode In dit experiment werd uitgegaan van de ‘oorspronkelijke methode’ (tabel 3-II) waarbij twee aanpassingen werden uitgevoerd nl. 1e en 5e aanpassingen die beschreven zijn in tabel 3-IV. In dit experiment werd de stap ‘scheiden van de lipiden’ niet uitgevoerd. Chromatogrammen en vetgehaltes van de andere experimenten worden telkens met de chromatogrammen en vetgehaltes van het experiment ‘de volledige methode’ vergeleken. Deel 4: Resultaten en bespreking 45 b Chromatogrammen In figuur 4-I worden de chromatogrammen weergegeven van de drie herhalingen waarbij het experiment ‘de volledige methode’ op het bodemstaal werd uitgevoerd. De GC-FID detecteert bepaalde FAME’s (tabel 3-III) in het bodemstaal en deze worden dan door een chromatogram weergegeven. De analyse duurt ongeveer 80 minuten. Figuur 4-I: Chromatogrammen van de drie herhalingen van het experiment ‘de volledige methode’ In bijlage 1 worden de verschillende FAME’s weergegeven met de oppervlaktes en hun retentietijd. De verhouding van de oppervlakte van de individuele FAME en de totale oppervlakte van de FAME’s (zonder de oppervlakte van interne standaard C19:0) worden ook in de tabel van bijlage 1 weergegeven. Zo kunnen de verschillende FAME’s vergeleken worden. De FAME’s die in dezelfde verhouding voorkomen in het bodemstaal worden gemarkeerd. Deel 4: Resultaten en bespreking 46 Berekening vetgehalte In tabel 4-II wordt de berekening van de vetgehaltes bij de ‘volledige methode’ weergegeven. Om het vetgehalte te berekenen wordt gebruik gemaakt van een interne standaard nl. C19:0. Dit is een methylester die grote gelijkenissen heeft met de methylesters van de vetzuren die in het bodemstaal worden bepaald. De bedoeling van een interne standaard is vooral te achterhalen of tijdens de analyse iets fout loopt. Eerst wordt de oppervlakte van de FAME’s in het bodemstaal bepaald door de oppervlakte van alle piekjes te verminderen met de oppervlakte van de interne standaard (C19:0). Deze oppervlakte wordt vervolgens gedeeld door de oppervlakte van C19:0. Om het vetgehalte in het bodemstaal te berekenen wordt dit laatste getal vermenigvuldigd met de concentratie (in mg/ml) van de interne standaard die werd toegevoegd aan het bodemstaal. Om het vetgehalte per gram bodemstaal te weten, moet het vetgehalte van het bodemstaal nog gedeeld worden door het gewicht van het bodemmonster. De gemiddelden worden telkens met standaarddeviatie berekend. Tabel 4-II:Berekening vetgehaltes van het experiment ‘de volledige methode’ Opp. FAME's (-) Opp. C19:0 (-) Opp. FAME's in bodemstaal (-) Chromatogram 1 Chromatogram 2 Chromatogram 3 1822,3 2532,21 2286,08 1098,20 1507,30 1318,00 724,10 1024,91 968,08 Opp. FAME's in bodemstaal/ opp. C19:0 (-) 0,66 0,68 0,73 C 19:0 (mg/ml) 1,71 1,71 1,71 Staal (mg/4g) 1,13 1,16 1,26 Afgewogen bodem (g) 4,05 4,08 4,18 Vetgehalte (mg/g) 0,28 0,28 0,30 Deel 4: Resultaten en bespreking 47 c Bespreking Bij de drie herhalingen wordt een vetgehalte van 0.290 ± 0.013 mg/g bodem in het bodemstaal gevonden (tabel 4-II). De chromatogrammen van de drie herhalingen hebben een goede scheiding van de FAME’s en zijn gelijkaardig (figuur4-I). In bijlage 1 worden de oppervlaktes en de retentietijden van de afzonderlijke FAME’s weergegeven. Chromatogram 1 en chromatogram 3 komen het best overeen wat betreft het voorkomen van FAME’s en de hoeveelheid (zie gemarkeerd in bijlage 1). De volgende FAME’s komen in dezelfde verhoudingen voor in de drie herhalingen: C12:0, C14iso, C14:0, C15iso, C15ante, C15:0, C16iso, C16:0, C16:1c, C17:0, C18:0, C18:1t9, C18:1c9, C18:2n-6, C18:3n-6, C18:3n-3 en C20:4n-6. Aangezien de vetgehaltes en chromatogrammen gelijkaardig zijn, kan besloten worden dat de methode goede resultaten oplevert. 4.2.2 Experiment ‘Vetzuren extraheren uit de bodem’ a Aanpassingen in de methode (2e aanpassing) In tabel 4-III wordt een vergelijking weergegeven van de ‘oorspronkelijke methode’ van Teri C. Balser (tabel 3-II) en de ‘aangepaste methode’ (tabel 3-IV). Er wordt telkens in vet weergegeven wat aan de extractiemethode veranderd is. Hier werden de lipiden niet gescheiden om te kunnen vergelijken met de chromatogrammen en vetgehaltes van het experiment ‘de volledige methode’. In tabel 4-I werd weergegeven welke aanpassingen werden uitgevoerd in dit experiment nl. de 1e, 2e en 5e aanpassingen. Via deze stap heeft men er een betere controle over dat geen waterige oplossing overgebracht werd in de andere buisjes of dat vetzuren verloren gingen. Watermoleculen breken de dubbele bindingen van vetzuren af. Om er zeker van te zijn dat alle vetzuren overgebracht zijn in de proefbuisjes werd extra chloroform toegevoegd aan de extractiebuizen, gewassen en afgezogen in kleinere proefbuisjes. Deel 4: Resultaten en bespreking 48 Tabel 4-III: Vetzuren extraheren uit de bodem Oorspronkelijke methode Aangepaste methode 4 g bodem afwegen in extractiebuizen 4 g bodem afwegen in extractiebuizen 3.6 3.6 ml P-buffer toevoegen in ml P-buffer toevoegen in extractiebuizen extractiebuizen 4 ml chloroform (CHCl3) 4 ml chloroform (CHCl3) 8 ml methanol (MeOH) 8 ml methanol (MeOH) 1 uur schudden (horizontaal, in het 1 uur schudden (horizontaal, in het donker) donker) Centrifugeren: 30 min, 2000 Centrifugeren: 30 min, 2000 toeren/min toeren/min De vloeistof decanteren in nieuwe De vloeistof extractiebuizen extractiebuizen 3.6 ml P-buffer en 4 ml CHCl3 3.6 toevoegen toevoegen 1 min schudden en ‘s nachts laten 1 min schudden en 1 ‘s nachts laten staan in het donker staan in het donker Scheiding van twee lagen is goed te Scheiding van twee lagen is goed te zien na één nacht zien na één nacht ml decanteren P-buffer en ml nieuwe CHCl3 2e aanpassing De bovenste laag afzuigen met een waterstraalpomp 4 in De onderste laag (CHCl3) met een spuit opzuigen en in proefbuisjes overbrengen 3 ml CHCl3 toevoegen aan de extractiebuizen Centrifugeren: 30 min, 2000 toeren/min De onderste laag (CHCl3) wordt Onderste laag met spuit in bewaard proefbuisjes brengen De CHCl3 droogdampen met N2-gas De CHCl3 droogdampen met N2-gas Na deze stap kunnen de proefbuisjes Na deze stap kunnen de proefbuisjes bewaard worden in het donker en in bewaard worden in het donker en in de de diepvries diepvries Deel 4: Resultaten en bespreking 49 b Chromatogrammen De chromatogrammen van de twee herhalingen van het experiment ‘vetzuren extraheren uit de bodem’ worden weergegeven in figuur 4-II. Voor bespreking van de chromatogrammen wordt verwezen naar 4.2.2d. Figuur 4-II: Chromatogrammen van de twee herhalingen van het experiment ‘vetzuren extraheren uit de bodem’ De oppervlaktes en de retentietijden van de FAME’s zijn weergegeven in een tabel in bijlage 2.De verhoudingen van de individuele FAME’s met de totale oppervlakte van de FAME’s zijn ook weergegeven in bijlage 2. Deel 4: Resultaten en bespreking 50 c Berekening vetgehalte In tabel 4-IV worden de vetgehaltes van de twee herhalingen van het experiment ‘vetzuren extraheren uit de bodem’ weergegeven. De berekening van het vetgehalte in bodem werd in ‘4.2.1 c Berekening vetgehalte’ al besproken. Tabel 4-IV: Berekening vetgehaltes van het experiment ‘vetzuren extraheren uit de bodem’ Chromatogram 1 1777,63 1578,40 199,23 Chromatogram 2 2463,76 2213,60 250,16 Opp. FAME's in bodemstaal/ opp. C19:0 (-) 0,13 0,11 C 19:0 (mg/ml) 5,30 5,30 Staal (mg/4g) 0,67 0,60 Afgewogen bodem (g) 4,07 4,06 Vetgehalte (mg/g) 0,16 0,15 Opp. FAME's (-) Opp. C19:0 (-) Opp. FAME's in bodemstaal (-) d Bespreking De twee herhalingen hebben een gemiddelde vetgehalte van 0.155 ± 0.010 mg/g bodem (tabel 4-IV). Bij deze stap werden de lipiden niet gescheiden om zo te kunnen vergelijken met de vetgehaltes van het experiment ‘de volledige methode’ (tabel 4-II), vergeleken met deze vetgehaltes zijn ze significant verschillend. Het vetgehalte is met de helft verminderd. Dit zorgt voor een lagere respons zodat het moeilijker te detecteren is. De chromatogrammen van de twee herhalingen hebben gelijkenissen (figuur 4-II). De volgende FAME’s werden in dezelfde verhouding teruggevonden in de twee herhalingen: C14:0, C15iso, C15ante, C16:0, C16:1c, C18:1c9, C18:3n-6 en C18:3n-3. Deze FAME’s werden ook in de drie herhalingen teruggevonden bij het experiment ‘de volledige methode’ werd uitgevoerd. De aanpassingen in deze stap zorgen voor geen grote verschillen zodat kan besloten worden dat deze stap mag uitgevoerd worden zoals vermeld in tabel 4-II. De types vetzuren die voorkomen zijn dezelfde, maar in hoeveelheid verschillen ze. Het hangt dus af van de toepassing of de aanpassing mag uitgevoerd worden of niet. Deel 4: Resultaten en bespreking 51 4.2.3 Experiment ‘Overbrengen naar andere buisjes’ a Aanpassingen in de methode (3e aanpassing) Deze stap zorgt er voor geen onzuiverheden mee te hebben in de proefbuisjes voor verdere extractie en analyse. Het overbrengen naar andere buisjes vraagt veel tijd en bijgevolg werd nagegaan of deze stap niet overbodig is. Tijdens het overbrengen kunnen ook vetzuren verloren gaan doordat ze in de proefbuisjes achterblijven. Deze stap heeft wel als voordeel dat eventuele watermoleculen in het staal kunnen verwijderd worden. Zoals eerder vermeld breken watermoleculen de dubbele bindingen van vetzuren af. Als de CHCl3-laag in het proefbuisje troebel is, wil dit zeggen dat water werd meegenomen. Dit kan men oplossen door MeOH toe te voegen totdat de oplossing terug helder is. De chromatogrammen en vetgehaltes werden bekomen door de ‘aangepaste methode’ toe te passen. De 3e aanpassing is dus de stap ’overbrengen naar andere buisjes’ weglaten. Hierbij werden de 2e aanpassing en 4e aanpassing niet uitgevoerd. De 1e aanpassing en 5e aanpassing werden wel uitgevoerd zoals beschreven in tabel 3-IV. Deel 4: Resultaten en bespreking 52 b Chromatogrammen De figuur 4-III stelt de drie chromatogrammen voor om aan te tonen dat de stap ‘overbrengen naar andere buisjes’ eventueel kan weggelaten worden. Figuur 4-III: Chromatogrammen van de drie herhalingen van het experiment ‘overbrengen naar andere buisjes’ Deel 4: Resultaten en bespreking 53 c Berekening vetgehalte In tabel 4-V wordt de berekening weergegeven van de vetgehaltes in de bodemstalen waarbij de stap ‘overbrengen naar andere buisjes’ werd weggelaten. Tabel 4-V: Berekening vetgehaltes van het experiment ‘overbrengen naar andere buisjes’ Opp. FAME's (-) Opp. C19:0 (-) Opp. FAME's in bodemstaal (-) Chromatogram 1 Chromatogram 2 Chromatogram 3 3225,35 2767,29 4765,70 2835,70 2447,00 4127,40 389,65 320,29 638,30 Opp. FAME's in bodemstaal/ opp. C19:0 (-) 0,14 0,13 0,15 C 19:0 (mg/ml) 5,30 5,30 5,28 Staal (mg/4g) 0,73 0,69 0,82 Afgewogen bodem (g) 4,02 4,07 4,03 Vetgehalte (mg/g) 0,18 0,17 0,20 d Bespreking De vetgehaltes van de drie herhalingen een gemiddelde van 0.183 ± 0.018 mg/g bodem (tabel 4-V). Het vetgehalte berekend bij het experiment ‘de volledige methode’ ligt hoger (tabel 4-I) en is dus significant verschillend. In de drie herhalingen worden de volgende FAME’s gevonden die in verhouding gelijk zijn (bijlage 3): C15iso, C15ante, C15:0, C16:0, C16:1c en C18:1t9. Deze FAME’s zijn ook terug te vinden in de drie herhalingen waar de ‘volledige methode’ werd uitgevoerd (bijlage 1). De scheiding van de FAME’s is goed (figuur 4-III). Weinig onzuiverheden werden gedetecteerd door de GC-FID. De PLFA-methode is voornamelijk bedoeld om het aantal vetzuren te bepalen en niets zozeer de hoeveelheid. Hier kan men uit concluderen dat deze stap eventueel kan worden weggelaten. Deel 4: Resultaten en bespreking 54 4.2.4 Experiment ‘scheiden van de lipiden’ a Aanpassingen in de methode In dit experiment werden enkel de 1e en 5e aanpassing uitgevoerd zoals beschreven in tabel 4-IV. Hier werd enkel onderzocht of de stap ‘scheiding van de lipiden’ beschreven in tabel 3-II goed verloopt. De scheiding van de lipiden gebeurt door SPE (zie deel 3). De lipiden worden gescheiden in neutrale, glyco- en fosfolipidenfracties. De vorige stappen werden telkens uitgevoerd zonder de scheiding en de FAME’s van de totale lipiden werden telkens bepaald door de GCFID. In dit experiment werden de vetgehaltes van de neutrale, glyco- en fosfolipidenfracties berekend en nagegaan of de som overeenkomt met vetgehaltes van het experiment ‘de volledige methode’. In verdere PLFA-analyses zullen telkens de fracties van de neutrale en glycolipiden opgevangen worden in een beker en niet verder worden bewaard. Men is in deze studie enkel geïnteresseerd in de fosfolipidenfracties. Deel 4: Resultaten en bespreking 55 b Chromatogrammen De drie herhalingen van het bodemstaal werden telkens in fosfo-, glyco- en neutrale lipidenfracties gescheiden. De chromatogrammen van de fosfo-, glyco- en neutrale lipidenfracties worden respectievelijk weergegeven in figuren 4-IV, 4-V en 4-VI. In bijlagen 4, 5 en 6 worden de oppervlaktes en retentietijden van respectievelijk de fosfo-, glyco- en neutrale lipidenfracties weergegeven. Fosfolipidenfracties Figuur 4-IV: Chromatogrammen van de drie herhalingen van de fosfolipidenfractie Deel 4: Resultaten en bespreking 56 Glycolipidenfracties Figuur 4-V: Chromatogrammen van de drie herhalingen van de glycolipidenfractie Neutrale lipidenfracties Figuur 4-VI: Chromatogrammen van de drie herhalingen van de neutrale lipidenfractie Deel 4: Resultaten en bespreking 57 c Berekening vetgehalte Aan de hand van de bovenstaande chromatogrammen worden voor de drie soorten lipidenfracties de vetgehaltes van de drie herhalingen berekend. In tabel 4-VI wordt de berekening van de vetgehaltes van de fosfolipidenfractie weergegeven, in tabel 4-VII voor de glycolipidenfractie en voor de neutrale lipidenfractie wordt de berekening weergegeven in tabel 4-VIII. Fosfolipidenfractie Tabel 4-VI: Berekening vetgehaltes van de fosfolipidenfractie Opp. FAME's (-) Opp. C19:0 (-) Opp. FAME's in bodemstaal (-) Chromatogram 1 Chromatogram 2 Chromatogram 3 684,87 479,62 816,15 527,00 368,70 623,20 157,87 110,92 192,95 Opp. FAME's in bodemstaal/ opp. C19:0 (-) 0,30 0,30 0,31 C 19:0 (mg/ml) 1,60 1,60 1,60 Staal (mg/4g) 0,48 0,48 0,50 Afgewogen bodem (g) 4,02 4,14 4,00 Vetgehalte (mg/g) 0,12 0,12 0,12 Glycolipidenfractie Tabel 4-VII: Berekening vetgehaltes van de glycolipidenfractie Opp. FAME's (-) Opp. C19:0 (-) Opp. FAME's in bodemstaal (-) Chromatogram 1 Chromatogram 2 Chromatogram 3 4131,87 3834,84 3899,02 3886,40 3581,10 3718,70 245,47 253,74 180,32 Opp. FAME's in bodemstaal/ opp. C19:0 (-) 0,06 0,07 0,05 C 19:0 (mg/ml) 5,28 5,28 5,28 Staal (mg/4g) 0,33 0,37 0,26 Afgewogen bodem (g) 4,19 4,00 3,99 Vetgehalte (mg/g) 0,08 0,09 0,06 Deel 4: Resultaten en bespreking 58 Neutrale lipidenfractie Tabel 4-VIII: Berekening vetgehaltes van de neutrale lipidenfractie Chromatogram 1 Chromatogram 2 Chromatogram 3 4376,34 2183,73 4133,95 3804,30 1969,60 3744,00 572,04 214,13 389,95 Opp. FAME's (-) Opp. C19:0 (-) Opp. FAME's in bodemstaal (-) Opp. FAME's in bodemstaal/ opp. C19:0 (-) 0,15 0,11 0,10 C 19:0 (mg/ml) 5,28 5,28 5,28 Staal (mg/4g) 0,79 0,57 0,55 Afgewogen bodem (g) 4,19 4,00 3,99 Vetgehalte (mg/g) 0,19 0,14 0,14 Som Tabel 4-IX is de som van de vetgehaltes van de fosfo-, glyco- en neutrale lipidenfracties weergegeven. Op deze manier wordt nagegaan of de scheiding goed verlopen is. Als de som van de vetgehaltes van de drie lipidenfracties gelijk is aan het vetgehalte dat eerder werd bekomen, kan besloten worden dat de scheiding goed verlopen is. In 4.2.4 d worden de resultaten besproken. Tabel 4-IX: De som van de vetgehaltes van de fosfo-, glyco- en neutrale lipidenfracties fosfolipidenfractie glycolipidenfractie neutrale lipidenfractie bodemstaal 1 0.12 0.08 0.19 bodemstaal 2 0.12 0.09 0.14 bodemstaal 3 0.12 0.06 0.14 Deel 4: Resultaten en bespreking som 0.39 0.35 0.32 59 d Bespreking Bij de fosfolipiden werd er telkens een vetgehalte van 0.12 ± 0.000 mg/g bodem gevonden (tabel 4-VI). De chromatogrammen van de fosfolipiden zien er gelijkaardig uit (figuur 4-IV). In bijlage 4 worden de FAME’s met gelijke verhoudingen gemarkeerd nl. C12ante, C14:0, C15iso, C15ante, C16iso, C16:0, C16:1c, C17:0, C18:1t11, C18:1c9 en C18:3n-3. Behalve C12ante werden de andere FAME’s in vorige chromatogrammen teruggevonden. De glycolipiden hebben een gemiddeld vetgehalte van 0.076 ± 0.017 mg/g bodem (tabel 4-VII). Er is enkel 1 FAME die in dezelfde verhouding voorkomt in de drie herhalingen nl. C12:0 (bijlage 5). De chromatogrammen zien er in het algemeen gelijkaardig uit (figuur 4-V). Het gemiddelde vetgehalte van de neutrale lipiden is 0.157 ± 0.033 mg/g bodem (tabel 4-VIII). De chromatogrammen van deze lipiden geven bij de drie bodemstalen dezelfde types vetzuren weer (figuur 4-VI). Ook bij de neutrale lipidenfractie komt er enkel 1 FAME nl. C13iso voor die dezelfde verhouding heeft bij chromatogram 2 en chromatogram 3 (bijlage 6). In tabel 4-IX wordt de som van de vetgehaltes van de drie lipiden weergegeven. Het gemiddelde van de som is 0.343 ± 0.041 mg/g bodem. Het gemiddelde is niet significant verschillend aan het gemiddelde vetgehalte bij de ‘volledige methode’ (tabel 4-I) nl. 0.290 ± 0.013 mg/g bodem. De scheiding van de verschillende lipidenfracties verloopt goed. De fosfolipidenfracties bestaan uit FAME’s die eerder werden teruggevonden en de vetgehaltes zijn niet significant verschillend. Aangezien men enkel geïnteresseerd is in de fosfolipidenfracties, zijn de glyco- en neutrale lipidenfracties niet van groot belang. Deel 4: Resultaten en bespreking 60 4.2.5 Experiment ‘vetzuren omvormen naar methylesters’ Aanpassingen in de methode (4e aanpassing) a In de stap ‘ vetzuren omvormen naar methylesters’ (tabel 4-X) werden tipbuisjes gebruikt i.p.v. GC-vials. Het extra toevoegen van hexaan:chloroform (4:1) is om zekerheid te verkrijgen dat alle methylesters werden overgebracht in de tipbuisjes. De methode beschreven in tabel 3-IV werd uitgevoerd, maar de 2e aanpassing en 3e aanpassing werden uitgevoerd zoals beschreven in tabel 3-II. De stap ‘scheiden van lipiden’ werd ook hier niet uitgevoerd om de chromatogrammen en vetgehaltes te kunnen vergelijken met deze van het experiment ‘de volledige methode’. Tabel 4-X: Vetzuren omvormen naar methylesters Oorspronkelijke methode Aangepaste methode De drooggedampte lipiden worden in 1 De drooggedampte lipiden worden in 1 ml ml 1:1 MeOH:tolueen en 1 ml 1:1 MeOH:tolueen en 1 ml methanolic KOH opgelost methanolic KOH opgelost Vortexen Vortexen De proefbuisjes incuberen op 35°C De proefbuisjes incuberen op 35°C gedurende 15 min gedurende 15 min in oven De stalen op kamertemperatuur De stalen op kamertemperatuur brengen brengen 2 ml 4:1 hexaan:CHCl3 toevoegen, 2 ml 4:1 hexaan:CHCl3 toevoegen, vortexen vortexen De stalen neutraliseren met 1ml 1M De stalen neutraliseren met 1ml 1M zwavelzuur (pH controleren!) zwavelzuur (pH controleren!) 2 ml milliQ ultrapuur water toevoegen, 2ml milliQ ultrapuur water toevoegen, vortexen vortexen Centrifugeren op 2000 tpm gedurende Centrifugeren op 2000 tpm gedurende 5 min om de fasen te scheiden 5 min om de fasen te scheiden De bovenste (hexaan) laag in 4 ml De amber tipbuisjes GC-vials met schroefdop bovenste (hexaan) laag brengen in met brengen pasteurpipet Twee ml 4:1 hexaan:CHCl3 toevoegen, Twee ml 4:1 hexaan:CHCl3 toevoegen, Deel 4: Resultaten en bespreking 61 vortexen vortexen Centrifugeren op 2000 tpm gedurende Centrifugeren op 2000 tpm gedurende 5 min 5 min De hexaanlaag in de 4 ml GC-vials De brengen brengen hexaanlaag in de tipbuisjes 4e aanpassing Deze drie laatste stappen nogmaals herhalen De hexaan droogdampen met N2-gas De hexaan droogdampen met N2-gas Eventueel kunnen de stalen in het Eventueel kunnen de stalen in het donker en in de diepvries bewaard donker en in de diepvries bewaard worden worden b Chromatogrammen In figuur 4-VII zijn de chromatogrammen weergegeven van de drie herhalingen van het experiment ‘vetzuren omvormen naar methylesters’. Voor verdere bespreking wordt verwezen naar puntje d: bespreking. In bijlage 7 zijn de oppervlaktes en retentietijden van de verschillende FAME’s terug te vinden. Figuur 4-VII:Chromatogrammen van de drie herhalingen van het experiment ‘ vetzuren omvormen naar methylesters’ Deel 4: Resultaten en bespreking 62 c Berekening vetgehalte De berekening van de vetgehaltes van de drie herhalingen van het eperiment ‘vetzuren omvormen naar methylesters’ wordt weergegeven in tabel 4-XI. De resultaten worden verder in 4.2.5 d besproken. Tabel 4-XI: Berekening vetgehaltes van het experiment ‘vetzuren omvormen naar methylesters’ Opp. FAME's (-) Opp. C19:0 (-) Opp. FAME's in bodemstaal (-) Chromatogram 1 Chromatogram 2 Chromatogram 3 2670,50 251,13 403,77 2309,40 204,40 338,50 361,10 46,73 65,27 Opp. FAME's in bodemstaal/ opp. C19:0 (-) 0,16 0,23 0,19 C 19:0 (mg/ml) 5,28 5,30 5,30 Staal (mg/4g) 0,82 1,21 1,02 Afgewogen bodem (g) 4,08 4,00 4,08 Vetgehalte (mg/g) 0,20 0,30 0,25 d Bespreking De vetgehaltes en chromatogrammen bij de drie bodemstalen verschillen (tabel 4-XI en figuur 4-VII). Het vetgehalte en chromatogram van het eerste bodemstaal verschilt van de andere twee bodemstalen. Bij de twee laatste bodemstalen werden minder FAME’s gedetecteerd door de GC-FID (figuur 4-XII). Een verklaring kan zijn dat niet alle vetzuren gemethyleerd werden. De grootste gelijkenissen van de soorten FAME’s worden gevonden in de tweede en derde herhaling (bijlage 7). Volgende FAME’s komen in dezelfde verhouding voor: C12:0, C16:1c, C18:1t11 en C18:1c9. Deze FAME’s werden eerder al teruggevonden. Het gemiddelde vetgehalte bedraagt 0.250 ± 0.058 mg/g bodem en is niet significant verschillend met het gemiddelde vetgehalte van het experiment ‘de volledige methode: 0.290 ± 0.013 mg/g bodem. Deel 4: Resultaten en bespreking 63 In tabel 4-XI ziet men dat de oppervlaktegroottes van C19:0 bij de drie chromatogrammen sterk verschillen van elkaar. Dit kan verklaard worden doordat een luchtbel werd opgezogen door de injector van de GC-FID, zodat alle oppervlaktes van de vetzuren (bij chromatogrammen 2 en 3) veel lager liggen dan bij chromatogram 1. Een andere verklaring kan zijn dat water de dubbele bindingen van de FAME’s heeft aangevallen. In de stap ‘vetzuren omvormen naar methylesters’ wordt milliQ ultrapuur water gebruikt voor de methylatie (tabel 4-X) en het kan dus zijn dat de fasen niet genoeg gescheiden waren zodat het water de dubbele bindingen van de vetzuren kan afgebroken hebben. 4.2.6 De analyse door de GC-FID a Bespreking Tijdens de analyse door de GC-FID spelen veel factoren een rol voor het bekomen van bepaalde chromatogrammen. Een factor kan zijn dat luchtbelletjes werden geïnjecteerd in de kolom, zodat te kleine concentraties van vetzuren werden gedetecteerd. De luchtbelletjes in de inserts van de GC-vials kunnen voorkomen worden door tegen de GC-vials te tikken zodat de eventuele luchtbelletjes naar boven worden gebracht. De stalen werden nooit direct na de extractieprocedure door de GC-FID bepaald. De GC-vials werden bewaard in de diepvries en ongeveer twee weken tot een maand later door GC-FID geanalyseerd. Dit kan ook een reden zijn dat kleinere concentraties van FAME’s werden gedecteerd doordat deze vervluchtigen. Er wordt dus aangeraden direct na de extractieprocedure de stalen in de GC-FID te injecteren. Deel 4: Resultaten en bespreking 64 5 Besluit In dit eindwerk werd de optimalisatie van de PLFA-methode besproken om deze te kunnen toepassen op bodem behandeld met verschillende soorten bemesting. Hier werd gebruik gemaakt van de eenvoudige PLFA-methode. Dit wil zeggen dat de PLFA’s niet verder verdeeld worden in subfracties, wat wel het geval is bij de uitgebreide methode. Het doel van de PLFA-methode is inzicht te krijgen in veranderingen van microbiële populaties (bacteriën en schimmels) ten gevolge van de verschillen in bemesting. PLFA’s zijn biomerkers voor bacteriën en schimmels. Aan de hand van deze biomerkers kan bepaald worden welke verschuivingen binnen microbiële populaties optreden bij bepaalde behandelingen (de bemesting). De optimalisatie van de PLFA-methode verliep moeizaam. De extractieprocedure vraagt veel tijd (ongeveer drie dagen) en de verschillende stappen moeten nauwkeurig opgevolgd worden. Het voordeel is wel dat vele stalen (ongeveer 40) in één keer kunnen geëxtraheerd en daarna geanalyseerd worden (met GC-FID of GCMS). Aan de hand van de chromatogrammen en de vetgehaltes werd de methode op punt gesteld. Bepaalde stappen in de extractieprocedure werden anders uitgevoerd of zelfs weggelaten. Door na te gaan of dezelfde FAME’s bij de verschillende herhalingen terugkwamen en of de berekende vetgehaltes constant bleven, werd nagegaan of bepaalde stappen op een verantwoorde manier kunnen toegepast worden. Er werd ook onderzocht of bij aanpassingen van bepaalde stappen dezelfde FAME’s en vetgehaltes werden bekomen met deze bepaald bij de ‘volledige methode’. De FAME’s en vetgehaltes van de herhalingen waar de stap ‘vetzuren extraheren uit de bodem’ werd aangepast, vertoonden geen grote verschillen en de aanpassingen in de methode mogen worden toegepast. De stap ‘overbrengen naar andere buisjes’ mag weggelaten worden. De FAME’s die werden gevonden, werden eerder gevonden wanneer de ‘volledige methode’ werd gedaan. De stap ‘scheiden van de lipiden’ verliep goed. De FAME’s gevonden in de fosfolipidenfractie kwamen Deel 5: Besluit 65 in de drie herhalingen voor en in de eerdere proeven. De stap ‘vetzuren omvormen naar methylesters’ verliep bij de drie herhalingen moeizamer. Minder soorten FAME’s werden teruggevonden, maar het vetgehalte was niet significant verschillend met het vetgehalte bepaald bij de ‘volledige methode’. Dus kan besloten worden dat de aanpassingen van de stap mogen. In het algemeen geven de aanpassingen in de methode weinig verschillen en zijn ze aanvaardbaar. In de PLFA-methode kunnen veel factoren een rol spelen in het verkrijgen van bepaalde chromatogrammen. Tijdens de extractieprocedure kan veel mislopen doordat vele stappen moeten uitgevoerd worden. Vetzuren kunnen verloren gaan, watermoleculen kunnen de dubbele bindingen van de vetzuren aanvallen, waardoor de GC-FID eventueel minder vetzuren kan detecteren. Een oplossing kan zijn om een interne standaard in het begin van de extractieprocedure mee te nemen in plaats van op het einde. Nu wordt enkel de analyse door de GC-FID gecontroleerd. Deel 5: Besluit 66 6 Literatuurlijst Arao, T., Okano, S., Kanamori, T., Analysis of the phospholipid fatty acids of upland light colored Andosol and the relationship among the size of biomass based on phospholipid fatty acid analysis, microscopical counts and chloroform fumigationincubation, Japanese Journal Soil Science Plant Nutrition, vol. 69 (1998), p. 38-46 Bååth, E. en Anderson, T.-H., Comparison of soil fungal/bacterial ratios in a pH gradient using physiological and PLFA-based techniques, Soil Biology & Biochemistry, vol. 35 (2003), p. 955-963 Balser, T., Phospholipid Fatty-acid analysis (PLFA), Beschikbaar op het World Wide Web: http://www.cnr.berkeley.edu/soilmicro/methods/BalserPLFA.pdf, [5.10.2005] Borgå, P., Nilsson, M. en Tunlid, A., Bacterial communities in peat in relation to botanical composition as revealed by phospholipid fatty acids analysis, Soil Biology & Biochemistry, vol. 26, nr. 7 (1994), p. 841-848 Craswell, E.T. en Waring, S.A., Effect of grinding on the decomposition of soil organic matter: The mineralization of organic nitrogen in relation to soil type, Soil Biology & Biochemistry, vol. 4 (1972), p. 427-433 Dumoulin, A., Milieuchemie 2, cursus gedoceerd in kader van het vak ‘ Milieuchemie 2- Theorie’, Hogeschool West-Vlaanderen, Kortrijk, 2005 Duxbury, T. en Bicknell, B., Metal-tolerant bacterial populations from natural and metal-polluted soils, Soil Biology & Biochemistry, vol. 15, nr. 3 (1983), p. 243-250 Frostergård, A., Phospholipid fatty acid analysis to detect changes in soil microbial community structure, Zweden, Lund University, (1995) Deel 6: Literatuurlijst 67 Frostergård, A., Tunlid, A. en Bååth, E., Phospholipid fatty acid composition, biomass, and activity of microbial communities from two soil types experimentally exposed to different heavy metals, Applied Environmental Microbiology, vol.59, nr. 11 (1993), p. 3605-3617 Hiroki, M., Effects of heavy metal contamination on soil microbial population, Soil Science and Plant Nutrition, vol. 38, nr. 1 (1992), p. 141-147 Hurlbert, R.E., Fundamentals of microbiology: chapter III: bacterial architecture: the virtual bacterium [online], Washington, 1999, Beschikbaar op het World Wide Web: http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/pages/Chap3.htm, [20.02.2006] Kaluzny, M.A., Duncan, L.A., Merritt, M.V. en Epps, D.E., Rapid separation of lipid classes in high yield and purity using bonded phase columns, Journal of Lipid Research, vol. 26 (1985), p. 135-140 Kozdroj, J. en van Elsas, J.D., Structural diversity of microorganisms in chemically perturbed soil assessed by molecular and cytochemical approaches, Journal of Microbiological Methods, nr. 43 (2001), p. 197-212 Kim, H.-Y. en Salem, N.Jr., Separation of lipid classes by solid phase extraction, Journal of Lipid Research, vol. 31 (1990), p. 2285-2289 Madigan, M.T., Martinko en J.M., Parker, J., Brock: Biology of microorganisms, 11 editie, Verenigde Staten Amerika, Pearson Education, 2006, 992 p., ISBN 0-13196893-9 O’Leary, W.M. en Wilkinson, S.G., Gram-positive bacteria, in: Ratledge, C. en Wilkinson, S.G. (eds), Microbial Lipids, vol. 1 (1988), Academic Press Ltd., Londen, p. 117-185 Pennanen, T., Frostergård, A., Fritze, H. en Bååth, E., Phospholipid fatty acid composition and heavy metal tolerance of soil microbial communities along two heavy metal-polluted gradients in coniferous forests, Applied and Environmental Microbiology, vol. 62, nr. 2 (1996), p. 420-428 Deel 6: Literatuurlijst 68 Petersen, S.O. en Klug, M.J., Effects of sieving, storage, and incubation temperature on the phospholipid fatty acid profile of a soil microbial community, Applied and Environmental Microbiology, vol. 60, nr. 7 (1994), p. 2421-2430 Roberson, E.B., Sarig, S., Shennan, C. en Firestone, M.K., Nutritional management of microbial polysaccharide production and aggregation in an agricultural soil, Soil Science Society of America Journal, vol. 59 (1995), p. 1587-1594 Scott, R.P.W., Introduction to analytical gas chromatography: second edition, revised and expanded, New York, Dekker, 1998, 397 p., ISBN 0-8247-0016-3 Simpson, N. J. K., Solid-phase extraction: principles, techniques and applications, New York, Dekker, 2000, 503p., ISBN 0-8247-0021-X Toyota, K. en Kuninage, S., Comparison of soil microbial community between soils amended with or without farmyard manure, Applied Soil Ecology, in press Tunlid, A. en White, D.C., Biochemical analysis of biomass, community structure, nutritional status, and metabolic activity of microbial communities in soil, in: Stotzky G., Bollag J.M. (eds), Soil Biochemistry, vol. 7 (1992), Dekker, New York, p. 229-262 Universiteit Gent, Vakgroep bodembeheer en bodemhygiëne, Gent, Beschikbaar op het World Wide Web: http://www.soilman.ugent.be/home/index2_nl_content.html, [31.10.2005] Varian, GC Columns, USA, 2005, Beschikbaar op het World Wide Web: http://www.varianinc.com/cgibin/nav?products/consum/gccolumns/cpsil/cpsil88&cid=IPOHNPQKFN, [2.23.2006] Viklund, A., The lipid library, Schotland, Beschikbaar op het World Wide Web: http://www.lipidlibrary.co.uk/Lipids/fa_branc/index.htm, [22.02.2006] Wander, M.M., Hedrick, D.S., Kaufman, D., Traina, S.J., Stinner, B.R., Kehrmeyer, S.R. en White, D.C., The functional significance of the microbial biomass in organic and conventionally managed soils, Plant and Soil, vol. 170, nr. 1 (1995), p. 87-97 Deel 6: Literatuurlijst 69 Wander, M.M., Traina, S.J., Stinner, B.R. en Peters, S.E., Organic and conventional management effects on biologically soil organic matter pools, Soil Science Society of America Journal, vol. 58 (1994), P. 1130-1139 White, D.C., Analysis of microorganisms in terms of quantity and activity in natural environments, Microbes in their Natural Environments, vol. 34 (1983), p. 37-66 White, J.H., Wise A., Main M.J., Green A., Fraser N.J., Disney G.H., Barnes A.A., Emson P., Foord S.M. en Marshall F.H., Heterodimerization is required for the formation of a functional GABAB receptor, Nature, (1998), p. 679-982 Zelles, L., Fatty acid patterns of microbial phospholipids and lipopolysaccharides, in Schinner F, Öhlinger R., Kandeler E., Margesin R. (eds), Methods in Soil Biology, Springer, Berlijn Heidelberg New York, 1996, p. 80-93 Zelles, L., Fatty acid patterns of phosphlipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review, Biol Fertil Soils, nr. 29 (1998), p. 111-129 Zelles, L., Identification of single cultured micro-organisms based on their wholecommunity fatty acid profiles, using an extended extraction, Chemosphere, vol. 39, nr. 4 (1999), p. 665-682 Zelles, L., Bai, Q.Y., Beck, T. en Beese, F., Signature fatty acids in phospholipids and lipopolysaccharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils, Soil Biology & Biochemistry, vol. 24, nr. 4 (1992), p. 317-323 Zelles, L. en Bai, Q.Y., Fractionation of fatty acids derived from soil lipids by solid phase extraction and their quantitative analysis by GC-MS, Soil Biology & Biochemistry, vol. 25, nr. 4 (1993), p. 495-507 Deel 6: Literatuurlijst 70 Bijlagen In onderstaande bijlagen worden de oppervlaktes en retentietijden van de individuele FAME’s weergegeven. De verhouding tussen de oppervlakte van de individuele FAME’s met de oppervlakte van alle FAME’s in de bodem (zonder de oppervlakte van de interne standaard C19:0) worden ook weergegeven. Bijlage 1: experiment ‘de volledige methode’ Bijlagen 1 Bijlage 2: experiment ‘extraheren van de vetzuren’ Bijlagen 2 Bijlage 3: experiment ‘overbrengen naar andere buisjes’ Bijlagen 3 Bijlage 4: experiment ‘scheiden lipiden : fosfolipidenfractie’ Bijlagen 4 Bijlage 5: experiment ‘scheiden lipiden: glycolipidenfractie’ Bijlagen 5 Bijlage 6: experiment ‘scheiden van lipiden: neutrale lipidenfractie’ Bijlagen 6 Bijlage 7: experiment ‘vetzuren omvormen naar methylesters Bijlagen 7
