Materiaal en methode - Utrecht University Repository

Teken en door teken overdraagbare pathogenen
aangetroffen bij gezelschapsdieren in het tickbusters
survey in 2010
Annemarie Conijn
Februari 2011-Mei 2011
locatie: Utrecht Centrum voor Teken-gebonden Ziekten (UCTD), Departement
Infectieziekten en Immunologie, Faculteit Diergeneeskunde, Universiteit Utrecht
begeleiders: Prof. Dr. F. Jongejan, M. Wijnveld.
Inhoudsopgave
Samenvatting ............................................................................................. 3
Introductie ................................................................................................. 4
1.
Teken .............................................................................................. 4
a.
Inleiding ....................................................................................... 4
b.
levenscyclus van de Ixodidae. ......................................................... 4
2.
Door teken overdraagbare pathogenen ................................................ 6
A.
Protozoa .......................................................................................... 6
a.
Babesiose ..................................................................................... 6
b.
Theileriose .................................................................................... 7
B.
Prokaryoten ...................................................................................... 8
c.
Borreliose ..................................................................................... 8
d.
Anaplasmose ................................................................................. 9
e.
Erhlichiose .................................................................................... 9
Materiaal en methode ................................................................................ 11
1.
Teken determinatie: ........................................................................ 11
2.
DNA extractie: ................................................................................ 11
3.
Polymerase Chain Reaction (PCR) amplificatie: ................................... 12
4.
Gelelectroforese: ............................................................................. 15
5.
Reverse line blot hybridisatie: ........................................................... 17
Resultaten ................................................................................................ 19
1.
ingezonden teken ............................................................................ 19
2.
pathogenen .................................................................................... 19
Discussie .................................................................................................. 22
Conclusie ................................................................................................. 23
Dankwoord ............................................................................................... 24
Literatuurlijst ............................................................................................ 25
Bijlage ..................................................................................................... 28
1.
UCTD protocollen ............................................................................ 28
a.
Teken determineren ..................................................................... 28
b.
DNA isolatie uit de teek ................................................................ 30
c.
PCR ter behoeve van de Reverse Line Blot (RLB) Hybridisatie ............ 32
d.
Agarose gel electroforese .............................................................. 33
e.
Reverse Line Blot (RLB) hybridisatie ............................................... 34
f.
RLB membraan strippen ............................................................... 36
2.
species verdeeld over de families ...................................................... 37
3.
resultaten ...................................................................................... 38
2
Samenvatting
In de veterinaire en medische wereld spelen teken een belangrijke rol. Teken zijn
vectoren, ze zijn in staat om diverse pathogenen over te brengen die bijvoorbeeld
Anaplasmose, Babesiose, Borreliose, Ehrlichiose en Rickettsiose veroorzaken.
In Nederland kent de incidentie van vector gebonden ziekten bij zowel mens en
andere dierensoorten een stijgende lijn. Zo kunnen we denken aan de ziekte van Lyme
bij de mens of Babesiose bij dieren.
Tijdens dit onderzoek zijn er 400 teken willekeurig gekozen uit de teken collectie van
het Utrecht Centrum voor Teken-gebonden Ziektes (UCTD) afkomstig uit het jaar
2010. Deze teken zijn getest op de aanwezigheid van Anaplasma, Ehrlichia, Babesia,
Theileria en Borrelia soorten.
Er zijn uit de selectie van 400 teken, 5 verschillende teken onderzocht namelijk: 327
Ixodes ricinus, 34 Ixodes spp (nymfen), 27 I.hexagonus, 9 Rhipicephalus sanguineus,
en 3 Dermacentor reticulatus. Uit de I.ricinus is gebleken dat 6.1% geïnfecteerd is
met B.burgdorferi sensu lato (1.83% B.afzelii, 1.83% B.garinii, 1.83% B.valaisiana
en 0.3% B.burgdorferi sensu stricto), 2.14% is besmet met Babesia spp (1.22%
B.divergens), 3.1% is besmet met Anaplasma spp (1.22% A.phagocytophilum), 3.1%
Ehrlichia spp en 0,92% is besmet met Theileria spp. Uit de I.hexagonus is gebleken
dat er 3.7% geïnfecteerd is met Babesia spp, 18.5% is besmet met Anaplasma spp
(3.7% A.phagocytophilum) en 18.5% is besmet met Ehrlichia spp.
Opmerkelijk is dat het percentage Borrelia spp gevonden in de teken (voornamelijk
I.ricinus) redelijk hoog is vergeleken met eerdere onderzoeken. De aanwezigheid van
Theileria in de teken is zeer minimaal (1% over het totale aantal onderzochte teken).
De bevinding van Babesia in teken is vergelijkbaar met eerder onderzoek. Echter de
bevinding van Theileria is nieuw en verder onderzoek is nodig.
Bij enkele teken is er sprake van een besmetting (A/E catch all of T/B catch all) maar
is deze niet verder gedifferentieerd. Bij deze teken is er verder onderzoek nodig om de
resultaten verder te definiëren.
3
Introductie
In de veterinaire en medische wereld spelen teken een belangrijke rol. Teken spelen
een rol als vector, ze zijn in staat om diverse ziektes over te brengen zoals
Anaplasmose, Babesiose, Borreliose, Ehrlichiose en Rickettsiose veroorzaken.[1]
In Nederland kent de incidentie van Lyme Borreliose een stijgende lijn. Naast deze
verwekker, Borrelia burgdorferi, zijn ook nog andere potentiële ziekteverwekkers
zoals Rickettsia, Babesia en Ehrlichia aanwezig in de Ixodes ricinus teek, de soort die
het meest wordt gevonden in Nederland. [5]
1. Teken
a. Inleiding
Teken zijn obligaat bloedzuigende ectoparasieten. Ixodes species behoren tot de
Arthropoda, specie: Arachnida (spinachtigen) en tot de subspecie: Acarina (teken en
mijten). De teek bijt zich vast in de huid van de gastheer om zich vervolgens na de
bloedmaaltijd weer te laten vallen (afhankelijk van de teek of hij zich laat vallen na de
maaltijd of niet). Aangezien de teek maar gedurende een korte periode op zijn
gastheer zit, is de omgeving van de teek van groot belang voor zijn overleving. De
twee belangrijkste eisen voor een juiste omgeving voor de teek zijn dat er voldoende
gastheren aanwezig zijn en dat de luchtvochtigheid vrij hoog moet zijn. [3]
Er zijn ongeveer 878 teken species beschreven. Deze zijn verdeeld in vier families, de
Argasidae (zachte teken), de Ixodidae (harde teken), de Nutalliellidae en de
Laelaptidae. De familie van de Ixodidae is verreweg de grootste, en daarom zullen we
ons specifiek richten op deze groep met betrekking tot de toelichting van de cyclus.
(bijlage 3)[4].
b. levenscyclus van de Ixodidae.
De levenscyclus van de Ixodus teken kent vier stadia: het ge-embryoneerde ei, de
zespotige larve, de achtpotige nimf en als laatste de achtpotige adult.(zie fig1) [3] De
laatste drie stadia zijn de actieve stadia van de teek. Tijdens elke actieve stadia zoekt
de teek een gastheer, voedt zich, en laat zich vervolgens weer vallen. De meeste
soorten van de Ixodes familie hebben een drie-gastheer levenscyclus. [6;52-53]
Fig 1: Teek Ixodes ricinus: larve – nimf – mannetje – vrouwtje
4
De door het vrouwtje gelegde eitjes ondergaan embryogenese en ontwikkelen zich
hierna tot larve. Vervolgens gaat de larve op zoek naar gastheer nr1 door op de
vegetatie te klimmen. De eerste parasitaire fase gebeurt tijdens het hechten aan
gastheer nr1. (zie fig: 2)
Om een gastheer te detecteren beschikt de teek over een apart orgaan, genaamd
Haller’s orgaan. Deze is gelegen aan het uiteinde van de eerste paar poten. Hiermee
zijn ze instaat om veranderingen in geur (CO2, NH3, melkzuur), vibraties,
temperatuur en andere externe factoren te detecteren wanneer een gastheer in de buurt
is [6;8].
Hierna volgt de voedingsfase van de larve, deze kan enkele dagen duren (afhankelijke
van de tekensoort). De larve laat zich daarna weer vallen in de vegetatie om zich
verder te ontwikkelen tot nymfe (ecdysis). De nymfe gaat op zoek naar gastheer nr2,
hecht zich, voedt zich om vervolgens weer los te laten en in de vegetatie terecht te
komen. De nymfe ontwikkelt zich tot adult (mannelijk of vrouwelijk). De voedings
cyclus wordt weer herhaald, hechten aan gastheer nr3, voeden. Hierna volgt er paring
tussen mannelijke en een vrouwelijke teek. De vrouwelijke teek zal hierna weer los
laten en in de vegetatie opzoek gaan naar een beschutte locatie om over te gaan tot
ovipositie. De vrouwelijke teek zal na de ovipositie dood gaan [6;52-53].
Fig 2: levenscyclus van de Ixodes teek
5
2. Door teken overdraagbare pathogenen
Tijdens dit onderzoek zijn door middel van verschillende testen (Polymerase Chain
Reaction (PCR) en de Reverse Line Blot hybridisation (RLB)), teken onderzocht op
de aanwezigheid van Babesia, Theileria, Anaplasma, Ehrlichia en Borrelia soorten.
A. Protozoa
Protozoa zijn enkelcellige eukaryote micro-organismen. Zowel het genus Babesia als
het genus Theileria behoren tot de protozoa.
a. Babesiose
Introductie
Babesia spp infecties worden veroorzaakt door protozoaire parasieten, die in de
erytrocyten van de gastheer ontwikkelen [6][7]. Na een beet van een geïnfecteerde
teek, als de pathogeen overgedragen wordt, kan de babesia zich asexueel ontwikkelen
in de rode bloed cellen. De afbraak van geparasiteerde erytrocyten veroorzaakt het
vrijkomen van hemoglobine en andere bijproducten. De verschijnselen die hierbij
gepaard gaan zijn hematurie, koorts en anemie.[6]
Babesiose wordt in veel dieren getroffen zoals rundvee, paarden, schapen, geiten maar
ook bij gedomesticeerde dieren zoals honden en katten. Hier spelen verschillende
soorten Babesia een rol. In Europa wordt Babesiose veroorzaakt door B.divergens die
overgedragen wordt door I.ricinus.[6]. Babesiose wordt in de volksmond ook wel
eens piroplasmose genoemd. Bij honden en katten werd de ziekte eerst gezien als een
(sub)tropische ziekte maar in recent onderzoek is bewezen dat Babesiose in
toenemende frequentie voorkomt in gematigd klimaat, door de aanwezigheid van
D.reticulatus [8].
Tijdens dit onderzoek is er getest op B. felis, B. divergens, B. microti, B. bigemina, B.
bovis, B. rossi, B. canis, B. vogeli, B. major, B. bicornis en naar B. caballi.
Babesiose bij gezelschapsdieren
Bij de hond komt B.canis voor en bij de kat (wat zeldzaam is) komt B.felis voor. De
meeste Babesia parasieten worden door de harde teken, Ixodidae, overgebracht.
Infectieuze sporozoieten kunnen, samen met het speeksel van de teek, in de hond of
kat geïnjecteerd tijdens de bloedmaaltijd van de teek. De organismen gaan vervolgens
de erytrocyten binnendringen en ontwikkelen zich verder. Er vindt vervolgens
asexuele vermenigvuldiging plaats. Hierbij komen merozoieten vrij en deze zullen
weer andere erytrocyten binnendringen. Transmissie naar de vector (dus naar de teek)
gebeurt tijdens parasietemie. Eenmaal in de teek, begint de sexuele
vermenigvuldiging waarbij sporozoieten worden gevormd in de speekselcellen van de
teek. Babesiose wordt meestal overgedragen door een geïnfecteerde teek, maar kan
ook gebeuren met een transfusie met geïnfecteerd bloed of via transplacentale
overdracht (van moeder op nakomeling)[8].
6
Humane babesiose
Humane babesiose werd als eerst waargenomen bij mensen waarbij de milt
verwijderd was. De eerste bevestigde casus was in 1957, bij een man uit Joegoslavië
die een splenectomie had ondergaan. In het vervolg zijn er meerdere gevallen van
humane babesiose ontdekt in andere landen zoals Ierland, Schotland, Frankrijk etc. In
de meeste gevallen was er sprake van een infectie met B.major of B.divergens
veroorzaakt door de vector teek I.ricinus. In de US werden vervolgens ook gevallen
van humane babesiose gevonden bij patiënten met een gezonde milt. Daar was sprake
van een infectie met B.microti die door de I.scapularis werd overgedragen [6].
De incubatie periode van Babesia spp varieert van 1 tot 4 weken. De klinische
verschijnselen die hierbij voorkomen zijn: koorts, rillingen, veel zweten, hoofdpijn en
spierpijn. Deze verschijnselen persisteren en in het verloop van de ziekte komt er ook
nog gewrichtspijn, misselijkheid, braken, uitputting bij [6].
De diagnose van babesiose wordt gesteld door middel van het aantonen van de
parasieten aanwezig in de erytrocyten van verdachte patiënten. Ook is het mogelijk
om Babesia-specifieke antilichamen aan te tonen door middel van de indirect
fluorescentie test (IFT).
In de meeste gevallen is humane babesiose, veroorzaakt door B.microti, zelf
limiterend en is alleen ondersteunende therapie nodig. Bij ernstige gevallen is
specifieke therapie nodig [6; 130-135].
b. Theileriose
Tijdens dit onderzoek is getest op Theileria/Babesia catch all.
Theileria spp infecties worden ook veroorzaakt door teek-gebonden protozoaire
parasieten. De levenscyclus van Theileria parasieten vergelijkbaar met Babesia spp
met enkele kleine verschillen. Theileria ssp ontwikkelen zich eerst in lymphocyten
alvorens zich verder in erythrocyten te ontwikkelen. Transmissie van Theileria
gebeurt uitsluitend transstadieel.[6]
Theileria soorten veroorzaken belangrijke rundvee ziektes. Een van de belangrijkste
ziekten met een grote economische impact is East Coast Fever (ECF), veroorzaakt
door T.parva. Deze parasiet veroorzaakt een hoge morbiditeit en mortaliteit. ECF
komt voornamelijk voor in Oost en Zuid Africa.[17][6]
7
B. Prokaryoten
Prokaryoten zijn micro-organismen die geen kern bezitten. Tot deze groep behoren
Borrelia, Ehrlichia en Anaplasma soorten.
c. Borreliose
Tijdens dit onderzoek is er getest op B. burgdorferi senu lato, B. burgdorferi sensu
stricto, B. garinii, B. afzelii en B. valaisiana.
Introductie
Sinds de ontdekking van Lyme Borreliose, of de ziekte van Lyme, bij de mens hebben
de teek-gebonden ziektes een enorme bekendheid verkregen. Sindsdien is er veel
onderzoek hiernaar gedaan. [15].
B. burgdorferi behoort tot de spirocheten en worden over het algemeen overgedragen
door Ixodes teken [16]. B.burdorferi wordt gezien als de belangrijkste zowel in Noord
Amerika als in Europa. Tot op heden worden er jaarlijks tienduizenden vector
gebonden gevallen gerapporteerd [15].
Humane Borreliose: Lyme disease
Op het noordelijke halfrond is Lyme disease de meest voorkomende vectorgebonden
ziekte bij de mens [5]. Het oorzakelijke agens is de gram-negatieve spirocheet,
Borrelia burgdorferi. Wanneer een teek een bloedmaaltijd tot zich neemt van een
geïnfecteerd dier, dan zal de spirocheet zich in de teek gaan vermenigvuldigen. Hierna
zullen ze in een latent stadium blijven tot dat de teek opnieuw een bloedmaaltijd
neemt. Door het verse inkomende bloed wordt de spirocheet geactiveerd. Ze gaan
vervolgens migreren naar de speekselcellen. Na ongeveer drie dagen bloed zuigen zijn
de spirocheten zichtbaar in het speeksel van de volwassen teek. Dit impliceert dat de
overdracht van de ziekte pas plaats vind nadat de teek al uren vastgehecht is om bloed
te zuigen. [6]
Bij de mens varieert de incubatie periode tussen 1 en 3 weken. De eerste opvallende
verschijnselen zijn griepachtige symptomen zoals koorts, hoofdpijn, zowel spier- als
gewrichtspijn, vergroting van de regionale lymfeklieren, soms komt er misselijkheid,
braken, gegeneraliseerde malaise of vermoeidheid voor. Een zeer karakteristiek eerste
verschijnsel is het erythema migrans. Dat is een huidaandoening op de plek van de
tekenbeet. Er ontstaat een rode kring rondom die plek, deze wordt steeds groter. De
rode kring wordt veroorzaakt door de migrerende spirocheten, deze blijven eerst in de
huid maar komen vervolgens ook in circulatie terecht. Het verloop van de ziekte
verschilt per persoon. Soms is de ziekte zelf limiterend en hersteld de persoon
volledig. Maar dit is zeker niet in alle gevallen zo en kunnen de patiënten last krijgen
van chronische zenuw-, hart- of gewrichtsklachten. De diagnose is echter lastig te
stellen, meestal is deze gebaseerd op de klachten, anamnese en serologische
onderzoek.
8
Indien er antibiotica gegeven worden in een vroeg stadium dan is de therapie zeer
effectief. B.burgdorferi is gevoelig voor tetracycline en peniciline. Deze twee
antibiotica worden meestal gecombineerd gegeven. Ook kan er amoxicillin of
doxycycline worden gegeven.[6]
d. Anaplasmose
Tijdens dit onderzoek is er getest op A. centrale, A. phagocytophilum en op A. bovis.
Introductie
Anaplasmose word beschouwd als de belangrijkste teek-gebonden ziekte bij
landbouwhuisdieren [14][6]. Anaplasma spp is een bacterie die voorkomt in de rode
bloedcellen en in witte bloedcellen van een geïnfecteerd dier. Binnen de teken
populatie is transstadiele overdracht van Anaplasma mogelijk. Er is geen sprake van
transovariele overdracht [6].
Anaplasmose bij dieren
De incubatie periode van Anaplasmose varieert tussen 20 en 40 dagen. Deze ziekte
kent een abrupte start met hoge koorts tot 42⁰C. Na enkele dagen daalt de koorts weer.
Vlak na de besmetting sterven de dieren snel (5-6 dagen na besmetting). De
mortaliteit van de ziekte varieert tussen de 30 en de 50 procent. De ernst van de ziekte
stijgt naar mate de leeftijd voordert, jonge dieren (tot 1,5 jaar) overleven de ziekte
meestal. Tijdens de acute fase van de ziekte tonen de dieren zwaar ademhalen,
obstipatie of bloederige feces, anorexie...[6]
De diagnose voor Anaplasmose wordt bevestigd op basis van de verschijnselen en
anamnese, en door middel van serologisch onderzoek (voornamelijk met behulp van
ELISA). Echter zijn er reeds ook technieken beschikbaar die het mogelijk maken om
populatie teken te screenen op aanwezigheid van de bacterie.
Preventieve maatregelen zijn mogelijk door de dieren te vaccineren, maar ook hier is
de effectiviteit ervan onzeker.
De therapie is gebaseerd op een behandeling met tetracycline[6].
e. Erhlichiose
Tijdens dit onderzoek is eveneens getest op E.canis, E. chaffeensis, E. ruminantium en
op E. sp omatjenne
Introductie
Ehrlichiose komt bij vele diersoorten voor maar voornamelijk bij honden, paarden en
mensen. Ehrlichia invadeert de witte bloedcellen, voornamelijk monocyten en
lymfocyten. Ehrlichia zijn, evenals Anaplasma, obligaat intracellulaire bacteriën [6].
9
Canine Monicytic Ehrlichiose (CME)
Bij de hond is Ehrlichia canis de veroorzaker van Ehrlichiose, die wordt over
overgebracht door de teek Rhipicephalus sanguineus en experimenteel door
Dermacentor variabilis. Bij honden varieert de incubatie periode tussen 10-15 dagen.
De symptomen zijn acute hoge koorts, anorexie, conjunctivitis, oedeem, en
pancytopenie (laag aantal rode witte bloedcellen, lage trombocyten). Deze klachten
kunnen meerdere weken aanhouden. Canine Ehrlichiose is veel voorkomend in
(sub)tropische gebieden, waar de vector teek veel voorkomt. Echter wordt de ziekte
nu ook in andere delen van de wereld gezien [6]
Bij de mens zijn de belangrijke symptomen van Ehrlichiose acute start van de ziekte
met hoge koorts, hoofdpijn, zowel spier- als gewrichtspijn, misselijkheid, en maagdarmklachten.
De diagnose is gebaseerd op de klinische verschijnselen en op basis van de anamnese.
Op basis van bloedonderzoek is het mogelijk om trombocytopenie en leukopenie vast
te stellen. Ook microscopisch onderzoek van de witte bloedcellen moeten een goede
aanwijzing zijn voor Ehrlichiose. Om bevestiging te krijgen is het mogelijk om een
serologische test te laten doen met behulp van de IFT.
De therapie berust op een behandeling met tetracycline tijdens de vroege fase van de
ziekte en is zeer efficiënt tegen Ehrlichia infecties. Indien de aandoening een meer
chronische ziektebeeld aanneemt is een langere behandeling aangeraden. Vaccins zijn
beschikbaar, maar zoals reeds hierboven al besproken, ook voor deze geld geen
volledige efficiëntie. [6]
10
Materiaal en methode
1. Teken determinatie:
In 2005 is het “Tickbusters” project van start gegaan. Vanuit het UCTD zijn er ruim
tweehonderd “tickbusters-pakketten” verstuurd naar praktijken die interesse hadden
getoond in het project. Afkomstig van de dierenartsen of diereigenaren werden de
teken naar het UCTD opgestuurd met daarbij de ingevulde standaardformulier met
informatie over de gastheer, locatie, datum etc.… (1). Elk jaar worden weer pakketten
verstuurd naar de klinieken/praktijken die daar interesse in hebben. Op deze manier
zijn er sinds 2005 elk jaar weer veel teken opgestuurd naar het UCTD (zie bijlage 1)
en wordt de teken collectie goed aangevuld.
In het laboratorium wordt er vervolgens verder onderzoek gedaan naar de teken. Hier
worden ze onder de microscoop gelegd om de teken verder te determineren naar
species, stadium en sexe. De identificatie wordt mogelijk gemaakt door te kijken naar
de verschillen tussen de teken. Deze zijn over het algemeen gelegen in het schild en
de ligging van de anaal groeve etc.
Hierna wordt elke teek in een eppendorf tube geplaatst gevuld met 70 % ethanol en
krijgt een eigen unieke identificatie nummer. Vervolgens wordt de informatie hiervan
in de bestaande elektronische teken collectie opgeslagen. Deze wordt vervolgens terug
gekoppeld naar de praktijken.
(bijlage 1.a)
2. DNA extractie:
Voor de DNA extractie, wordt de determinatie van de teek uitgevoerd. De gevonden
informatie kan worden terug gekoppeld aan de bestaande informatie in de
elektronische teken collectie. Deze extra stap wordt gezien als verificatie van de reeds
bestaande informatie.
De DNA extractie is uitgevoerd volgens het bestaande protocol aanwezig op het
laboratorium van het UCTD en met behulp van NucleoSpin ® Tissue Kit (MachereyNagel, Düren, Duitsland) (zie bijlage 1).
Nadat het protocol volledig is afgewerkt is er per teek een epje gevuld met 100 µL
DNA. Dit epje wordt gelabeld en opgeslagen in de vriezer.
(bijlage 1.b)
11
3. Polymerase Chain Reaction (PCR) amplificatie:
Na de DNA extractie is het mogelijk om een specifiek DNA fragment te amplificeren.
[19]. Aangezien we maar beschikken over een kleine hoeveelheid DNA (100µL), is
het uitvoeren van een PCR, de ideale uitkomst om deze kleine hoeveelheden te
vermeerderen [18].
Om een PCR in te zetten is het
noodzakelijk om een master mix klaar
te maken. Deze mix bevat:
-
H2O
10xTrue Start buffer
25mM MgCl2
UNG
Foward primer
Reverse primer
dNTP/UTP mix
True Start polymerase
het desbetreffende DNA
Fig nr 3: Polymerase Chain Reaction (PCR)
Tijdens dit onderzoek, werd er gekeken naar de aanwezigheid van vijf verschillende
genera die eventueel aanwezig waren in de teken. De primers voor de PCR zijn zo
ontwikkeld dat ze zo veel mogelijk pathogenen oppikken. Zo was het dus mogelijk
om Babesia en Theileria te combineren in een master mix, Ehrlichia samen met
Anaplasma en dan als laatste Borrelia (Tabel 1)
Primer*
RLB-F2
RLB-R2
Ehr-F
Ehr-R
Bor-F
Bor-R
Sequence
5’-GAC ACA GGG AGG TAG TGA CAA G
5’-Biotin-CTA AGA ATT TCA CCT CTG ACA GT
5’-GGA ATT CAG AGT TGG ATC MTG GYT CAG
5’-Biotin-CGG GAT CCC GAG TTT GCC GGG ACT
TYT TCT
5’- ACC ATA GAC TCT TAT TAC TTT GAC CA
5’ -Biotin-GAG AGT AGG TTA TGC AGG G
+
+
-
Tm
(oC)
57.9
53.7
61.0
69.5
+
-
?
?
Orientation
Tabel 1: Sequentie primers
12
De master mix en het DNA, worden gecentrifugeerd en in het PCR apparaat geplaatst.
Hier zal de amplificatie stap voor stap door het apparaat uitgevoerd worden. Eerst zal
de temperatuur verhoogd worden zodat de DNA zal denatureren. Dit betekent dat de
waterstofbruggen tussen de DNA strengen worden verbroken, hierdoor gaat de DNA
helix uit elkaar. Vervolgens zal de temperatuur weer dalen en worden de primers
gekoppeld aan de complementaire strengen van het DNA. Hierna volgt er weer een
stijging van de temperatuur. De DNA-polymerase zal hierna ervoor zorgen dat de
strengen vermenigvuldigd worden tot een complementaire streng. Deze stappen
worden meerdere malen herhaald. [18][19] (tabel 1&2)
1 cycle
1 cycle
3 min
10 min
20 sec
2 cycles 30 sec
30 sec
20 sec
2 cycles 30 sec
30 sec
20 sec
2 cycles 30 sec
30 sec
20 sec
2 cycles 30 sec
30 sec
20 sec
2 cycles 30 sec
30 sec
20 sec
40 cycles 30 sec
30 sec
1 cycle
7 min
37oC
94oC
94oC
67oC
72oC
94oC
65oC
72oC
94oC
63oC
72oC
94oC
61oC
72oC
94oC
59oC
72oC
94oC
57oC
72oC
72oC
Activation of UDG
Inactivate UDG & activate Taq
Final extension
Tabel 2: Thermocycler program for Ehrlichia/Anaplasma and Babesia/Theileria touchdown PCR
13
1 cycle
1 cycle
3 min
37oC
Activation of UDG
10 min 94oC
Inactivate UDG & activate Taq
20 sec
94oC
2 cycles 30 sec
60oC
30 sec
72oC
20 sec
94oC
2 cycles 30 sec
58oC
30 sec
72oC
20 sec
94oC
2 cycles 30 sec
56oC
30 sec
72oC
20 sec
94oC
2 cycles 30 sec
54oC
30 sec
72oC
20 sec
94oC
2 cycles 30 sec
52oC
30 sec
72oC
20 sec
94oC
40 cycles 30 sec
50oC
30 sec
72oC
1 cycle
5 min
72oC
Final extension
Tabel 3: Thermocycler program for Borrelia touchdown PCR
(bijlage 1.c)
14
4. Gelelectroforese:
Indien er geen zekerheid bestaat over de juistheid van het uitgevoerde PCR, is het
verstandig om alvorens de Reverse Line Blot (RLB) te doen, eerst het DNA op gel te
plaatsten. Dit is omdat het uitvoeren van een RLB kostbaar is en een gel minder. Aan
de hand van de gel electroforese is het mogelijk te zien of er daadwerkelijk DNA zit
in de DNA monsters. Zo niet dan wordt er geen RLB uitgevoerd want dan komen er
geen resultaten uit.
De agarose gel wordt eerst in een oplossing geplaatst die voor de geleiding van de
aangebrachte elektrische stroom zorgt. Vervolgens wordt er Loading Dye toegevoegd
aan het DNA. Deze zorgt ervoor dat de dichtheid van het DNA verhoogd wordt zodat
het monster in het slotje zinkt. Een bijkomstigheid van deze stof is dat hij kleur brengt
aan het kleurloze DNA. Vervolgens worden de verschillende DNA monsters door
middel van een pipet in de slotjes aangebracht.[19]
Aangezien DNA een negatieve lading heeft zal deze naar het aangebrachte positief
geladen punt van de gel migreren [18]. De negatieve lading van DNA komt door de
fosfaat groep van het DNA [19]. Hierdoor gaan de DNA fragmenten migreren op de
gel. Het verschil tussen de fragmenten berust op hun verschil in lengte, wat wordt
weergegeven in een bandenpatroon op de gel [18].
De kleinere DNA fragmenten migreren sneller door de gel dan de groteren en zo zal
er een banden patroon tevoorschijn komen [18].
Het migreren van DNA neemt afhankelijk van de gel 30 a 45 min in beslag. Hierna is
het mogelijk om de gel te bekijken onder UV-licht. Hiermee is het mogelijk de DNA
fragmenten te vergelijken met de referentie waarde, de DNA ladder. [18]
(bijlage 1.d)
15
fig nr4: Gelelectroforese.
16
5. Reverse line blot hybridisatie:
Bepaalde teek-gebonden pathogenen komen tegelijkertijd voor in een dezelfde vector.
Een handige manier om al deze pathogenen in een keer op te sporen wordt mogelijk
gemaakt door de Reverse Line Blot (RLB) hybridisatie [9].
De RLB werd ontwikkeld om Streptococcus serotypes te identificeren [10]. Hierna is
de test met succes steeds verder ontwikkeld. Eerst was het alleen mogelijk om
Borrelia spirocheten in teken te vinden [11] Nu is het reeds mogelijk om vele
pathogenen met elkaar te combineren, zoals Ehrlichia, Anaplasma, Borrelia,
Theileria en Babesia [12].
Een RLB wordt uitgevoerd met een membraan waarop verschillende probes zijn
aangebracht [9]. Tijdens dit onderzoek zijn er 32 probes (genaamd oligo’s in fig 6)
aangebracht op 3 membranen, die dus telkens weer gebruikt kunnen worden. De PCR
producten worden verdund aangebracht op het membraan met behulp van een miniblotter. Eenmaal op het membraan worden de stappen volgens het UCTD protocol
(zie bijlage 1) uitgevoerd en zijn aan het einde de resultaten zichtbaar.
Fig 5: schematische weergave van een RLB.
17
Hieronder is te zien hoe de resultaten in werkelijkheid eruit komen te zien.
Aan de rechter verticale kant van het rooster is er een nummering te zien van 32
verschillende namen. Deze correspondeert aan de probes aanwezig op het membraan.
Aan de horizontale bovenzijnde van het rooster zijn er 45 verschillende codes
zichtbaar. Aan de buitenzijde zitten eerst de buffers en daarna de 2 controles (A/E en
Babesia deze kleuren redelijke zwart aan de linker en rechter kant). Exact in het
midden van deze horizontale nummering zit een positief aangebrachte E.canis
monster. Dit dient ter verificatie van het membraan. De 40 andere nummers
correspondeert aan de teek identiteit die voor dit membraan gebruikt zijn.
De zichtbare losse stippen die te zien zijn corresponderen aan positieve monsters. De
resultaten zijn voor dit membraan als volgt:
- Teek nummer 9474D en 10707: positief voor E/A catch-all
- Teek nummer 10708: positief voor B.valaisiana
- Teek nummer 10631D: positief voor T/B catch-all en B-catch-all 1.
- Teek nummer 11054B: B catch-all 1 en 2
Fig 6: weergave van resultaten uit dit onderzoek.
18
Resultaten
1. ingezonden teken
Gedurende het jaar 2010 zijn er in totaal 1395 inzendingen geweest naar het UCTD
laboratorium, met in totaal 3123 teken. Deze teken worden bij aankomst meteen
gedetermineerd door een medewerker. Vervolgens worden de teken in buisjes
geplaatst met 70% alcohol en komen in de teken collectie terecht. De gegevens van
de teken worden opgeslagen in de elektronische teken collectie. Deze teken zijn
afkomstig van 29 mensen en 1366 dieren: 847 honden, 388 katten, 72 onbekend, 12
meer dan een gastheer, 11 paarden, 8 egels, 6 konijnen, 3 dassen, 3 fretten, 3 in huis,
3 wezel, 2 van het reeën project, 2 koeien, 2 herten, 1 vogel, 1 cavia, 1 pony, 1
schaap. Het aantal teken dat per inzending wordt opgestuurd varieert tussen de 1 en
146. Bij 381 inzendingen waren er meer dan een teek aanwezig. De inzendingen zijn
duidelijk gebonden aan een seizoen, in de wintermaanden was er een duidelijke
daling in inzendingen, terwijl in het voorjaar er een duidelijke piek bestaat aan
inzendingen.
Uit de teken collectie van 2010 zijn er 138 inzendingen van een onbekende regio/land
met een totaal van 263 teken. Een aantal teken van deze collectie komen uit het
buitenland, in totaal 7 (1xFrankrijk; 6xBelgie). De resterende 1250 inzendingen zijn
afkomstig uit Nederland met een totaal van 2853 teken.
2. pathogenen
Tijdens dit onderzoek werden er 400 teken met behulp van een RLB assay op
aanwezigheid van Anaplasma, Ehrlichia, Babesia, Theileria en Borrelia getest. Dit
kwam uit op: 327 I.ricinus, 34 Ixodes.spp, 27 I.hexagonus, 9 R.sanguineus en 3
D.reticulatus
I.ricinus
Ixodes spp
aantal
327
34
Tabel 1: aantallen per teek soort.
I.hexagonus
27
R.sanguineus
9
D.reticulatus
3
Spirocheten van Borrelia burgdorferi sensu lato werden bij 20 I.ricinus teken, 2 bij
de niet verder gespecificeerde Ixodes spp en bij 1 D.reticulatus gevonden. Bij de
I.ricinus groep werd er 6 keer B.garinii, 6 keer B.afzelii, 6 keer B.valaisiana, 1 keer
B.burgdorferi ss en 1 keer B.burgdorferi sl.
Dit komt er op neer dat 6.1% van de I.ricinus teken besmet zijn met B.burgdorferi sl.
Hiervan is 0.3% B.burgdorferi ss, 1.83% B.garinii, 1.83% B.afzelii, en 1.83%
B.valaisiana (zie tabel 2). Een I.ricinus was geïnfecteerd met meer dan een Borrelia
soort.
19
I.ricinus
Ixodes spp
Totaal aantal
327
34
B.burgdorferi sl 20 (6.1%)
2 (5.9%)
B.burgdorferi ss 1 (0.3%)
0
B.garinii
6 (1.83%)
0
B.afzelii
6 (1.83%)
1 (2.94%)
B.valaisiana
6 (1.83%)
0
Tabel 2: infectie percentage van Borrelia.
I.hexagonus
27
0
0
0
0
0
R.sanguineus
9
0
0
0
0
0
D.reticulatus
3
1 (33%)
0
1 (33%)
0
0
In deze 400 teken werden er geen B.canis aangetoond. In 4 I.ricinus teken werd
B.divergens gevonden en bij 1 Ixodes spp. Niet verder gespecificeerde Babesia is
gevonden bij 3 I.ricinus teken en bij een I.hexagonus. Dit betekend dat van de 7
Babesia spp 4 tot de B.divergens behoren en de resterende 3 niet verder
gedifferentieerd zijn.
Dit komt er op neer dat 1.22% van de I.ricinus teken besmet zijn met B.divergens, en
2.94% van de I.spp teken zijn besmet met B.divergens. ( zie tabel 3)
I.ricinus
Ixodes.spp
aantal
327
34
Babesia spp
7 (2.14%)
1 (2.94%)
B.divergens
4 (1.22%)
1 (2.94%)
Tabel 3: infectie percentage van Babesia.
I.hexagonus
27
1 (3.7%)
0
R.sanguineus
9
0
0
D.reticulatus
3
0
0
Anaplasma spp is zowel aangetoond in de I.ricinus, I.spp als in de I.hexagonus. In
totaal is er 14 keer Anaplasma spp bij de I.ricinus gevonden, 2 keer bij de I.spp en 6
keer bij de I.hexagonus. Dit betekend dat van de 10 Anaplasma spp 4 tot de
A.phagocytophilum behoren en de resterende 7 niet verder gedifferentieerd zijn.
Dit komt er op neer dat 1.22% van de I.ricinus teken besmet zijn met
A.phagocytophilum en 3.7% van de I.hexagonus. (zie tabel 4)
I.ricinus
I.spp
I.hexagonus
aantal
327
34
27
Anaplasma spp
10 (3.1%) 2 (5.88%) 5 (18.5%)
A.phagocytophilum 4 (1.22%) 0
1 (3.7%)
Tabel 4: infectie percentage van Anaplasma.
R.sanguineus
9
0
0
D.reticulatus
3
0
0
Ehrlichia spp is zowel aangetoond in de I.ricinus, I.spp als in de I.hexagonus. In
totaal zijn er 10 Ehrlichia spp gevonden bij de I.ricinus, 2 keer bij de I.spp, 5 keer bij
de I.hexagonus en 2 keer bij de D.reticulatus.
Dit komt er op neer dat 3.1% van de I.ricinus teken besmet zijn met Ehrlichia spp,
5.9% van de I.spp teken, 18.5% van de I.hexagonus en 66.6% van de D.reticulatus.
Hier moet wel vermeld worden dat de besmette D.reticulatus besmet was met meer
dan een soort Ehrlichia, namelijk E.canis en E.sp.Omatjenne. (zie tabel 5)
20
I.ricinus
I.spp
I.hexagonus
aantal
327
34
27
Ehrlichia spp
10 (3.1%)
2 (5.9%)
5 (18.5%)
E.canis
0
0
0
E.sp.Omatjenne 0
0
0
Tabel 5: infectie percentage van Ehrlichia.
R.sanguineus
9
0
0
0
D.reticulatus
3
2 (66.6%)
1 (33.3%)
1 (33.3%)
Theileria spp is zowel aangetoond in de I.ricinus als in de I.spp. In totaal zijn er 3
Theileria spp gevonden bij de I.ricinus en 1 keer bij de I.spp.
Dit komt er op neer dat 0.92% van de I.ricinus teken besmet zijn met Theileria spp en
2.94% van de I.spp teken besmet zijn met Theileria spp. (zie tabel 6) De Theileria
behoort tot een onbekende soort.
I.ricinus
I.spp
I.hexagonus
aantal
327
34
27
Theileria spp
3 (0.92%)
1 (2.94%) 0
Tabel 6: infectie percentage van Theileria.
R.sanguineus
9
0
D.reticulatus
3
0
21
Discussie
Tijdens het verwerken van de resultaten van het onderzoek zijn er een aantal
vraagtekens naar voren gekomen.
Reflectie resultaten
In totaal zijn er bij 17 teken Anaplasma spp gevonden. Hiervan waren er 5 verder
gespecificeerd en behorend tot de A.phagocytophilum. De resterende 12 waren niet
verder gespecificeerd en vallen onder de A/E catch all. Uit dit onderzoek is dus niet
naar boven gekomen waar deze resterende 12 toe behoren. Het is mogelijk dat ze tot
een andere species behoren die niet als probe aanwezig is op het membraan. Ook is
het mogelijk dat ze tot een Ehrlichia soort horen. Een andere verklaring die hier ook
mogelijk zou kunnen zijn is dat er een nieuwe soort is ontdekt. Al deze
mogelijkheden zouden verder onderzocht kunnen worden.
Een andere bevinding tijdens dit onderzoek wat zeer merkwaardig is, is dat er bij een
I.hexagonus teek, het pathogeen E.canis samen met E.sp.Omatjenne met zich
meedroeg. Nu is het bekend dat deze pathogeen niet voorkomt in deze teek soort,
maar juist bij de R.sanguineus [20]. Voor dat hier verdere conclusies aangenomen
worden is het noodzakelijk dat hiernaar verder onderzoek gedaan wordt. Het resultaat
op de RLB membraan was niet zeer duidelijk, maar wel aanwezig, dus valt niet te
negeren. Een mogelijke meest waarschijnlijke verklaring hiervoor is dat er mogelijk
een kruis reactie heeft plaats gevonden.
Uit dit onderzoek zijn een aantal prevalenties naar boven gekomen van verschillende
pathogenen. Echter indien we deze vergelijken met andere onderzoeken dan valt op
dat deze grote verschillen kennen. Om hier een voorbeeld van te geven heb ik
gekeken naar de prevalentie van A/E. Uit dit onderzoek is een prevalentie van 4.25%
(4.25% van de teken is drager van A/E).
Bij verschillende onderzoeken die in de afgelopen 3 jaar gedaan zijn op het UCTD
zijn de volgende prevalenties gevonden: 40.4% [21], 61.8% [24], en 23.1% [23]. Al
deze waarden zijn aanzienlijk hoger dan wat tijdens dit onderzoek nar boven is
gekomen. Een mogelijke verklaring hiervoor zou kunnen zijn dat de onderzoeken op
verschillende diersoorten (en dus in verschillende regio’s) hebben plaats gevonden.
22
Conclusie
Uit dit onderzoek is naar voren gekomen dat de teken in Nederland van het jaar 2010
overwegend behoren tot de species: I.ricinus namelijk met 84.11% (2627 van de in
totaal 3123 teken). D.reticulatus is ook in 2010 weer gevonden op de Nederlandse
bodem, namelijk 5 teken van deze soort zijn er ingestuurd. Wat opmerkelijk is, is dat
er 9 R.sanguineus zijn gevonden op de Nederlandse bodem in 2010.
Tijdens dit onderzoek is er aangetoond dat er een grote verscheidenheid aan
pathogenen zit in de Nederlandse teek uit het jaar 2010. Een aantal pathogenen
kunnen geen kwaad bij bepaalde diersoorten en een aantal kunnen de veroorzaker zijn
van zeer vervelende aandoeningen zowel bij mens als bij dier. Het is daarom
essentieel om dieren eigenaren goed op de hoogte te stellen over alle mogelijke
manieren die beschikbaar zijn om de teken te bestrijden. Aangezien een aantal
pathogenen een zoönotisch karakter hebben is het ook van belang om de risico’s voor
de mens goed te belichten.
Uit dit onderzoek is naar boven gekomen dat de prevalentie voor Borrelia spp in de
teken populatie vrij hoog is, namelijk 6.5% (26/400). Hierna volgt Anaplasma spp
met 6.25% (25/400), dan Ehrlichia spp 4.75% (19/400), dan Babesia spp met 3%
(12/400) en als laatst Theileria spp met 0.75% (3/400)
Aangezien nog lang niet alles bekend is over teken-gebonden ziektes en zoönoses, is
het noodzakelijk om door te gaan met dit soort onderzoeken uit te voeren. Er is meer
onderzoek nodig op dit gebied om te kunnen bepalen of een bepaalde pathogeen
überhaupt beschikt over een zoönotisch karakter en of er dus nog meer preventieve
maatregelen genomen dienen te worden voor de bescherming van mens en dier.
23
Dankwoord
Graag zou ik op deze wijze iedereen willen bedanken dit mij geholpen heeft met dit
onderzoek en het realiseren van mijn presentatie / verslag. Allereerst wil ik graag
Prof. Dr. F. Jongejan bedanken voor de mogelijkheid dit onderzoek te doen op het
UCTD. Daarbij heeft hij mij goed op weg geholpen met zijn commentaar, op- en
aanmerkingen, tips over verschillende artikels die ik goed kon gebruiken. Verder wil
ik graag Michiel Wijnveld bedanken voor het begeleidend werk op het laboratorium.
Dankzij hem heb ik al het uitvoerend werk goed kunnen doen. En natuurlijk wil ik
mijn leuke collega’s Abbey, Jesse en Marjon bedanken voor hun handige tips wat
betreft het onderzoek, maar vooral voor de leuke en gezellige sfeer die zij gecreëerd
hebben.
Dit onderzoek heb ik als erg leerzaam ervaren. Het was een leuke ervaring om te
ontdekken wat er allemaal mogelijk is binnen het UCTD. Het laboratorium werk is
me goed in de smaak gevallen. Verder vond ik de sfeer heel erg gezellig en dat heeft
ervoor gezorgd dat de deze stageperiode voorbij gevlogen is!
Bedankt!
24
Literatuurlijst
1. Bodaan C, Nijhof AM, Postigo M, Nieuwenhuijs H, Opsteegh M, Franssen L,
Jebbink F, Jansen S, Jongejan F. Teken en door teken overdraagbare
pathogenen bij gezelschapsdieren in Nederland. Tijdschrift voor
Diergeneeskunde 2007; 132 (13): 517-523.
2. Estrada-Peňa A, Bouattour A, Camicas JL, Walker AR. Ticks of Domestic
Animals in de Mediterranean Region: A Guide to Identification of Species.
University of Zaragoza, 2004.
3. Wall R, Shearer D. Veterinary Ectoparasites: Biology, Pathology and
Control. 2001
4. Anderson JF, Magnarelli LA. Biology of ticks. Infectious Disease Clinics of
North America, 2008; 195-215
5. Tijsse-Klasen E, Jacobs JJ, Swart A, Fonville M, Reimerink JH, Brandenburg
AH, Giessen JWB, Hofhuis A, Sprong H. Small risk of developing
symptomatic tick-born diseases following a tick bite in the Netherlands.
Parasites & Vectors, 2011
6. Sonenshine DE. Biology of Ticks. Vol 2. Oxford University Press, 1991
7. Hildebrandt A, Hunfeld KP, Baier M, Krumbholz A, Sachse S, Lorenzen T,
Kiehntopf M, Fricke HJ, Straube E. First confirmed autochthonous case of
human Babesia microti infection in Europ. European Journal Of Clinical
Microbiology & Infectious Disease 2007; 26:595-601
8. Shaw SE, Day MJ. Arthropod-borne Infectious Diseases of the Dog and Cat.
Manson Publishing/The Veterinary Press. 2005
9. Taoufik A, Nijhof A, Hamidjaja R, Jongejan F. Reverse line blot
hybridization in the detection of tick-borne diseases; published in BioTech
Sept 2004; Division of Parasitology and Tropical Veterinary Medicine,
Utrecht University.
10. Kaufhold A, Podbieldski A, Baumgarten G, Blokpoel M, Top J, Schouls L.
Rapid typing of group A streptococci by the use of DNA amplification an
non-radioactive allele-specific oligonucleotide probes. FEMS Microbiol
letters 1994: 19-26.
25
11. Rijpkema SG, Molkenboer MJ, Schouls LM, Jongejan F, Schellekens JF.
Simultaneaous detection and genotyping of three genomic groups of
Borrelia burgdorferi sensu lato in Dutch Ixodus ricinus ticks by
characterization of the amplified intergenic spacer region between 5S and
23S rRNA genes. Journal of Clinical Microbiology, 1995, p.3091-3095.
12. Schouls LM, van de Pol I, Rijpkema SG, Schot CS. Detection and
identification of Ehrlichia, Borrelia burgdorferi sensu lato and Bartonella
species in Dutch Ixodus ricinus ticks. Journal of Clinical Microbiology,
1999, p.2215-2222.
13. Gubbels MJ, de Vos S, van der Weide M, Viseras J, Schouls LM, de Vries E,
Jongejan F. Simultaneous detection of bovine Theileria and Babesia species
using reverse line blot hybridization. Journal of Clinical Microbiology 1999,
p.1782-1789.
14. Ristic M, Bovine anaplasmose. p 235-349. In: Kreier J.P. (Ed.). Parasitic
Protozoa. IV. Babesia, Theileria, Myxosporidia, Microsporida,
Bartonellaceae, Anaplasmataceae, Ehrlichia, and Pneumocystis. Academic
Press, New York
15. Jongejan F, Uilenberg G, The global importance of ticks. Parasitology,129,
S3-S14, Cambrigde University Press, 2004
16. Gray JS, Kahl O, Lane RS, Stanek G. Lyme borreliose. Biology,
Epidemiology and Control. Wallingford, UK, CABI Publishing. 2002.
17. Thomas T.D. Identification of Theileria species and characterization of
Theileria parva stocks. International Laboratory for Research on Animal
Diseases, Food and Agriculture Organization, 1988
18. http://www.allesoverdna.nl/basisinfo/dna-analyse/zo-werktgelelektroforese.html
19. http://www.dnalc.org/resources/animations/gelelectrophoresis.html
20. Jongejan F. Teken en door teken overgedragen ziekten. Diergeneeskundig
memorandum, april 2001
21. van Dijk S, Teken en door teken overgedragen infecties bij de kat. UCTD,
Departement I&I, februari 2008
26
22. Oldehinkel A, Moleculaire detectie van teken-gebonden zoönosen in
I.hexagonus teken afkomstig van katten in Nederland. UCTD, Departement
I&I, december 2009
23. Busser M, Screeningsonderzoek naar teken-gebonden ziekten bij wilde
hoefdieren in Nederland. UCTD, Departement I&I, januari 2010
24. Megens I.A.G, Screeningsonderzoek naar teken en door teken overgedragen
ziekten bij groot wild in Nederland. UCTD, Departement I&I, februari 2009
27
Bijlage
1. UCTD protocollen
a. Teken determineren
Om te beginnen, denk aan je eigen veiligheid. Tussen de ingezonden teken zitten
nog veel teken die in leven zijn. Zorg dan ook dat je goed oplet dat ze niet aan de
wandel gaan.
Pas op dat sommige teken eitjes hebben kunnen leggen in de buisjes en dat hier
mogelijk larven uit gekomen zijn. Tref je larven aan of vertrouw je het niet, laat dan
het buisje dicht zitten en gooi dit in de gele bak weg. Let met eitjes er op dat deze niet
verspreid raken, voorkom zoveel mogelijk dat eitjes met de teek mee uit het buisje
gaan en dat ze hier door overal op je werk plek terecht komen. Er mogen wel enkele
eitjes met het vrouwtje mee het nieuwe buisje in. Vul het oude buisje, waar de
overige eitjes in zitten met 70% alcohol, draai de dop er weer op en gooi het geheel in
de gele bak. Mochten er eitjes op tafel terecht gekomen zijn, dan kan je de tafel
desinfecteren met 70% alcohol.
1. Haal de teek uit het verzendmateriaal en bekijk hem onder de microscoop.
Hier voor kan je gebruikmaken van een object glaasje waar klei opgeplakt is.
Hier in kan je de teek makkelijk vast pinnen waardoor je de teek goed van alle
kanten kan bekijken.
2. Determineer de teek. Om onderscheid te maken is het belangrijk om naar de
volgende zaken te kijken:
o De vorm van het schild.
o De genitale opening en dan met name de positie hier van.
o De sporen op de basis van het eerste poten paar.
(Zie bijlage I voor informatie over hoe je enkele van de veel voorkomende
teken in Nederland kan herkennen.)
3. Wanneer je bepaald hebt welke soort teek het is dan doe je deze in oude buisje
als deze nog redelijk schoon is en anders in een nieuw buisje. Teken,
afkomstig van dezelfde gastheer, van het zelfde geslacht (♀/♂) en zelfde
stadia (nimf/larve) mogen bij elkaar in 1 buisje. (Dus als er 3 ♀, 1 ♂, 2nimfen
en 1 larve ingezonden zijn die van bijvoorbeeld 1 hond afkomen heb je uit
eindelijk 4 buisjes.)
Bij larven en nimfen is het niet mogelijk om te bepalen bij welke ondersoort
ze horen, deze worden dan ook opgeschreven als bv. Ixodes sp. 1 x larve.
4. Geef elke buis een uniek nummer en schrijf op het formulier de datum van
determinatie, het nummer van het buisje en wat er in het buisje zit. Mochten je
meerdere buisjes hebben, dan graag meerdere formulieren in vullen waarbij je
een deel van het originele formulier over neemt zo dat duidelijk is dat deze bij
elkaar horen en schrijf op elke formulier weer de datum, nummer van het
buisje en wat er in zit. (Deze formulieren worden naast dat het in de database
gezet wordt, ook opgeslagen.)
5. Vul de buisjes aan met 70% alcohol zo dat de teken ruim onder staan.
Vervolgens kunnen ze in de lade gedaan worden waarin ze opgeslagen
worden.
28
Teken die stuk gegaan zijn, of erg beschimmeld zijn worden niet opgeslagen. Deze
mag je in de gele bak weg doen. Probeer deze teken wel te determineren, eventueel
alleen het hoofdgeslacht (b.v. Ixodes) en vul het formulier wel aan met deze
informatie. Deze teken krijgen tevens een nummer, alleen hoef je deze niet op het
buisje te plakken maar op het formulier zelf. Indien er meerdere teken zijn, waarvan
er 1 niet opgeslagen wordt dan schrijf je op het formulier wat er in het buisje zit en
dat je 1 teek weg gegooid hebt. (bv. Datum, buis nummer, I. ricinus 2x♀ en 1x
I.ricinus ♀ weggegooid.)
Mocht je twijfelen over de teek vraag dan altijd de hulp van Frans Jongejan of iemand
anders. Mocht er niemand zijn die je verder kan helpen, zet dan het buisje apart zodat
er later alsnog naar gekeken kan worden.
Let er ook op dat je geen dubbele buisnummers gebruikt.
Wanneer je klaar bent met determineren, zorg dan dat je de plek schoon en
opgeruimd achter laat. Desinfecteer je werkplek met 70% alcohol.
29
b. DNA isolatie uit de teek
In de T1 en B3 buffer kan neerslag gevormd zijn als deze lang niet gebruikt zijn.
Verwarm deze buffers in een waterbad tussen de 50-700C tot de neerslag opgelost is.
Zet tevens een waterbad aan op 560C en een hitteblok op 700C. Voorverwarm de BE
buffer op 700C.
Voor je begint, verwijder de blender delen en was deze in een buis met
gedemineraliseerd water, vervolgens in 70% alcohol en hierna weer in
gedemineraliseerd water. Droog de onderdelen en zet de blender weer in elkaar. Vul
tevens het sonificatie bad met gedemineraliseerd water.
1. Was de teek in het sonificatie bad gedurende 20-30 seconden, controleer
eventueel onder de microscoop of de teek schoon getrild is.
2. Stop vervolgens de individuele teek in een epje welke ruim wordt aangevuld
met 70% alcohol en vortex de teek gedurende 5 tot 10 seconden.
3. Was de pincet eerst in 70% alcohol en vervolgens in gedemineraliseerd water.
4. Haal de teek uit het epje, het epje kan vervolgens gesloten in de gele bak weg
gegooid worden, en laat deze enkele tellen drogen op een tissue of filter
papier.
5. Wanneer de teek droog is, plaats deze dan op een rond filter papier en snij
hem voorzichtig met het scalpel mesje in 2, of als het een grotere teek is in 4,
stukjes. Neem voor elke teek een schone plek op het filter.
6. Doe deze stukjes teek in een 2 ml epje en voeg hier 180µl T1 buffer aan toe en
label dit epje correct. (Schrijf het nummer van het buisje op, met toevoeging
van een letter als er meerdere teken in het buisje zaten en schrijf ook de datum
van de DNA isolatie op.)
a. Blender de teek tot er nog maar zeer kleine stukjes over zijn.
b. Verwijder de blender onderdelen en was deze in gedemineraliseerd
water, vervolgens in 70% alcohol en hierna weer in gedemineraliseerd
water.
c. Droog de onder delen en zet de blender weer in elkaar.
Was de pincet, net zoals bij stap b, na de teek uit het sonificatie bad
gehaald te hebben en na het in het epje doen van de gesneden
tekenstukjes.
(Ververs om de 5 teken de twee buizen met gedemineraliseerd water
en de 70% alcohol)
7. Voeg 25µl proteinase K toe en vortex. (Proteinase K ligt in de vriezer.)
8. Incubeer vervolgens 1 tot 3 uur bij 560C. Vortex elk uur. De duur van deze
incubatie is afhankelijk van hoe snel de teek afgebroken wordt, maar duurt
meestal 3 uur.
a. Als het hitte blok nog niet aan staat op 700C, doe dit dan voor het
laatste uur incuberen en voorverwarm de BE buffer.
9. Voeg 200µl B3 buffer toe.
10. Incubeer vervolgens 10 tot 15 minuten bij 700C. Draai de epjes vervolgens
kort af in de centrifuge zodat de epjes weer vrij zijn van condensvorming.
11. Voeg 210µl 100% alcohol toe en vortex.
12. Centrifugeer 2 minuten op 11.000 x g.
13. Breng het supernatant over naar een nucleospin kolom en centrifugeer 1
minuut op 11,000 x g . Verwijder de doorgelopen vloeistof. (Voorkom dat
stukjes teek, mee genomen worden op de kolom. Label de kolom correct.)
30
14. Voeg 500µl BW buffer toe en centrifugeer 1 minuut op 11.000 x g. Verwijder
de doorgelopen vloeistof.
15. Voeg 600µl B5 buffer toe en centrifugeer 1 minuut op 11.000 x g. Verwijder
de doorgelopen vloeistof.
16. Centrifugeer vervolgens nog een keer 1 minuut op 11.000 x g.
17. Plaats de colom in een nieuwe, steriele, 1,5ml epje. Label dit epje correct.
(TeekID + Datum.)
18. Pipetteer vervolgens 100µl voorverwarmde BE buffer direct op het
membraan en incubeer gedurende 1 minuut.
19. Centrifugeer 1 minuut op 8.000 x g en vervolgens nog 1 minuut op 11.000 x
g.
20. Bewaar het verkregen DNA monster bij -20.
Leeg na afloop het sonificatie bad en desinfecteer het bad met 70% alcohol.
31
c. PCR ter behoeve van de Reverse Line Blot (RLB) Hybridisatie
De verkregen DNA monsters kunnen vervolgens gebruikt worden in een aantal
bepalingen waaronder de RLB. Hierbij moet een PCR met 1 of meerdere PCR primer
paren gedaan worden zodat er specifieke DNA fragmenten ontstaan welke
aangetoond kunnen worden middels de RLB. Voor deze PCR wordt er 1 master mix
gemaakt, deze bevat de totale hoeveelheid PCR reagens voor alle te PCR-en monsters
+1 positieve controle en 1 negatieve controle. Dus aantal DNA monsters + 2.
Deze master mix wordt door het vermenigvuldigen van onderstaande onderdelen met
het aantal PCR monsters en dit te pipeteren in 1 epje.
UNG en de True Start DNA polymerase zijn beide enzymen. Dit houd in dat ze in
glycerol in de vriezer staan en pas op het moment van toevoeging aan de mastermix,
uit de vriezer behoren te worden gehaald. Let bij het pipeteren van de enzymen er op
dat je pipetpunt niet in de vloeistof gaat maar net het oppervlak aanraakt. (Glycerol is
erg stroperig en door zo te pipeteren wordt voorkomen dat er druppels aan de pipettip
vormen en hierdoor teveel enzymen worden toegevoegd.)
RLB-PCR (Fermentas True Start polymerase)
Volledige Mix voor 1 reactie:
15,025ul
H2O
2,5 µl
2,5 µl
0,1 µl
0.5 µl
0.5 µl
1,25 µl
0.125 µl
10x True Start buffer, thaw & vortex before use
25 mM MgCl2, thaw & vortex before use
UNG
F primer (20 pmol/ul)
R primer (20 pmol/ul)
dNTP/UTP mix
True Start polymerase (5u/ul)
y µl (meestal 2,5ul)
cDNA or DNA
Eind volume per PCR reactie: 25 µl
Het te gebruiken PCR programma is afhankelijk van de primers, vraag dan ook welk
programma gebruikt moet worden als dit nog niet duidelijk is. (Ze staan al
geprogrammeerd op het PCR apparaat.) De verkregen PCR producten worden
vervolgens middels gel electroforese beoordeeld of de PCR naar behoren heeft
gewerkt.
32
d. Agarose gel electroforese







Om 1 liter 1x TEA te verkrijgen moet de een deel van de 50x TEA
stockoplossing verdund worden (20ml 50x TAE aanvullen tot 1000 met MilliQ water)
Weeg vervolgens 1,125 gram agarose af en voeg hier 75ml 1x TEA aan toe en
verwarm vervolgens de oplossing in een magnetron tot dat de agarose
gesmolten is.
Laat de oplossing afkoelen tot ongeveer 60 OC en voeg 2,5µl van de
(10mg/ml) Ethidiumbromide oplossing toe. LET OP! Ethidiumbromide is
carcinogeen! Draag handschoenen!
Plak van de electroforese tray beide kanten af met tape, zodat de gel niet kan
gaan lekken, en plaats de kam.
Giet voorzichtig de gel. (Eventuele luchtbellen kunnen verwijderd worden met
een pipet punt.)
Wanneer de gel gestold is kan de kam voorzichtig verwijderd worden en de
tray in het electroforese apparaat gezet worden.
Vul indien nodig de 1x TAE niveau aan tot de volledige gel onder een klein
laagje buffer staat.
PCR product voorbereiden op de electroforese
Pipetteer 1µl 6x loadingbuffer in een 0,2ml epje of in een welletje van een 96 wells
plaat.
Voeg hier 5 µl PCR product aan toe.
Pipetteer vervolgens voorzichtig het PCR product in een slotje. De loadingbuffer
bevat een hogere dichtheid dan de TEA buffer, hierdoor zal je PCR product +
loadingbuffer naar onderen zakken in het slotje. Echter, wanneer te vlug gepipetteerd
wordt bestaat de kans dat het slotje “overstroomt” en je PCR product niet in het slotje
blijft.
Pipetteer vervolgens 5 µl van de DNA ladder aansluitend of voorafgaand aan je PCR
monsters. (1 per “rij” slotjes die gebruikt worden.)
Run vervolgens de gel gedurende 30-45minuten.
Vervolgens kan de gel, indien de producten vergenoeg door de gel heen gemigreerd
zijn, bekeken worden onder UV licht en tevens kan er een foto van de gel gemaakt
worden. (De DNA ladder bevalt kleurstoffen welke als referentie dienen tijdens het
electroforeren. Aan de hand van deze kleur fracties kan er bepaald worden of er lang
genoeg geëlectroforeert is. Wanneer de fragmenten erg langzaam migreren door de
gel, kan het zijn dat de buffer te vaak gebruikt is en dient deze vervangen te worden.
Giet de oude buffer in het afvalvat waar duidelijk “EtBr Waste” opgeschreven staat.)
33
e. Reverse Line Blot (RLB) hybridisatie
Controleer of een PCR beschikbaar is, en schrijf je in voor de tijd dat de PCR
gebruikt zal worden. (Tijd begin, tijd eind – Naam. Bij een overnacht PCR kan er
O/N geschreven worden als eind tijd.)
1. Combineer en verdun de verkregen PCR producten in een 1,5 epje. Neem van
elk PCR product 10 µl en vul dit aan tot een totaal volume van 160 µl met 2x
SSPE/0,1% SDS. (B.V. 10 µl Anaplasma/Ehrlichia PCR + 10 µl
Babesia/Theileria PCR + 140 µl 2x SSPE/0,1%SDS. De verdunning van de
PCR producten kan ook de dag voor de RLB gedaan worden, de verdunde
monsters kunnen vervolgens bewaard worden in de koude kamer.)
2. Denatureer de verdunde PCR producten gedurende 10 minuten bij 100°C op
een heating block en koel vervolgens de epjes meteen op ijs. Centrifugeer,
short spin, de epjes kort nadat ze zijn afgekoeld.
3. Incubeer tijdens de denaturatie van de PCR producten het RLB membraan
gedurende 5 minuten in ±100ml 2x SSPE/0,1%SDS bij kamertemperatuur
onder zacht schudden.
4. Plaats het membraan op een ondersteunend kussen in de miniblotter, met de
sloten van de miniblotter haaks op de aangebrachte probes op het membraan.
5. Verwijder de buffer uit de sloten van de miniblotter met behulp van vacuüm.
6. Pipetteer vervolgens de PCR verdunde producten in de sloten. (De sloten
kunnen 150 µl bevatten dus je houd 10 µl van de 160 µl over. Deze overmaat
is zodat de gehele slot gevuld kan worden ZONDER luchtbellen. Wanneer
luchtbellen ontstaan, zuig met behulp van de pipet het monster weer op en
pipetteer opnieuw tot dat er geen luchtbellen meer in de slot aanwezig zijn.)
7. Laat de PCR producten gedurende 60 minuten hybridiseren bij 42°C in de
stoof zonder te schudden.
8. Zet alvast 30ml 2x SSPE/0,5%SDS in een tube in de stoof bij 42°C om op
temperatuur te komen.
9. Verwijder de monsters met behulp van vacuüm.
10. Was het membraan 2x met ±100ml voorverwarmde 2x SSPE/0,5% SDS
gedurende 10 minuten bij 50°C onder rustig schudden in het waterbad.
11. Incubeer het membraan met 30 ml 2x SSPE/0,5% SDS + 5 µl streptavidine
gedurende 30 minuten bij 42 in de stoof onder rustig schudden. Zet het
waterbad op alvast op 42°C met de 2x SSPE/0,5%SDS zodat beide op de
juiste temperatuur komen.
12. Was het membraan 2x met ±100ml 2x SSPE/0,5% SDS gedurende 10 minuten
bij 42°C onder rustig schudden.
13. Was het membraan 2x met ±100ml 2x SSPE gedurende 5 minuten bij
kamertemperatuur onder rustig schudden.
14. Verwijder de 2x SSPE.
15. Spreid 10ml ECL (5ml ECL1 + 5ml ECL2, koude kamer) over het membraan
door met de hand de bak heen en weer te bewegen tot het volledige membraan
bedekt is met ECL.
16. Plaats het membraan tussen 2 overhead sheets of tussen keuken folie,
voorkom luchtbellen.
17. Plaats het membraan in de foto cassette.
34
18. Ga naar de donkere kamer op de 5e verdieping en plaats de x-ray film op het
membraan. (Markeer hoeken zodat het uiteindelijk makkelijker oriënteren is.)
19. Belicht de x-ray gedurende 10 minuten.
20. Ontwikkel de foto met behulp van het ontwikkelingsapparaat.
35
f.
RLB membraan strippen
Plaats de 1% SDS oplossing in het waterbad en laat beide opwarmen tot 80°C.
1. Was de gebruikte membraan 2x met 1% SDS oplossing gedurende 30 minuten
bij 80°C onder rustig schudden.
2. Wanneer er gedurende langere tijd geen gebruik gemaakt wordt van het
membraan volgt nog 1x wassen van het membraan met 20mM EDTA
oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
3. Berg het membraan op in de sealbag en voeg ±2ml 20mM EDTA toe.
36
2. species verdeeld over de families
37
3. resultaten
over de 400 in totaal
D.reticulatus
I.hexagonus
I.ricinus
Anaplasma /Ehrlichia spp
5 (4wezel,1egel)
10(3hond,1kat, 3?,3mens)
17
Anaplasma phagocytophilum
1(>1)
4(1hond, 1?, 1kat, 1hert))
5
Theileria
I.spp (nymfe)
3(1hond, 1konijn,1 >1)
Babesia
1(1wezel)
totaal
4
1(1egel)
4
3(2hond, 1?)
5
Babesia divergens
4(2hert,1kat,1hond)
Borrelia burgdorferi sl
1(1hond)
1
Borrelia burgdorferi ss
1(1kat)
1
6(4hond,2kat)
7
Borrelia afzelii
6(5hond,1konijn)
6
Borrelia valaisiana
6(3hond, 2kat, 1?)
6
A.phagocytophilum & B.divergens
1(1hert)
1
A/E (nvd) & B.divergens
2(1hert, 1kat)
2
Borrelia garinii
E.canis & E.sp.Omatjenne
1(1hond)
1(1fret)
1
1(1wezel)
B.divergens & B.afzelii
1(1hert)
B.divergens & B.burgdorferi
1(1fret)
2
1(1fret)
1
B.garnii & B.afzelli
1(1hond)
1
B.divergens & B.burgdorferi ss
totaal
1(1hond)
1
65
2
7
50
6
?: de gastheer van de teek is onbekend
>1: de teek is afkomstig van meer dan 1 gastheer
38