Samenvatting

Samenvatting
Het onderwerp van dit promotieonderzoek. Het onderzoek beschreven in dit
proefschrift richt zich op een transportsysteem dat een onderdeel is van het eiwitafbrekende systeem van de melkzuurbacterie Lactococcus lactis (L.lactis). Deze bacterie
is onmisbaar voor de productie van kaas en andere zuivelproducten. Mede door dit
economische belang wordt L.lactis al vele jaren door onderzoekers vanuit verschillende
disciplines bestudeerd. Wanneer L.lactis groeit in melk wordt het melksuiker, lactose,
omgezet in melkzuur. Door deze omzetting verzuurt de melk en gaat deze klonteren.
Deze klonten worden later in het productieproces van de kaas samengeperst tot wrongel,
de toekomstige kaas. De energie die vrijkomt bij de omzetting van het melksuiker wordt
door de bacterie gebruikt om te groeien en te delen. Naast suiker heeft de
melkzuurbacterie ook aminozuren nodig. Dit zijn de bouwstenen van eiwitten. In de
natuur komen twintig verschillende aminozuren voor. De opbouw van een eiwit of
peptide kan vergeleken worden met een kralenketting waarbij er een keuze gemaakt kan
worden tussen twintig verschillende kralen die in vele volgordes aan elkaar geregen
kunnen worden. Door de lengte van de ketting en de “kralen samenstelling” te variëren, is
het mogelijk veel verschillende kettingen (eiwitten) op te bouwen. Omdat L.lactis niet in
staat is om alle twintig verschillende aminozuren zelf te maken moeten deze uit de
omgeving worden opgenomen. In melk zijn de vrije aminozuren niet in grote
hoeveelheden aanwezig. Om toch aan deze behoefte te kunnen voldoen bezit de bacterie
een uitgebreid enzymsysteem dat gericht is op de afbraak van eiwitten uit de melk: het
proteolytisch systeem (figuur 1).
M elkeiw it
P rote ina se
P eptide
O pp systee m
B uite n
C elm em bra an
B inne n
P eptidasen
A m in ozu re n
Figuur 1: Het proteolytisch systeem van de melkzuurbacterie L.lactis bestaande uit het proteinase,
het Opp systeem, en verschillende peptidasen.
Chapter 5
Het afbraakproces bestaat uit drie stappen: (i) het eiwit wordt buiten de cel in kleinere
stukjes (peptiden genaamd) geknipt door het proteinase; (ii) de peptiden worden door het
peptiden transportsysteem over de celmembraan getransporteerd; en (iii) in de cel worden
deze stukjes door de peptidasen verder afgebroken tot aminozuren. De eiwitten uit de
melk kunnen niet direct opgenomen worden door de bacterie omdat deze simpelweg te
groot zijn. Daarom scheidt de bacterie het proteinase uit dat aan de buitenkant van de
bacterie actief is en de melkeiwitten in kleinere peptiden breekt die wel klein genoeg zijn
om naar binnen getransporteerd te worden. In de celmembraan, het omhulsel van de cel,
zitten verschillende pompsystemen die o.a. afval en giftige stoffen uitscheiden en
voedingstoffen opnemen. Deze systemen zijn van groot belang voor de bacterie,
aangezien voor de meeste stoffen de celmembraan een barrière vormt die niet te passeren
is. Dit geldt ook voor de peptiden die gevormd worden door het proteinase. Het
onderzoek beschreven in dit proefschrift richt zich met name op het mechanisme van de
tweede stap, het transport van peptiden over de celmembraan. In de celmembraan van
L.lactis is een transport systeem aanwezig, specifiek voor peptiden, dat Opp
(oligopeptiden permease) genoemd wordt. Het Opp systeem bestaat uit vijf verschillende
eiwitten die samen één transportsysteem vormen. De transporter bindt een peptide aan de
buitenkant van de bacterie via een bindingeiwit (OppA; A in figuur 1) en vervolgens
wordt dit peptide afgegeven aan andere Opp eiwitten die onderdeel uitmaken van het
peptiden transportsysteem. Omzetting van een energierijke stof, “de brandstof”, aan de
binnenkant van de bacterie levert de energie voor de pomp, waardoor uiteindelijk de
peptiden naar binnen gebracht kunnen worden. Eenmaal binnen in de bacterie
aangekomen, wordt het peptide verder afgebroken tot aminozuren door peptidasen (het
derde onderdeel van het proteolytisch systeem), zodat de bacterie kan beschikken over de
bouwstenen voor eiwitten. Een voor de bacterie onbelangrijke bijkomstigheid, maar voor
de kaasliefhebber des te belangrijker, is dat de afbraakroute van melkeiwitten er tevens
voor zorgt dat er stoffen ontstaan die de smaak van kaas bepalen.
De inhoud van het proefschrift. In hoofdstuk 1 wordt een overzicht gegeven van de
rol die peptiden spelen in bacteriën en de verschillende transportsystemen die hierbij
betrokken zijn. Behalve als voedingsstof kunnen peptiden ook fungeren als een
signaalmolecuul. Deze signaalmoleculen worden “opgepikt” door de bacterie en
verschaffen de bacterie informatie over zijn directe leefomgeving. De bacterie kan
vervolgens reageren op deze informatie en zich aanpassen door bijvoorbeeld andere
eiwitten aan te maken die belangrijk zijn voor de nieuwe condities. Deze processen zijn
van levensbelang voor de bacterie want op deze manier kan geanticipeerd worden op
veranderingen in het milieu en wordt de kans op overleven vergroot. Het onderzoek
beschreven in dit proefschrift is gericht op de rol die het Opp systeem in L.lactis speelt in
het selecteren en importeren van peptiden die als voedingsstof dienen.
In hoofdstuk 2 is de voorkeur voor bepaalde peptiden (substraat-specificiteit) van het
Opp systeem van L.lactis nader onderzocht. Uit eerder onderzoek, uitgevoerd door
Edmund Kunji aan de vakgroep Microbiologie in Haren, bleek dat het Opp systeem lange
peptiden (tot 10 aminozuren) kan transporteren uit het complexe mengsel van peptiden
dat door het proteinase gemaakt wordt. Dit was een belangrijk resultaat omdat op dat
moment niet bekend was dat bacteriële peptiden transportsystemen zulke lange peptiden
kunnen transporteren. De substraat-specificiteit is nader onderzocht met L.lactis cellen
80
Samenvatting
waarin het Opp systeem tot overexpressie was gebracht. In deze experimenten werden
gezuiverde peptiden, dus niet in een mengsel met andere peptiden, aangeboden aan
L.lactis. Uit deze studie bleek dat peptiden met een lengte van 18 aminozuren nog
getransporteerd kunnen worden door het Opp systeem. Langere peptiden zijn niet getest
omdat deze niet voor handen waren, maar het is zeker niet uitgesloten dat ook deze
getransporteerd zouden kunnen worden door het Opp systeem.
De voorkeur voor peptiden wordt met name bepaald door het bindingeiwit van het
Opp systeem, het OppA. Om goed te kunnen kijken naar de substraat-specificiteit van
OppA is dit eiwit uit L.lactis opgezuiverd. In dit gezuiverde preparaat is dus alleen nog
OppA aanwezig en geen andere eiwitten die invloed zouden kunnen hebben op het
bindingsproces van de peptiden. In hoofdstuk 3 is gedetailleerd gekeken naar de
substraat-specificiteit van OppA. Het grote verschil met de studie in hoofdstuk 2 is dat in
dit geval dus geen hele bacterie cellen gebruikt worden maar alleen het bindingeiwit van
het Opp systeem. De specificiteit van OppA is getest in samenwerking met de groep van
Professor Tampé van de universiteit van Marburg (Duitsland), omdat zij beschikken over
een uitgebreide systematische “peptiden bibliotheek”. Uit deze experimenten bleek dat de
aminozuursamenstelling van het peptide slechts beperkt van belang is maar dat de grootte
van het peptiden veel belangrijker is. Peptiden bestaande uit 9 aminozuren binden
verreweg het sterkst aan het bindingseiwit OppA.
In hoofdstuk 4 van dit proefschrift staat beschreven hoe geprobeerd is het hele Opp
systeem (dus alle vijf componenten) uit de membraan op te zuiveren en in een
kunstmatige membraan te plaatsen. Hierdoor zou het mogelijk zijn de werking van het
Opp systeem te bestuderen zonder invloed van andere eiwitten die onderdeel uitmaken
van het proteolytisch systeem. Op verschillende manieren is geprobeerd dit voor elkaar te
krijgen. De pogingen om het hele Opp complex te zuiveren mislukten, omdat tijdens deze
procedure het complex uit elkaar viel en er componenten verloren gingen. Vervolgens is
geprobeerd de componenten apart op te zuiveren en deze daarna weer bij elkaar te voegen
en in de kunstmatige membraan te plaatsen. Uit analyses van deze membraan bleek, dat
de componenten wel aanwezig waren in de membraan maar dat er geen transportactiviteit
te meten was. Waarschijnlijk komt dit doordat de componenten niet op de juiste manier
met elkaar een complex gevormd hebben. Ook is het mogelijk, dat de natuurlijke
membraan componenten bevat, die belangrijk zijn voor transportactiviteit en dat die
ontbreken in de kunstmatige membraan. Het grootste probleem in deze studie was dat het
moeilijk bleek te zijn om grote hoeveelheden van de gezuiverde Opp componenten in
handen te krijgen. Wanneer, in de toekomst, dit probleem opgelost wordt kan de in dit
hoofdstuk beschreven methode van grote waarde zijn om het Opp succesvol te zuiveren
en over te brengen naar kunstmatige membranen.
Het onderzoek beschreven in dit proefschrift heeft meer inzicht gegeven in de manier
waarop het Opp systeem van L.lactis peptiden bindt en transporteert.
81
Chapter 5
82