Document

Synthetische biologie
In de praktijk
Wat is synthetische biologie?
Het aanpassen van cellen of bacteriën, zodat deze
bepaalde taken verrichten.
Cellen
• Celkern
• ER
• Organellen
Alles wordt geregeld door eiwit reacties
DNA
Deoxyribonucleïnezuur
Bevat erfelijke informatie
4 basen: A,T,G en C
Bouwplan voor eiwitten
Van DNA naar eiwit
Bacteriën
1 cellige organismen
Lineair DNA
Plasmiden
- uitwisselbaar
- antibiotica resistentie
Veel gebruikt door mensen
Produceren van eiwitten
door gebruik van bacteriën
Plan van aanpak:
• Een plasmide maken met het gen erin
• Plasmide in bacterie brengen
• Controleren van plasmide
• Eiwitten maken
Knippen
Knippen van het gen en de plasmide
Twee restrictie enzymen
bijvoorbeeld:
• HindIII
• BamHI
Knippen opgaven
Onderdeel
Benodigde
massa/concentratie
DNA van gen (200 ng/ μL)
10x CutSmart buffer
Restrictie enzym
3 μg
1x
10 U
15 μL
5 μL
0.5 μL
BamHI (20 U/ μL)
Restrictie enzym
10 U
0.5 μL
HindIII (20 U/ μL)
H20
Total
Eind volume
29 μL
50 μL
20 basen lang
Plakken
Aan elkaar plakken van het gen
en de open plasmide
Geeft een dichte plasmide met
het gen
plakken opgaven
Waarom wordt er bij de digestie met
twee verschillende restrictie enzymen
geknipt, en niet met één?
Wanneer er maar één
restrictie enzym
gebruikt wordt, kan
de vector dichtgaan
zonder dat het gen
erin zit.
Plan van aanpak
• Een plasmide maken met het gen erin
• Plasmide in bacterie brengen
• Controleren van plasmide
• Eiwitten produceren
Transformatie
Bacteriën een heat shock geven
Plaat de bacteriën uit
Laat ze s’ nachts delen
Transformatie opgaven
Wat is de functie van de heat shock?
Door de heat shock gaat de bacterie celwand open en kan de plasmide
naar binnen.
Waarom is het belangrijk dat de voedingsbodem
antibiotica bevat?
Anders zouden andere bacteriën, en ook de bacteriën waar de
transformatie niet bij gelukt is, zich kunnen vermenigvuldigen.
Wat denk je dat er zou gebeuren bij de transformatie
wanneer het aan elkaar plakken niet gelukt is?
Dan bevatten de bacteriën niet de plasmide met de juiste antibiotica
resistentie. Er zullen geen bacteriën groeien.
Bacterie kolonies
Bacteriën vermenigvuldigen zich
door te delen
Een kolonie is een bacterie die zich
heel vaak gedeeld heeft
Bacterie kolonies opgaven
Hoe ontstaat een kolonie?
Wanneer 1 bacterie zich heel vaak deelt, worden deze bacteriën zichtbaar.
Dit noemen we een kolonie.
Waarom is de vorming van kolonies zo handig voor het
onderzoek?
Een kolonie is heel vaak dezelfde bacterie (dezelfde plasmide) hierdoor
gaan we dus verder met één plasmide.
Waarom wordt de plaat vervolgens in de koelkast
bewaard?
Op 4 graden zullen de bacteriën niet meer delen. De plaat groeit dus niet
vol en is zo even te bewaaren.
Bacteriën kweken
Voor ongeveer 5 kolonies wordt er
een kweek ingezet.
Een kweek bevat:
• LB medium (voedingstoffen)
• Antibiotica
• Bacterie kolonie
De kweekjes worden een hele nacht
op 37 graden geschud.
Bacteriën kweken opgaven
• Een bacterie deelt elke 20 minuten
• Je begint met 50 bacteriën
• Je wilt 5 miljoen bacteriën hebben
Hoelang moet de kweek blijven staan?
N= B*G^t
50*2^t= 5.000.000
2^t= 100.000 t= ln(100.000)/ln(2)= 16.6
16.6*20 minuten= 332 minuten= 5 uur en 32 minuten
Waarom is het nodig dat de buisjes geschud worden?
Door het schudden worden de voedingstoffen en bacteriën beter verdeeld
in het medium. Het belangrijkste van het schudden is dat de bacteriën
genoeg zuurstof krijgen.
Plan van aanpak
• Een plasmide maken met het gen erin
• Plasmide in bacterie brengen
• Controleren van plasmide
• Eiwitten produceren
Plasmide zuivering
=> DNA sequensen
Houden alleen de plasmiden over
Controleren of gen daadwerkelijk in de plasmide zit
Opsturen voor sequensen
Dit wordt door gespecialiseerde bedrijven gedaan
DNA sequensen
Sanger methode
In elk buisje 4 gewone basen
In elk buisje 1 gekleurde base
Het DNA wordt niet verlengt als een gekleurde base is ingebouwd
DNA sequensen opgave
Wat is de basenpaar sequentie?
CGCGATTACGTC
Plan van aanpak
• Een plasmide maken met het gen erin
• Plasmide in bacterie brengen
• Controleren van plasmide
• Eiwitten maken
Eiwitten maken
DNA gen wordt afgelezen
Heel veel eiwit wordt gevormd
Eiwit zuivering
Alleen het pure eiwit blijft over
Testen van het eiwit
Resultaten beschrijven
Plan van aanpak
• Een plasmide maken met het gen erin
• Plasmide in bacterie brengen
• Controleren van plasmide
• Eiwitten maken
Geïnteresseerd?
iGEM is een jaarlijkse wereldwijde competitie in de
synthetische biologie.
Honderden teams werken aan hun eigen project.
Alle teams komen in oktober samen in Boston om hun
resultaten te laten zien.
Meer informatie:
www.igem.org
http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven