University of Groningen Biosynthesis of phenylalanine and tyrosine

University of Groningen
Biosynthesis of phenylalanine and tyrosine in the methylotrophic actinomycete
amycolatopsis methanolica
Euverink, Gerrit
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to
cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
1995
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Euverink, G. J. W. (1995). Biosynthesis of phenylalanine and tyrosine in the methylotrophic actinomycete
amycolatopsis methanolica Groningen: s.n.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the
author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately
and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the
number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Download date: 18-07-2017
SAMENVATTING
141
Samenvatting
Aminozuren zijn bouwstenen voor de synthese van eiwitten die nodig zijn voor de
groei van een organisme. De synthese van aminozuren kost energie dat wordt gewonnen
uit de voedingstoffen die door het organisme worden verbruikt. Om geen energie te
verspillen door het onnodig aanmaken van aminozuren, wordt er via
reguleringsmechanismen voor gezorgd dat er precies genoeg aminozuren worden
gemaakt. Van de 20 verschillende aminozuren zijn de aromatische aminozuren
fenylalanine, tyrosine en tryptofaan het meest kostbaar om te maken. Dieren (en ook
mensen) zijn niet in staat om de aromatische aminozuren zelf te maken en moeten deze
dan ook via het voedsel opnemen. De meeste planten, schimmels, gisten en bacteriën
kunnen deze aminozuren wel maken. De synthese van de aromatische aminozuren wordt
in het algemeen goed gereguleerd in deze organismen zodat zo efficient mogelijk met de
beschikbare hoeveelheid energie wordt omgegaan. De regulatie bestaat voornamelijk uit
remming van het eerste enzym en de enzymen op elk vertakkingspunt in de route door
de aromatische aminozuren zelf (terugkoppelingsremming).
Actinomyceten zijn veelzijdige bodembacteriën die in staat zijn om vele soorten
antibiotica te produceren. Veel eigenschappen van actinomyceten zijn nog onbekend en
verder onderzoek wordt van groot belang geacht voor het maken van meer en nieuwe
varianten van bekende antibiotica maar ook voor de isolatie van geheel nieuwe typen
antibiotica. Daarnaast is kennis omtrent de aanvoerroutes van de bouwstenen van
antibiotica belangrijk. Een interessante groep van antibiotica wordt gemaakt uit
aromatische aminozuren of uit tussenprodukten van hun biosynthese. De kennis die wordt
verkregen door de bestudering van de regulatie van aromatische aminozuur biosynthese
in actinomyceten is dan ook belangrijk om een efficiënte produktie van deze groep
antibiotica te bewerkstelligen.
Aromatische aminozuren worden gemaakt door het achtereenvolgens uitvoeren van
verschillende chemische reacties. Deze reacties worden in het organisme uitgevoerd door
enzymen, de biologische katalysatoren. De eerste 7 enzymatische stappen, de shikimaat
route, zijn voor de drie aromatische aminozuren identiek. Het eerste enzym,
3-deoxy-D-arabino-heptulosonaat 7-fosfaat synthase (DS) maakt uit fosfoenolpyruvaat
en erythrose-4-fosfaat het produkt 3-deoxy-D-arabino-heptulosonaat 7-fosfaat. Aan het
eind van de shikimaat route wordt het eindprodukt chorismaat verdeeld over de enzymen
anthranilaat synthase (tryptofaan route) en chorismaat mutase (fenylalanine en tyrosine
route). Het produkt van de chorismaat mutase, prefenaat, wordt verdeeld over prefenaat
dehydratase (fenylalanine route) en prefenaat aminotransferase (tyrosine route).
De eigenschappen van een aantal enzymen die noodzakelijk zijn in de biosynthese
van fenylalanine en tyrosine zijn bestudeerd in de actinomyceet Amycolatopsis
methanolica. Er is gekozen voor de bestudering van DS, chorismaat mutase, prefenaat
dehydratase en prefenaat aminotransferase, enzymen die de verdeling over de
verschillende routes bepalen. In A. methanolica is gevonden dat DSI een interactie
142
Samenvatting
aangaat met chorismaat mutase (complex vorming). Deze interactie is noodzakelijk voor
een goede werking van de chorismaat mutase maar niet voor die van DSI. De andere
bestudeerde enzymen functioneren zelfstandig.
De procedures voor het isoleren van mutanten van A. methanolica die geen
fenylalanine, tyrosine en/of tryptofaan konden maken werden geoptimaliseerd. De cellen
van A. methanolica zijn met elkaar verbonden in lange, vertakte ketens. Hierdoor is het
bijna onmogelijk om auxotrofe mutanten te isoleren. Door de ketens kort te behandelen
met ultrageluid konden individuele cellen worden verkregen waarna beschadigingen in
het erfelijk materiaal (DNA) geïntroduceerd werden met behulp van bestraling met
ultraviolet licht. Aldus konden op eenvoudig wijze vele mutanten geïsoleerd worden. In
deze mutanten waren één of meerdere activiteiten van bepaalde enzymen uit de
biosynthese van aromatische aminozuren niet meer aanwezig. Mutanten die DS,
shikimaat dehydrogenase, shikimaat kinase of prefenaat aminotransferase activiteit
verloren hadden werden niet geïsoleerd, hetgeen een duidelijke aanwijzing was dat er
meerdere vormen van deze enzymen aanwezig waren. Dit vermoeden werd bevestigd
met behulp van enzymzuiveringen.
In A. methanolica wordt DSI activiteit geremd door zowel fenylalanine, tyrosine als
tryptofaan. Tevens remt tryptofaan ook de anthranilaat synthase activiteit zodat er geen
chorismaat wordt omgezet in tryptofaan als dit al voldoende aanwezig is. Chorismaat
mutase activiteit wordt geremd door zowel fenylalanine als tyrosine. De route vanaf
prefenaat naar tyrosine wordt alleen indirect gecontroleerd door tyrosine. Tyrosine
stimuleert de prefenaat dehydratase activiteit zodat meer fenylalanine gemaakt wordt,
waardoor er minder prefenaat beschikbaar is voor tyrosine synthese. Fenylalanine remt
zijn eigen synthese door remming van de prefenaat dehydratase activiteit. In de situatie
waarin te weinig fenylalanine in de cel aanwezig is om optimaal te kunnen functioneren
wordt er een tweede DS (DSII) gemaakt en extra veel van chorismaat mutase. De DSII
activiteit wordt niet geremd door fenylalanine maar alleen door tyrosine en in mindere
mate door tryptofaan. Een grote hoeveelheid van chorismaat mutase kan geen interactie
aangaan met DSI omdat van dit enzym juist niet extra veel gemaakt wordt. Deze vrije
vorm van chorismaat mutase heeft een lage specifieke activiteit maar wordt niet geremd
door fenylalanine en tyrosine.
Remming van prefenaat dehydratase door fenylalanine wordt veroorzaakt door een
lagere affiniteit voor prefenaat en een lagere maximale snelheid van prefenaat
dehydratase. De stimulatie door tyrosine wordt veroorzaakt door een hogere affiniteit
voor prefenaat en een hogere maximale snelheid van prefenaat dehydratase. Door
veranderingen in het erfelijk materiaal van prefenaat dehydratase werden twee typen
mutanten geïsoleerd. In beide mutanten is prefenaat dehydratase niet meer gevoelig voor
remming door fenylalanine. In één mutant is tegelijkertijd de stimulatie door tyrosine en
de remming door fenylalanine verloren.
143
Samenvatting
In A. methanolica zijn meerdere aromatische aminotransferasen aanwezig. In de route
naar fenylalanine kunnen twee enzymen, aro ATI en aro ATII, fenylalanine maken uit
fenylpyruvaat; in de route naar tyrosine zijn drie enzymen, Ppa ATI-III, aanwezig die
arogenaat, de precursor voor tyrosine, maken uit prefenaat. Het enzym aro ATII is voor
het grootste gedeelte verantwoordelijk voor de vorming van fenylalanine. Aro ATII is
daarnaast ook noodzakelijk voor de groei op en de afbraak van tyrosine en heeft daardoor
een dubbele functie. Aro ATI en Ppa ATI komen overeen met de aminotransferase die
ook de vertakte aminozuren maakt. De activiteit van Ppa ATII is een nevenactiviteit van
het enzym aspartaat aminotransferase. Ppa ATIII kan alleen prefenaat omzetten in
arogenaat en is waarschijnlijk het belangrijkste enzym voor de vorming van arogenaat
uit prefenaat.
A. methanolica is naast veel andere koolstofbronnen ook in staat om te groeien op
quinaat (1,3,4,5-tetrahydroxy-cyclohexaancarbonzuur). Het katabolisme (afbraak) van
quinaat verloopt via 3-dehydroquinaat en 3-dehydroshikimaat. Deze twee intermediairen
maken ook deel uit van de shikimaat route. Normaal gesproken verlopen katabole routes
gescheiden van biosynthetische routes. Indien er dezelfde intermediairen gevormd
worden in zowel katabole als biosynthetische routes zijn hiervoor meestal verschillende
enzymen verantwoordelijk. In A. methanolica is het enzym dat 3-dehydroquinaat omzet
in 3-dehydroshikimaat, 3-dehydroquinaat dehydratase, zowel betrokken bij het
katabolisme van quinaat als bij de biosynthese van aromatische aminozuren. Het enzym
vertoonde grote overeenkomsten met het katabole type II, zoals die voorkomt in
schimmels die groeien op quinaat, maar niet met het biosynthetische type I. Mutanten die
geen 3-dehydroquinaat dehydratase activiteit bezaten konden niet meer groeien op
quinaat en konden ook geen aromatisch aminozuren meer maken, een duidelijk bewijs
dat één 3-dehydroquinaat dehydratase aanwezig is met een dubbele functie.
De twee startprodukten voor de synthese van aromatische aminozuren,
fosfoenolpyruvaat en erythrose-4-fosfaat, worden gemaakt uit glucose via respectievelijk
de glycolyse en de pentosefosfaat-weg. Erythrose-4-fosfaat speelt ook een rol in het
metabolisme van methanol. De regulatie van glucose en methanol metabolisme werd
bestudeerd vanwege de interactie met de biosynthese van de aromatische aminozuren.
Het metabolisme van glucose verloopt volgens de klassieke Embden-Meyerhoff route
Opmerkelijk was dat het enzym fosfofruktokinase (PPi-PFK) pyrofosfaat gebruikt als
fosfaat donor bij de omzetting van fructose-6-fosfaat in fructose-1,6-bisfosfaat, in
tegenstelling tot het meer gebruikelijke ATP als fosfaat donor. De PPi-PFK activiteit werd
ook aangetoond in naaste verwanten van A. methanolica. De glycolyse in A. methanolica
wordt niet of nauwelijks gereguleerd door remming of stimulatie van PPi-PFK en
pyruvaat kinase door intermediairen uit de glycolyse en citroenzuur-cyclus maar lijkt
meer gereguleerd te worden aan de hand van de energiestatus van de cel.
144
Samenvatting
De groei op een simpel molekuul als methanol vereist dat dit wordt omgezet in grote,
meer ingewikkelde molekulen. De fixatie van methanol verloopt via de ribulose-5-fosfaat
(RuMP) cyclus. De oxydatie van methanol in formaldehyde kon lange tijd niet worden
aangetoond in A. methanolica. Met behulp van een tetrazolium zout, een kunstmatige
elektronen acceptor, werd een methode ontwikkeld om de methanol dehydrogenase
activiteit reproduceerbaar te kunnen meten. Dit nieuwe type methanol dehydrogenase
kon ook worden aangetoond in andere actinomyceten die op methanol en/of ethanol
konden groeien. De activiteit van transketolase en ribulose-5-fosfaat epimerase, twee
andere enzymen uit de RuMP cyclus, zijn sterk verhoogd door de aanwezigheid van
methanol. De hogere transketolase activiteit is het gevolg van synthese van een extra
enzym.
145